Разработка методов выявления генома энтеровируса и парвовирусов крс
На правах рукописи
КОЧЕТКОВ Сергей Андреевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ЭНТЕРОВИРУСА И ПАРВОВИРУСОВ КРС 03.02.02 «Вирусология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир – 2010 2
Работа выполнена в федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») Научный руководитель – доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Сухарев Олег Иванович, Российский университет Дружбы народов, г. Москва;
кандидат биологических наук Мудрак Наталья Станиславовна ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.
Ведущая организация – ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирская область)
Защита состоится «15» июня 2010 г. в 1200 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ«ВНИИЗЖ».
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте: http//www.arriah.ru.
Автореферат разослан «_» _ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент А. П. Пономарев 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания КРС наносят значительный экономический ущерб в странах с развитым скотоводством.
Инфекционные энтериты привлекают внимание ученых и практиков вследствие их широкой распространенности, полиэтиологичности, а также низкой профилактической и терапевтической эффективности проводимых мероприятий.
В настоящее время появляется все больше сообщений о том, что энтериты телят могут вызываться энтеровирусами, парвовирусами, вирусом диареи крупного рогатого скота, герпесвирусом, хламидиями, способными обуславливать заболевание самостоятельно, или в различных сочетаниях. Решение проблемы борьбы с этими болезнями осложняется преимущественно смешанной формой их течения. Нет сомнений, что одной из причин, порождающих трудности в борьбе с этими заболеваниями, является недостаток знаний об их этиологии, о свойствах агентов, их вызывающих, методах диагностики, профилактики и лечения.
Учитывая сходство в течение заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики. Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, реакция нейтрализации, не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность и чувствительность.
Несмотря на выше сказанное, до настоящего момента в Российской Федерации методы выявления и дифференциации для энтеровируса и парвовирусов КРС не разрабатывались.
Цели и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка методов выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в биологических образцах с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования, а также изучения распространённости и генетического разнообразия данных вирусов на территории Центрального федерального округа Российской Федерации (ЦФО РФ).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить первичную структуру исследуемых областей генома ранее изученных штаммов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3;
- разработать методы выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования;
- установить первичную структуру и провести сравнительный анализ амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3;
- изучить возможность применения разработанных методов для выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в материалах от естественно инфицированных животных;
- изучить распространённость и генетическое разнообразие энтеровируса и парвовирусов КРС на территории РФ с помощью разработанных метода;
Научная новизна и теоретическое значение. Разработаны методы ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО) и метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в образцах вируссодержащего материала с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования.
Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей 5' – нетранслируемой области генома полевых изолятов энтеровируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры данных фрагментов генома энтеровируса КРС. Исследованы вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами и ранее опубликованными последовательностями энтеровируса КРС. Впервые изучено распространение и генетическое разнообразие энтеровируса КРС, циркулирующего на территории РФ.
С использованием разработанного метода определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленных на территории РФ, изучено их генетическое разнообразие. Изучение парвовирусов КРС 2, 3 в РФ проводилось впервые.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработаны:
- «Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции» (2008 г.). Методика предназначена для выявления генома энтеровируса КРС в патологическом материале от КРС;
- «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, типа с помощью полимеразной цепной реакции» (2009 г.).
Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены ученым советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ».
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО;
- метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 при помощи полимеразной цепной реакции и секвенирования;
- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов энтеровируса КРС, а также его филогенетические взаимоотношения;
- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3;
- результаты применения разработанных методов выявления генома указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных животных;
- результаты исследований распространенения и генетического разнообразия энтеровируса КРС на территории Центрального Федерального округа РФ с помощью разработанного метода;
- результаты исследования генетического разнообразия парвовирусов 1, 2, 3, обнаруженных в материалах от естественно инфицированных животных на территории РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2009 г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2007 – 2009 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, две из них опубликованы в журналах «Ветеринария» и «Ветеринарная патология», которые предусмотрены перечнем ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает источников, в том числе 14 на русском языке и 112 зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Биологические материалы. В работе использованы изоляты энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленные в полевых образцах, собранных на территории Российской Федерации в 2006-2009гг. Также в работе использовали штаммы гетерологичных вирусов и инфекционных агентов, вызывающих заболевания со сходными клиническими признаками (энтеровирус свиней, парвовирус свиней, парвовирус собак, ротавирус КРС, респираторно-синцитиальный вирус КРС, инфекционный ринотрахеит КРС, парагрипп-3 КРС, вирус вирусной диареи КРС, коронавирус КРС).
Выделение суммарных нуклеиновых кислот (ДНК, РНК). Суммарную НК выделяли с помощью наборов реагентов для выделения «Пробоподготовка универсальная» (ДНК) и «Пробоподготовка РНК» (ООО «Биоком», г. Москва).
Выделение суммарной РНК с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО). В качестве ВКО использовали вирус инфекционной бурсальной болезни (ИББ) штамм Winterfield-2512. ВКО добавляли в исследуемую пробу на начальной стадии выделения РНК.
ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО. Для получения кДНК применяли реакцию обратной транскрипции, в которой на 3 мкл суммарной РНК наслаивали 20 мкл минерального масла и денатурировали прогреванием при 850С в течение 2,5 мин., после чего быстро охлаждали на льду. В пробирку с денатурированной РНК добавляли реакционную смесь, содержащую мкл пятикратного буфера для реакции обратной транскрипции, 2 мкл 10 мМ dNTP, по 1 мкл 10 пмоль праймеров EN1, EN5 (табл. 1) для синтеза кДНК фрагмента энтеровируса КРС и по 0,5 мкл 10 пмоль праймеров IS1, IS4 (табл. 2) для синтеза кДНК вируса инфекционной бурсальной болезни, 2,5 ед. обратной транскриптазы и деионизированную воду до конечного объема 25 мкл. Обратную транскрипцию проводили при температуре 420С в течение 40 мин.
Полимеразную цепную реакцию проводили в два этапа («nested» ПЦР). Для проведения первой реакции амплификации к 3 мкл продуктов реверсии добавляли реакционную смесь, содержащую 10 мкл деионизированной воды, по 1 мкл 10 пмоль праймеров EN1/EN5, по 0.5 мкл 10 пмоль праймеров IS1/ IS4, 3 мкл 25 мМ MgCl2, мкл 10 мМ dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 5мкл 5Х буфера для ПЦР. На поверхность реакционной смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Реакцию проводили при следующих температурных и временных режимах: 30 циклов при С – 30 с, 53 0С – 30 с, 72 0С – 30 с.
Для реамплификации использовали ту же реакционную смесь за исключением праймеров – EN2, EN4 (табл. 1) и IS2, IS3 (табл. 2). Реакцию проводили при следующих температурных и временных режимах: 25 циклов при 94 0С – 30 с, 57 0С – 30 с, 72 0С – 30 с.
ПЦР для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3. Для каждого из парвовирусов проводили отдельную реакцию в два этапа («nested» ПЦР).
Реакционная смесь для всех вирусов, как в первой, так и во второй реакциях составлялась аналогично, за исключением праймеров (Табл. 3). Амплификацию и реамплификацию осуществляли в реакционной смеси объёмом 25 мкл следующего состава: 11 мкл деионизированной воды, по 1 мкл 10 пмоль прямого и обратного праймера, 3 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл 10 мМ dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 5мкл 5Х буфера для ПЦР. К реакционной смеси добавляют 3 мкл раствора ДНК. На поверхность реакционной смеси наслаивают 20 мкл минерального масла.
Температурно-временные режимы: амплификация – 1 цикл, при 95 Св течение 2 мин;
30 циклов, при 940 С – 30 с, 500 С – 30 с, 720С – 40 с;
1 цикл, при 72 0С в течение 5 мин;
реамплификация – 25 циклов, при 95 0 С – 30 с, 60 0 С – 30 с, 72 0С – 40 с;
1 цикл: при 72 0С в течение 5 мин.
Электрофорез в агарозном геле. Анализ продуктов амплификации проводили методом элекрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Очистка продуктов ПЦР. Амплифицированные в ПЦР фрагменты ДНК очищали с помощью набора реактивов «Wizard® PCR Preps DNA Purification System» (Promega) согласно методике производителя.
Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК и кДНК.
Секвенирование продуктов ПЦР осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.
Расчёт эпизоотологических показателей и статистическая обработка данных. Определение требуемого объёма выборки для проведения выборочного исследования популяции крупного рогатого скота РФ по оценке превалентности по заданным критериям осуществляли по методу Cannon и Roe (1982 г.). Данный метод позволяет с 95-99% достоверностью выносить заключение о статусе исследуемого объекта.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка метода ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО Анализ нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС. Для разработки метода ПЦР с целью выявления генома энтеровируса КРС были проанализированы нуклеотидные последовательности, содержащиеся в компьютерной базе данных GenBank (www. ncbi.nlm.nih.gov). Анализ показал невозможность использования областей, кодирующих капсидные и некапсидные белки в качестве мишени для праймеров, по причине отсутствие областей, консервативных для всех штаммов энтеровируса КРС. В связи с этим, фрагмент 5' – нетранслируемой области генома был выбран в качестве мишени для ПЦР.
Выбор первичной структуры праймеров. После проведения сравнительного анализа первичной структуры выбранного фрагмента генома были сконструированы 6 праймеров, специфичных для данного вируса (табл.1).
Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления генома энтеровируса КРС Наименование праймера Последовательность нуклеотидов Локализация праймеров * EN1 5’- GTA CCT TTG TAC GCC TGT TTT -3’ 66- EN2 5’- TCA AGC ACT TCT GTT TCC CC -3’ 270- EN3 5’- CAC AAC CCC AGT GGT AGC -3’ 369- EN4 5’- GGA TTA GCA GCA TTC ACG GC -3’ 528- EN5 5’- GTC TGT TCC GCC TCC AAC TT -3’ 598- EN6 5’- GTA GTC TGT TCC GCC TCC AA -3’ 601- *соответствует нуклеотидной последовательности штамма энтеровируса K2577 (номер доступа в GenBank AF123432).
Оптимизация условий постановки ОТ ПЦР. Для увеличения чувствительности и специфичности ПЦР был разработан вариант «nested» ПЦР с двумя парами праймеров. Проверка различных комбинаций праймеров показала, что для обратной транскрипции и амплификации наиболее удачной оказалась комбинация праймеров EN1/EN5, для реамплификации – EN2/EN4.
В ходе работы были оптимизированы следующие параметры ОТ ПЦР:
Mg2+ и праймеров, количество вносимой концентрации dNTP, ионов ДНК, температурно-временные режимы реакции.
На рис. 2 показана электрофореграмма продуктов реамплификации после проведения ОТ ПЦР.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ОТ ПЦР энтеровируса КРС Цифрами и буквами обозначены дорожки: 1 – полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/1;
2 – полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/2;
3 – полевой изолят Stavrovskiy/Vladimir/2006;
4 – полевой изолят Centralnoe/N.Novgorod/2008;
5 – вода (отрицательный контроль ПЦР);
M – маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. Стрелками обозначены длины фрагментов п.н.
Специфичность разработанного метода проверили на материалах, содержащих гетерологичные вирусы, а также вирусы, вызывающие заболевания со сходными клиническими признаками. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.
В отсутствие аналогичных методов мы попытались провести сравнение разработанного нами метода, с методами, основанными на одношаговой «оne-step» ПЦР и не предполагающими прямого выявления генома вируса в патологическом материале. Воспроизведенные нами методы, предложенные Theng-Theng Fong с соавт. (2005) и Knowles (2005), не выявляли наличие генома энтеровируса в пробах.
Полученные результаты вынудили нас отказаться от дальнейшего использования ранее опубликованных методов.
Использование внутреннего контрольного образца при выявлении генома энтеровируса КРС. Для амплификации фрагмента генома ИББ была разработана система праймеров, фланкирующих фрагмент 185 п.н. (табл. 2).
ВКО добавляли в исследуемую пробу на стадии выделения РНК. Далее при составлении реакционных смесей добавляли соответствующие пары праймеров.
Таблица Структура праймеров для амплификации фрагмента генома инфекционной бурсальной болезни Наименование Первичная структура Локализация праймеров праймеров * IS1 5'- CCT ATG GAA GTG GGA CCT ACA TG -3' 580- IS2 5'- TAC ACT TTT GAG AGC ATC GCG -3' 681- IS3 5'- CTT GAT GAC TTG AGG TTG ATT TTG -3' 842- IS4 5'- ACG TTA TTT GGG CTG TTG GAC -3' 1160- *соответствует нуклеотидной последовательности инфекционной бурсальной болезни штамма Winterfield-2512 (номер доступа в GenBank AF083092).
Наличие ампликона ВКО, длиной 185 п.н. в реакционной смеси свидетельствовало о нормальном прохождении выделения РНК, реакций обратной транскрипции и амплификации, а также об отсутствия ингибиторов ПЦР (Рис 3).
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ОТ ПЦР энтеровируса КРС с использованием ВКО Цифрами и буквами обозначены дорожки: 1 – ВКО + полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/1;
2 – ВКО + полевой изолят stavrovskiy/Vladimir/2006;
3 – ВКО + полевой изолят centralnoe/N.Novgorod/2008;
4 – полевой изолят Lenina/Vladimir/2008/2;
5 – ВКО;
6 – вода (отрицательный контроль ПЦР);
M – маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. Стрелками обозначены длины фрагментов п.н.
Стоит отметить, что применение ВКО не влияло на чувствительность выявления генома энтеровируса КРС.
Применение ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС. В течение 2006-2009гг. было проанализировано 246 проб от животных различных возрастных групп из 70 хозяйств РФ. Энтеровирус КРС был выявлен в 16 пробах, при этом его обнаруживали в фекалиях, лёгких и носовых смывах. При наличии в тестируемом материале генома энтеровируса КРС проводили секвенирование продуктов ПЦР.
Сравнительный анализа первичной последовательности амплифицированных фрагментов и соответствующих участков геномов 20 опубликованных энтеровирусов КРС и 10 наиболее сходных энтеровирусов других видов животных и человека показал, что генетическая гомология между различными представителями вида энтеровируса КРС составляет 73–93%, между энтеровирусом КРС и энтеровирусами других хозяев – 50–59%, а между энтеровирусом КРС и выявленными нами полевыми изолятами – 75–95%. Это дало нам возможность идентифицировать выявленные нами агенты как энтеровирус КРС.
Стоит отметить, что наряду с энтеровирусом КРС в 50% проб одновременно выявляли другие инфекционные агенты (парвовирус КРС 1;
парвовирус КРС 3;
вирус инфекционного ринотрахеита;
коронавирус КРС;
вирус вирусной диареи КРС;
ротавирус КРС;
сhlamydophila pecorum;
рasteurella multocida;
мannheimia haemolytica).
Исследование распространённости энтеровируса КРС в Центральном федеральном округе. Обследование 13 стад расположенных в 7 регионах страны, входящих в ЦФО (Московская, Владимирская, Тамбовская, Брянская, Белгородская, Тверская, Костромская области) показало, что стадная превалентность инфицирования энтеровирусом КРС телят весьма высока и составляет 61,5%.
Индивидуальная превалентность среди всех обследованных животных составила 11,5%. В стадах, где был выявлен энтеровирус КРС, превалентность составила 18,8%.
Для 45 изолятов, выявленных в настоящем исследовании, были определены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов.
Филогенетический анализ ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС с выявленными нами изолятами показал, что энтеровирусы КРС, циркулирующие на территории Российской Федерации, характеризуются высокой генетической гетерогенностью (Рис. 5). Генетическая гомология между данными изолятами варьировала от 74% до 99%.
Mar/Moskow/2008/2/ Mar/Moskow/2008/2/ Mar/Moskow/2008/2/ Mar/Moskow/2008/ Mar/Moskow/2008/2/ Ore/Moskow/2008/ Ore/Moskow/ Ore/Moskow/2008/ Ore/Moskow/2008/ Ore/Moskow/2008/ Mar/Moskow/2008/1/ Mar/Moskow/2008/ 1 100 Mar/Moskow/2008/1/ Mar/Moskow/2008/1/ Kys/Belgorod/2008/ Kys/Belgorod/2008/1/ Kys/Belgorod/2008/1/ D 58/96-V2130/bovine VD 2860/1-99/bovine Kyst/Belgorod/2008/ 100 Kys/Belgorod/2008/2/ Len/Vladimir/2008/ Len/Vladimir/2008/2/ Len/Vladimir/2008/2/ Kar/Kostroma/ Kar/Kostroma/2008/ Kar/Kostroma/2008/ Shy/Kostroma/2008/ Shy/Kostroma/2008/2/ Shy/Kostroma/2008/2/ Shy/Kostroma/2008/ Shy/Kostroma/2008/1/ Shy/Kostroma/2008/1/ 64 Shy/Kostroma/2008/1/ Shy/Kostroma/2008/1/ Shy/Kostroma/2008/1/ 3A/bovine PS87/Belfast/bovine PS 87/bovine 100 Len/Vladimir/2008/ 37 Len/Vladimir/2008/1/ D 3/98/bovine 37 Jena 38/02/bovine D 14/3/96/bovine D 14/1/96/bovine Shy/Kostroma/2008/ 94 Shy/Kostroma/2008/3/ Shy/Kostroma/2008/3/ RM-2/bovine 56/59/1/bovine Vir 404/03/bovine 47 SD 1182 II/bovine 19 E 6-82/bovine D 8/01/bovine PS 83/bovine 51 LC-R4/bovine VG527/bovine Pri/Tambov/ 68 Pri/Tambov/2008/ Pri/Tambov/2008/ Pro/Bryansk/2208/ Pro/Bryansk/ Pro/Bryansk/2208/ SL305/bovine K2577/bovine Enterovirus type 9/porcine 0. Рис.5. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС с выявленными нами изолятами Не менее важным и эпизоотически значимым фактом нашего исследования было то, что в 4 из 8 хозяйств регистрировали одновременное присутствие нескольких различных изолятов изучаемого вируса. При этом, в отдельных стадах, уровень различий между изолятами составлял 13%.
3.2. Разработка метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, c помощью полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования Анализ нуклеотидных последовательностей парвовирусов КРС 1, 2, 3.
Сравнительный анализ геномов парвовирусов КРС, принадлежащих разным родам, продемонстрировал отсутствие консервативных для трех вирусов участков генома.
Данное обстоятельство исключило возможность создания универсальных праймеров, позволяющих выявлять геном трех парвовирусов КРС одновременно в одной реакции.
Выбор первичной структуры праймеров, и оптимизация условий постановки ПЦР. Основной задачей нашего исследования было создание трех отдельных «nested» ПЦР, имеющих идентичные условия реакции и отличающихся лишь набором праймеров. В итоге были разработаны три группы праймеров (табл. 3).
Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления генома парвовирусов КРС Реакция Наименова– Последовательность нуклеотидов Локализаци Длина ние праймера (5' – 3') я праймеров фрагмента, н.
Парвовирус КРС Амплифи– BPV1F1 5'-CAA GCA CAT CCA ATC AAC AG-3' 3674-3693* кация BPV1R1 5'-GAT CAT TGT TGT AGA CGG TCC-3' 4139-4159* Реамплифи BPV1F2 5'-AAT TGA ACT GGC GAC TCG GTC C-3' 3744-3765* –кация BPV1R2 5'-CCA GGT GTT GCC AGT CAT TAG GA-3' 4026-4048* Парвовирус КРС Амплифи– BPV2F1 5'-CAA CAA ACT GCC AAA TAG GA-3' 1381-1400** кация BPV2R1 5'-TCT TCT TGT TCT TGT TCC TCG-3' 1829-1849** Реамплифи BPV2F2 5'-GTA AGC TTT GTC CAC AAA AAA CCG C-3' 1572-1596** –кация BPV2R2 5'-AGC TTG TGT ATG GGA CTA CGT GCC-3' 1762-1785** Парвовирус КРС Амплифи– BPV3F1 5'-GAG ATT TGC CCT ATG ATT GG-3' 370-389*** кация BPV3R1 5'-CTT CTT TTA GCG GGT GGC-3' 857-874*** Реамплифи BPV3F2 5'-GTT GCC TGT GAT GCG TTC TGG-3' 423-443*** –кация BPV3R2 5'-GCG GCG CTT AGG CTC GC-3' 790-806*** * соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 1 (номер в GenBank NC_001540).
** соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 2 (номер в GenBank NC_006259).
*** соответствует нуклеотидной последовательности штамма парвовируса КРС 3 (номер в GenBank AF406967).
На рис. 6 показана электрофореграмма продуктов реамплификации после проведения полимеразной цепной реакции.
BPV1 BPV2 BPV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 М Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР парвовирусов КРС Цифрами обозначены дорожки: 1 – ПЦР BPV1, отрицательный контроль ПЦР;
2 – ПЦР BPV1, полевой изолят Zarja/Ivanovo/2008/1;
3 – ПЦР BPV1, положительный контроль ПЦР;
4 – ПЦР BPV2, отрицательный контроль ПЦР;
5 – ПЦР BPV2, полевой изолят OrlNiva/Orel/2008/1;
6 – ПЦР BPV2, положительный контроль ПЦР;
7 – ПЦР BPV3, отрицательный контроль ПЦР;
8 – ПЦР BPV3, полевой изолят Bugur/Orenburg/2008/1;
9 – ПЦР BPV3, положительный контроль ПЦР;
M – маркер молекулярных весов ДНК pUC Mix Marker,8. (размер фрагментов маркера указан в п.н.).
Относительную аналитическую чувствительность разработанного нами метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 определяли сравнением с ранее опубликованными методами.
Для сравнения чувствительности выявления генома парвовируса КРС использовали метод предложенный Сомковой С.Е. с соавт. (1999). При сравнении было показано, что данный метод обладает более низкой чувствительностью.
Сравнение чувствительности выявления генома парвовирусов КРС 2 и 3 не проводилось по причине того, что разработанных аналогичных методов, нами обнаружено не было. В настоящее время найдена единственная работа Allander с соавт. (2001) в которой опубликованы полные нуклеотидные последовательности парвовирусов КРС 2 и 3, а также приведены первичные структуры праймеров, специфичных данным последовательностям. Стоит отметить, что условия постановки ПЦР в работе не указаны.
По результатам проведенных экспериментов мы были вынуждены отказаться от использования праймеров, предложенных Allander с соавт. (по причине одновременной амплификации, как специфических, так и неспецифических фрагментов, затрудняющих анализ результатов.
Специфичность разработанного нами метода выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции была проверена на пробах, содержащих гетерологичные вирусы и вирусы, вызывающие заболевания со сходными клиническими признаками. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.
Применение ПЦР для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3.
Разработанный метод был использован для выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в патологическом материале, поступавшем для исследования в ФГУ ВНИИЗЖ в течение 2008 – 2009гг. Были исследованы 211 проб из 54 хозяйств РФ. Парвовирус КРС 1 был обнаружен в 13 пробах из 7 хозяйств, парвовирус КРС 2 – в 2 пробах из хозяйства, парвовирус КРС 3 – в 14 пробах из 8 хозяйств. При этом парвовирусы обнаруживали в фекалиях, носовых смывах, легких, селезенке, кишечнике и сперме.
Для определения генетического родства среди выявленных нами изолятов для каждого из парвовирусов КРС был проведен филогенетический анализ (Рис. 7, 8). Исключением стали изоляты ПВ КРС 2, идентичные между собой.
Обе дендрограммы имеют вид, свидетельствующий о том, что на территории РФ циркулируют две генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС и две генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 3.
Kamenskoe/N.Novgorod/2008/ Kamenskoe/N.Novgorod/2008/ Kamenskoe/N.Novgorod/2008/ Kamenskoe/N.Novgorod/2008/ Zarja/Ivanovo/2008/ Б 76 Zarja/Ivanovo/2008/ Zarja/Ivanovo/2008/ Rodina/Rostov/ OrlNiva/Orel/ Zarja/Ivanovo/2008/ Centralnoe/N.Novgorod/ M14363/USA/bovine А Prigorodnoe/Tambov/ Abinanti/bovine Predport/S.Peterburg/ Canine minute virus 0. Рис. 7. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованных нуклеотидных последовательностей парвовируса КРС 1 с выявленными нами изолятами ZolNiva/Moskow/2009/ ZolNiva/Moskow/2009/ Verhnevolgskiy/Tver/ Artemida/Bashkortostan/2008/ Zelenograd/Moskow/2009/ Б Zelenograd/Moskow/2009/ Zelenograd/Moskow/2009/ Akkond/Chuvashiya/2008/ 97 Akkond/Chuvashiya/2008/ Artemida/Bashkortostan/2008/ Bovine parvovirus Efremovskaja/Tula/ А Bugur/Orenburg/2008/ Bugur/Orenburg/2008/ Avto/N.Novgorod/ Human parvovirus B19-Au 0. Рис 8. Филогенетические взаимоотношения ранее опубликованной нуклеотидной последовательности парвовируса КРС 3 с выявленными нами изолятами Результаты филогенетического анализа позволяют говорить о том, что с помощью разработанного нами метода возможно проводить дифференциацию парвовирусов, циркулирующих на территории РФ.
Стоит отметить, что в 70% случаев, наряду с парвовирусами, выявляли другие инфекционные агенты (парвовирус КРС 1;
парвовирус КРС 2;
энтеровирус КРС;
инфекционный ринотрахеит;
коронавирус КРС;
вирус вирусной диареи КРС;
ротавирус КРС;
аденовирус КРС;
герпесвирус КРС 4 типа;
Mycoplasma bovis;
Chlamydophila pecorum;
Pasteurella multocida;
Mannheimia haemolytica). Отдельного внимания заслуживает факт одновременного выявления генома парвовирусов КРС и 2 в одной из проб фекалий.
4. ВЫВОДЫ 1. Разработан метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием ВКО. Метод позволяет выявлять указанный возбудитель в патологическом материале, а также проводить внутренний контроль реакции, начиная со стадии выделения РНК.
2. Проведено исследование распространённости энтеровируса в стадах КРС Центрального федерального округа РФ. Показано что превалентность данного вируса среди стад ЦФО РФ составила 61,5 %. Индивидуальная превалентность среди всех обследованных животных составила 11,5 %. В стадах, где был выявлен энтеровирус КРС, превалентность составила 18,8%.
3. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'– нетранслируемой области генома энтеровируса КРС. Сравнительный анализ выявленных изолятов показал, что энтеровирус КРС, циркулирующий на территории РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Генетическая гомология между данными изолятами варьировала от 74 до 99%.
4. Разработан метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования. Данным методом было исследовано 211 проб патологического материала. Парвовирус КРС 1 был обнаружен в 13 пробах, парвовирус КРС 2 – в 2 пробах, парвовирус КРС 3 – в пробах. Изоляты парвовирусов КРС 2 и 3 были выявлены на территории РФ впервые.
5. Установлены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов выявленных парвовирусов КРС 1, 2, 3. Сравнительный анализ данных последовательностей с аналогичными фрагментами опубликованных последовательностей парвовирусов КРС показал: идентичность изолятов парвовирусов КРС 1 составила 96 – 100 %, парвовирусов КРС 2 составила 97%, парвовирусов КРС 3 составила 87 – 100%. Высокая идентичность изолятов парвовирусов подтверждает данные о консервативности генома парвовирусов.
6. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей установлено, что на территории РФ циркулируют генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 1, одна из которых выявлена впервые, а также 2 генетически обособленные группы изолятов парвовируса КРС 3, одна из которых выявлена впервые.
7. Геном энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 выявляли у животных всех возрастных групп. При этом энтеровирус обнаруживали в фекалиях, лёгких и мазках из носа, парвовирусы обнаруживали в фекалиях, носовых смывах, легких, селезенке, кишечнике и сперме.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ На основании проведенных исследований предлагаются для использования в практической работе рассмотренные и одобренные Ученым советом, и утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ» методики:
– «Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции»;
– «Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, типа с помощью полимеразной цепной реакции».
Полученные данные о нуклеотидных последовательностях энтеровируса КРС и парвовирусов КРС могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов.
6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Выявление генома энтеровируса крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования / С. А. Кочетков, А. Е. Вечеров, С. А. Чупин, Л. Б. Прохватилова, В.А. Мищенко // Ветеринария. – 2009.
– № 10. – С. 53 – 56.
2. Распространение энтеровируса крупного рогатого скота на территории Центрального Федерального округа РФ / С. А. Кочетков, М.А. Шибаев, С. А. Чупин, Л. Б. Прохватилова, В.А. Мищенко // Ветеринарная патология. – 2009. – №4.
– С. 17 – 20.
3. Кочетков С. А., Прохватилова Л. Б., Мищенко В. А. Разработка метода выявления парвовирусов КРС 1, 2, 3 с помощью полимеразной цепной реакции // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины:
Международная научно-практическая конференция молодых ученых. – Покров, 2009.
– С. 102 – 106.
Подписано в печать 11.05.2010 г. Заказ № Формат 6090/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 90 экз.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»