авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Влияние трансформации клеточной культуры винограда vitis amurensis rupr. геном rolb из agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола

1

На правах рукописи

ДУБРОВИНА АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА ВЛИЯНИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ВИНОГРАДА Vitis amurensis Rupr. ГЕНОМ rolB ИЗ Agrobacterium rhizogenes НА БИОСИНТЕЗ РЕЗВЕРАТРОЛА 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 2010 2 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института Актуальность темы. Решение проблемы промышленного получения биологически ДВО РАН активных веществ (БАВ) часто осложняется недостатком быстро воспроизводимых сырьевых источников. Такими источниками могут стать культуры клеток растений.

Однако опыт получения клеточных культур показывает, что содержание в них целевых

Научный консультант: доктор биологических наук, веществ чаще всего ниже, чем необходимо для эффективного промышленного академик РАН производства этих соединений, поэтому разработка методов увеличения содержания Журавлев Юрий Николаевич БАВ в клетках растений in vitro является актуальной задачей.

Известно, что резвератрол (3,5,4’-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против нескольких видов рака, положительно влияет на сердечно

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, сосудистую систему, а также обладает высоким фармакологическим потенциалом в профессор лечении нейродегенеративных заболеваний (Shankar et al., 2007;

Vingtdeux et al., 2008).

Одинцова Нэлия Адольфовна Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как арахис, клюква и голубика, однако виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amurensis Rupr., относят к кандидат биологических наук, основным источникам резвератрола. В растениях содержание этого вещества невелико, доцент поэтому получать резвератрол из растений невыгодно. Синтетические аналоги БАВ Кожемяко Валерий Борисович часто содержат токсичные примеси. Клеточные культуры винограда, при условии их высокой целевой продуктивности, могли бы стать альтернативным источником резвератрола.

Клеточные культуры растений, трансформированные генами rol из Agrobacterium

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики rhizogenes, уже давно привлекали внимание биотехнологов вследствие повышенной СО РАН, г. Новосибирск способности продуцировать самые разнообразные вторичные метаболиты (Bulgakov, 2008). Так, недавно был показан стимулирующий эффект трансформации Rubia cordifolia геном rolB на синтез антрахинонов в культурах клеток этого растения (Bulgakov et al., 2002). Однако механизм активации биосинтеза вторичных метаболитов в культурах клеток, трансформированных геном rolB агробактерий, не изучен.

Понимание этого механизма имеет фундаментальное и прикладное значение. Новые данные о протекании процессов онкогенеза у растений и влиянии белка RolB на метаболизм растительных клеток позволят расширить знания об общих принципах

Защита состоится «26» февраля 2010 г. в «10» часов на заседании регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, что важно для промышленного диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН получения ценных БАВ.

Цель и задачи исследования. Цель работы – получение культуры клеток по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, факс: (4232) V. amurensis с высоким содержанием резвератрола, а также исследование 310- биохимических механизмов активации биосинтеза резвератрола в полученных клетках.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО 1. Оценить эффективность классических биотехнологических приемов, РАН. направленных на увеличение продукции резвератрола клеточной культурой V. amurensis.

2. Трансформировать клетки культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes и

Автореферат разослан «18» января 2010 г. оценить биосинтез резвератрола в трансгенных клеточных линиях.

3. Изучить механизм влияния трансформации культуры клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.

Основные положения, выносимые на защиту.

Ученый секретарь 1. Воздействие различных элиситоров, добавление фенилаланина в питательные диссертационного совета, среды, а также селекция на фторфенилаланине приводят к увеличению продукции кандидат биологических наук транс-резвератрола культурой клеток V. amurensis, однако уровень биосинтеза этого Музарок Т. И. вещества остается недостаточным для промышленного использования полученных клеточных линий.

4 Благодарности. Автор искренне благодарит научного руководителя академика 2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes приводит к активации биосинтеза транс-резвератрола и накоплению больших Журавлева Ю.Н. за всестороннюю помощь и поддержку, к.б.н. Киселева К.В. за количеств этого стильбена в полученных трансгенных клеточных линиях. помощь в освоении экспериментальных методов и ценные консультации на всех этапах 3. В rolB-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре работы, чл.-корр. Булгакова В.П. за ценные консультации в работе. Автор признателен V. amurensis, обработанной салициловой кислотой (SA), дифференциально увеличена Исаевой Г.А., Чернодед Г.К. и Черкавской Г.Д за помощь в работе с культурами клеток экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, таких как растений. Также автор выражает глубокую признательность Веселовой М.В. и фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS). При этом влияние SA и Федорееву С.А. (ТИБОХ ДВО РАН) за проведение ВЭЖХ анализов.

трансформации геном rolB на экспрессию генов PAL и STS в культурах клеток V.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ amurensis значительно различается.

4. Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект Дикорастущие растения винограда амурского Vitis amurensis Rupr. (Vitaceae) были трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола. собраны на юге Приморского края Дальнего Востока России и определены в 5. Трансформация геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов лаборатории геоботаники БПИ ДВО РАН. Каллусные культуры V1, V2 и V3 получены Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK), а также приводит к появлению транскриптов из молодых стеблей взрослых растений. Каллусы культивировали в пробирках CDPK с необычными модификациями последовательности Ser/Thr-киназного домена. размером 20020 мм с 15 мл агаризованной среды WB/A (Bulgakov et al., 1998) с Научная новизна. Впервые изучено влияние трансформации растительных клеток добавлением 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина и 2.0 мг/л -нафтилуксусной кислоты, в темноте при 24-25oС. Для экспериментов использовали каллусные агрегаты клеточных геном rolB из A. rhizogenes на биосинтез стильбенов. В клеточной культуре V.

amurensis, активно экспрессирующей ген rolB, продукция транс-резвератрола клетками культур, начальный вес которых составлял около 0.2 г. Интервал субкультивирования составила 111.5 мг/л среды или 1431.3 мкг/г сырого веса клеток (2.32% от сухого веса составлял 35 дней.

клеток), что значительно превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол- Растворы метилжасмоната (MeJA) и салициловой кислоты (SA) добавляли в продуцирующих клеточных культур растений. Впервые показано, что трансформация культуральные среды, как было описано ранее (Bulgakov et al., 2002) в необходимых растительных клеток геном rolB и обработка SA по-разному влияют на экспрессию концентрациях. Фенилаланин (Phe) и нитропруссид натрия (SNP) растворяли в генов PAL и STS. Впервые показано, что трансформация культур клеток растений геном стерильной дистиллированной воде и добавляли в культуральные среды после rolB из A. rhizogenes значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK и автоклавирования в асептических условиях. Фениларсин оксид (PAO), а также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями нифлюмовую кислоту (NA) растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и добавляли в последовательностей Ser/Thr-киназного домена. питательные среды после автоклавирования в асептических условиях. Эквивалентные Теоретическая и практическая значимость работы. количества DMSO были добавлены в питательную среду для контрольной культуры Полученные результаты важны для понимания протекания процессов онкогенеза у клеток. Ортованадат натрия (SOV), хлористый лантан (LaCl3) и верапамил (VER) растений, механизма действия гена rolB A. rhizogenes на метаболизм трансгенных растворяли в стерильной дистиллированной воде и добавляли в культуральные среды растительных клеток, а также принципов регуляции биосинтеза стильбенов. Понимание до автоклавирования и до измерения pH среды. p-фтор-DL-фенилаланин (PFP) растворяли в горячей воде (50oС) и добавляли в питательные среды после этих процессов необходимо для решения практических задач биотехнологии растений.

Запатентован новый способ получения резвератрола, основанный на получении rolB- автоклавирования в стерильных условиях. Клеточные агрегаты культуры V трансгенных клеточных культур V. amurensis (Патент РФ № 2326165). поддерживали на среде, содержащей 30 и 100 мг/л PFP, как описано ранее (Bulgakov et Апробация работы. al., 2001). Фирма-производитель SNP, PAO, NA, DMSO, SOV и LaCl3 – ICN Результаты работы были представлены на Всероссийском конкурсе Pharmaceuticals (Коста-Меса, США). Фирма-производитель MeJA, Phe и PFP – Sigma инновационных проектов "Живые системы" (г. Киров, 2005);

на 10-й Пущинской (Сант Луис, США). Фирма-производитель SA – Serva (Хаапподж, США).

школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006);

на rolB-трансгенные каллусные культуры VB1 и VB2 были получены в результате XI Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии трансформации суспензионной культуры V2 штаммом GV3101 A. tumefaciens, несущим и биологии (Владивосток, 2007);

на IX Международной конференции "Биология клеток бинарную векторную конструкцию pPCV002-CaMVB/pMP90RK (Spena et al., 1987), растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008);

на Международном Симпозиуме согласно ранее описанной методике (Bulgakov et al., 1998). В конструкции pPCV002 по достижениям в биохимической инженерии (Китай, 2009);

на 4-й Международной CaMVB ген rolB находится под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии капусты (CaMV). Контрольная культура VV получена в результате кокультивации суспензионной культуры V2 со штаммом GV3101 A. tumefaciens, несущим конструкцию (Польша, 2009).

Публикации. содержащую только селективный маркер pPCV002/pMP90RK, (ген По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в ведущих неомицинфосфотрансферазы nptII), согласно описанной методике (Bulgakov et al., рецензируемых научных журналах и один патент. 1998). рМР90RK – vir-хелперная плазмида, кодирующая полный состав vir-белков.

Структура и объем работы. Образцы растительной ДНК выделяли из культур клеток по опубликованной методике Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа (Киселев и Булгаков, 2009). Тотальную РНК экстрагировали из клеточных культур на изложена на 117 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 13 таблиц. 35 день культивирования при помощи набора YellowSolve (Clonogen, Санкт-Петербург, Список литературы насчитывает 186 наименований. Россия) по методике, описанной производителем, либо при помощи метода с 6 использованием LiCl, оптимизированного для работы с тканями растений, богатыми Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической вторичными метаболитами (Bekesiova et al., 1999). Комплементарную ДНК (кДНК) разницы во всех экспериментах.

получали, используя 1-3 мкг тотальной РНК, с помощью набора для обратной РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ транскрипции (Силекс M, Москва, Россия) по опубликованной методике (Gorpenchenko Характеристика нетрансгенных клеточных культур V. amurensis et al., 2006). Две пары праймеров были использованы для амплификации фрагментов гена rolB длиной 623 пн и 200 пн (номер доступа в GenBank K03313). ПЦР проводили Каллусные культуры V1, V2 и V3 представляют собой рыхлую активно растущую по опубликованной методике (Bulgakov et al., 2005). Участок транскриптов гена гомогенную ткань, не проявляющую тенденции к дифференциации. С помощью ВЭЖХ VaActin1 длиной 303 пн был амплифицирован с использованием праймеров, дизайн было показано, что в каллусах присутствуют такие стильбены как транс-резвератрол, которых был сделан на основе последовательности гена актина V. vinifera (номер пицеатаннол и ампелопсин А. Содержание резвератрола достигало 0.026% от сухого доступа в На основе анализа аминокислотных веса клеток в культуре V2 (табл. 1). Пицеатаннол и ампелопсин присутствовали в GenBank AY680701).

последовательностей генов PAL из разных видов растений были разработаны исследуемых образцах в следовых количествах. Таким образом, данные ВЭЖХ вырожденные праймеры для амплификации фрагментов PAL из V. amurensis длиной 266 показали, что транс-резвератрол является доминирующим стильбеном в культурах V1, пн. Для амплификации фрагментов генов STS длиной 461 пн были разработаны V2 и V3, однако содержание его невелико. Наибольшую продукцию резвератрола вырожденные праймеры на основе анализа аминокислотных последовательностей STS наблюдали в культуре V2 (табл. 1), поэтому именно эта клеточная культура разных видов растений сем. Vitaceae. Амплификацию участков генов CDPK использовалась для дальнейших экспериментов.

Таблица V. amurensis проводили, используя вырожденные праймеры, разработанные на основе Прирост биомассы, содержание и продукция резвератрола в каллусных культурах сравнения аминокислотных последовательностей CDPK из разных видов растений.

V. amurensis.

Последовательности праймеров и особенности проведения ПЦР представлены в диссертации. Полученные ампликоны генов rolB, PAL, STS и CDPK были выделены из транс-резвератрол, Сырая Сухая Продукция транс геля при помощи набора Glass Milk (Силекс M, Москва, Россия). Последовательности Культура % от сухого веса биомасса, г/л биомасса, г/л резвератрола, мг/л генов PAL, STS и CDPK переносили в вектор pTZ57R/T согласно протоколу фирмы- клеток производителя (Fermentas, Вильнус, Литва). ПЦР продукты VaActin1, rolB PAL, STS и V1 218.6±19.1 10.3±0.7 0.004±0.002 0. CDPK были секвенированы с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit V2 231.7±26.1 9.8±0.7 0.026±0.010 2. (Perking-Elmer Biosystems, Форстер, Канада), следуя протоколу и рекомендациям V3 192.3±12.4 8.8±0.5 0.022±0.009 1. изготовителя. После очистки этанолом последовательности были секвенированы на ABI Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Увеличение продукционных характеристик клеточной культуры V 310 Genetic Analyser (Perking-Elmer Biosystems). Для оценки суммарной экспрессии Салициловую кислоту (SA) причисляют к стрессовым фитогормонам. Это хорошо генов PAL, STS и CDPK, а также экспрессии гена rolB, в разных культурах клеток, известный, хотя и не универсальный, индуктор синтеза защитных вторичных использовали полуколичественную обратно-транскрипционную ПЦР (OT-ПЦР) и метаболитов в растениях (Zhao et al., 2005). При добавлении SA в питательные среды технологию микрочипов с DNA 1000 LabChip® kit на Agilent 2100 Bioanalyzer общая продукция резвератрола культурой V2 возросла в 2.5 раза (табл. 2).

(Германия). Данные представлены как относительные флуоресцентные единицы, Таблица нормализованные к экспрессии гена VaАctin1. Экспрессию отдельных генов семейств Влияние различных эффекторов на рост и биосинтез стильбенов в клеточной культуре V2.

PAL, STS и CDPK оценивали количественно, основываясь на данных о количестве Эффектор Phe (мМ) SA (мкМ) MeJA (мкМ) SOV (мМ) SNP (мМ) клонов каждого транскрипта, полученных с помощью секвенирования, и данных о Концентрации 0 0.1 0 50 0 50 0 0.1 0 0. суммарной экспрессии этих генов, полученных с помощью микрочиповой технологии 129 107 274 239 184 84 156 91 231 на Bioanalyzer. Относительные единицы рассчитывали следующим образом: Сырая биомасса, г/л ±8 ±4* ±9 ±15 ±11 ±12** ±6 ±14** ±8 ±5** нормализованная к экспрессии гена VaActin1 суммарная экспрессия генов PAL, STS и Сухая биомасса, г/л 6.7 6.0 10.8 10.5 8.1 5.5 6.8 5.2 8.4 4. CDPK умноженная на процент клонов каждого транскрипта и деленная на 100 (Киселев транс-резвератрол, и др., 2008). Кроме того, экспрессию отдельных генов семейств PAL, STS и CDPK % от сухого веса 0.043 0.050 0.017 0.045 0.039 0.058 0.035 0.036 0.036 0. оценивали количественно с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ). ПЦР РВ клеток генов PAL, STS и CDPK была выполнена согласно методике, описанной Giulietti с Продукция транс-резвератрола, 2.88 3.00 1.85 4.73 3.16 3.19 2.38 1.87 3.02 6. соавторами (2001). Геноспецифичные пары праймеров, TaqMan пробы и особенности мг/л проведения ПЦР РВ представлены в диссертации.

Данные представлены как среднее значение ± С.О., * р 0.05, ** р 0.01.

Определение качественного и количественного содержания стильбенов производилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в Жасмоновую кислоту (JA) и ее более активное производное, метилжасмонат лаборатории химии природных хиноидных соединений (ЛХПХС) ТИБОХ ДВО РАН в (MeJA), также причисляют к стрессовым фитогормонам. MeJA повысил содержание соответствии с опубликованной методикой (Fedoreyev et al., 2005;

Kiselev et al., 2007).

резвератрола в клетках V2 в 1.5 раза, но суммарная продукция резвератрола при этом не Результаты были обработаны при помощи программы Statistica, версия 8.0. Все увеличилась из-за значительного ингибирования роста клеток (табл. 2). Тассони с данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка измерений (С.О.).

соавторами (Tassoni, et al., 2005) сообщают, что ортованадат натрия (SOV) Значимость полученных данных оценивали по спаренному критерию Стьюдента.

8 стимулировал продукцию цис-резвератрола суспензионной культурой клеток V. vinifera клеточные линии, быстрорастущая VB1 и умереннорастущая линия VB2, были cv. Barbera. По нашим данным SOV ингибирует прирост биомассы клеточной культуры выбраны для дальнейших исследований (табл. 3).

V2 и не влияет на содержание резвератрола (табл. 2). Известно, что нитропруссид Экспрессию гена rolB в культурах винограда оценивали при помощи OT-ПЦР натрия (SNP), донор NO, способен индуцировать работу NO-синтазной сигнальной путем сравнения с экспрессией гена актина V. amurensis (рис. 1 а). Визуальная оценка системы растений и накопление некоторых вторичных метаболитов (Zhao et al., 2005). результатов электрофореза (рис. 1 а) соответствует результатам количественного Несмотря на значительное ингибирование роста культуры V2, суммарная продукция анализа ПЦР проб, полученных с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (рис. 1 б).

резвератрола клетками при концентрации SNP 0.1 мМ возросла в 2 раза (табл. 2). Оказалось, что ген rolB в культуре VB1 экспрессируется на низком уровне, в то время Присутствие Phe – важный фактор для биосинтеза стильбенов, однако экзогенный Phe как в культуре VB2 экспрессия гена rolB выше более чем в 40 раз.

незначительно влиял на продукцию стильбенов в культуре V2 в наших опытах (табл. 2).

Известно, что отбор клеток устойчивых к фторфенилаланину (PFP), аналогу Phe, может приводить к аккумуляции больших количеств ароматических соединений в культуре растительных клеток (Quesnel and Ellis, 1989). В результате трехмесячной селекции культуры V2 на средах с добавлением PFP в концентрации 100 мг/л была получена линия V2F. Продукция резвератрола клетками полученной линии возросла в 11 раз по сравнению с контролем и составила 16.53 мг/л (0.257% от сухого веса клеток).

Результаты вышеописанных экспериментов подтверждают результаты других авторов о том, что высокая продукция резвератрола и его производных культурами клеток растений не может быть обеспечена обработкой элиситорами (Ku et al., 2005;

Tassoni et al., 2005). Мы исключаем возможность того, что низкая продукция резвератрола клеточными культурами V. amurensis вызвана низким пулом предшественников резвератрола в исследуемых клетках, поскольку добавление Phe в Рис. 1. Оценка уровня экспрессии гена rolB в трансгенных культурах V. amurensis: а – культуральные среды и селекция клеток культуры V2 на средах, содержащих PFP, были электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов rolB и VaActin1;

б – количественный анализ малоэффективны. продуктов ПЦР гена rolB в культурах, проведенный с помощью технологии микрочипов. VV – Характеристика трансгенных клеточных культур V. amurensis векторная культура, VB1 и VB2 – rolB-экспрессирующие культуры, М – маркер молекулярных весов, Pc – позитивный контроль (плазмида pPCV002-CaMVB), Nc – негативный контроль (ПЦР Трансгенные культуры клеток VV, VB1 и VB2 были получены с помощью смесь без кДНК).

агробактериальной трансформации клеточной культуры V2. Культура клеток VV (контрольная), которая была трансформирована штаммом A. rhizogenes, не содержащим Данные ВЭЖХ показывают, что содержание транс-резвератрола в rolB гена rolB, обладает схожими морфологическими, ростовыми и биосинтетическими трансгенных культурах клеток VB1 и VB2 значительно превышает содержание этого характеристиками с культурой клеток V2 (табл. 1, табл. 3). Это свидетельствует о том, вещества в контрольной культуре клеток VV (табл. 3). Других стильбенов, кроме что процесс трансформации не является причиной морфологических и биохимических транс-резвератрола, в клетках культур VB1 и VB2 обнаружено не было. Показано, что изменений в rolB-культурах.

рост VB2 клеточной культуры значительно снижен по сравнению с ростом контрольной Таблица клеточной культуры, в то время как рост культуры клеток VB1 находится на уровне Накопление биомассы, содержание и продукция резвератрола трансгенными клеточными контроля (табл. 3). Содержание резвератрола в клеточной культуре VB2 на два порядка культурами V. amurensis.

Культура Сырая Сухая Продукция Продукция транс- превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол-продуцирующих клеточных транс биомасса, биомасса, резвератрол, резвератрола, мкг/г транс- культур растений (Sgarbi et al., 2003;

Ku et al., 2005;

Tassoni et al., 2005). Необходимо г/л г/л % от сухого резвератрола, сырого веса клеток отметить, что представленные в данной работе эксперименты были проведены в веса клеток мг/л течение двух лет после формирования стабильных каллусных фенотипов rolB VV 184.1±11.5 7.8±0.3 0.018±0.007 1.4 7. трансгенных культур клеток. Все это время содержание резвератрола в VB2 культуре VB1 170.6±15.3 8.6±0.4 0.232±0.120* 20.0 116. клеток было стабильно высоким, варьируя от 1.34% до 3.15% от сухого веса клеток VB2 77.9±6.9** 4.8±0.3** 2.323±0.356** 111.5 1431. (табл. 3, рис. 2, рис. 7). Однако после двух лет культивирования продуктивность Данные представлены как среднее значение ± С.О. * р – 0.05, ** – р 0.01.

культуры VB2 начала постепенно снижаться (данные не представлены). В культуре клеток VB1, в течение двух лет после получения, содержание резвератрола Первоначально для каллусов, трансформированных геном rolB, было характерно варьировало от 0.006% до 0.561% от сухого веса клеток (табл. 3, рис. 2, рис. 7), высокое морфологическое разнообразие и различный рост. Кроме нормального рыхлого повышаясь с течением времени. Нам не известна точная причина флуктуаций в каллусного фенотипа, характерного для V2 и VV культур, в rolB-трансгенных содержании резвератрола в клетках rolB-трансгенных культур. Возможно, что одна из культурах наблюдали формирование плотного глобулярного каллуса. Только после причин этого явления – наличие клеточных популяций с разным уровнем экспрессии отбора в течение полугода более рыхлых и активно растущих клеточных агрегатов, трансгена в исследуемых культурах, и, вероятно, размер таких популяций может произошло формирование стабильных каллусных фенотипов. Две характерные варьировать по причине случайной селекции. Для выяснения точных причин этого 10 явления необходимо отдельное исследование. Высокое содержание резвератрола, контроле (рис. 3 а, б). Интересно, что в то время как продуктивность VB2 культуры наблюдаемое в VB2 культуре, показывает, что запас предшественников резвератрола в клеток на два порядка превышает продуктивность контрольной культуры, суммарная клетках достаточен для синтеза стильбенов. Исходя из этого, возможно предположить экспрессия генов PAL и STS в rolB-трансгенных клетках изменяется не столь существование регуляторного механизма, который способен сдерживать синтез значительно.

резвератрола нетрансформированными клетками V. amurensis в условиях среды без какого-либо стрессового воздействия.

Влияние ингибитора Tyr-фосфатаз фениларсиноксида на рост и содержание резвератрола в клеточных культурах V. amurensis Известно, что белок RolB обладает Tyr-фосфатазной активностью (Filippini et al., 1996). Чтобы показать, действительно ли значительное увеличение продукции резвератрола rolB-трансгенными клетками обусловлено действием RolB как Tyr фосфатазы, мы решили исследовать влияние ингибитора Tyr-фосфатаз фениларсин оксида или PAO (Olivari et al., 2000) на рост и аккумуляцию резвератрола в контрольной и rolB-трансгенных культурах V. amurensis. В присутствии PAO частично снималось подавляющее действие трансформации геном rolB на прирост сырой биомассы культур VB1 и VB2 (рис. 2 а), а также снижался стимулирующий эффект трансформации геном rolB на продукцию резвератрола (рис. 2 б).

а б Рис. 3. Оценка суммарной экспрессии генов PAL и STS в трансгенных культурах V. amurensis:

Контроль Контроль а – электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов генов VaPAL, VaSTS и VaActin1;

б – Резвератрол, % от сухого веса клеток 2, 200 2. PAO количественный анализ продуктов ПЦР генов VaPAL и VaSTS, проведенный с помощью PAO Сырая биомасса, г/л технологии микрочипов. VV – векторная культура, VB1 и VB2 – rolB-экспрессирующие культуры.

** 1, 3 и 5 – ПЦР продукты, полученные с использованием 0.5 мкл препаратов кДНК из культур VV, 1, 1. ** 100 VB1 и VB2, разведенных водой (1:4);

2, 4 и 6 – 0.5 мкл неразведенных препаратов кДНК из 1 культур VV, VB1 и VB2. М – маркер молекулярных весов, Pс – позитивный контроль (плазмидные 50 ДНК, содержащие кДНК генов VaPAL, VaSTS и VaActin1), Nс – негативный контроль (ПЦР смесь 0. 0, без кДНК). Данные получены из трех независимых экспериментов и представлены как среднее 0 0 значение ± С.О., ** р 0.01.

VV VB1 VB2 VV VB1 VB Рис. 2. Влияние ингибитора фосфатаз PAO на рост (а) и аккумуляцию резвератрола (б) в ОТ-ПЦР продукты были клонированы, и для каждой из трех культур клеточных культурах V. amurensis. VV – векторная культура, VB1 и VB2 – rolB-экспрессирующие секвенировано от 36 до 97 клонов генов PAL и STS. Экспрессию отдельных генов культуры. Данные представлены как среднее значение ± С.О., ** p 0.01. семейств PAL и STS (рис. 4) оценивали, основываясь на данных о количестве клонов каждого транскрипта в исследуемых пробах и данных о суммарной экспрессии генов Это говорит о том, что дефосфорилирование Tyr остатков вовлечено в PAL и STS (рис. 3). Показано, что суммарная экспрессия генов PAL увеличена в rolB стимулирующее действие гена rolB на аккумуляцию резвератрола клетками трансгенных культурах V. amurensis за счет значительного повышения уровня V. amurensis. Таким образом, можно предположить, что компонент сигнальной сети, экспрессии генов VaPAL1 и VaPAL2 (рис. 4 а). Экспрессия VaPAL3 увеличивалась в контролирующий биосинтез стильбенов в клетках V. amurensis, регулируется VB1 культуре и не изменялась в VB2 культуре клеток (рис. 4 а).

фосфорилированием/дефосфорилированием по Tyr прямо или опосредованно. а б Вероятно, белок RolB способствует ослаблению действия этого компонента, Экспрессия генов PAL, отн.ед.

0,6 0, 0. 0. Экспрессия генов STS, отн.ед.

стимулируя таким образом биосинтез резвератрола. 0, 0. Экспрессия генов PAL и STS в контрольной и rolB-трансгенных клеточных 0, 0. 0, 0. культурах V. amurensis VaSTS PAL VaSTS 0, 0.3 PAL Фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS) – ключевые ферменты 0.2 VaSTS2,4,5, 0, PAL VaSTS 0, 0. в биосинтезе резвератрола. Суммарная экспрессия генов PAL и STS в культурах клеток 0. 0, 0. 0, VV, VB1 и VB2 была определена с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием вырожденных праймеров. Визуальная оценка результатов VV VB1 VB2 электрофореза (рис. 3 а) соответствует результатам количественного анализа ПЦР проб, VV VB1 VB проведенного с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (рис. 3 б). Оказалось, что Рис. 4. Экспрессия отдельных генов семейств PAL (а) и STS (б) в культурах клеток VV, VB1 и суммарная экспрессия генов семейства PAL в культуре клеток VB1 выше в 2.3 раза, а в VB2 V. amurensis.

VB2 выше в 3.8 раза, чем в культуре VV (рис. 3 а, б). Суммарная экспрессия генов семейства STS в культуре клеток VB1 выше в 1.3 раза, а в VB2 выше в 1.9 раз, чем в 12 Уровень суммарной экспрессии генов семейства STS увеличен не только за счет повышения экспрессии гена VaSTS1, но и за счет увеличения экспрессии пяти генов Экспрессию отдельных генов VaPAL исследовали с помощью анализа частоты STS: VaSTS2, VaSTS3, VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS7 (рис. 4 б). Значения экспрессии генов встречаемости различных транскриптов PAL в ОТ-ПЦР-продуктах (рис. 6 а). Как в VaSTS2, VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS7 объединены на графике, поскольку только контрольной культуре VV, так и при обработке клеток этой культуры SA, наблюдали экспрессия VaSTS1 и VaSTS3 выше фоновой. Важно отметить, что уровень экспрессии экспрессию пяти генов PAL. Доля транскриптов VaPAL1 была наибольшей во всех VaSTS6 значительно не изменялся во всех исследуемых культурах. Экспрессию генов исследуемых образцах. Экспрессия VaPAL3 достоверно возрастала под воздействием PAL и STS определяли также с помощью ПЦР РВ (данные представлены в SA (300 мкМ), в то время как экспрессия VaPAL1, VaPAL2, VaPAL4 и VaPAL диссертации). Полученные данные ПЦР РВ подтвердили вышеописанные результаты. значительно не изменялась. ПЦР РВ подтвердила полученные данные (результаты ПЦР Необходимо отметить, что, согласно данным ПЦР РВ, экспрессия VaPAL3 значительно РВ представлены в диссертации). При добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные не изменялась в исследуемых клеточных культурах. среды суммарная экспрессия генов VaSTS увеличивалась, однако наблюдаемое Таким образом, RolB прямо или опосредованно активирует экспрессию увеличение не было достоверным (рис. 5 а, б). Экспрессию отдельных генов VaSTS большинства известных нам для V. amurensis генов PAL и STS, но в разной степени. исследовали с помощью анализа частоты встречаемости различных транскриптов STS в Интересно, что в контрольной культуре VV наблюдается довольно высокий уровень ОТ-ПЦР-продуктах (рис. 6 б). В SA-обработанных клетках значительно увеличивалась суммарной экспрессии генов PAL и STS (рис. 3), в то время, как содержание экспрессия VaSTS2, VaSTS3 и VaSTS6. При добавлении 300 мкМ SA в питательные резвератрола низкое. среды доля транскриптов VaSTS2 и VaSTS6 была высокой и сравнима с долей Влияние салициловой кислоты на экспрессию генов PAL и STS в контрольной транскриптов VaSTS1 (рис. 6 б), в то время как в rolB-трансформированных клетках культуре клеток V. amurensis экспрессия VaSTS6 не изменялась, а экспрессия VaSTS2 увеличивалась только в VB В настоящей работе установлено, что салициловая кислота (SA) оказала культуре (рис. 4 б).

а б наибольшее влияние на биосинтез резвератрола клетками V. amurensis по сравнению с Экспрессия генов STS, отн. ед.

Экспрессия генов PAL, отн. ед.

Phe, MeJA и SOV (табл. 2). Мы провели анализ экспрессии генов VaPAL и VaSTS при 0, 0,3 0. 0.3 VaSTS культивировании культуры VV на питательных средах с добавлением SA с целью VaSTS VaPAL сравнения действия этого фитогормона и трансформации геном rolB на экспрессию ** VaSTS 0. 0, 0, 0.2 VaPAL2 VaSTS ключевых генов биосинтеза резвератрола в клетках V. amurensis. Культура клеток VV * VaPAL3 VaSTS являлась контрольной при изучении экспрессии VaPAL и VaSTS в rolB-трансгенных * VaPAL4 VaSTS 0. 0, 0, 0. клеточных культурах, поэтому мы ее используем для изучения влияния SA на VaPAL5 VaSTS * * экспрессию этих генов в клетках V. amurensis. При добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные среды суммарная экспрессия генов VaPAL значительно не изменялась К 50 мкM 300 мкM К 50 мкM 300 мкM (рис. 5 а, б).

Рис. 6. Экспрессия отдельных генов семейств PAL (а) и STS (б) в культуре клеток VV без добавления SA (К), а также при добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные среды. Данные получены из двух независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О., * р 0.05, ** р 0.01.

Также при воздействии SA наблюдали экспрессию генов VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS8, транскрипты которых не были обнаружены в контроле. ПЦР РВ подтвердила полученные данные (результаты ПЦР РВ представлены в диссертации).

Таким образом, обработка клеток SA и трансформация их геном rolB действуют по разному на экспрессию генов PAL, и некоторых генов STS (VaSTS1, VaSTS3 и VaSTS6) в клетках V. amurensis (рис. 5, рис. 6). Возможно, что SA и белковый продукт гена rolB индуцируют биосинтез и накопление резвератрола, действуя через различные регуляторные пути. Известно, что PAL могут участвовать в процессах одревеснения Рис. 5. Оценка суммарной экспрессии генов PAL и STS в культуре клеток VV при добавлении (Raes et al., 2003), или в биосинтезе стресс-гормонов (Chaman et al., 2003), поэтому не в питательные среды 50 и 300 мкМ SA: а – электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов удивительно, что гены биосинтеза стильбенов могут активно экспрессироваться в генов VaPAL, VaSTS и VaActin1;

б – количественный анализ продуктов ПЦР генов VaPAL и VaSTS, клетках, где содержание резвератрола низкое (рис. 5, рис. 6). Основываясь на анализе проведенный с помощью технологии микрочипов. К, 50 и 300 – 0.5 мкл препаратов кДНК полученных результатов и литературных данных, мы предполагаем, что белковые культуры VV, разведенных водой (1:4), без добавления SA (К), а также при добавлении 50 и продукты генов VaSTS1, VaSTS6 и VaPAL3 выполняют функции, не связанные с мкМ SA. М – маркер молекулярных весов, Pс – позитивный контроль (плазмидные ДНК, синтезом резвератрола, или обладают низкой молекулярной активностью его содержащие кДНК генов VaPAL, VaSTS и VaActin1), Nс – негативный контроль (ПЦР смесь без биосинтезе.

кДНК). Данные получены из двух независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О.

14 Влияние ингибиторов Сa2+-каналов на прирост биомассы и синтез приводило к значительному снижению аккумуляции резвератрола в rolB-трансгенных резвератрола в каллусных культурах V. amurensis культурах клеток (рис. 7 г, д, е). Необходимо отметить, что в экспериментах с VER, Для изучения взаимосвязи стимулирующего действия трансформации клеток LaCl3 и NA содержание резвератрола в культуре клеток VV было значительно ниже, V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола с уровнем концентрации Сa2+ в чем в культурах VB1 и VB2, либо стильбенов не было обнаружено вовсе (рис. 7 г, д, е).

цитоплазме мы исследовали влияние ингибиторов Сa2+-каналов на рост и биосинтез Результаты экспериментов с ингибиторами Ca2+-каналов показывают, что ингибирование притока Ca2+ в цитоплазму блокирует активную продукцию резвератрола в трансгенных и контрольной культурах клеток (рис. 7).

резвератрола rolB-трансгенными культурами клеток V. amurensis, а значит активация Сухая биомасса VV VB1 VB2 VB1 VB2 1, 10 Резвератрол аккумуляции резвератрола, вызванная трансформацией клеток V. amurensis геном rolB, Резвератрол, % от сухого Сырая биомасса, г/л VV Сухая биомасса, г/л зависит от поступления Ca2+ в клетку. Мы предполагаем, что активный биосинтез 1, 120 * веса клеток резвератрола в rolB-трансгенных культурах клеток является Ca2+-зависимым процессом.

* 0, Оказалось, что рост rolB-трансгенных культур более устойчив к LaCl3 и VER, чем рост контрольной культуры (рис. 7), что коррелирует с данными Булгакова с соавторами ** 0, 40 (Bulgakov, et al., 2003): рост rolB-трансгенной клеточной культуры R. сordifolia был ** более устойчив к LaCl3 и VER по сравнению с контролем. Предположительно, в rolB 0 0,5 1 0 0,5 1 0 0,5 0 0,5 1 0 0,5 1 0 0,5 трансгенных клеточных культурах нарушен гомеостаз Ca2+.

г VER, мМ а VER, мМ Экспрессия генов CDPK в клеточных культурах V. amurensis Сухая биомасса 200 VV VB1 VB2 Резвератрол Методом ОТ-ПЦР на кДНК культур VV, VB1 и VB2, используя вырожденные Резвератрол, % от сухого Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л VV VB1 VB2 1, праймеры, мы получили ампликоны CDPK ожидаемого размера (рис. 8 а).

веса клеток 1, 0, 50 ** ** 0, ** 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 LaCl3, мM д LaCl3, мМ б Сухая биомасса VV VB1 VB2 12 1, 200 Резвератрол Резвератрол, % от сухого VV VB1 VB Сухая биомасса, г/л Сырая биомасса, г/л 160 1, веса клеток 120 ** 6 0, 80 0, * 0 Рис. 8. Оценка суммарной экспрессии генов CDPK в трансгенных культурах V. amurensis: а – 0 50 0 50 0 0 50 0 50 0 е NA, мкМ NA, мкМ в электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов VaCDPK, rolB и VaActin1;

б – Рис. 7. Влияние VER, LaCl3 и NA на прирост сырой (а, б, в) и сухой (г, д, е) биомассы культур количественный анализ продуктов ПЦР генов CDPK и rolB, проведенная с помощью технологии микрочипов. VV – векторная культура, VB1 и VB2 – rolB-экспрессирующие культуры. 1 – 0.5 мкл клеток V. amurensis, а также на содержание стильбенов в исследуемых клетках (г, д, е). VV – препаратов кДНК из культур VV, VB1 и VB2, разведенных водой (1:4);

2 – 0.5 мкл неразведенных контрольная культура клеток, VB1 и VB2 – rolB-экспрессирующие клеточные культуры. Данные препаратов кДНК из культур VV, VB1 и VB2, М – маркер молекулярных весов, Pс – позитивный представлены как среднее значение ± С.О., ** р 0.01, * р 0.05.

контроль (плазмида pPCV002-CaMVB и плазмидные ДНК, содержащие кДНК генов VaCDPK и VaActin1), Nс – негативный контроль (ПЦР смесь без кДНК). Данные получены из трех Мы использовали LaCl3, общий ингибитор Ca2+-каналов (Knight et al. 1992), независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О.

верапамил (VER), ингибитор Ca2+-каналов плазматической мембраны L-типа (Pineros and Tester, 1997), а также нифлюмовую кислоту (NA), ингибитор внутренних Ca2+ В rolB-трансгенных культурах винограда VB1 и VB2 общий уровень экспрессии каналов (Cessna and Low, 2001). Показано, что рост rolB-трансгенных культур клеток генов CDPK был выше, чем в контрольной культуре, однако находился в пределах V. amurensis менее чувствителен к VER и LaCl3 по сравнению с ростом контрольной доверительного интервала (рис. 8). Ампликоны CDPK клонировали и секвенировали.

культуры клеток (рис. 7 а, б, г, д). Интересно, что добавление NA в питательные среды Проанализировано 74, 107 и 137 клонов для VB1, VV и VB2 культур клеток, не повлияло на прирост сухой биомассы культуры VV, в то время как прирост сырой соответственно (табл. 4). Кроме того, была проведена повторная оценка экспрессии биомассы был значительно ингибирован (рис. 7 в, е). Прирост сухой биомассы культур гена rolB в исследуемых культурах клеток для того, чтобы показать, изменилась ли VB1 и VB2 значительно не изменялся под влиянием NA. Таким образом, четкой экспрессия трансгена (рис. 8 б). ОТ-ПЦР анализ показал, что в клетках культуры VB корреляции между ростовой чувствительностью культур к NA и уровнем экспрессии гена rolB не наблюдается. Добавление VER, LaCl3 и NA в питательные среды 16 ген rolB по-прежнему экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с его клеток VB2, также помимо вышеназванных четырех CDPK для культуры клеток VV, экспрессией в клетках VB1 (рис. 8). обнаружено семь транскриптов: VaCDPK1е, VaCDPK3b, VaCDPK1-L1-a, VaCDPK1-L2 При анализе выведенных аминокислотных последовательностей генов CDPK b, VaCDPK1a-S2, VaCDPK3a-S1 и VaCDPK3a-S2 (табл. 4). В VB2 культуре клеток V. amurensis транскрипты CDPK разделились на три подсемейства, которые получили экспрессия VaCDPK1a увеличивается в 1.7 раза по сравнению с культурой VV.

название VaCDPK1, VaCDPK2 и VaCDPK3. Каждое подсемейство представлено Экспрессия VaCDPK1d в клеточных культурах VB1 и VB2 увеличивается в 4.2 и 8.9 раз, несколькими группами транскриптов, всего выделено 15 групп (табл. 4). Основанием соответственно;

экспрессия VaCDPK3a в культуре VB2 снижается в 1.3 раза (табл. 4).

для выделения новой группы транскриптов было отличие аминокислотной Данные об экспрессии VaCDPK2a противоречивы: в культуре клеток VB1 экспрессия последовательности секвенированного участка CDPK от других последовательностей этого гена снижается в 2.8 раза, тогда как в VB2 увеличивается в 1.8 раза по сравнению больше, чем на один аминокислотный остаток. Далее, для удобства, мы не употребляем с контролем (табл. 4). Транскрипты VaCDPK3a и VaCPK1a преобладают в кДНК пробах слово “группы” при упоминании групп транскриптов CDPK. всех исследуемых культур клеток: процентное содержание клонов VaCPK3a составило Таблица 4 44.5-72.9%, а клонов VaCPK1a – 17.6-27.7% (табл. 4). Для подтверждения и уточнения Количество и процентное содержание клонов различных транскриптов CDPK, полученных из полученных результатов экспрессию CDPK оценивали с помощью ПЦР РВ. Результаты кДНК контрольной и rolB-экспрессирующих культур клеток V. amurensis с использованием ПЦР РВ (данные представлены в диссертации) подтвердили данные, представленные в вырожденных праймеров, и экспрессия генов CDPK.

таблице 4. Необходимо отметить, что согласно ПЦР РВ экспрессия VaCDPK1a и Экспрессия CDPK, VaCDPK2a значительно не изменяется.

Число клонов CDPK (процентное относительные Транскрипты содержание) В кДНК rolB-трансформированных клеточных культур V. amurensis были найдены флуоресцентные единицы CDPK короткие транскрипты CDPK, в последовательности Ser/Thr-киназного домена которых VV VB1 VB2 VV VB1 VB отсутствует участок длиной 48, 63 или 114 нуклеотидов: VIII каталитический субдомен 0.299 0.296 0. VaCDPK1a 22 (20.6) 13 (17.6) 38 (27.7) и половина IX в VaCPK1a-S2, VI каталитический субдомен в VaCPK3a-S1 и часть VIII 0 0.024 VaCDPK1b 0 1 (1.4) каталитического субдомена в VaCPK3a-S2 (рис. 9, табл. 4). Рамка считывания при этом 0 0.045 VaCDPK1c 0 2 (2,7) 0 не сбивается (рис. 9). Кроме коротких транскриптов CDPK, в кДНК rolB-трансгенных 0.028 0.114 0.241 клеточных культурах V. amurensis нами были найдены длинные транскрипты CDPK VaCDPK1d 2 (1.9) 5 (6.8) 18 (13.1) (рис. 10, табл. 4). Все последовательности длинных транскриптов (VaCDPK1-L1-a, 0 0.024 0. VaCDPK1e 0 1 (1.4) 2 (1.5) VaCDPK1-L1-b, VaCDPK1-L2-b и VaCDPK1-L3) содержат 35 дополнительных 0 0 0. VaCDPK1a-S2 0 0 2 (1.5) нуклеотидов в последовательности VII каталитического субдомена (рис. 10). По 0 0.024 0. VaCDPK1-L1-a 0 1 (1.4) 3 (2.2) нуклеотидным последовательностям длинные транскрипты наиболее близки к 0 0.045 VaCDPK1-L1-b 0 2 (2.7) 0 транскрипту VaCDPK1a. Наиболее яркой отличительной особенностью VaCDPK1-L1-a 0.013 и VaCDPK1-L1-b от других транскриптов с вставками является отсутствие пяти VaCDPK1-L2-b 0 1 (1.4) 1 (0.7) 0 0. нуклеотидов в промежуточной области между V и VI субдоменами (рис. 10).

0 0.024 VaCDPK1-L3 0 1 (1.4) 0.068 0.024 0. VaCDPK2a 5 (4.7) 1 (1.4) 9 (6.6) 1.057 1.021 0. VaCDPK3a 78 (72.9) 45 (60.8) 61 (44.5) 0 0 0. VaCDPK3b 0 0 1 (0.7) 0 0.012 0. VaCDPK3a-S1 0 1 (1.4) 1 (0.7) 0 0 0. VaCDPK3a-S2 0 0 1 (0.7) Суммарная экспрессия генов CDPK, относительные 1.452 1.677 1. флуоресцентные единицы Рис. 9. Выравнивание аминокислотных последовательностей частей Ser/Thr-киназных доменов коротких транскриптов CDPK V. amurensis. VI, VII, VIII и IX – каталитические субдомены Экспрессия отдельных генов CDPK (табл. 4) просчитана на основе данных о Ser/Thr-киназного домена CDPK.

количестве клонов каждого транскрипта CDPK в кДНК-пробах различных клеточных В связи с отсутствием пяти нуклеотидов для транскриптов VaCDPK1-L1-a и культур (табл. 4) и данных о суммарной экспрессии генов CDPK (рис. 8, табл. 4). В VaCDPK1-L1-b характерно изменение рамки считывания и появление четырех стоп контрольной культуре клеток VV экспрессируются гены VaCDPK1a, VaCDPK1d, кодонов в области VI, VII субдоменов и последовательности промежуточной между VI VaCDPK2a и VaCDPK3a (табл. 4). Трансформация геном rolB привела к увеличению и VII субдоменами (рис. 10). В последовательностях VaCDPK1-L1-a и VaCDPK1-L1-b числа экспрессирующихся генов CDPK до 12 и 11 в VB1 и VB2 культурах, рамка считывания восстанавливается после 35-нуклеотидной инсерции. Для VaCDPK1 соответственно, а также к изменению уровня экспрессии некоторых генов, транскрипты L2-b характерно изменение рамки считывания после инсерции 35 нуклеотидов и которых присутствуют и в контроле (табл. 4). В кДНК-пробах культуры клеток VB1, наличие трех стоп-кодонов (рис. 10). В последовательности VaCDPK1-L3 присутствует помимо вышеназванных четырех CDPK для культуры клеток VV, показано наличие еще два стоп-кодона, и происходит изменение рамки считывания после инсерции восьми транскриптов: VaCDPK1b, VaCDPK1с, VaCDPK1е, VaCDPK1-L1-a, VaCDPK1 нуклеотидов (рис. 10). Рамка считывания восстанавливается после появления L1-b, VaCDPK1-L2-b, VaCDPK1-L3 и VaCDPK3a-S1 (табл. 4). В кДНК-пробах культуры 18 дополнительного гуанина (однонуклеотидная инсерция) между VIII и IX субдоменами, растительных клеток геном rolB. Ген VaCDPK3a, экспрессия которого уменьшалась в однако в промежуточной области между IX и X субдоменомами появляется второй rolB-трансгенных клетках, может быть также вовлечен в регуляцию различных дополнительный гуанин, в результате чего рамка считывания снова сбивается (рис. 10). клеточных процессов, таких как вторичный метаболизм, восприимчивость к ауксинам и баланс Ca2+.

Мы не можем с уверенностью говорить о точном количестве генов каждого подсемейства CDPK в геноме V. amurensis, так как геном этого растения полностью не Присутствие в кДНК пробах rolB-трансформированных культур коротких, секвенирован. Недавно были секвенированы высоко гомозиготный и гетерозиготный длинных и “химерных” транскриптов CDPK вызывает особый интерес (рис. 9, рис. 10, геномы двух сортов V. vinifera, близкого вида для V. amurensis (Jaillon et al., 2007;

табл. 4). Мы исключаем возможность аномалий прохождения легирования, клонирования или амплификации коротких и длинных транскриптов CDPK Velasco et al., 2007).

V. amurensis. Мы отметили, что количество отсутствующих нуклеотидов во всех коротких транскриптах кратно трем, и один и тот же вид модификаций был получен для разных клеточных культур V. amurensis (VaCDPK3a-S1, VaCDPK1-L1-a и VaCDPK1-L2 b) (табл. 4). Кроме того, в геноме V. vinifera обнаружена последовательность близкая к VaCDPK1-L1-a и VaCDPK1-L1-b (номер в GenBank AM427019). Известно несколько случаев подобных изменений последовательностей киназных доменов для некоторых Ser/Thr-протеинкиназ растений и животных (Xiong, Yang, 2003;

Park et al., 2006;

Kurihara et al., 2007;

Wei et al., 2007;

Laudadio et al., 2008). Однако для CDPK подобные модификации последовательностей киназного домена не были прежде описаны, и их физиологическое значение не известно. Информация об альтернативном сплайсинге транскриптов CDPK очень скудна. Нишияма с соавторами (Nishiyama, et al., 1999) сообщают о случае альтернативного сплайсинга гена CDPK, в последовательности мРНК которого были модифицированы участки, соответствующие областям связывания Ca2+. В геноме V. vinifera мы обнаружили последовательности близкие только к VaCDPK1-L1-a и VaCDPK1-L1-b из найденных нами необычных транскриптов CDPK V.

amurensis, поэтому можно предположить, что эти транскрипты не подвергались посттранскрипционным изменениям мРНК, и в геноме V. amurensis присутствуют соответствующие гены. Так как в геноме V. vinifera не обнаружено Рис. 10. Выравнивание аминокислотных и нуклеотидных последовательностей частей последовательностей близких VaCDPK1a-S2, VaCDPK3a-S1 и VaCDPK3a-S2, можно Ser/Thr-киназного домена транскриптов CDPK V. amurensis, принадлежащих к группе VaCDPK1-L. предположить, что эти транскрипты CDPK подвергались альтернативному сплайсингу, VI, VII, VIII и IX – каталитические субдомены Ser/Thr-киназного домена CDPK. Серым цветом однако это предположение требует дальнейшей проверки. Возможно, белковые выделены стоп-кодоны, стрелками обозначены однонуклеотидные инсерции.

продукты, соответствующие транскриптам VaCDPK1a-S2, VaCDPK3a-S1 и VaCDPK3a S2, в последовательностях киназного домена которых отсутствуют некоторые важные Проведя поиск среди депонированных в GenBank геномных последовательностей V. каталитические субдомены, не обладают киназной активностью, но, несмотря на vinifera, мы нашли близкие последовательности для всех описанных нами транскриптов отсутствие данной каталитической активности, могут иметь другие важные функции, в CDPK V. amurensis (идентичность нуклеотидных последовательностей 98-100%), за том числе и каталитические. Возможно, что присутствие стоп-кодонов в исключением коротких транскриптов, а также двух длинных – VaCDPK1-L3 и последовательностях длинных транскриптов CDPK V. amurensis, приводит к VaCDPK1-L2-b. Также в геноме V. vinifera мы не обнаружили транскриптов высоко образованию коротких белков CDPK, однако, с другой стороны, не исключено, что гомологичных “химерным” транскриптам V. amurensis VaCDPK1b и VaCDPK1c, транскрипты VaCDPK1-L1-a, VaCDPK1-L1-b, VaCDPK1-L2-b и VaCDPK1-L3 являются которые были получены нами из препаратов кДНК культуры клеток VB1 (табл. 4). мишенями “nonsense-mediated mRNA decay”, как это было показано для других Последовательность транскрипта VaCDPK1c с 1 по 178 нуклеотид идентична аберрантных мРНК (Baker and Parker, 2004). Функция каждого гена CDPK, экспрессия последовательности транскрипта VaCDPK1a-2, однако между 170 по 328 нуклеотидами которого изменена в rolB-экспрессирующих клетках V. amurensis, требует дальнейшего VaCDPK1c идентична транскрипту VaCDPK1d. Последовательность VaCDPK1b с 1 по исследования.

230 нуклеотид идентична VaCDPK1a, а с 214 по 328 нуклеотид идентична транскрипту VaCDPK1-L1-a, за исключением позиции 270. VaCDPK1a-1 и VaCDPK1a-2 различаются ВЫВОДЫ на один нуклеотид и принадлежат к группе транскриптов VaCDPK1a. 1. С помощью воздействия различных элиситоров, добавления Phe в питательные Таким образом, главное различие в экспрессии генов CDPK между контрольной среды и селекции на PFP можно повысить содержание стильбенов (транс-резвератрол) культурой и rolB-трансгенными заключается в том, что в rolB-культурах значительно в культуре клеток V. amurensis в 1.2-11 раз. Максимальное содержание транс изменяется сила экспрессии некоторых генов CDPK и увеличивается разнообразие резвератрола достигало 0.26% от сухого веса клеток в результате трехмесячной транскриптов CDPK (табл. 4). Мы предполагаем, что VaCDPK1d и VaCDPK1e – селекции культуры на PFP, что является недостаточным для использования культуры в кандидаты для изучения аномалий развития, механизмов ризогенеза и других биотехнологическом производстве стильбенов.

биохимических и морфологических изменений, вызываемых трансформацией 20 2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes амурского // Живые системы: Всероссийский конкурс инновационных проектов. Тезисы приводит к активации биосинтеза транс-резвератрола и накоплению больших докладов. Киров, 2005. С. 85-87.

7. Дубровина А.С., Киселев К.В., Веселова М.В., Федореев С.А., Булгаков В.П.

количеств этого стильбена rolB-трансформированными клетками в течение двух лет после формирования стабильных каллусных фенотипов. rolB-трансгенная культура, Активация синтеза резвератрола – ценного противоопухолевого полифенола в активно экспрессирующеая трансген, накапливала более 2% резвератрола от сухого трансгенных клеточных культурах Vitis amurensis // Биология – наука XXI века: X веса клеток. Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 16.

8. Дубровина А.С., Киселев К.В., Булгаков В.П. Влияние гена rolB агробактерий на 3. В rolB-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной SA, дифференциально увеличена экспрессия генов биосинтез резвератрола в культуре клеток винограда (Vitis amurensis Rupr.) // XI ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, PAL и STS. Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии и 4. Паттерны влияния трансформации клеток V. amurensis геном rolB и обработки биологии. Владивосток, 2007. С. 12-13.

9. Киселев К.В., Дубровина А.С., Булгаков В.П. Экспрессия генов кальций SA на экспрессию генов VaPAL и VaSTS значительно различаются. Это свидетельствует о том, что эти способы воздействия на клетки винограда индуцируют биосинтез и зависимых протеинкиназ в rolB-трансгенных культурах клеток винограда и женьшеня // накопление резвератрола, действуя через различные регуляторные пути. XI Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии 5. Дефосфорилирование тирозиновых остатков неизвестного белка вовлечено в и биологии. Владивосток, 2007. С. 22-23.

10. Дубровина А.С., Киселев К.В. Экспрессия генов биосинтеза резвератрола PAL стимулирующее действие трансформации клеток V. amurensis геном rolB на аккумуляцию транс-резвератрола. и STS в rolB-трансгенных клетках винограда амурского // Биология клеток растений in 6. Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект vitro и биотехнология: IX Международная конференция. Звенигород, 2008. С. 114-115.

11. Киселев К.В., Дубровина А.С., Исаева Г.А., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н.

трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.

Трансформация геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK, а Экспрессия генов CDPK и появление транскриптов CDPK с модифицированной также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательностью серин/треонин-киназного домена в rolB-трансгенных клетках последовательности Ser/Thr-киназного домена. Эти данные свидетельствуют о том, что винограда // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: IX Международная активный синтез резвератрола является Ca2+-зависимым процессом. конференция. Звенигород, 2008. С. 172-173.

12. K.V. Kiselev, A.S. Dubrovina, Y.N. Zhuravlev Regulation of resveratrol Список работ по теме диссертации: biosynthesis in grape cell cultures // International Mini-Symposium on Advances in Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах: Biochemical Engineering Sciences (ABioChES). Shanghai, 2009. P. 8.

1. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., 13. Kiselev K.V., Dubrovina A.S. Stilbene synthase gene expression in callus cultures of Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis Vitis amurensis with different levels of resveratrol production // 4th Conference of Polish transformed cells // Journal of Biotechnology. 2007. V. 128. № 3. P. 681-692. Society of Experimental Plant Biology, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. Cracow, 2. Киселев К.В., Горпенченко Т.Ю., Чернодед Г.К., Дубровина А.С., Грищенко 2009. V. 51. Suppl. 2. P. 78.

О.В., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Кальций-зависимый механизм соматического эмбриогенеза в культурах клеток женьшеня Panax ginseng, экспрессирующих онкоген rolC // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 2. С. 275-285.

3. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Bulgakov V.P. Phenylalanine ammonia-lyase and stilbene synthase gene expression in rolB transgenic cell cultures of Vitis amurensis // Applied Microbiology and Biotechnology 2009. V. 82. № 4. P. 647-655.

4. Dubrovina A.S., Kiselev K.V., Veselova M.V., Isaeva G.A., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Enhanced resveratrol accumulation in rolB transgenic cultures of Vitis amurensis correlates with unusual changes in CDPK gene expression // Journal of Plant Physiology. 2009. V. 166. № 11. P. 1194-1206.

Патент:

5. Федореев С.А., Киселев К.В., Дубровина А.С., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Патент РФ №2326165. Способ получения резвератрола.

С12N 5/04, C12N 15/05, A01H 1/04. Заявка 2006135294. Решение о выдаче патента от 19.10.2007 г.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских и международных научных конференций и симпозиума:

6. Дубровина А.С., Булгаков В.П. Активация синтеза резвератрола, ценного противоопухолевого полифенола, в трансгенных клеточных культурах винограда

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.