Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода t-rflp с целью разработки способов ее оптимизации
На правах рукописи
Ильина Лариса Александровна
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ РУБЦА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
T-RFLP С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ СПОСОБОВ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ
03.01.06 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Дубровицы – 2012
Работа выполнена в лаборатории зоологической микробиологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельско хозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.
Научный руководитель: доктор биологических наук, Лаптев Георгий Юрьевич
Официальные оппоненты:
Вахитов Тимур Яшэрович, доктор биологических наук, ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых био препаратов» Федерального медико-биологического агентства, ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной микробиологии.
Гладырь Елена Александровна, кандидат биологических наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН зав. лабораторией молекулярной генетики животных Центра биотехнологии и мо лекулярной генетики животных.
Ведущая организация: ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН
Защита диссертации состоится « » _ 2012 г. в 10 часов на заседании дис сертационного совета Д 006.013.01. при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВНИИЖ;
тел./факс (4967) 65-11-01.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ РАСХН.
Автореферат разослан « » _2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.013.01. С.В. Воробьева 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. На протяжении последних десятилетий изучение мик роорганизмов рубца, их роли в пищеварении и обмене веществ в многокамерном желудке жвачных вызывает повышенный интерес, как ученых, так и практиков – животноводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организа ции более рационального и полноценного кормления животных и эффективного использования кормов для повышения продуктивности (Пивняк, Тараканов, 1982;
Георгиевский, 1990;
Прохоренко, 2006;
Стрекозов и др., 2006;
Романенко, 2007;
Эрнст, Зиновьева, 2008;
Hungate, 1966).
Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии (Bryant, 1959;
Hungate, 1966;
Dehority, Orpin, 1988;
Hespell et al., 1997). Однако в настоящее время исследователями описан ряд ограничений и недостатков данных методов - прежде всего их трудоемкость и неточность (Dehority, 2003). Помимо этого, зарубежными специалистами было показано, что значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивируемыми видами. Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов, происходящих в рубце (Amann et al., 1992;
Wintzingerode et al., 1997;
Zoetendal et al., 1998;
Krause et al., 2003;
Shin, 2004).
Развитие метагеномных методов делает возможным дальнейшее изучение разнообразия микроорганизмов без ограничений традиционных методов микробиологии – т.е. минуя стадию культивирования. Большинство данных методов основано на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов (например, 16S/18S рРНК) и часто включают в себя стадии клонирования общей ДНК всех микроорганизмов в вектор, а затем анализ полученных библиотек клонов в базах данных (Stackebrandt, Goebel, 1994;
Amann et al., 1995;
Madden et al., 1996;
Tajima et al. 1999;
Nelson et al., 2003;
Handelsman, 2004). Однако, несмотря на широкий спектр возможностей, данные методы являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто изучить структуру микробного сообщества, но и проследить за изменением этой структуры в результате какого-либо воздействия. Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является T RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) – молекулярно биологический метод для изучения структуры микробной экосистемы, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Преимуществом использования данного подхода является возможность получения профиля микробного сообщества (бактерий, архей, грибов), что позволяет установить количество и относительную численность доминирующих групп микроорганизмов. Для определения таксономической структуры бактериальных сообществ по длинам рестрикционных фрагментов созданы компьютерные программы, например, программа FragSort (March et al., 2000). Таким образом, в результате возможно выявление микроорганизмов, оказывающих непосредственное влияние на продуктивность животных.
Цель исследований. Изучить состав микрофлоры рубца крупного рогатого скота, его изменения в течение суток, в процессе роста и развития животных, а также под действием пробиотических препаратов на основе молекулярно биологического метода T-RFLP для оценки возможности использования данного подхода в разработке способов его оптимизации.
Задачи исследований:
- модифицировать методику T-RFLP для изучения микрофлоры рубца крупно го рогатого скота;
- сравнить результаты классических методов микробиологии и T-RFLP анализа при изучении микрофлоры рубца жвачных животных;
- изучить закономерности суточной и возрастной динамики микробного сооб щества рубца бычков с помощью T-RFLP-анализа;
- установить особенности микробиоценоза рубца дойных коров в зависимости от уровня продуктивности и состояния здоровья;
- оценить влияние пробиотических препаратов на микрофлору рубца крупного рогатого скота.
Научная новизна исследований. Впервые проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества рубца крупного рогатого ско та на основе модифицированного молекулярно-биологического метода T-RFLP, в результате чего было выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых, а также установлена возможная роль данных микро организмов в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных. Изучены изменения во всех компонентах микробного сообщества (бактерии, археи, грибы), происходящие в течение суток, связанные с кормлением животных. Установлено, что рост и развитие пищеварительной системы животных сопровождается сменой доминирующих таксономических групп в составе бактерий, архей и грибов. В условиях рубцовой экосистемы проанализировано действие пробиотиков Целло бактерин-Т и Целлобактерин-S на разные физиологические группы микроорганиз мов.
Выявлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеваре ния (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья жи вотных и количеством микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.
Практическая значимость работы. С использованием модифицированного метода T-RFLP в рубце крупного рогатого скота выявлено более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), установлена их связь с физиолого биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), про дуктивностью, состоянием здоровья животных, что позволяет разработать способы регулирования микробиологических процессов в рубце, направленных на повыше ние эффективности использования корма жвачными животными, снижение заболе ваемости и увеличение продуктивности животных.
Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвач ных животных» (Дубровицы, ВИЖ, 2011).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы пред ставлены:
- на Международной конференции «Проблемы увеличения производства про дуктов животноводства и пути их решения» (Дубровицы, октябрь 2008 г.);
- на 13 и 14 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, 2008-2009 г.), - на Международной научно-практической конференции «Актуальные про блемы заготовки, хранения и рационального использования кормов» (Москва, 19 20 августа 2009 г.);
- на пятой Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 14-16 сентября 2010 г.);
- на пятой Международной конференции «Современное производство комби кормов «Комбикорма – 2010» (Москва, 22-24 ноября 2010).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликова но 13 научных статей, в том числе пять в изданиях, рекомендованных ВАК Мини стерства образования и науки РФ.
Положения, выносимые на защиту:
- изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе модифици рованного метода T-RFLP позволяет идентифицировать более 200 филотипов мик роорганизмов (бактерий, архей и грибов), в том числе некультивируемых, а также установить их возможную роль в процессах пищеварения и обмена веществ в руб це жвачных;
- установлена связь между физиолого-биохимическими показателями пище варения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и содержанием микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах компьютерной верстки, содержит 40 таблиц, 18 рисунков, структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения производству и список использованной литературы, включающий 342 источника, в том числе 303 на иностранном языке.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа была выполнена в период с 2008 по 2011 гг. Общая схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.
Рис.1. Общая схема исследований Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов Изучение суточной динамики микробного сообщества рубца бычков Исследования проводили на физиологическом дворе ГНУ ВИЖа (Подольский район Московской области) на бычках черно-пестрой породы, подобранных по возрасту и живой массе, прооперированных по наложению фистул рубца по Басову и дуоденальных анастомозов Синещекову. Основной рацион подопытных животных состоял из силоса. В рацион бычков первой группы был введен комбикорм, второй группы – комбикорм с добавлением 10 г Целлобактерина-S (дрожжи Saccharomyces ellipsoideus - штамм S4-38), третьей группы – комбикорм с добавлением 10 г Целлобактерина-Т (бактерии Bacillus subtilis - штамм 1-85). Оба пробиотика смешивали с комбикормом и задавали в утренние часы кормления. В основу физиологических исследований положена методика комплексного изучения процессов пищеварения, разработанная в лаборатории физиологии пищеварения сельскохозяйственных животных ГНУ ВИЖа (Синещеков, Шеремет, 1953).
Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца телят Исследование проводили в СПК «Кобраловский» Ленинградской области. Для опыта было отобрано 2 группы телят 11-20-суточных бычков черно-пестрой породы по принципу аналогов (живая масса, пол, возраст). Состав рациона животных представлен в таблице 1. Кормление телят было групповым, цельное молоко выпаивалось индивидуально. Сено, сенаж и силос телятам давали с 10 суточного возраста, комбикорм – с 30-суточного. Ежемесячно проводили взвешивание животных.
Таблица Рацион бычков Корм, кг.
Месяцы Цельное Концентраты Сено Силос Сенаж молоко Овсянка Комбикорм 1 230 - - Приуч. – 2 Приуч. - Приуч. 2 190 2,0 10 Приуч. -16 Приуч. - 16 Приуч. 3 80 - 32 37 45 4 - - 45 54 74 Всего 500 - 87 109 135 Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях Исследования проводили в условиях хозяйств Ленинградской, Тверской, Белгородской областей и Краснодарского края на первотелках и коровах старшего возраста черно-пестрой породы разного периода отела, состояния здоровья и уровня продуктивности (табл. 2):
- здоровые животные - ЗАО «Племзавод «Большевик» Лениградской области, ОАО «Агрофирма Дмитрова гора» Тверской области, МПФ «М. Орловка» Белго родской области, ГП «Племзавод ОПХ «Ладожское», ЗАО «Племзавод «Воля», ЗАО «Племзавод «Победа» Краснодарского края;
- животные, выбракованные по бесплодию, хромоте и снижению удоев - СПК "Племзавод "Детскосельский", ЗАО «Племзавод «Большевик», ЗАО «Племзавод «Раздолье», ЗАО «Племзавод «Приневское», СПК «Кобраловский» Ленинградской области.
Таблица Характеристика рациона и продуктивности коров Состав рациона, кг Средне -сут.
Хозяйство удой, Комби Дроби Патока Плющ.
Карто Кукур.
Силос свекл.
Шрот экстр.
зерно масса корм Сено Жом фель Зел.
кг на «Раздолье» №1415 3 25 9 1 1 - - - - - - Выбрако «Приневское» №4036 2 35 3,5 - 1 - 3 - - - - ванные «Детскосельский» №1415 1 35 5 - 1 - - 5 - - - «Кобраловский» №4036, №1297 2 35 5 - 0,5 - - - - - - «Большевик» №1229, №452 2 35 6 - 1,5 - - - 6 2 - «Большевик» №1342, №1241, Здоровые коровы 2 35 6 - 1,5 - - - 6 2 - №1030, № 7,8 2,8 «Агрофирма Дмитрова гора» 14,8 10 - 2,3 5,2 - - 22- - 9 МПФ «М. Орловка» 13 12 - - - 10 - 25- - 4 «Племзавод ОПХ «Ладожское» - 15 - - - - 25 22- - 8 «Племзавод «Воля» 12,5 15 - 0,8 - - 10 28- - 9 «Племзавод «Победа» 12 10 - - - - 10 21- Методики лабораторных исследований Химический анализ кормов, кала, мочи и рубцового содержимого проводили в химико-аналитической лаборатории ГНУ ВИЖа по общепринятым методикам (М.Ф. Томмэ, 1969;
Ю.И. Раецкая, В.Н. Сухарева, 1970).
Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов Микробиологические исследования проводили в лаборатории зоологической микробиологии ГНУ ВНИИСХМ и лаборатории молекулярной генетики ООО «Биотроф». Численность микроорганизмов в пробах рубцового содержимого определяли методом предельных разведений на селективных агаризованных питательных средах и выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г субстрата (Теппер, 1975;
Зенова, 2002;
Тараканов, 2006). Для приготовления разведений и создания анаэробных условий использовали раствор Дейтча и соавт.
(Тараканов, 2006). Молочнокислые бактерии выявляли на агаризованной среде (САМ), энтерококки - на энтерококк-агаре, сапротрофные бактерии - на мясо пептонном агаре (МПА), энтеробактерии - на агаре Эндо-ГРМ. Для трансформации бактериальной ДНК рубца использовали штамм Escherichia coli DH5. Для хранения и поддержания культуры использовали агаризованную среду LB.
Молекулярно-биологические методы. Молекулярно-биологические исследова ния проводили в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ ВНИИСХМ и лаборатории молекулярной биологии ООО «Биотроф».
Экстракцию ДНК проводили из 0,5 мл рубцового содержимого с помощью двух методов (в трех повторностях), включающих лизис с помощью буфера на ос нове CTAB (CTAB 2%;
Tris-HCl 0,1M;
ЭДТА-Na2 20 мM;
NaCl 1,4 M;
pH 8,5) или SDS (SDS 2%;
Tris-HCl 20 мM;
ЭДТА-Na2 20 мM;
NaCl 2 M;
pH 8,0), гомогениза цию стеклянными шариками в приборе FastPrep 24 (M.P.Biomedicals) и фенол хлороформную экстракцию.
Очистку геномной ДНК проводили тремя способами: методом отмывки ДНК в агарозных блоках и экстракции фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1), хлоро формом;
методом очистки ДНК с помощью раствора CTAB (CTAB 2%;
Tris-HCl 0,1M;
ЭДТА-Na2 10 мM;
NaCl 0,9 M;
pH 8,0) и экстракции хлороформом;
с помо щью ДНК-сорбента Silica (Маниатис и др., 1984).
T-RFLP-анализ. Амплификацию генов бактериальных, архейных и грибных проводили с помощью праймеров, представленных в таблице 3 (Singh et al., 2006).
Праймеры 63f, ITS1f, Ar3f имели с 5’ конца флуоресцентную метку Cy5 (цианин- дезоксицитидинтрифосфата).
Таблица Праймеры для амплификации микроорганизмов рубца № Название Ген Назначение Последовательность праймера п/п праймера 63f 5’-AGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ (Сy5) 1 16S Бактерии 1087r 5’-CTCGTTGCGGGACTTACCCC-3’ Ar3f 5’-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’ (Cy5) 2 16S Археи AR927r 5’-CCCGCCAATTCCTTTAAGTTTC-3’ ITS1f 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ (Cy5) 3 ITS Грибы ITS4r 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Электрофорез, амплификацию, выделение ДНК из геля и рестрикцию эндо нуклеазами (HaeIII, HhaI и MspI) проводили по стандартным методикам (Маниа тис, 1984). Далее ДНК осаждали этанолом, растворяли в SLS (Beckman Coulter), добавляли маркер «Size Standart 600» (Beckman Coulter) и разделяли в секвенаторе CEQ8000 (Beckman Coulter). Вычисление размеров пиков и их площади проводили в программе Fragment Analysis (Beckman Coulter). Пики площадью менее 0,3% ис ключали из анализа. Оставшиеся пики объединяли в подтипы (филотипы) с приня той в исследовании погрешностью в 1,5 нуклеотида. Содержание филотипов мик роорганизмов в экосистеме определяли при расчете процентной доли в микробном сообществе. Для определения таксономической принадлежности пиков, данные T RFLP для трех эндонуклеаз (HaeIII, HhaI и MspI) обрабатывали с помощью про граммы Fragment Sorter (http://www.oardc.ohio-state.edu/trflpfragsort/index.php).
Секвенирование. Экстракцию ДНК из ночной культуры бактерий, амплификацию, электрофорез в агарозном геле и выделение ДНК из геля проводили по стандартным методикам (Маниатис, 1984). ПЦР-продукты клонировали в векторе рTZ-57R (Fermentas) по протоколу фирмы-изготовителя.
Скрининг трансформантов проводили с помощью метода бело-голубой селекции (Маниатис, 1984). Секвенирование проводили с помощью секвенатора CEQ (Beckman Coulter) по инструкции фирмы-изготовителя. Идентификацию микроорганизмов проводили сравнением нуклеотидной последовательности фрагментов гена 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных NCBI BLAST.
Статистическая обработка результатов исследований.
Математическую и статистическую обработки результатов проводили стан дартными методами дисперсионного и корреляционного анализа с использованием критерия Стьюдента (Фишер, 1958;
Лакин, 1990) с помощью программного обес печения Excel XP/2000. Статистический анализ данных T-RFLP проводили в про грамме «Past». Для анализа биоразнообразия в сообществе рассчитывали показа тель Шеннона. Сравнение микробных сообществ проводили с помощью метода неметрического многомерного шкалирования Non-metric MDS и кластерного ана лиза (UPGMA), основанные на расчете коэффициентов сходства Брея-Кертиса. Для определения взаимосвязей между содержанием микроорганизмов в рубце с различ ными показателями рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Модификация метода T-RFLP для изучения микробиоценоза рубца крупного рогатого скота Основной проблемой при изучении микрофлоры рубца крупного рогатого скота с помощью метода T-RFLP является экстрагирование геномной ДНК из образцов рубцового содержимого, свободной от загрязняющих веществ, ингибирующих дальнейшее проведение анализа (Tebbe, Vahjen, 1993;
Zhou et al., 1996;
Frostegard et al., 1999;
Sylvia, 2005). Для выбора оптимального способа экстракции ДНК мы опробовали два метода, включающие лизис клеточных стенок микроорганизмов (с помощью растворов на основе СТАB или SDS), гомогенизацию образцов и фенол-хлороформную экстракцию (Yu and Morrison, 2004). Установлено, что применение метода выделения ДНК на основе раствора SDS в качестве лизирующего раствора с последующей очисткой раствором CTAB позволяет экстрагировать ДНК, пригодную для T-RFLP-анализа (рис.2, 3) Рис. 2. Агарозный гель-электрофорез Рис. 3. Агарозный гель-электрофорез амплификации геномной ДНК ДНК А, Б, В – метод на основе раствора CTAB;
А – ДНК очищена с помощью легкоплавкой агарозы;
Г, Д, Е – метод на основе раствора SDS;
Б - ДНК очищена с помощью буфера на основе CTAB;
М – маркер молекулярного веса. В - ДНК очищена с помощью Silica;
(GeneRuler 100+ п.н., Fermentas). М – маркер молекулярного веса (GeneRuler 100+ п.н., Fermentas).
Результаты подбора условий для амплификации универсальных фрагментов генов микроорганизмов рубца крупного рогатого скота представлены в таблице 4.
Таблица Условия ПЦР-амплификации генов микроорганизмов рубца жвачных животных Концентрация Микроор буфера Mg в Режим ПЦР ганизм смеси ПЦР 1 шаг: 95°С – 3 мин;
2 шаг: 94°С – 30 с, 45°С – 30 с, 72°С – 1, Бактерии 1,5 mM мин – 35 раз;
3 шаг: 72°С –10 мин 1 шаг: 95°С – 3 мин;
2 шаг: 94°С – 45 с, 57°С – 45 с, 72°С – 1, Грибы 3,0 mM мин – 35 раз;
3 шаг: 72°С –15 мин.
1 шаг: 95°С – 3 мин;
2 шаг: 94°С – 45 с, 55°С – 45 с, 72°С – 1, Археи 3,0 mM мин – 35 раз;
3 шаг: 72°С – 15 мин.
При выборе эндонуклеаз для T-RFLP-анализа учитывали количество фраг ментов генов бактерий, архей и грибов, полученных при рестрикции (табл. 5). Со гласно данным исследователей, при малом числе фрагментов ДНК образуются комплексные пики, анализ которых трудно поддается интерпретации, (Liu, 1997;
Osborn et al., 2000;
Engebreston, Moyer, 2003). Таким образом, для анализа T-RFLP грамм были выбраны следующие эндонуклеазы: для бактериального сообщества MspI, для грибного – HhaI, для архейного – HaeIII.
Таблица Количество терминальных рестрикционных фрагментов T-RFLP-грамм мик робного сообщества рубца Количество терминальных рестрикционных фрагментов Микроорганизм MspI HhaI HaeIII Бактерии 250 ± 6,3 120 ± 2,9 45 ± 0, Грибы 39 ± 2,1 138 ±3,2 65 ± 1, Археи 40 ± 1,9 105 ± 0,9 127 ± 3, Для проверки воспроизводимости результатов T-RFLP-анализа рассчитывали коэффициенты сходства Брея-Кертиса для трех параллельных определений. Уста новлено, что для всех компонентов микробного сообщества были получены высо кие индексы сходства: для бактериального сообщества – 0,84-0,92, для грибного – 0,89-0,91, для архейного – 0,90-0,91.
Сравнительный анализ микрофлоры рубца бычков с помощью традиционных микробиологических методов и T-RFLP показал, что процентное соотношение раз личных групп микроорганизмов было сопоставимо, однако имело неточности: ко личество колоний на энтерококк-агаре превышало количество всех молочнокислых бактерий на MRS-агаре в 10 раз (рис. 4). Определение таксономической принад лежности колоний с энтерококк-агара с помощью метода секвенирования показало, что 32% колоний – принадлежат к роду Bacillus, 50% - Aerococcus (Lactobacillales), 18% - Enterococcus (Lactobacillales). Таким образом, установлено, что результаты исследования микрофлоры рубца бычка с помощью T-RFLP-анализа более точные по сравнению с традиционными методами культивирования микроорганизмов.
А Б 8,86 1000К ОЕ/мл % 0,94 0,85 0,77 11 Актиномицеты Энтерококки Молочнокислые Энтеробактерии Актиномицеты Энтерококки Молочнокислые Энтеробактерии бактерии бактерии Микроорганизм Микроорганизм Рис. 4. Результаты сравнительного анализа микрофлоры рубца бычка при анализе:
А - T-RFLP, Б – традиционные микробиологические методы.
Для проверки возможности определения филогенетической принадлежности бактерий в программе FragSort для колоний с энтерококк-агара проводили T-RFLP анализ и расшифровку рестрикционных профилей штаммов. Сравнение результа тов секвенирования и T-RFLP выявило неточности в определении вида бактерий методом T-RFLP: штамм Aerococcus в программе имел совпадения с фрагментами бактерии Atopostipes (Carnobacteriaceae), а для штамма Bacillus sp. – с разными ви дами бактерий рода Bacillus. Поэтому для характеристики бактериальных сооб ществ с помощью программы FragSort в дальнейших исследованиях в качестве сравнительных таксономических единиц использовали род, семейство или порядок бактерий.
3.2. Результаты исследования динамики микробного сообщества рубца жвач ных животных в течение суток и влияния на нее пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-S Решение вопросов, связанных с реализацией продуктивного потенциа ла крупного рогатого скота невозможно без понимания особенностей пищеварения жвачных, в том числе суточной динамики микробного сообщества. В связи с этим на экспериментальном физиологическом дворе ГНУ ВИЖа был проведен опыт по изучению суточной динамики микробиоценоза рубца бычков с помощью метода T RFLP и оценке воздействия пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-S на микрофлору рубца, процессы желудочно-кишечного пищеварения и обмен веществ животных.
Интенсивность течения ферментативных процессов в рубце бычков Анализ результатов учета заданных кормов и их остатков показал, что введе ние в рацион бычков пробиотиков Целлобактерин-S и Целлобактерин-Т способ ствовало повышению потребления сухого вещества на 2,1 и 15,5% соответственно, что, вероятно, было связано с более высокой поедаемостью силоса у опытных жи вотных.
Установлено, что общее количество летучих жирных кислот (ЛЖК) в рубцо вой жидкости животных контрольной и опытных групп возрастает, достигая мак симума через два-три часа после кормления. Показано, введение в рацион пробио тиков способствовало увеличению общей концентрации ЛЖК, а также повышению уровня масляной (на 6,4% и 1,8% соответственно) и пропионовой кислот (на 9,4% и 1,4%), а также понижению содержания ацетата в рубце (на 4,8% и 1%) по сравне нию с контролем (табл. 6). Также было выявлено увеличение количества аммиака в рубце животных при скармливании пробиотиков.
Таблица Динамика показателей рубцового метаболизма Время взятия проб Пока Группа После кормления через (час.) За 1 час до затель кормления 1 2 3 Контр. 6,93±0,03 7,0±0,04 7,05±0,02 7,09±0,07 7,01±0, рН Целлоб.-S 7,0±0,02* 6,96±0,02 6,79±0,07 6,91±0,04 6,87±0,06* Целлоб.-Т 7,24±0,04*** 7,0±0,07 6,76±0,09 7,08±0,04 6,79±0,08** Контр. 6,59±0,04 7,39±0,09 8,16±0,04 8,86±0,09 9,21±0, ЛЖК (Ммоль/ Целлоб.-S 7,82±0,07*** 9,41±0,08*** 9,34±0,12*** 10,08±0,11*** 9,53±0, 100мл) Целлоб.-Т 8,59±0,2*** 12,46±0,18*** 12,04±0,22*** 9,52±0,09*** 8,9±0,13* Контр. 8,89±0,11 14,24±1,09 15,6±0,7 13,16±0,02 9,4±0, Аммиак Целлоб.-S 7,88±0,17*** 18,57±0,98** 21,73±1,23** 19,08±0,95*** 15,2±0,32*** (мг%) Целлоб.-Т 7,32±0,08*** 15,0±0,67 14,23±0,67* 14,85±0,84 15,51±0,76*** Примечание: *p0,05, ** p0,01, *** p0,001 (к контролю).
Показано, что у бычков, получавших в составе комбикорма пробиотики, отме чается общая тенденция к повышению переваримости всех питательных веществ, кроме БЭВ (табл.7). Кроме того, анализ эвакуации химуса в дуоденальном отделе кишечника показал, что количество химуса у животных, которым скармливали Целлобактерин-S было на 34,6%, а Целлобактерин-Т - на 50% больше, чем в кон троле, что связано с более интенсивным гидролизом углеводов. Таким образом, установлено, что добавление в рацион пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобак терин-S оказало стимулирующее действие на течение ферментативных процессов в рубце бычков.
Таблица Количество переваренных питательных веществ рационов Группа Показатели Контроль Целлобактерин-S Целлобактерин-Т % % % Сухое вещество 65,5 ± 0,98 66,79 ± 1,12 67,43 ± 1, Органическое вещество 67,71 ± 0,89 69,34 ± 1,24 70,26 ± 2, Сырой протеин 62,24 ± 1,22 63,18 ± 0,85 67,08 ± 2, Сырой жир 51,47 ± 2,11 56,28 ± 2,17 63,01 ± 2,17** Сырая клетчатка 52,89 ± 1,98 56,5 ± 3,11 59,96 ± 2,09* БЭВ 74,95 ± 2,76 74,98 ± 1,87 74,95 ± 1, Примечание: *p0,05, ** p0,01 (к контролю).
Результаты анализа суточной динамики микробиоценоза рубца бычков Структуру микробного сообщества рубца бычков анализировали с помощью метода T-RFLP. Для каждого животного учитывали состав бактериального, грибно го и архейного сообществ, начиная за час до утреннего кормления (7 часов утра) и далее через каждый час (до 22 часов вечера).
Анализ суточной динамики микробного сообщества в рубце бычков показал, что через два-три часа после кормления животных увеличивалась доля микроорга низмов фил Bacteroides и Firmicutes: сахаролитических бактерий семейств Clos tridiaceae, Eubacteriaceae, лактат-утилизирующих - семейства Veillonellaceae и амилолитических – семейства Bacteroidaceae (табл. 8).
Таблица Содержание доминирующих микроорганизмов в рубце бычков Количество микроорганизмов в рубце животных, % Группа Вариант 7 часов 9 часов 11 часов 13 часов Контроль 8,82±1,14 3,48±1,01 14,01±3,09** 4,89±1, Фила Целлоб-S 4,62±1,90 5,35±1,66 10,03±2,26 11,44±3, Bacteroidetes Целлоб-Т 9,73±2,78 7,25±1,43 10,54±2,73 10,73±1, Контроль 0,40±0,03 0,27±0,02 0,86±0,51 0,16±0, Семейство Целлоб-S 0,21±0,02 0,93±0,14 2,04±1,40 2,54±1, Bacteroidaceae Целлоб-Т 0,59±0,03 0,26±0,05 2,98±0,78* 0,33±0, Контроль 41,75±3,73 30,27±2,33 41,89±6,48 33,46±0, Фила Firmicutes Целлоб-S 42,53±3,82 36,64±4,85 40,13±4,53 34,86±5, Целлоб-Т 37,93±6,92 32,11±4,63 27,60±3,90 42,12±2, Контроль 7,26±1,68 6,77±0,96 6,06±1,17 8,06±0, Семейство Целлоб-S 9,86±0,81 7,36±0,21 6,81±0,57 7,69±2, Clostridiaceae Целлоб-Т 5,29±2,03 4,22±1,68 4,64±1,68 10,46±1, Контроль 2,13±0,45 0,78±0,64 4,26±0,49* 2,71±0, Семейство Целлоб-S 3,51±0,76 3,21±0,83 4,13±0,63 2,64±0, Eubacteriaceae Целлоб-Т 1,26±0,70 5,36±0,98* 2,67±0,31 2,77±0, Контроль 17,95±0,94 11,57±1,45 13,37±3,25 7,62±0, Семейство Lach Целлоб-S 8,73±0,99 5,24±1,44 7,32±1,84 6,62±0, nospiraceae Целлоб-Т 12,61±3,82 9,29±5,21 7,98±0,19 12,79±2, Контроль 9,24±2,83 0,55±0,46*** 15,51±3,96 9,67±0, Семейство Целлоб-S 8,94±1,28 5,81±0,93 6,20±0,83 6,61±0, Ruminococcaceae Целлоб-Т 11,84±3,17 8,58±0,04 11,76±3,84 11,70±2, Контроль н.п.д.о. н.п.д.о. н.п.д.о. 0,43±0, Семейство Veillonellaceae Целлоб-S 2,69±0,63 1,49±0,70 3,93±1,06 1,92±1, Целлоб-Т 2,12±0,71 0,54±0,22 1,93±0,03 1,46±0, Примечание: н.п.д.о. - ниже предела достоверного обнаружения *p0,05, ** p0,01, *** p0,001, (к врем. кормления - 7 ч) Результаты расчета среднего содержания микроорганизмов в течение суток показали, что добавление в рацион бычков пробиотиков способствовало увеличе нию доли амилолитических, лактатферментирующих бактерий (табл. 9).
Таблица Среднесуточное содержание бактерий в рубце бычков Среднесуточное количество бактерий, % Бактерии Контроль Целлобактерин-S Целлобактерин-Т Сем. Bacteroidaceae 0,45±0,28 1,84±1,05 1,00±0, Сем. Laсhnospiraceae 13,4±4,42 6,54±1,24 10,35±1, Сем. Ruminococcaceae 8,42±2,76 7,07±1,40 11,15±1, Cем. Veillonellaceae 0,27±0,09 1,98±0,75* 1,02±0, Примечание: *p0,05 (к контролю) Установлена достоверная положительная связь между количеством амилоли тических бактерий семейства Bacteroidaceae и содержанием пропионовой кислоты в рубце (r=0,79), а также достоверная отрицательная - между содержанием лактат утилизирующих микроорганизмов семейства Veillonellaceae и лактат продуцирующих бактерий семейства Lactobacillaceae с количеством уксусной кис лоты (r=-0.50 и r=-0.89 соответственно). Полученные нами результаты согласуются с рядом исследований (Пивняк, Тараканов, 1982;
Тараканов, 1987), которые пока зали, что взаимосвязь между данными группами микроорганизмов обусловлена особенностями их метаболизма: амилолитические бактерии при сбраживании крахмала продуцируют молочную и янтарную кислоты, тогда как лактатферменти рующие бактерии преобразуют данные кислоты в пропионовую. Таким образом, установлено, что добавление в рацион пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобак терин-S вследствие повышения переваримости легкогидролизуемых кормов сопро вождалось изменением направленности бродильных процессов в преджелудках.
Анализ динамики сообществ архей и грибов в рубце бычков в течение суток показал, что содержание отдельных микроорганизмов варьировало в зависимости от времени кормления и от варианта опыта. Расчет коэффициентов корреляции позволил выявить микроорганизмы, связанные с показателями рубцового пищева рения. Результаты расчета коэффициентов сходства Брея-Кертиса и кластерного анализа всех компонентов микробного сообщества также показали разделение об разцов рубцового содержимого в зависимости от времени кормления (рис. 5).
А Б В Рис. 5. Дендрограммы сходства микробных сообществ рубца здоровых и выбракованных животных: А – бактериальное сообщество;
Б – сообщество архей;
В – грибное сообщество. К- контроль, ЦТ – Целлобактерин-Т, ЦС – Целлобактерин S, 7 Ч – 22 Ч – время взятия образцов рубцового содержимого.
3.3. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца жвачных животных Следующим этапом наших исследований было изучение закономерностей возрастных изменений в рубце телят с помощью T-RFLP-анализа. Одним из пока зателей, характеризующих у жвачных животных микрофлору «взрослого типа», является ее способность к перевариванию клетчатки (Тараканов, Николичева, 1986). На основании анализа содержания микроорганизмов, способных ферменти ровать компоненты растительных кормов (бактерии семейств Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae), в рубце под опытных животных можно сделать выводы о том, что доля данных микроорга низмов у бычков к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного (табл. 10). Обоснованность данного заключения подтвер ждается тем, что в 4-5-месячном возрасте количество данных микроорганизмов практически не увеличивается. Наши данные согласуются с результатами иссле дований Севастьяновой, Тараканова и Николичевой (Севастьянова, 1966;
Тарака нов, Николичева, 1986), которые на основании анализа показателей рубцового пищеварения и метаболической активности целлюлозолитической микрофлоры бычков разного возраста, сделали вывод о том, что данные показатели достигают уровня «взрослого типа» лишь к 3-4 месячному возрасту. Установлено, что добав ление в рацион бычков пробиотика Целлобактерин-Т способствовало более ран нему (2-месячные телята) увеличению доли целлюлозолитиков практически до уровня взрослого животного. Полученные результаты подтверждаются данными статистической обработки результатов (рис. 6).
Помимо этого, что в рубце бычков всех возрастов были выявлены патоген ные бактерии семейства Enterobacteriaceae, а также родов Staphylococcus и Fusobacterium. Кроме того, анализ бактериального сообщества выявил значитель ное количество некультивируемых видов в рубце всех бычков.
Таблица Содержание бактерий в рубце бычков Таксономический Доля микроорганизмов в рубце животных, % Вариант ранг микроорга низмов 1 мес. 2 мес. 3 мес. 4 мес. 5 мес.
Контр. 41,07±3,26 8,68±1,54 1,16±0,29 2,79±0,78 3,22±0, Сем.
Bifidobacteriaceae Целлоб-Т 36,71±4,11 0,47±0,11*** н.п.д.о. 1,47±0,56 0,81±0,22*** Контр. 0,74±0,11 5,69± 0,56 5,63±0,22 5,47±0,22 14±2, Фила Bacteroidetes Целлоб-Т 3,78 ±0,65** 4,63±0,76 4,57±1,10 12,7±1,19*** 7,08±0,78* Контр. 3,21 ±0,34 27,6± 1,15 7,32±0,78 6,88±0,65 1,92±0, Семейство Clostridiaceae Целлоб-Т 1,62±0,24** 3,84±0,02*** 5,49±0,55 10,6±1,16* 6,6±0,22*** Контр. н.п.д.о. 2,98± 0,34 9,06±0,43 8,24±0,34 5,59±1, Семейство Eubacteriaceae Целлоб-Т 1,0±0,23 2,38±0,76 25,83±4,02** 20,35±0,55*** 18,67±1,5*** Контр. 1,74 ±0,12 2,45± 0,28 6,39±0,45 7,24±0,39 8,31±0, Семейство Lachnospiraceae Целлоб-Т 4,81±0,34*** 18,84±2,45*** 13,41±1,76** 11,09±1,08** 9,3±0, Контр. 17,72 ±1,1 2,97± 0,45 35,97±3,72 27,87±2,16 10,42±2, Семейство Ruminococcaceae Целлоб-Т 15,78±2,11 15,85±1,18*** 9,63±0,65*** 5,79±0,56*** 8,13±1, Контр. 1,34 ±0,19 0,53± 0,04 3,35±1,11 1,76±0,11 1,09±0, Семейство Veillonellaceae Целлоб-Т 2,61±0,15*** 8,13±0,98*** 3,37±0,67 3,3±0,26*** 2,76±0,55* Контр. 9,15±1,17 23,2±2,65 11,4±0,98 13,6±2,11 27,4 ±4, Некультиви руемые бактерии Целлоб-Т 10±2,17 28,7±2,87 19,7±1,09*** 11,1±0,56 27,2±0, Примечание: н.п.д.о. - ниже предела достоверного обнаружения *p0,05, ** p0,01, *** p0,001 (к контролю).
А Б В Рис. 6. Дендрограммы сходства бактериального (А), архейного (Б) и грибного сообществ (В) рубца бычков разного возраста. К-контроль, Ц-вариант с Целлобактерином. 1-5 – возраст бычков, мес.
Установлено, что добавление в рацион пробиотика Целлобактерин-Т способ ствовало увеличению прироста живой массы бычков (табл. 11). При этом выявлена достоверная положительная связь между продуктивностью животных и содержа нием бактерий, ферментирующих растительные корма (семейств Clostridia, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Veillonellaceae) и достоверная отрицательная – с долей микроорганизмов семейств Lactobacillaceae, Bifidobacteriaceae, Bacillaceae.
Таблица Показатели прироста живой массы бычков Возраст бычков, мес Показатели 1 2 3 Опытный вариант Живая масса, кг 52,71 ± 1,18 73 ± 3,42 101,71 ± 3,39 123,71 ± 2,53* Среднемесячный, кг 12,71 ± 1,18 20,28 ± 2,89 29,71 ± 5,10 22,0 ± 3, Контрольный вариант Живая масса, кг 52,14 ± 1,60 72,86 ± 2,16 95,86 ± 1,26 115,43 ± 1, Среднемесячный, кг 11,57 ± 1,79 20,71 ± 3,10 23,0 ± 2,57 19,57 ± 1, Примечание: *p0,05 (к контролю).
Результаты анализа динамики сообществ архей и грибов в рубце бычков так же продемонстрировали возрастные изменения, при этом одни доминирующие филотипы сменялись другими по мере взросления и развития пищеварительной системы животных. Показано, что добавление в рацион пробиотика Целлобакте рин-Т также оказало влияние на данные микроорганизмы.
3.4. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях Следующим этапом наших исследований было изучение закономерностей в составе микрофлоры рубца коров с разным уровнем состояния здоровья, молоч ной продуктивности и с различными рационами. Известно, что в настоящее время для поддержания потребностей в энергии высокопродуктивных молочных коров в рационы включают большое количество концентратов, что приводит к измене нию направленности биохимической деятельности микрофлоры преджелудков.
При этом наблюдается ухудшение здоровья и сокращение продуктивного долго летия крупного рогатого скота (Курилов, 1971;
Mertens, 1997;
Pereira, 2000;
Leiva, 2000). Некоторые ученые связывают данные нарушения с состоянием лактатного ацидоза, который развивается при избытке крахмала в рационе. Однако отсут ствуют четкие доказательства существования этой связи.
Сравнительный анализ микрофлоры рубца всех здоровых и выбракованных коров свидетельствует о существенном нарушении баланса микроорганизмов (бак терий, грибов и архей) в микробном сообществе рубца исследованных нами выбра кованных коров.
Результаты анализа бактериального сообщества рубца выбракованных живот ных продемонстрировали низкое содержание целлюлозолитических бактерий се мейств Laсhnospiraceae и Ruminococcaceae, лактат-утилизирующих - семейства Veillonellaceae, высокий уровень молочнокислых бактерий семейства Lactobacillaceae, ферментирующих моносахара до лактата в рубце, и бактерий рода Fusobacterium.
Таблица Среднее содержание бактерий в рубце здоровых и выбракованных коров Фила Сем. Сем. Сем. Сем. Фила Bacteroi- Lachnospi- Rumino- Veillonel- Lactoba- Fusobac Хозяйство detes raceae coccaceae laceae cillaceae teria 8,61 ±0,9 12,03 ±1,2 3,45 ±1,0 3,66 ±0,28 0,38 ±0,19 0,24 ±0, «Ладожское»
Выбракован- Здоровые ко 11,52 ±2,3 15,79 ±3,2 3,82 ±0,3 6,33 ±0,5 0,31 ±0,01 2,49 ±0, «Воля»
ровы 2,31 ±0,4 13,25 ±2,8 3,59 ±0,3 4,97 ±0,95 1,36 ±0,5 1,88 ±0, «Победа»
7,39±2,78 13,3±2,5 3,33±0,9 4,12±1,05 1,13±0,54 1,87±0, «Дмитрова гора»
6,67±2,1 18,55±2,54 4,65±1,34 4,75±1,43 0,64±0,11 1,46±0, «М. Орловка»
0,64±0,11 16,7±3,29 5,3±0,23 3,53±0,78 3,19±0,12 0,65±0, «Большевик»
8,82±2,16 2,8±0,89 2,9±0,98 0,6±0,06 2,9±0,98 3,55±0, «Большевик»
0,2±0,11 4,47±0,52 3,03±0,37 1,62±0,7 5,55±0,67 1,82±0, «Раздолье»
ные 1,61±0,7 0,93±0,26 4,26±0,87 0,68±0,19 2,78±0,45 4,08±1, «Приневское»
0,24±0,11 5,2±2,8 7,03±0,6 1,87±0,56 1,76±0,56 2,07±0, «Детскосельский»
10,1±0,65 1,8±0,15 3,0±0,11 0,5±0,56 6,7±0,60 4,0±0, «Кобраловский»
Расчет коэффициентов корреляции показал, что содержание в рубце бактерий семейств Lachnospiraceae и Veillonellaceae было достоверно положительно связано с уровнем молочной продуктивности (r=0,76 и r=0,60 соответственно). Стоит отме тить, что при высоком содержании комбикормов в рационе жвачных животных, крахмал (который входит в состав комбикорма) сбраживается до молочной кисло ты, вследствие чего повышается кислотность в рубце, что приводит к угнетению роста лактат-ферментирующих и целлюлозолитических бактерий, что в результате приводит к накоплению молочной кислоты. Таким образом, запускается каскадный механизм лактатного ацидоза. В таких условиях в рубце начинает размножаться бактерия Fusobacterium necrophorum (использующая лактат в качестве энергетиче ского субстрата), вызывающая некробактериоз. Её проникновение через слизистую в кровь обуславливает дальнейшее инфицирование - абсцессы печени и других внутренних органов, поражения копыт, кожи или слизистых. Таким образом, ре зультаты наших исследований дают возможность предположить, что снижение удоев у выбракованных животных, вероятно, произошло в результате лактатного ацидоза (Nocek, 1997).
Дендрограммы cходства бактериальных, грибных и архейных сообществ рубца коров также свидетельствуют о значительном различии микробиоценоза рубца здоровых коров и выбракованных животных (рис.7). Расчет коэффициентов сходства показал значительное влияние рациона на микробиоценоз рубца. При сравнении бактериального сообщества, наибольшим сходством обладали выбра кованные коровы СПК «Кобраловский» и ЗАО «Племзавода «Большевик», кото рые получали похожие рационы. При этом результаты анализа дендрограммы сходства грибного сообщества указывают на высокое сходство среди выбракован ных животных из отдельных хозяйств.
А Б В Рис. 7. Дендрограммы сходства микробных сообществ рубца здоровых и выбракованных животных Ленин градской области: А – бактериальное сообщество;
Б – сообщество архей;
В – грибное сообщество.
К – СПК «Кобраловский», Б – ПЗ «Большевик», Д – СПК «Детскосельский, П – ПЗ «Приневское», Р – ПЗ «Раздолье».
Таким образом, с использованием модифицированного метода T-RFLP полу чены экспериментальные данные, которые дополняют знания о микрофлоре пре джелудков и её роли в питании жвачных, что открывает новые перспективные направления поиска способов направленной регуляции микробиологических про цессов в преджелудках, позволяющих повысить эффективность использования корма, увеличить продуктивность и снизить заболеваемость крупного рогатого скота.
4. ВЫВОДЫ 1. Метод T-RFLP модифицирован для анализа микрофлоры рубца крупного ро гатого скота, в том числе выбраны методы экстракции и очистки ДНК, условия ПЦР-амплификации универсальных фрагментов генов микроорганизмов, эндо нуклеазы рестрикции, что позволило получить высоковоспроизводимые результа ты. Индексы сходства Брея-Кертиса для бактериального сообщества составляют 0,84-0,92, для грибного – 0,89-0,91, для архейного – 0,90-0,91.
2. В рубце крупного рогатого скота с использованием модифицированного мо лекулярно-биологического метода T-RFLP выявлено более 200 филотипов бакте рий, архей и грибов, в том числе некультивируемых видов. Результаты T-RFLP анализа бактериального сообщества рубца крупного рогатого скота сопоставимы с данными традиционных микробиологических методов.
3. Во всех компонентах микробного сообщества рубца крупного рогатого скота зафиксированы изменения, связанные с кормлением животных: через два-три часа после кормления животных в рубце увеличивается доля сахаролитических (се мейств Closridiaceae, Eubacteriaceae), лактат-утилизирующих (семейства Veillonellaceae) и амилолитических бактерий (филы Bacteroidetes).
4. Введение в рацион бычков пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин S оказывает регулирующее действие на состав бактериального сообщества в рубце и показатели рубцового пищеварения: увеличивается доля амилолитических (в 2, и 4,08 раз соответственно) и лактатферментирующих бактерий (в 3,77 и 7,33 раза), а также измененяется соотношение ЛЖК в рубце в сторону увеличения доли про пионата (на 9,4 и 1,4%) по сравнению с контрольным вариантом.
5. Изучен процесс формирования состава микробного сообщества в рубце в процессе роста и развития животных на основе молекулярно-биологического мето да T-RFLP. Показано, что смена рациона в процессе роста бычков сопровождается сменой доминирующих таксономических единиц в составе бактерий, архей и гри бов.
6. Содержание в рубце бычков микроорганизмов, ферментирующих раститель ные корма, к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного. Введение в рацион пробиотика Целлобактерин-Т способствует более раннему увеличению количества целлюлозолитических, амилолитических и лактат ферментирующих микроорганизмов в рубце животных.
7. Установлена достоверная положительная связь между содержанием в рубце бычков разного возраста бактерий, обладающих способностью ферментировать уг леводы растительных кормов (семейств Bacteroidaceae, Clostridiaceae, Eubacteri aceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae) с долей в рационе сена, силоса и концен тратов, а также с увеличением продуктивности животных.
8. Снижение продуктивности у исследованных коров сопровождалось значи тельными нарушениями в таксономической структуре микробного сообщества: вы явлено низкое количество целлюлозолитических (0,93±0,26-7,03±0,6%), лактат ферментирующих бактерий (0,5±0,16 – 1,87±0,56%), а также высокое содержание молочнокислых бактерий (до 6,7±0,60) и фузобактерий (до 4,08±1,07%).
9. Установлена достоверная положительная связь между уровнем молочной продуктивности коров и долей бактерий семейств Lachnospiraceae и Veillonellaceae (r=0,76 и r=0,60 соответственно) и достоверная отрицательная - с содержанием бак терий рода Fusobacterium (r=-0.78).
5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ Научным учреждениям рекомендуем проводить комплексный анализ микроб ного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного ме тода T-RFLP для разработки методов направленной регуляции микробиологиче ских процессов в преджелудках, позволяющих повысить эффективность использо вания корма, увеличить продуктивность и снизить заболеваемость животных.
Сельскохозяйственным предприятиям рекомендуем применение пробиотиков на основе бацилл и дрожжей для регуляции состава микробного сообщества в руб це крупного рогатого скота для увеличения продуктивности бычков на откорме и дойных коров.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1. Лаптев, Г.Ю. Микробиология рубца крупного рогатого скота / Г.Ю. Лап тев, Л.А. Кряжевских // Животноводство России. – М., 2008. - №10. – С. 2-3.
2. Кряжевских, Л.А. Метод T-RFLP – основа профилактики некробактерио за скота / Г.Ю. Лаптев // Животноводство России. - М., 2009. - №10. – С. 2-3.
3. Лаптев, Г.Ю. Исследование бактериального сообщества рубца с помощью метода T-RFLP / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Молочное и мясное скотовод ство. – 2010. - №3. – С. 16-18.
4. Ильина, Л.А. Исследование бактериального сообщества рубца коров с помощью T-RFLP-анализа / Л.А. Ильина, А.Ф. Балакирева, Е.А. Йылдырым, Г.Ю.
Лаптев // Молочное и мясное скотоводство. – 2011. - №2. – С.24-27.
5. Лаптев, Г.Ю. Рациональное кормление высокопродуктивных коров / Г.Ю.
Лаптев, Л.А. Ильина // Кормопроизводство. – 2011. - №10. – С. 44-45.
Статьи в других изданиях.
6. Кряжевских, Л.А. Методические подходы к изучению бактериальной микрофлоры рубца крупного рогатого скота / Л.А. Кряжевских, Г.Ю. Лаптев // 13-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 28 сент – 2 окт 2009. – С. 202-203.
7. Лаптев, Г.Ю. T-RFLP - новый метод анализа микрофлоры крупного рога того скота / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов: материалы междунар. научно практической конф. Москва, 19-20 августа 2009 г. – М., 2009. – С. 36-40.
8. Кряжевских, Л.А. Изучение микробиологических процессов в рубце жвачных – основа профилактики некробактериоза / Л.А. Кряжевских, Г.Ю. Лаптев // Сельскохозяйственные вести. – М., 2009. - № – С. 22.
9. Кряжевских, Л.А. Метагеномный анализ экосистемы рубца жвачных жи вотных / Л.А. Кряжевских // 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 2010. – С. 237.
10. Лаптев, Г.Ю. T-RFLP – новый биотехнологический метод для оценки микрофлоры крупного рогатого скота / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Актуаль ные проблемы биологии в животноводстве: материалы пятой междунар. конф., по священной 50-летию ВНИИФБиП. Боровск, 14-16 сентября 2010. – М., 2010. С.
287-288.
11. Кряжевских, Л.А. Биотехнологии в основе продуктивного долголетия КРС / Л.А. Кряжевских // Сельскохозяйственные вести. – 2010. - №3. – С. 48.
12. Лаптев, Г.Ю. Комбикорма и микрофлора рубца высокоудойных коров / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Ильина // Современное производство комбикормов «Комби корма – 2010»: материалы пятой междунар. конференции. Москва, 22-24 ноября 2010. – М., 2010. С. 89-100.
13. Романов, В.Н. Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных / В.Н. Романов, С.В. Воробьева, В.Г. Двалишвили, В.М. Дубо резов, М.Г. Чабаев, Р.В. Некрасов, Г.В. Иванова, Г.Ю. Лаптев, Л.А. Ильина // Ме тодические рекомендации. Дубровицы. - ВИЖ. 2011.
Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967) 65-13- (8-4967) 65-15- Сдано в набор 08.02.2012. Подписано в печать 09.02. Заказ № 8. Печ. л. 1,0. Тираж 150 экз.
Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии