Разработка тест- систем для оценки мукозального и клеточного иммунитета птиц
На правах рукописи
Ирза Анна Викторовна РАЗРАБОТКА ТЕСТ- СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ МУКОЗАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПТИЦ 03.02.02 «Вирусология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир – 2012 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.
Владимир Научный руководитель – кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, Старов Сергей Константинович
Официальные оппоненты: Цыбанов Содном Жамьянович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биофизики ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров Смоленский Владимир Иванович доктор биологических наук, профессор, заместитель директора ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») г.
Москва Ведущая организация – Государственное научное учреждение «Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии), г. Москва
Защита диссертации состоится 15 мая 2012 г. в «10 00» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г.
Владимир, мкр. Юрьевец
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Автореферат разослан «» апреля 2012 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ» доктор биологических наук А.П. Пономарев 1.
Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы. Поверхности слизистых респираторного и желудочно-кишечного тракта представляют собой основные ворота для проникновения большинства патогенов, поражающих птиц. Защитные реакции слизистых оболочек играют роль наружного барьера, предохраняя организм от воздействия различной патогенной микрофлоры. Этот тип иммунного ответа получил название иммунитета слизистых оболочек или мукозального иммунитета. Одно из перспективных направлений совершенствования иммунологических препаратов представляет конструирование мукозальных вакцин, главными компонентами которых являются специфический антиген и адъюванты, обладающие мукоадгезивной активностью, вводимые интраназально или перорально [2, 3, 13].
Преимуществом мукозальных вакцин при локальной иммунизации является их высокая безопасность, а также формирование не только местной защиты слизистых оболочек, но и системного иммунного ответа. Разработка методов оценки мукозального и клеточного иммунитета необходима для определения типа, динамики и направления иммунного ответа при изучении резистентности организма птиц к возбудителям болезней или эффективности вакцинации [7, 9, 12].
В связи с этим исследования по разработке различных количественных и качественных методов, сравнению и установлению корреляции между ними с целью построения общей картины иммунного ответа приобрели актуальность.
1.2. Степень разработанности проблемы. Вопросам оценки клеточного и мукозального иммунитета птиц и взаимодействия их с гуморальными факторами защиты посвящены работы ряда зарубежных авторов [7, 8, 10, 12, 13]. Lambrecht B. и сотр. (2004) предложили сэндвич-вариант ИФА для выявления -интерферона [4]. AL-Garib S.O. и сотр. (2003) с помощью ИФА определили кинетику и распределение классов иммуноглобулинов к вирусу ньюкаслской болезни (ВНБ) [8]. Применение метода проточной цитофлуориметрии позволило количественно охарактеризовать субпопуляции лимфоцитов. В работах Dalgaard T.S. и сотр. (2010), Fair J.M. и сотр. (2008), Bridle B.W. и сотр. (2006) показана их зависимость от возраста птицы и типа иммунного ответа [7, 9, 11]. Kaizer Р. и сотр. (2000) предложили методы исследований клеточного иммунитета по экспрессии цитокинов на основе ПЦР [6]. В составе мукозальных препаратов для вакцинопрофилактики болезней птиц L. Illum и сотр. (2001), F. Rauw и сотр. (2010) были испытаны новые типы вакцинных адъювантов и описаны способы оценки их эффективности [5, 12].
Однако данные, полученные разными исследователями при изучении иммунных реакций птиц, имеют большие отличия и носят противоречивый характер. В РФ Колабской Л.С. (1987) были предложены методы исследований отдельных направлений клеточного иммунитета птиц, но в комплексе глубокого изучения различных факторов иммунного ответа не проводилось [1].
До текущего времени надёжных и достоверных диагностических тест-систем по оценке мукозального и клеточного иммунитета не разработано.
1.3. Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в разработке тест-систем для оценки мукозального и клеточного иммунитета птиц. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Оптимизировать методы отбора проб секреторных жидкостей с поверхностей слизистых оболочек для получения качественных образцов, позволяющих проводить оценку мукозального иммунитета.
2. Разработать методы комплексной оценки иммунитета:
- клеточного (иммунофенотипирование и оценка пролиферации лимфоцитов, анализ экспрессии цитокинов, количественное определение интерферона;
- мукозального (выявление иммуноглобулинов классов IgА, IgG, IgM в секреторных жидкостях);
- гуморального (выявление специфических иммуноглобулинов класса M).
3. С помощью разработанных методов изучить иммунный ответ цыплят на введение различных вакцинных препаратов против НБ: коммерческие живые и инактивированные вакцины;
инактивированные вакцины, содержащие мукозальные адъюванты.
4. Определить взаимосвязь между изучаемыми показателями местных факторов защиты и гуморального иммунитета.
5. Изучить зависимость между уровнем защиты и параметрами иммунного ответа вакцинированной птицы до и после контрольного заражения высоковирулентным вирусом НБ с помощью разработанных методов.
1.4. Научная новизна исследований. Впервые в отечественной ветеринарной лабораторной диагностике разработаны методы комплексной оценки гуморального, мукозального и клеточного иммунитета птиц с использованием современных лабораторных тест-систем. Испытаны адьюванты в составе экспериментальных вакцин против НБ для местного применения. На биологической модели с контрольным заражением цыплят высоковирулентным вирусом НБ установлены параметры местных и системных иммунных реакций, обеспечивающие устойчивость птиц к заболеванию и гибели.
1.5. Практическая значимость работы. По результатам исследований разработаны и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 7 методических указаний и рекомендаций по комплексной оценке иммунитета птиц, которые используются в лабораторной практике.
1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертации приведены результаты исследований по разработке методов оценки клеточного и мукозального иммунитета птиц и их применению для изучения иммунного ответа цыплят на введение различных вакцин против НБ, что соответствует пунктам 6, 7, 10 паспорта специальности.
Материалы диссертации 1.7. Апробация результатов работы.
представлены, опубликованы и обсуждены на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (г.
Покров, ГНУ ВНИИВВиМ, 2009 г.), международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2010 г.), заседаниях учёного совета ФГБУ "ВНИИЗЖ" 2005-2009 гг., в материалах международной конференции по мукозальным вакцинам в г. Порто (Португалия, 2008 г.).
1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.9. Основные положения, выносимые на защиту. Разработанные методы комплексной оценки иммунного ответа. Результаты их применения для изучения иммунного ответа цыплят на введение различных вакцинных препаратов против НБ: живых и инактивированных вакцин, инактивированных вакцин с мукозальными адъювантами. Определение взаимосвязи между показателями местных факторов защиты и гуморальным иммунитетом.
1.10. Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение и выводы. Список используемой литературы включает 210 источников, из которых иностранных. Работа включает 33 таблицы и иллюстрирована 30 рисунками.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2004-2011 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.
1.11. Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали сотрудники лаборатории диагностики болезней птиц: М.А. Волкова, И.А. Чвала, Н.С. Мудрак, за что автор выражает им признательность.
2. Собственные исследования 2.1. Материалы Инактивированный АЭЭИ и концентрированный Антиген.
ультрацентрифугированием вирус НБ, штамм «Ла Сота», полученный культивированием в 9-11-сут. эмбрионах СПФ-кур. Для изготовления вакцин использовали препарат антигена с гемагглютинирующей активностью 13 log2 и концентрацией белка 0,4 мг/мл, определенной по методу Бредфорд.
Животные. Серонегативные к вирусу НБ цыплята 20-23-сут. возраста кросса “Хайсекс белый”, а также цыплята, выведенные из СПФ КЭ фирмы “Lohman Tierzucht” (Германия).
Вирус контрольного заражения. Использовали высоковирулентный вирус НБ из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» NDV/Chicken/Rus/Amursky/1057/ Птиц заражали внутримышечно (в/м) в область бедра в дозе 10 6 ЭИД50/0,5 мл.
Иммуноспецифические компоненты реакции: БСА (Sigma, США);
антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты к IgА, IgМ и IgG кур (Serotec, Англия);
моноклональные антитела, меченные FITC, к CD4, СD8, СD (SouthernBiotest, США);
моноклональные антитела, меченные фикоэритрином, к CD4, CD45 (SouthernBiotest, Serotec, США);
стрептавидиновый иммунопероксидазный конъюгат к IFN- кур, рекомбинантный куриный IFN-, антикуриные IFN- - улавливающие антитела, антикуриные IFN- антитела с биотином - детекторные антитела (BioSource, США).
2.2. Методы 2.2.1. Выделение суммарной РНК из селезенок кур проводили с помощью набора для выделения РНК фирмы БИОКОМ (г. Москва) по инструкции производителя.
2.2.2. ПЦР-РВ для оценки уровня экспреcсии цитокинов. Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью AMV-ревертазы (Promega, США). Для этого 3 мкл суммарной РНК, 1 мкл праймеров-гексамеров (5 пМ) прогревали при 96С 1 мин. Затем быстро охлаждали на льду и инкубировали 15 мин. Добавляли 0,5 мкл 10мМ р-ра dNTPs, 5х буфера для обратной транскриптазы и 1 ед. обратной транскриптазы, смесь прогревали при 20С мин и при 45С 25 мин.
Для постановки ПЦР РВ использовали ранее опубликованные праймеры (5 пМ) и зонды Taqman (1 пМ) на IFN-гамма и IL-2, 4, 6, 8, 10 [Kaiser P., 2003;
Faizal M., 2007]. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры и зонд на мРНК белка GAPD-H [Kaiser P., 2003;
Markowski-Grimsrud C.J., 2003].
Cостав реакционной смеси: 2,5 мкл буфера 10x c референтным красителем ROX;
2,5 мкл dNTPs 2,5 мМ;
2,5 мкл MgCl2 25 мМ;
0,2 мкл ДНК Taq полимеразы;
2,5 мкл воды. Температурный режим реакции: 95С - 5 мин и циклов: 95С - 20 сек, 58С - 40 сек и 72С - 30 сек.
2.2.3. Изготовление образцов вакцин.
Экспериментальные вакцины против НБ c мукозальными адъювантами были следующего композиционного состава: №1 АГ ВНБ+САР+IL-2 (антиген вируса НБ и иммуностимулирующие вещества:
частицы фосфата кальция (САР) + IL-2);
№2 АГ ВНБ+хитозан +IL-2;
№3 АГ ВНБ+ФБР+IL-2;
№4 АГ ВНБ+ФБР. В автореферате отражены данные по образцам №2 и №3.
Живая вакцина. Живая сухая вакцина против НБ из штамма «Ла Сота» производства ФБГУ «ВНИИЗЖ». Биологическая активность 9,75 ± 0,3 lg ЭИД50/мл.
Вакцинный препарат Инактивированная эмульсионная вакцина.
готовили, диспергируя на лабораторном гомогенизаторе 30 весовых частей инактивированного антигена ВНБ в 70 весовых частях масляного адъюванта Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция).
2.2.4. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Для выявления антител к вирусу НБ в РТГА использовали коммерческий набор (ФБГУ «ВНИИЗЖ») согласно инструкции по применению. Протективным титром считали разведение сывороток 1:16.
2.2.5. Непрямой вариант ИФА. Очищенный концентрированный антиген вируса НБ (0,5-1,0 мкг на лунку) в КББ сорбировали в лунках полистироловых планшетов и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. После блокирования 1% раствором бычьего сывороточного альбумина вносили контрольные и исследуемые пробы в рабочем разведении. Связавшиеся антитела определяли добавлением иммунопероксидазных препаратов антикуриных антител к IgG, IgM и IgA. В качестве хромогена добавляли субстрат АБТС. Результат учитывали, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм. Титр антител в испытуемых пробах определяли по конечной точке титрования (отношение оптической плотности пробы к среднему значению отрицательного контроля 2 считали положительным).
2.2.6. Выделение лимфоцитов из периферической крови кур. Кровь обрабатывали раствором ЭДТА и центрифугировали в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS. Наслаивали 2 мл крови, разведённой 1:1 раствором среды RPMI 1640, на 3 мл Ficoll-Paque, и центрифугировали 30 мин при 400 g.
Выделенную фракцию лимфоцитов отмывали. Осадок ресуспендировали в мкл ФБР. Подсчет клеток проводили в счётчике клеток Countess Automated Cell Counter. Концентрацию лимфоцитов доводили раствором ФБР до 106- клеток/мл.
2.2.7. Выделение лимфоцитов из ткани селезёнки кур. Отобранные в соответствии с правилами асептики селезенки помещали в стерильный холодный ФБР. Далее готовили суспензию, осторожно пропуская селезенки через стерильное нейлоновое сито в соответствующее количество среды RPMI 1640 (1:10 от массы пробы). Клеточную суспензию наслаивали на градиент Ficoll-Paque в соотношении 2/3 и центрифугировали при 400 g в течение мин. Дальнейшие этапы идентичны процессу выделения лимфоцитов периферической крови.
Для статистической 2.2.8. Статистический анализ материалов.
обработки данных использовали компьютерную программу Statistica: Basic Statistics and Tables.
2.3. Результаты собственных исследований 2.3.1. Разработка методов 2.3.1.1. Отбор проб секреторных жидкостей. Для отбора лакримальной жидкости присыпали несколько мелких кристаллов хлорида натрия в глаз птице, через 1 мин собирали накопившуюся жидкость в пробирки.
Трахеальные смывы отбирали при помощи стерильных ватных тампонов, после чего тампоны помещали в пробирки с 0,5 мл ФБР, затем инкубировали на шейкере-инкубаторе при 160 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре.
2.3.1.2. Оптимизация метода отбора и окрашивания пейеровых Для проведения процедуры окрашивания промытый участок бляшек.
кишечника пережимали корнцангом, заливали 20-30 см3 раствора эозина. Через 1 мин эозин выливали и вводили 10-20 см3 разведенного раствора красителя mCV. Серозные и слизистые поверхности сегмента осматривали для определения проявившихся участков красно-розового цвета на фоне фиолетового.
2.3.1.3. Разработка метода выявления специфических к вирусу НБ иммуноглобулинов (IgA, IgM и IgG) в непрямом варианте ИФА. В ходе работы осуществляли подбор оптимальных параметров постановки реакции и определяли позитивно-негативный порог (табл.1).
Таблица Оптимизация условий постановки реакции Позитивно – негативный порог реакции Рабочие разведения Пробы проб отрицательные сомнительные положительные Трахеальные 1:2 1:2 1:2 1: смывы Слёзная 1:20 1:20 1:20 1: жидкость Сыворотки 1:100 1:100 1:200 1: крови Чувствительность выявления специфических к вирусу НБ иммуноглобулинов трех классов в секреторных жидкостях и сыворотках крови составила 96,0 - 99,3%. Специфичность составила 97,3 - 99,3%. Каждый образец исследовали в непрямом варианте ИФА в трех повторностях. Отклонения в титрах не превышали величину одного 2-кратного разведения, что свидетельствует о воспроизводимости результатов реакции.
2.3.1.4. Разработка метода подготовки проб для иммунофенотипирования и количественной оценки субпопуляций лимфоцитов с использованием проточной цитофлуориметрии. Были оптимизированы параметры пробоподготовки: рабочее разведение моноклональных антител с флуоресцентной меткой (1:25) и режим инкубации специфических компонентов реакции (30 мин при 40°С).
Количественный анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре BD FACS Calibur (Becton, Dickinson, США), имеющем лазер с длиной волны 488 нм. Измерение и обработку полученных результатов осуществляли с использованием программного обеспечения Cell Quest Pro 1.0.
2.3.1.5. Разработка метода оценки пролиферативной активности лимфоцитов. Пролиферация лимфоцитов - это ответ клеток памяти на повторное воздействие антигена in vitro. Для оценки пролиферативной функции клеток используют митогенную или антигенную стимуляцию in vitro, которая довольно близко воспроизводит активацию специфическими антигенами. В последнее время для оценки клеточной пролиферации широко применяется колориметрический метод, основанный на использовании реагента AlamarBlue.
Подбор оптимальных параметров постановки реакции проводили, оценивая пролиферативную активность лимфоцитов крови и селезенки кур, иммунизированных интраназально живой вакциной и инактивированной вакциной против НБ с мукозальными адъювантами. При тестировании различных митогенов и антигена в разных концентрациях (КонА, IL-2, PMA, вирус НБ) наибольший индекс стимуляции был отмечен при использовании РМА в концентрации 5 мг/мл и вируса НБ в разведении 1:500. Оптимальное время инкубации составило 48 часов.
2.3.1.6. Разработка метода количественного определения куриного гамма-интерферона. IFN- относится к основным противовоспалительным цитокинам и является индуктором клеточного звена иммунитета. При разработке сэндвич-варианта ИФА в качестве улавливающих антител к IFN– использовали фракцию иммуноглобулинов IgG из гиперимунных сывороток крови кроликов. Были определены рабочие разведения: улавливающих антител - 1:500, детекторных антител - 1:1500 и антивидового конъюгата - 1:3000.
Специфичность метода показана отсутствием перекрестной реакции с пробами лимфоцитов кролика и моноклональными антителами к другим цитокинам. Чувствительность реакции оценивали по минимально определяемой концентрации IFN–, используя панель с калибровочными образцами рекомбинантного интерферона. Она составила не менее 30 пг/мл.
2.3.1.7. Разработка метода анализа экспрессии цитокинов в ПЦР-РРВ.
Определение экспрессии цитокиновых генов в исследуемом материале дает возможность на ранних стадиях иммунного ответа определить эффективность вакцины. Для этого был разработан метод количественного анализа экспрессии цитокинов с помощью ПЦР в режиме реального времени. При этом определяли отношение количества копий гена-мишени в исследуемом образце к количеству копий гена-калибратора. В качестве образца-мишени использовали РНК, выделенную из проб лимфоидных органов птиц опытных групп. Образец калибратор - РНК, выделенная из проб от птиц контрольной группы. Для выявления ложноотрицательных результатов и нормализации значений Сt использовали эндогенный внутренний контроль (GAPDH). Используемые праймеры: IFN-, IL-1, IL-6, IL-15 [Kaiser P. et al., 2000, 2004], IL-2 [Choi K.D.
et al., 2000], IL-10 [Rothwell L. et al., 2004].
2.3.2. Применение разработанных методов для комплексной оценки иммунного ответа Была проведена апробация разработанных методов в экспериментах с применением коммерческой инактивированной эмульсионной вакцины, живой вакцины и инактивированной вакцины с мукозальными адъювантами.
2.3.2.1. Комплексная оценка иммунного ответа после применения коммерческой эмульсионной инактивированной вакцины. 25 цыплят 20 сут возраста 1-кратно привили внутримышечно инактивированной вакциной против НБ в объеме 0,5 см3. 2-я группа птиц такой же численности оставалась интактной (контрольной). Отбор проб проводили до иммунизации и с интервалом в 1 нед. после нее в течение 10 нед. Через 1, 2, 3, 4 и 8 нед. после вакцинации проводили контрольное заражение цыплят высоковирулентным вирусом НБ.
При исследовании сывороток крови через 2 нед после вакцинации и до окончания срока наблюдения 100% проб были положительными в РТГА. В ИФА антитела в максимальных титрах выявляли через 8-10 нед. после вакцинации (табл. 2).
Таблица Титры антител к вирусу НБ в сыворотках крови цыплят, привитых инактивированной эмульсионной вакциной (ИФА и РТГА) Средний титр антител к вирусу НБ Вводимый недели после вакцинации до инокулянт вакц. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 618 1976 4660 8000 9600 11520 23040 35840 30720 НБ+ISA70 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ИФА* 41 143 523 1201 2011 1244 3455 2474 3544 ± 23 50 50 50 50 50 100 50 63 50 Контроль ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 21 12 21 11 16 32 21 22 6 6.82 8.92 10.63 10.72 10.77 10.92 10.76 9.43 9.58 8. 2. РТГА(log2) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± НБ+ISA70 ± 2.3 4.5 5.4 4.7 5.2 4.6 3.3 3.1 2.1 1. 1. 80% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 0% Контроль 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% *титр выражен как среднее арифметическое значение по группе ± стандартная ошибка среднего.
в ИФА максимальные При исследовании секреторных жидкостей титры антител IgG в трахеальных смывах цыплят опытной группы были установлены с 4 по 10 нед. В слезной жидкости пик выработки IgG приходился на 5-9 нед., достигая максимума к 9-й нед. Содержание IgA и IgM в секреторных жидкостях цыплят опытной и контрольной групп отличалось незначительно (рис. 1).
30 1 2 20 Титр IgG Титр IgG 10 0 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 3456789 Недели после вакцинации Недели после вакцинации А В Рис.1. Результаты выявления специфических к вирусу НБ антител (IgG) в трахеальных смывах (А) и слезной жидкости (В) Примечание: 1-НБ+ISA70;
2-контроль Таким образом, инактивированная эмульсионная вакцина против НБ индуцировала гуморальный иммунный ответ в ранние сроки и на высоком уровне. Антитела в РТГА и ИФА (IgG) выявляли уже через 1-2 нед.
Секреторные антитела выявляли в более поздние сроки - через 4 нед.
2.3.2.2. Исследование иммунного ответа цыплят на введение адъювантами. Для мукозальных вакцин против НБ c различными изучения комплексного иммунного ответа цыплят на введение мукозальных вакцин против НБ c различными адъювантами были сформированы 3 группы по 6 гол из 23-сут. коммерческих цыплят. Птицам 1-й и 2-й групп вводили экспериментальные образцы вакцин против НБ: №1 - АГ ВНБ+хитозан+IL-2 и №2 – АГ ВНБ+ФБР+IL-2. 3-я группа оставалась интактной и служила контролем. Вакцинацию проводили интраназально в объёме 0,2 см3, 3-кратно с интервалом в 6 сут. Отбор проб крови и трахеальных смывов от цыплят проводили до иммунизации и с недельным интервалом после 3-й вакцинации.
Через 21 сут. после 3-й вакцинации цыплят заражали высоковирулентным вирусом НБ в/м в область бедра в дозе 10 6 ЭИД50/0,5 мл.
В ходе эксперимента установлено, что рекомбинантный IL-2 повышал уровень гемагглютинирующих антител к антигену ВНБ при их совместном введении цыплятам (табл. 3). В сыворотках крови цыплят опытных групп в ИФА был отмечен низкий уровень IgM и высокие уровни IgG в течение 4 нед после 3-й вакцинации (рис.2).
Таблица Титры антител к вирусу НБ в сыворотках крови цыплят, иммунизированных 3-кратно мукозальными вакцинами Средний титр антител к вирусу НБ в РТГА, log № Вакцина до срок после третьей иммунизации, нед.
вакцинации 1 2 3 4 1 6,2 ± 2,8 5,6 ± 1,9 4,0± 1,0 5,2± 0,4 2,8 ±1, АГ ВНБ + (6/6) (5/6) (5/6) (5/5) (2/5) хитозан+IL- 1,6 ±0, 2 9,3± 1,2 6,7 ± 2,1 5,0 ±1,3 6,4 ± 1,1 5,0 ± 1, АГ ВНБ+ФБР+IL- (0/5)* (6/6) (6/6) (6/6) (5/5) (5/5) 3 0 0 0 0 1,2± 1, Контроль (0/6) (0/6) (0/6) (0/6) (0/6) *положительные пробы/общее количество проб 7000 6000 Титр IgG 5000 0 1 2 3 4 Недели после 3-й вакцинации Рис. 2. Результаты выявления специфических к вирусу НБ IgG в ИФА в сыворотках крови цыплят после вакцинации мукозальными препаратами Примечание: №1 - АГ ВНБ+хитозан+IL-2, №2 – АГ ВНБ+ФБР+IL-2, №3-контроль Исследование секреторных жидкостей. Включение в состав вакцин хитозана и IL-2 оказывало влияние на мукозальный иммунный ответ цыплят (рис. 3, 4).
200 175 2 250 150 3 Титр IgA Титр IgG 0 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 Недели после 3-й вакцинации Недели после 3-й вакцинации Рис.3. Динамика титров антител к вирусу НБ в слезной жидкости Примечание: №1 - АГ ВНБ+хитозан+IL-2, №2 – АГ ВНБ+ФБР+IL-2, №3-контроль У цыплят после иммунизации препаратами №1-2 отмечен более высокий уровень титров антител в секреторных жидкостях по сравнению с контролем.
IgM в обеих группах регистрировали через 1 нед, IgG - спустя 1-2 нед., IgA - 1- нед. после 3-й вакцинации.
14 12 Титр IgM Титр IgG 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Недели после 3-й вакцинации Недели после 3-й вакцинации Рис.4. Динамика титров антител к вирусу НБ в трахеальных смывах Примечание: №1 - АГ ВНБ+хитозан+IL-2, №2 – АГ ВНБ+ФБР+IL-2, №3-контроль Цитофлуориметрический анализ субпопуляций лимфоцитов.
Определение относительного количества субпопуляций CD4+ и CD8+ в периферической крови цыплят проводили еженедельно с 1 по 5 нед. после 3-й вакцинации (рис.5).
16 14 1 % CD8+ клеток %CD4+ клеток 12 10 8 2 6 4 2 3 0 1 2 3 4 1 2 3 Недели после 3-й вакцинации Недели после 3-й вакцинации CD4+ CD8+ Рис. 5. Динамика уровня субпопуляций CD8+ и CD4+ клеток в лимфоцитах периферической крови цыплят в разные сроки после 3-й вакцинации мукозальными вакцинами Примечание: №1 - АГ ВНБ+хитозан+IL-2, №2 – АГ ВНБ+ФБР+IL-2, №3-контроль Иммунизация цыплят препаратами с комбинированными адъювантами индуцировала увеличение продукции CD4+ и CD8+ клеток. Анализируя значения отношения CD4+/CD8+, можно отметить тенденцию к его снижению у цыплят всех групп. Таким образом, введение в состав вакцин IL-2 и комбинированных адъювантов вызывало изменение фенотипа Т-клеток, особенно через 1 нед. после 3-й вакцинации.
Для определения протективных свойств экспериментальных вакцин через 21 сут. после 3-й вакцинации проводили контрольное заражение цыплят.
Птицы опытных групп оставались живыми и клинически здоровыми, в контрольной группе гибель цыплят отмечена в течение 4 сут. При исследовании фенотипических изменений в иммунограмме наблюдали увеличение количества CD4+ и CD8+ клеток в периферической крови цыплят 2-й группы. У цыплят 1-й группы увеличение объёма CD4+ клеток было менее существенным. Отношение CD4+/CD8+ возросло в обеих группах. Количество CD4+ и CD8+ клеток в спленоцитах цыплят опытных групп после контрольного заражения было примерно на одном уровне (рис.6).
4,0 А Г В Н Б + хи т о з а н + IL - 3,5 0 А Г В Н Б + Ф Б Р + IL - 3,0 0 К он трол ь CD4+/CD8+ 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Кровь Кровь С ел езенка Д о К.З. П о с л е К.З.
Рис.6. Динамика уровня CD4+/CD8+ до и после контрольного заражения на 21 сутки после 3-й вакцинации мукозальными вакцинами ВНБ-специфический клеточный иммунный ответ оценивали по определению продукции гамма-интерферона лимфоцитами селезёнки после антигенной активации спленоцитов in vitro. У цыплят двух групп, иммунизированных мукозальными вакцинными препаратами против НБ, на сут. после контрольного заражения был установлен положительный ответ на специфическую стимуляцию спленоцитов антигеном вируса НБ. По результатам опыта было показано, что IL-2 обладает адъювантной активностью и усиливает мукозальный, гуморальный и клеточный иммунный ответ на антиген вируса НБ при его применении на слизистые оболочки.
2.3.2.1. Комплексная оценка иммунного ответа после применения живой вакцины. Для изучения динамики иммунного ответа были сформированы 2 группы 20-сут. цыплят. Цыплята 1-й группы были иммунизированы 1-кратно интраназально живой вакциной в объёме 0,1 см3.
Вторая группа оставалась интактной и использовалась как контрольная.
Для изучения гуморального иммунного ответа использовали РТГА и ИФА. Пик накопления специфических антител в РТГА у птиц опытной группы был отмечен через 2 нед. после вакцинации (табл. 4).
Таблица Динамика титров антител к вирусу НБ в сыворотках крови цыплят, привитых живой вакциной из штамма «Ла Сота» Средний титр антител к вирусу НБ в РТГА, log Группы птиц сроки после иммунизации, сут.
до № вакцинации 7 14 21 К.З.
1 Опытная группа 6,5+ 0,38 7,2 + 0,29 5,0 + 2,35 11,75 + 0, 2,27 + 0, 2 Контроль 1,0 + 0,29 0,4 + 0,16 0 В ИФА пик уровня IgM был отмечен на 7 сут. после вакцинации с последующим снижением. Уровень IgG возрастал, начиная с 7 сут. после вакцинации, достигая максимума к 21 сут. В контрольной группе в течение всего срока наблюдения положительных проб выявлено не было (рис. 7).
600 контроль 500 опыт титр IgM 0 7 14 21 кз Сутки после вакцинаци Рис.7. Результаты выявления специфических к вирусу НБ иммуноглобулинов класса G и M в сыворотках крови цыплят В слёзной жидкости Исследование секреторных жидкостей.
вакцинированных цыплят вирусспецифические антитела IgM выявляли, начиная с 7, а IgG и IgA - c 14 сут. после вакцинации. Пик выработки IgM отмечали на 7 сут., IgA - на 14, а IgG - на 21 сут. после вакцинации.
В трахеальных смывах вакцинированных цыплят максимальное количество IgM обнаруживали на 7 сут. после вакцинации. Незначительное повышение уровня IgG отмечали на 21 сут. Иммуноглобулины класса A на протяжении опыта выявлены не были (рис. 8).
контроль контроль 160 опыт опыт 140 Титр IgG Титр IgM 60 0 7 14 0 7 14 Cутки после вакцинации Cутки после вакцинации А В Рис. 8. Выявление специфических к вирусу НБ IgМ(А) и IgG(В) в слёзной жидкости цыплят после вакцинации живой вакциной Цитофлуориметрический анализ субпопуляций лимфоцитов. Для оценки эффективности стимуляции клеточного иммунитета у цыплят была проведена сравнительная оценка фенотипических изменений в иммунограмме птиц (рис.9).
контроль контроль 3 опыт опыт 2,5 0, CD4/CD CD4/CD 0, 1, 0, 0, 0, 0 1 2 3 7 14 21 КЗ 0 1 2 3 7 14 21 КЗ Сутки после вакцинации Сутки после вакцинации А В Рис.9. Динамика отношения CD4+/CD8+ в лимфоцитах крови (А) и селезенки (В) цыплят в разные сроки после вакцинации живой вакциной Анализируя значения отношения CD4+/CD8+ в лимфоцитах селезенки в течение 1-3 нед. после вакцинации, можно отметить общую тенденцию к его снижению у двух групп. В лимфоцитах периферической крови снижение отношения CD4+/CD8+ отмечали на 7 сут.
Данные иммунофенотипирования лимфоцитов крови цыплят после вакцинации живой вакциной демонстрируют снижение иммунорегуляторного индекса вследствие повышения уровня CD8+ клеток.
Специфическую активность лимфоцитов после антигенной активации in vitro оценивали по определению продукции гамма-интерферона. В лимфоцитах селезенки продукцию IFN- в ответ на специфическую стимуляцию начинали обнаруживать со 2-й нед. после вакцинации (у 50% цыплят). К 3-й нед у всех цыплят опытной группы был отмечен высокий уровень IFN-, в 16 раз превышающий таковой у непривитых птиц, что свидетельствует о стимуляции клеточного звена иммунного ответа.
Для определения протективных свойств вакцин проводили контрольное заражение цыплят высоковирулентным вирусом НБ через 3 нед. после вакцинации. Вакцина обеспечила полную защиту привитых птиц. В контрольной группе отмечали гибель всех цыплят на 4-5 сут. после заражения.
Следует отметить, что часть цыплят опытной группы (4/10), не имевших сывороточных антител к вирусу НБ на протективном уровне (4 log2), не погибла при заражении. Это можно объяснить созданием у них устойчивости за счет местных секреторных антител и факторов клеточного иммунитета.
Таким образом, использование предложенных методов для оценки поствакцинального иммунитета подтвердило данные о том, что:
1) применение инактивированной вакцины индуцирует более напряженный гуморальный иммунный ответ (за счет циркуляции иммуноглобулинов класса G и гемагглютинирующих антител);
2) живая вакцина и вакцины с мукозальными адъювантами в большей степени индуцируют выработку секреторных иммуноглобулинов (мукозальный иммунитет), повышение уровня цитотоксических Т-лимфоцитов (СD8+), интерферона- и вызывают поляризацию дифференцировки T-лимфоцитов по пути Th1.
4. Выводы Усовершенствованы методы отбора проб секреторных жидкостей co 1.
слизистых оболочек, что позволяет получать качественные образцы для оценки мукозального иммунитета.
Разработаны методы комплексной оценки клеточного иммунитета.
2.
Иммунофенотипирование лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии и анализ экспрессии цитокинов методом ПЦР-РРВ позволили спрогнозировать тип, динамику и направление иммунного ответа.
Для определения функциональной активности лимфоцитов и способности иммунной системы к активации разработан метод количественного определения интерферона в сэндвич-варианте ИФА, минимальная чувствительность которого составила 30 пг/мл.
Для выявления иммуноглобулинов трех классов (IgА, IgG, IgM) в 3.
секреторных жидкостях и специфических иммуноглобулинов класса M в крови разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа, обладающий специфичностью (97,3 - 99,3%) и чувствительностью (96,0 99,3%).
С помощью разработанных методов установлено, что иммунная реакция 4.
цыплят на введение живой вакцины против НБ из штамма «Ла Сота» развивается через 1 нед. и характеризуется преимущественно клеточными факторами защиты, выработкой интерферона и секреторных антител;
- на коммерческие инактивированные эмульсионные вакцины - через 2 нед., при этом основное звено защиты составляет гуморальная реакция;
- на инактивированные вакцины, содержащие мукозальные адъюванты, через 1-2 нед. и сочетает клеточные, гуморальные и мукозальные факторы защиты.
После контрольного заражения птиц, вакцинированных живой вакциной, 5.
отмечали следующие иммунные реакции: повышение уровня IFN- (в раз по отношению к контролю);
снижение иммунорегуляторного индекса вследствие роста уровня CD8+ клеток и повышение уровня гуморальных антител (с 5 log2 до 11, 75 log2).
Показано, что цыплята, не имевшие сывороточных антител на 6.
протективном уровне, были устойчивы к контрольному заражению вследствие действия факторов клеточного и мукозального иммунитета.
5. Практические предложения На основании результатов экспериментальных исследований по теме диссертации разработаны, одобрены учёным советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие нормативные документы:
«Методические указания по выявлению специфических к вирусу ньюкаслской болезни иммуноглобулинов IgА, IgМ и IgG в секреторных жидкостях кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (утверждены 23.11.2006 г.);
«Методические рекомендации по отбору проб лакримальной жидкости, смывов зоба и респираторного тракта» (утверждены 08.05.2008 г.);
«Методические рекомендации по отбору и окрашиванию пейеровых бляшек» (утверждены 08.06.2008 г.);
«Методические рекомендации для количественного определения куриного интерферона - в биологических жидкостях и культуральных суспензиях методом ИФА» (утверждены 16.12.2008 г.);
«Методические рекомендации по подготовке проб для иммунофенотипирования и количественной оценке субпопуляций лимфоцитов с использованием проточной цитофлуориметрии» (утверждены 12.09.2008 г.);
«Методика анализа экспрессии цитокинов кур с помощью ПЦР в режиме реального времени при автоматизации сбора реакционной смеси» (утверждена 16.12.2008 г.);
«Методические рекомендации по оценке пролиферативной активности лимфоцитов, выделенных из крови и селезенки кур, с использованием Alamar Blue» (утверждены 23.11.2010 г.) Разработанные методические указания и рекомендации используются в лабораторной практике при проведении исследований по оценке мукозального и клеточного иммунитета.
6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Оценка иммунного ответа у цыплят, привитых мукозальными вакцинами против ньюкаслской болезни / М. А. Волкова, А. В. Ирза, И. А. Рунина [и др.] // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С. 20-25.
2. Адъювантное действие хитозана при интраназальной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни / А.В. Ирза, М.А. Волкова, И.А. Рунина [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 40-42.
3. Применение иммуноферментной тест-системы для выявления специфических IgA, IgM и IgG к вирусу ньюкаслской болезни птиц в секреторных жидкостях и сыворотках крови кур / М. А. Волкова, А.В. Ирза, М.Е. Качалова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 176-185.
4. Непрямой жидкофазный блокирующий вариант иммуноферментного анализа для выявления и количественного определения антигена вируса ньюкаслской болезни / М. А. Волкова, А.В. Ирза, М.Е. Качалова [и др.] // Ветеринарна медицина: мiжвiд. тем. наук. зб. -Харкiв, 2007.- Вип.88.- C. 42 48.
5. Разработка и применение непрямого "сэндвич-варианта" иммуноферментного анализа для количественной оценки уровня интерферона гамма / А. В. Ирза, И. А. Рунина, О. С. Осипова [и др.] // Актуальные проблемы инфекц. патологии вет. медицины: материалы конф.
молодых ученых – Покров, 2009. - С. 168-173.
6. Иммуногенность мукозальных вакцин против ньюкаслской болезни / М. А.
Волкова, И. А. Рунина, А. В. Ирза [и др.] // Ветеринарна медицина: мiжвiд.
тем. наук. зб. – Харкiв, 2010. - Вип. 94. - С. 201-203.
7. Изучение адъювантного действия рекомбинантного интерлейкина-2 при интраназальной вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни / М. А.
Волкова, А. В. Ирза, С. В. Фролов [и др.] // Ветеринарна медицина. мiжвiд.
тем. наук. зб. - Харкiв, 2011. - Вип. 95. - С. 279-282.
8. Иммунный ответ у цыплят после введения мукозальных инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни / М. А. Волкова, И. А. Рунина, А. В.
Ирза [и др.] // Птахiвництво: –Материалы IV Мiжнар. науч.-практ. конф. Харкiв, 2008. - Вип. 62, ч.2. - С. 266-275.
7. Список литературы 1. Колабская Л.С. Иммуноглобулины птицы // Птицеводство. - 1987. № 9. - С.
35-36.
2. Основы инфекционной иммунологии / В.В. Макаров, А.А. Гусев, Е.В.
Гусева, О.И. Сухарев. - Владимир: Фолиант, 2000. – 176 С.
3. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. // Иммунология. – М.: Мир, 2000. - 592 C.
4. Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-gamma in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation / B. Lambrecht, M. Gonze, G. Meulemans, T.P. van den Berg // Avian Pathology. - 2004. - Vol. 33, №4. - P. 343-350.
5. Chitosan as a novel delivery system for vaccines / L. Illum, I. Jabbal-Gill, M.
Hinchcliffe [et al.] // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2001. - Vol. 51, №3 - P. 81-96.
6. Differential cytokine expression in avian cells in response to invasion by Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis and Salmonella gallinarum / P.
Kaiser, L. Rothwell, E. E. Galyov [et al.] // Microbiology. - 2000. - Vol. 12. - P.
3217-3226.
7. Flow cytometric assessment of antigen-specific proliferation in peripheral chicken T cells by CFSE dilution / T.S. Dalgaard, L.R. Norup, D. Rubbenstroth [et al] // Veterinary Immunology and Immunopathology.-2010. - Vol. 138. - P. 85-94.
8. Immunoglobulin class distribution of systemic and mucosal antibody response to Newcastle disease in chickens / S.O. AL-Garib, AL. Gielkens, E. Gruys [et al.] // Avian Disease. – 2003. - Vol. 47, №1. – P.32-40.
9. Immunophenotyping of chicken peripheral blood lymphocyte subpopulations:
individual variability and repeatability / J.M. Fair, K.J. Taylor-McCabe, Y. Shou, B.L. Marrone // Veterinary Immunology and Immunopathology. - 2008 Vol. 125.
- P. 268-273.
10. Kapczynski D., Kogut M. Measurement of avian cytokines with real-time RT PCR following infection with the avian influenza virus // Avian Influenza Virus Athens, GA. - 2008. - P. 127–134.
11. T lymphocyte subpopulations diverge in commercially raised chickens / B.W.
Bridle, R. Julian, P.E. Shewen [et al.] // Can.J.Vet.Res.-2006.-Vol. 70.-P.183-190.
12. The positive adjuvant effect of chitosan on antigen-specific cell-mediated immunity after chickens vaccination with live Newcastle disease vaccine / F.
Rauw, Y. Gardin, V. Palya [et al.] // Veterinary Immunology and Immunopathology. - 2010. - Vol. 134. - P. 249-258.
13. Virulent Newcastle disease virus elicits a strong innate immune response in chickens / C.A. Rue, L. Susta, I. Cornax [et al.] // J. Gen. Virol.- 2011. - Vol. 92, № 4. - P. 931-939.
8. Список обозначений и сокращений АЭЭИ – димер аминоэтилэтиленимина АГ – антиген АБТС – 2,2–азино-ди-(-3-этилбензтиазолинсульфонат) ВНБ – вирус ньюкаслской болезни ИФА – иммуноферментный анализ КББ – карбонатно-бикарбонатный буфер К.З. – контрольное заражение КЭ –куриный эмбрион KoнA - конканавалин А НБ – ньюкаслская болезнь ПЦР-РРВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени РТГА – реакция торможения гемагглютинации СПФ – животные, свободные от специфических патогенов ФБР – фосфатно-буферный раствор ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота BСA – бычий сывороточный альбумин CD – кластер дифференциации Ct – пороговый цикл dNTP – дезоксирибонуклеозидтрифосфат Ig – иммуноглобулин IL – интерлейкин IFN – интерферон mCV – модифицированный кристалл виолет PMA – форбол-12-миристат-13-ацетат