авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Эпитопное картирование с-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека

На правах рукописи

НАПЕРОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 03.00.23 - биотехнология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научные руководители:

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Кост О.А.

доктор биологических наук Данилов С.М.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Румш Л.Д.

доктор биологических наук, профессор Мягкова М.А.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится «22» декабря 2009 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » ноября 2009 года И. о. ученого секретаря диссертационного совета д.х.н., проф. А.В. Гусаков Актуальность темы. Моноклональные антитела (мАт) благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях мАт используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков. Эпитопное картирование – определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные мАт – является важным шагом для характеристики взаимодействия антиген-антитело. Картирование важно для определения специфичности антител, для предсказания перекрестной реактивности, при разработке вакцин и дизайне лекарственных средств, для понимания фундаментальных аспектов белок-белковых взаимодействий.

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) – Zn-зависимая пептидил дипептидаза, состоящая из двух доменов (N- и С-) в составе одной полипептидной цепи, является одним из главных регуляторов кровяного давления, вовлечен в метаболизм нейропептидов, иммунную и репродуктивную функции. В связи с этим новое знание свойств и особенностей этого фермента может иметь терапевтическое будущее.

Показано, что в крови людей содержатся в низких концентрациях аутоантитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. При развитии таких патологий, как системный склероз, красная волчанка, в крови увеличивается уровень аутоантител к АПФ [Станислав и др., 2001;

Balyasnikova et al., 2002]. Таким образом, данные антитела могут служить индикатором развития патологии. Поэтому картирование эпитопов мАт, специфичных к разным областям на поверхности молекулы фермента, возможно, даст шанс понять развитие данных заболеваний на молекулярном уровне, а также применить полученные знания для диагностики этих патологий.

Ранее была получена панель из 8 мАт к N-домену АПФ и идентифицированы их эпитопы связывания на поверхности белка. Работы по эпитопному картированию N-домена продемонстрировали важный исследовательский, диагностический и даже терапевтический потенциал данных антител: мАт были успешно использованы для количественного определения АПФ в растворе методом ELISA и на поверхности клеток жидкостной цитометрией [Danilov et al., 2003], для исследования структуры и функций АПФ [Skirgello et al., 2006;

Balyasnikova et al., 2007], для доставки ферментов к легочному эндотелию, как метод диагностики легочно-сосудистых заболеваний [Danilov et al., 1989]. С помощью иммунопреципитации клеток мАт ВВ9 к N-домену АПФ было показано, что АПФ экспрессируется гематопоэтическими клетками на всех стадиях гематопоэза [Ramshaw et al., 2001]. Таким образом, возможно, АПФ участвует в физиологической регуляции гематопоэза.

В то же время С-домен АПФ остается практически не изученным с иммунохимической точки зрения.

Целью работы явилось эпитопное картирование С-домена АПФ с помощью панели из 8 мАт, специфичных к С-домену фермента;

определение областей на поверхности С-домена, пространственно сближенных с N-доменом, и построение на основе этих данных модели двудоменного АПФ;

иммунохимическая характеристика АПФ в норме и при развитии ряда системных заболеваний.

Научная новизна и практическая значимость. Определена конкурентность связывания панели из 8 мАт, специфичных к С-домену АПФ, с тестикулярным АПФ (тАПФ), представляющим собой С-домен, содержащий уникальную N-концевую 36 аминокислотную последовательность. Выявлены три пары мАт, эпитопы связывания которых перекрываются друг с другом на поверхности С-домена фермента в значительной степени. На основе полученных данных построена диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с С-доменом АПФ.

Выявлены три пары мАт, которые, связываясь с АПФ человека, не связываются с АПФ шимпанзе, С-домен которого отличается от С-домена человека двумя заменами аминокислотных остатков. Проведен анализ связывания мАт с пятью химерами АПФ, одна из которых содержала N-домен и 125 аминокислотных остатков из С-домена, остальные четыре представляли собой С-домен, в котором ряд аминокислотных остатков заменен на гомологичные из N-домена, и пятью мутантами тАПФ, один из которых содержал замену Asp616Leu, остальные – замены остатков Asn некоторых потенциальных сайтов гликозилирования на остатки Gln.



На основе полученных данных предложено расположение эпитопов связывания 8 мАт на поверхности С-домена фермента.

Выявлены мАт 4Е3, ингибирующие активность тестикулярного АПФ. Для ряда мАт определены константы диссоциации комплексов АПФ-мАт.

Выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена прикрыт N доменом в составе полноразмерного фермента. На основе конкуренции мАт, специфичных к разным доменам фермента, за связывание с соматическим АПФ (сАПФ), выявлены участки на поверхности N- и С-доменов АПФ, пространственно сближенные друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента.

На основе экспериментальных данных впервые предложена модель двудоменного фермента.

Анализ образцов АПФ из почек, легких и семенной жидкости MALDI-TOF спектрометрией показал, что в АПФ из почек и легких гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn685, входящий в эпитопы связывания мАт 3F11 и 2Н9, а в АПФ из семенной жидкости гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn666, располагающийся в эпитопах связывания мАт 1Е10 и 4Е3.

Впервые показано различное связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей: почек, легких, сыворотки и семенной жидкости. Более того, показано, что связывание некоторых мАт с АПФ плазмы крови в норме (АПФ продуцируют эндотелиальные клетки) и при развитии патологии – саркоидоза и болезни Гоше (дополнительным источником АПФ в кровь являются саркоидные гранулемы и макрофаги) – различается. Таким образом, показана возможность применения мАт для выявления АПФ, продуцируемого другими клетками (не эндотелием, как в норме) в крови, полученные данные, возможно, в будущем могут быть использованы для упрощения диагностики саркоидоза и болезни Гоше.

Мутанты и химеры АПФ были любезно предоставлены профессором Е. Sturrock из Университета Кейптауна, ЮАР;

моделирование углеводной цепи, а также открытой конформации С-домена проводили в рамках совместной работы с к.ф.н., с.н.с. Упоровым И.В., плазма крови пациентов с саркоидозом и хроническим обструктивным бронхитом, а также донорская плазма были предоставлены Институтом Фтизиопульмонологии ММА им.

Сеченова, плазма крови пациентов с болезнью Гоше – Медико-генетическим научным центром РАМН;

статистический анализ результатов проводили в рамках совместной работы с к.ф.-м.н., доц. Яровой Е.Б. (Мех.-мат. ф-т, МГУ).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ – 2006» (Москва, 2006);

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007);

VI Симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2007);

IV Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007);

American Thoracic Society International Conference (Toronto, 2008);

Всероссийской школе-семинаре "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2008);

V Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009);

International Conference “Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications” (Arkhangelsk, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части (Глава 4), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Главы 5-10), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 4 таблицы и рисунок. Список литературы включает 178 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПОВ СВЯЗЫВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА ПОВЕРХНОСТИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА Для характеристики связывания мАт с АПФ был выбран метод иммуносорбции, за образованием комплексов фермент-антитело следили по активности фермента, связанного с мАт, сорбированных на планшете. Для этого в лунках полистиролового планшета сорбировали антивидовые антитела – иммуноглобулины козла против иммуноглобулинов мыши, затем мАт (мышиные иммуноглобулины) и, наконец, АПФ. При этом была выбрана насыщающая концентрация иммуноглобулинов козла 10 мкг/мл, которой, как показано ранее, достаточно, чтобы достичь насыщения лунок планшета, концентрации мАт и тАПФ варьировали. В качестве субстрата при определении активности АПФ использовали Hip-His Leu или Z-Phe-His-Leu, дающие при гидролизе продукт His-Leu, накопление которого наблюдали флюорометрически. В результате подбора условий иммуносорбции нами были выбраны следующие концентрации: 3 мкг/мл мАт и 1-6 нМ фермента.

Анализ связывания мАт с рекомбинантным тАПФ показал, что связывание различных мАт с тАПФ отличается в 5 раз (рис. 1).

Сигнал флюоресценции, 3. 2. 2. усл.ед.

Рис. 1. Связывание мАт с рекомбинантным тАПФ.

1. 1. 0. 0. 1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B Моноклональные антитела Относительно низкий сигнал флюоресценции при связывании тАПФ с мАт, например, 1В3, 1Е10, 4Е3 и 3F11 мог быть вызван как худшими константами связывания этих мАт с тАПФ, так и подавлением активности тАПФ антителами. В последнем случае сигнал флюоресценции не будет пропорционален истинному числу комплексов фермент-антитело, поскольку мы оценивали связывание фермента с мАт по активности фермента, измеряемой на планшетах.





При определении активности сАПФ при связывании с мАт с использованием двух субстратов Hip-His-Leu и Z-Phe-His-Leu было показано, что отношение активностей тАПФ, связанного с мАт 1Е10 и 4Е3, по этим двум субстратам (Z-Phe-His-Leu/Hip-His-Leu) составляет около 1,5 (рис. 2), в то время как для других мАт это отношение составляет 1.

2. Z-Phe-His-Leu/Hip-His-Leu 1. Рис. 2. Отношение активности 1. тАПФ, связанного с мАт, по субстрату Z-Hip-His-Leu к активности по субстрату 0. Hip-His-Leu.

0. 1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B Моноклональные антитела Поскольку известно, что Z-Phe-His-Leu/Hip-His-Leu для сАПФ равно 1, для тАПФ – 0,7, а для N-домена – 4,5 [Danilov et al., 2008], то, возможно, мАт 1Е10 и 4Е3 ингибируют частично активность С-домена АПФ. Данные мАт, а также мАт 1В3 и 3F11 нами были проверены на наличие ингибирующей активности в растворе и выявлено одно мАт – мАт 4Е3, которые ингибировали активность тАПФ на 40%. Таким образом, мАт 1В3 и 3F11 не оказывали ингибирующего действия на активность тАПФ, мАт 4Е3 инигибировали активность фермента как в растворе, так и на планшете, в то время как мАт 1Е10 подавляли активность С-домена АПФ только на поверхности планшета.

Для ряда мАт нами были определены константы диссоциации комплексов фермент антитело для тестикулярного нативного и рекомбинантного АПФ методом иммуносорбции, описанным выше (табл. 1).

АПФ мАт Кдисс., нМ Табл. 1. Константы 1В8 4,1±0,5 диссоциации комплексов фермент-антитело, 2Н9 1,6±0, тАПФ нат.* определенные методом 1В3 1,9±0,2 иммуносорбции * и методом плазмонного резонанса **.

3F11 4,3±0, 1В8 3,1±0, тАПФ рек.* 2Н9 2,8±0, сАПФ** 1В8 5,4±0, Для мАт 1В8 также была определена константа диссоциации комплексов с сАПФ методом плазмонного резонанса. В этом случае на поверхности чипа фиксировали поликлональные антитела козла против иммуноглобулинов мыши, затем связывали мАт 1В с поликлональными антителами и, наконец, сАПФ из семенной жидкости. Следует отметить, что константы диссоциации комплексов АПФ-мАт, определенные в условиях, когда лиганд (мАт) иммобилизован (на поверхности планшета или чипа), могут отличаться от констант диссоциации, определенных в растворе.

Для определения количества антигенных областей на поверхности фермента нами была проанализирована способность мАт конкурировать друг с другом за связывание с рекомбинантным тАПФ. Для этого на поверхности полистиролового планшета сорбировали мАт (тестируемые мАт), отдельно в растворе инкубировали тАПФ с избытком мАт (конкурирующие мАт) и выявляли связывание комплексов тАПФ-конкурирующее мАт с тестируемыми мАт. Если комплексы тАПФ-конкурирующее мАт связывались с тестируемыми мАт так же, как и свободный фермент, то мы считали, что эпитопы связывания тестируемых и конкурирующих антител не перекрываются. В том случае, если комплексы тАПФ-конкурирующее мАт не связывались с тестируемыми мАт, то можно утверждать, что эпитопы связывания этих антител в значительной степени перекрываются.

Если происходило лишь ухудшение связывания комплексов тАПФ-конкурирующее мАт с тестируемыми мАт, то можно заключить, что эпитопы связывания двух мАт перекрываются частично. На практике мы считали, что эпитопы связывания двух мАт практически полностью перекрываются, если наблюдается ингибирование связывания комплексов “тАПФ-конкурирующее антитело” более чем на 75%, т.е. степень перекрывания эпитопов связывания двух антител была больше 75%. Степень ингибирования связывания менее чем на 25% свидетельствовала о слабой конкуренции двух мАт. Если степень ингибирования связывания была меньше 10%, мы считали, что это значение входит в ошибку эксперимента и мАт не конкурируют за связывание с тАПФ. Для каждой пары мАт была определена способность конкурировать друг с другом за связывание с тАПФ, при этом оба мАт из каждой пары использовали и как конкурирующие, и как тестируемые.

Полученные результаты представлены на рис. 3, где показана степень ингибирования конкурирующими мАт связывания тестируемых мАт с ферментом.

Рассмотрим, например, тестируемые мАт 2Н9: мАт 3F11 блокируют связывание мАт 2Н9 с тАПФ (рис. 3), мАт 1Е10 и 4Е3 ухудшают связывание мАт 2Н9 с тАПФ, мАт 2В также ухудшают связывание мАт 2Н9 с тАПФ, но в меньшей степени, а остальные антитела не влияют на связывание мАт 2Н9 с тАПФ. Таким образом, для каждой пары мАт была определена способность конкурировать друг с другом за связывание с тАПФ. Важно, что при этом оба мАт из каждой пары использовали и как конкурирующие, и как тестируемые.

1E Тестируемые моноклональные антитела 4E 3F Рис. 3. Ингибирование 2H конкурирующими мАт связывания тАПФ с тестируемыми мАт.

1B8 2B Черным цветом отмечены те мАт, которые конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ более чем на 75%.

3F 1B 1Е10 4Е3 3F11 2H9 2B11 1B8 3F10 1B Конкурирующие моноклональные антитела В результате проведенных экспериментов были выявлены три пары мАт – 1В8 и 3F10, 1Е10 и 4Е3, 2Н9 и 3F11 – которые значительно конкурировали за связывание с тАПФ, с другой стороны пары мАт 1В3 и 2Н9, 3F10 и 3F11, 1В8 и 2В11 не конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ.

На основании полученных данных была построена диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с тАПФ (рис. 4).

4E 1B Рис. 4. Диаграмма, показывающая 1B 1E10 конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с тАПФ.

2В 2Н 3F 3F Диаграмма отражает то, что эпитопы связывания пяти мАт (1Е10, 2В11, 2Н9, 4Е3 и 3F11) находятся в одной области на поверхности С-домена АПФ, эпитопы связывания мАт 1В8 и 3F10 в другой области на поверхности АПФ, причем мАт 1Е10 и 4Е3, 2Н9 и 3F11, 1В и 3F10 конкурируют друг с другом за связывание с тАПФ в значительной степени, и эпитоп связывания мАт 1В3 практически не перекрывается с эпитопами связывания остальных антител.

Чтобы привязать полученную диаграмму к реальной поверхности С-домена АПФ, прежде всего, мы сравнили первичные аминокислотные последовательности человека и других животных. Оказалось, что С-домены человека и шимпанзе отличаются друг от друга наименьшим количеством аминокислотных остатков: Lys677 в С-домене человека заменен на Arg в С-домене шимпанзе, а Pro730 – на Thr (рис. 5).

671 681 человек YGTQARKFDV NQLQNTTIKR IIKKVQDLER шимпанзе YGTQARRFDV NQLQNTTIKR IIKKVQDLER 701 711 человек AALPAQELEE YNKILLDMET TYSVATVCHP шимпанзе AALPAQELEE YNKILLDMET TYSVATVCHT Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ человека и шимпанзе.

Эти остатки располагаются на поверхности С-домена АПФ на противоположных концах белковой глобулы (рис. 6). Анализ связывания мАт с АПФ сыворотки крови человека и шимпанзе показал, что три мАт – 1В8, 3F10 и 1Е10, связываясь с АПФ человека, не узнают АПФ шимпанзе. Так как эпитопы связывания мАт 1В8 и 3F10 перекрываются значительно, а мАт 1Е10 не конкурируют с мАт 1В8 и 3F за связывание с ферментом, можно предположить, что один из остатков, отличающихся у С Рис. 6. Структура С-домена АПФ (PDB 1O8A доменов АПФ человека и [Natesh et al. 2003]).

шимпанзе, входит в эпитоп мАт 1Е10, а другой – в эпитопы мАт 1В8 и 3F10.

Чтобы определить, какая аминокислота отвечает за связывание каких мАт, мы использовали мутант С-домена, содержащий замену Asp616Gly, и сравнили связывание мАт с этим мутантом со связыванием этих мАт с рекомбинантным тАПФ. Следует отметить, что остаток Asp616 располагается рядом с остатком Lys677 на поверхности С-домена АПФ (рис.

6). Полученные данные (рис. 7) позволили показать, что эта замена оказывает решающую роль при связывании мАт 1. 1Е10 и частично ухудшает 1. связывание мАт 2Н9 с FС-домен D616G/FтАПФ тАПФ, но практически не 1. влияет на связывание 0. других мАт с тАПФ. 0. Таким образом, 0. можно полагать, что 0. Asp616 входит в эпитопы 0. связывания мАт 1Е10 и 1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B Моноклональные антитела 2Н9, не играя, однако, решающей роли при Рис. 7. Отношение связывания мАт с тАПФ Asp616Leu к связыванию мАт с тАПФ. F – сигнал флюоресценции.

связывании мАт 2Н9. Так как Asp616 на поверхности С-домена АПФ располагается рядом с Lys677, то можно заключить, что в эпитоп связывания мАт 1Е10 входит именно Lys677, а не Pro730.

Значит, Pro730 участвует в формировании эпитопов связывания мАт 1В8 и 3F10.

Для уточнения эпитопов связывания мАт был проведен анализ связывания всех мАт с химерами (рис. 8) и гликомутантами (рис. 9) АПФ:

• С1-163 Ndom – С-домен, у которого остатки 1-163 замещены на первый аминокислотный остаток N-домена;

• С417-579 Ndom (остатки 993-1155 в нумерации по сАПФ) – С-домен, у которого остатки 993-1155 замещены на гомологичные из N-домена;

• С229-258 Ndom (остатки 805-834 в нумерации по сАПФ) – С-домен, у которого остатки 805-834 замещены на гомологичные из N-домена;

• Nfr1-737 – конструкция, состоящая из N-домена и 125 аминокислотных остатков С-домена;

• мутант тАПФ, у которого остатки 837AQH замещены на DRY;

• tACED36-g1234 – тАПФ, у которого остаток Asn пятого (Asn913) и шестого (Asn1162) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gln;

• tACED36-g123 – тАПФ, у которого остаток Asn четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и шестого (Asn1162) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gln;

• tACED36-g13 – тАПФ, у которого остатки Asn второго (Asn666), четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и шестого (Asn1162) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gln;

• tACED36-g12 – тАПФ, у которого остатки Asn третьего (Asn685), четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и шестого (Asn1162) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gln.

C1-163 Ndom / tACE 3.0 g123 / g 2. 1.5 2. Отношение связывания мАт с химерами и мутантами АПФ 1. 1. 0. 0.0 0. C225-227 Ndom / tACE 3.0 g12 / g 2. 1.5 2. 1. 1. 0. 0. 0. C229-258 Ndom / tACE 3.0 g13 / g 2. 1.5 2. 1. 1. 0. 0.0 0. C417-579 Ndom / tACE 3.0 g1234 / tACE? 2. 1.5 2. 1. 1. 0. 0.0 0. 1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B11 1B3 1B8 3F10 1Е10 4Е3 2H9 3F11 2B Моноклональные антитела Рис. 8. Сравнение связывания мАт с различными Рис. 9. Сравнение связывания мАт с химерами АПФ. гликомутантами АПФ.

Так, например, мАт 1Е10 являются единственными антителами, которые узнавали конструкцию Nfr1-737 и не узнавали химеру C1-163 Ndom, что свидетельствует о том, что остатки, критичные для связывания данных мАт, располагаются на N-конце С-домена.

Анализ связывания данных мАт с гликомутантами тАПФ показал, что замена остатков Asn потенциальных сайтов гликозилирования Asn666 и Asn685 на остатки Gln приводит к значительному ухудшению связывания мАт 1Е10, что может говорить о том, что данные потенциальные сайты гликозилирования либо участвуют в формировании эпитопа мАт, либо находятся в непосредственной близости от него.

Другой пример – мАт 1В8 не связывались с Nfr1-737, что свидетельствует о том, что первые 125 аминокислотных остатков не входят в эпитоп связывания данных мАт.

Связывание этих мАт ухудшалось с химерой С229-258 Ndom (восьмая a-спираль) по сравнению с тАПФ, таким образом, возможно, некоторые остатки восьмой a-спирали участвуют в формировании эпитопов связывания мАт 1В8. Замена остатков AQH в C225- Ndom (остатки 827-839 в нумерации по соматическому АПФ) на DRY приводила к значительному снижению связывания мАт 1В8, а также замена Asn731, являющегося потенциальным сайтом гликозилирования, на Gln практически полностью отменяла связывание данных мАт. Таким образом, можно предположить, что некоторые из остатков восьмой a-спирали, остатки 837-839, а также Asn731 формируют эпитоп связывания мАт 1В8.

На основании анализа совокупности данных по связыванию мАт с различными химерами и гликомутантами тАПФ мы уточнили расположение эпитопов связывания мАт и предложили конечный вариант расположения эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности С-домена АПФ (рис. 10).

Рис. 10. Расположение эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности С-домена АПФ. Зеленым отмечены потенциальные сайты гликозилирования.

2. МОДЕЛИРОВАНИЕ «ОТКРЫТОЙ» КОНФОРМАЦИИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА Исследование трехмерной структуры недавно открытого структурного гомолога АПФ фермента АПФ2 – показало, что при связывании лиганда в активном центре этот фермент претерпевает изменение конформации, называемое «hinge-bending movement», т.е.

«открывание-закрывание» [Towler et al., 2004]. Кроме того, такой же механизм «открывания закрывания» наблюдается и в случае других структурных гомологов АПФ и АПФ2:

нейролизина [Brown et al., 2001] и тримет-олигопептидазы человека [Ray et al., 2004]. Ранее было высказано предположение о том, что для N-домена также характерно движение «открывания-закрывания» активного центра, чем было объяснено ингибирующее действие двух мАт – 3А5 и i2H5 [Skirgello et al., 2006].

Как было отмечено выше, мАт 4Е3 обладают ингибирующим действием по отношению к тАПФ. Эпитоп связывания мАт 4Е3 располагается далеко от входов в туннель, в котором располагается активный центр С-домена. Для того чтобы проверить, не входят ли в эпитоп связывания мАт 4Е3 участки молекулы, которые являются подвижными при движении «открывания-закрывания» щели активного центра, чем может объясняться ингибирующее действие данных мАт, мы смоделировали «открытую» конформацию С домена АПФ.

Модель «открытого» С-домена АПФ была построена с помощью программы Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA) на основе открытой конформации АПФ2 (PDB 1R42). В процессе построения модели проводилась энергетическая минимизация и молекулярная динамика полученной структуры. Поскольку «открытая» структура С-домена АПФ в безводной среде энергетически менее выгодная, чем «закрытая», то энергетическая минимизация со временем приводила к «закрыванию» полученной структуры. Поэтому для сохранения «открытой» конформации было выбрано время минимизации 1пс.

Анализ расположения эпитопов связывания мАт на поверхности открытой конформации С-домена АПФ показал, что эпитоп связывания мАт 4Е3 располагается в области открывания щели активного центра (рис. 11), таким образом, мАт 4Е3, связываясь с С-доменом в одной конформации, могут препятствовать движению «открывания закрывания» молекулы и, соответственно, переходу белка в другую конформацию.

Следует отметить, что эпитопы мАт 1В8 и 3F10 располагаются в области одной из створок щели активного центра (рис. 11), но, видимо, конформационные изменения, происходящие в процессе связывания лиганда в активном центре фермента, не оказывают влияния на эпитопы связывания данных мАт.

Сравнение «открытой» и «закрытой» конформаций С-доменов, проведенное с помощью программы DynDom по расчёту движения белковых молекул, позволило выявить участки молекулы, движущиеся при движении «открывания-закрывания» щели активного центра С домена: 674-677, 692-693, 870-885, 989-990, 993-994, 1016-1017, 1106-1107, 1109-1110, 1126 1127, 1161-1162. Анализ расположения эпитопов мАт по отношению к подвижным участками молекулы показал, что подвижные участки принимают участие в формировании эпитопов мАт1Е10 и частично мАт 4Е3 – остатки 674-677, мАт 3F11 и 2В11 – остатки 1161-1162 и мАт 1В8 и 3F10 – остатки 870-885. Так как эти мАт не обладают ингибирующим действием по отношению к С-домену АПФ, то, можно предположить, что данные остатки не критичны для связывания этих мАт.

Рис. 11. Эпитопы связывания моноклональных антител на поверхности: А. закрытой (PDB 1О8А) и Б. открытой (построенной по гомологии с АПФ2) конформаций С-домена. Темным цветом отмечены остатки аминокислот, являющиеся подвижными при движении «открывания-закрывания» щели активного центра молекулы фермента.

3. ПРЕДСКАЗАНИЕ СТРУКТУРЫ ДВУДОМЕННОГО АНГИОТЕНЗИН ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА Структуры отдельных N- и С-доменов были расшифрованы [Corradi at al., 2006;

Natesh et al., 2003], в то время как структура полноразмерной формы АПФ остается неизвестной.

Нами была предпринята попытка предсказать структуру двудоменного фермента на основе анализа связывания мАт с однодоменными и двудоменной формами АПФ, а также конкуренции мАт к разным доменам фермента за связывание с двудоменным АПФ. В кристаллической структуре N-домена известно расположение 612-ого аминокислотного остатка, известная кристаллическая структура С-домена расшифрована с 616-ого аминокислотного остатка, таким образом, известно, в каких областях домены должны быть связаны друг с другом в составе полноразмерного фермента. При построении модели сАПФ мы соблюдали условие – между последним остатком N-домена (612) и первым С-домена (616) в расшифрованных структурах расстояние должно составлять не более 20. Кроме того, на основании существования отрицательной кооперативности N- и С-доменов в составе полноразмерного фермента мы предполагали, что домены в составе полноразмерного АПФ пространственно сближены. Необходимо было выявить участки на поверхности отдельных доменов АПФ, пространственно сближенных друг по отношению к другу.

Ранее было показано, что мАт 1G12, специфичные к N-домену АПФ, связываются с отдельным N-доменом гораздо лучше, чем с полноразмерной формой АПФ, на основе чего авторы предположили, что эпитоп связывания данного мАт располагается в той области на поверхности N-домена, в которой N-домен экранирован С-доменом в составе двудоменного АПФ [Balyasnikova et al., 2007]. Мы попытались выявить аналогичные мАт, специфичные к С-домену.

В результате сравнения связывания мАт, специфичных к С-домену АПФ, с однодоменным тАПФ и двудоменным сАПФ были выявлены мАт 1Е10, которые связывались с отдельным С-доменом гораздо лучше, чем с двудоменным АПФ. Эпитоп мАт 1Е10 располагается в области N-конца С-домена (рис. 10). Таким образом, можно заключить, что эпитоп мАт 1Е10 располагается в той области на поверхности С-домена АПФ, в которой С-домен экранируется N-доменом в составе полноразмерного фермента.

Для того чтобы выявить области на поверхности отдельных доменов, пространственно сближенные друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента, мы определяли конкуренцию мАт, специфичных к разным доменам фермента, за связывание с двудоменным АПФ. При этом, когда в качестве тестируемых использовали мАт к С-домену, в качестве конкурирующих использовали мАт к N-домену и наоборот. Оказалось, что пары мАт 1Е10 (к С-домену) и 1G12 (к N-домену), 3F11 (к С-домену) и 9В9 (к N-домену) достаточно сильно конкурировали друг с другом – степень подавления связывания тестируемых мАт с сАПФ конкурирующими мАт – более 50%. мАт 3F11 и 3А конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ меньше, но, тем не менее, степень ингибирования связывания была значительна и составила около 40%. Такие пары мАт, как 1G12 и 2В11, 2Н9 и 9В9, 1Е10 и 3А5 не конкурировали друг с другом за связывание с сАПФ, поэтому мы считали, что эпитопы связывания данных мАт располагаются достаточно далеко на поверхности доменов АПФ в составе полноразмерного фермента.

На основании полученных данных по конкуренции мАт за связывание с сАПФ с помощью программы Discovery Studio ViewerPro была построена модель двудоменного АПФ (рис. 12), при этом при построении модели соблюдались следующие условия: расстояние между 612 аминокислотным остатком в N-домене и 616 аминокислотным остатком в С домене не превышало 20, между остатком 531 в N-домене, располагающимся в центре эпитопа мАт 1G12, и остатком 678 в С-домене, располагающимся в центре эпитопа связывания мАт 1Е10, а также между остатком 339 в N-домене, находящимся в центре эпитопа связывания мАт 9В9, и остатком 1150 в С-домене, располагающимся в центре эпитопа связывания мАт 3F11, – не более 40.

С-домен N-домен 9B 3F 1E 1G Рис. 12. Модель двудоменного АПФ, учитывающая расположение эпитопов связывания мАт на поверхности N- и С-доменов АПФ.

4. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В НОРМЕ И ПРИ РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ В гликопротеинах в состав антигенных детерминант может входить не только белковая, но и углеводная часть молекул. АПФ из любой ткани сильно гликозилирован, причем содержание и состав углеводов в АПФ сильно варьируется в зависимости от источника получения фермента. В рекомбинантном тАПФ N-гликаны являются, главным образом, биантенными фукозилированными цепями комплексного типа [Yu et al., 1997]. Однако в состав N-гликанов АПФ из других источников могут входить и высокоманнозные цепи [Ripka et al., 1993]. Степень сиалирования цепей комплексного типа также может сильно различаться у АПФ из разных тканей.

сАПФ содержит 17 потенциальных сайтов гликозилирования. Ранее было показано, что в сАПФ из почек 6 сайтов гликозилированы (Asn9, Asn25, Asn82, Asn117, Asn480 на N домене и Asn913 на С-домене) и один сайт не гликозилирован (Asn1196 на С-домене) [Yu et al., 1997]. В данной работе с помощью MALDI-TOF спектрометрии в образцах АПФ из почек и легких были выявлены два гликозилированных сайта – Asn9, располагающийся на N домене АПФ, и Asn685 на С-домене фермента. В АПФ из семенной жидкости были выявлены три гликозилированных сайта – тот же Asn9, а также Asn480 на N-домене и Asn666 на С-домене фермента.

Потенциальные сайты гликозилирования входят в состав эпитопов связывания всех использованных нами мАт (рис. 9). Мы оценили площадь, которую может занимать углевод на поверхности белковой глобулы. Для этого был смоделирован сиалированный биантенный олигосахарид комплексного типа и с помощью молекулярного редактора программы Insight II ковалентно присоединен к каждому из потенциальных сайтов N-гликозилирования, находящемуся на поверхности С-домена АПФ (PDB 1O8A), после чего с помощью метода молекулярной динамики проводили моделирование движения гликана и окружающих его аминокислотных остатков белка, расположенных на расстоянии не более 15 от соответствующего остатка Asn. Оказалось, что углеводная цепь чаще всего контактирует с остатками Pro, Lys, Glu, Asn и Thr, реже с остатками Arg, Val, Leu, Gln.

При расчете площади контакта гликана с поверхностью белка, учитывали только те остатки аминокислот, от которых олигосахарид находился на расстоянии не более 5, этого расстояния достаточно только для того, чтобы между атомами могла поместиться молекула воды. Рассчитанная площадь контакта при фиксированном положении олигосахаридной цепи составила от 200 до 400. Так как средняя площадь эпитопа связывания мАт на поверхности белка составляет около 800 2, можно заключить, что олигосахаридные цепи могут занимать значительную часть эпитопа связывания мАт.

Так как АПФ из различных тканей и биологических жидкостей может быть по-разному гликозилирован, то можно ожидать различное связывание мАт с АПФ из различных источников.

На рис. 13 представлено связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей. Видно, что с АПФ из разных органов мАт связываются по разному, что, скорее всего, может объясняться именно различным гликозилированием сАПФ (отсутствием или присутствием Отношение связывания мАт с АПФ из разных тканей и биологических жидкостей легкие/почки олигосахарида в сайтах 2. 2.0 гликозилирования, входящих в 1. эпитопы связывания этих мАт, 1. или различным составом 0. 0. углеводных цепей).

Так, например, мАт 1В сыворотка/семенная жидкость 1. связываются одинаково с АПФ из 1. сыворотки, семенной жидкости и 0. почек, но с АПФ из легких связываются гораздо хуже.

0. Возможно, Asn731, входящий в сыворотка/легкие 5. эпитоп связывания мАт 1В8, 4. одинаково гликозилирован в 3. 2. АПФ из сыворотки, семенной 1. жидкости и почек, а в АПФ из 0. легких гликозилирован иначе.

семенная жидкость/почки В нормальных условиях 4. 3. АПФ в плазме крови 2. продуцируют эндотелиальные 1. клетки. У здоровых доноров 0. 1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B уровень АПФ в крови довольно стабилен, в то время как при Моноклональные антитела развитии гранулематозных Рис. 13. Связывание мАт с АПФ из различных тканей и биологических жидкостей заболеваний (например, саркоидоза) или болезни Гоше наблюдается значительное повышение уровня АПФ [Lieberman J., 1975]. Определение активности АПФ в крови сейчас является дополнительным методом для диагностики и мониторинга клинического протекания саркоидоза.

Саркоидоз и болезнь Гоше являются системными заболеваниями, которые достаточно тяжело диагностировать. Считается, что дополнительным источником АПФ в крови при развитии болезни Гоше являются макрофаги, а при саркоидозе – саркоидные гранулемы.

Таким образом, можно ожидать, что гликозилирование АПФ в крови при развитии этих болезней будет отличаться от гликозилирования АПФ в норме. В данной части работы мы предприняли попытку выявить изменения в топографии АПФ в крови в норме и при развитии саркоидоза и болезни Гоше в сравнении с хроническим обструктивным бронхитом (ХОБ), при котором уровень АПФ в крови не изменяется.

Прежде всего, мы определили активность в образцах плазмы больных саркоидозом, болезнью Гоше и ХОБ. Активность АПФ во всех образцах плазмы пациентов с болезнью Гоше (всего 6 образцов) была значительно повышена по сравнению с активностью АПФ в плазмах здоровых доноров. Среди больных саркоидозом (всего 12 образцов) были выявлены 4 образца плазмы с повышенной активностью фермента, активность АПФ в остальных образцах была такой же, как и в норме. Активность АПФ в образцах плазмы больных ХОБ не отличалась от активности АПФ в плазме здоровых доноров. С помощью пакета статистических программ SPSS 14.0 был проведен статистический анализ полученных результатов. При сравнении групп здоровых доноров и пациентов с саркоидозом и болезнью Гоше по основным показателям активности АПФ использовался непараметрический U критерий Манна-Уитни. Данный критерий используется для выявления различий в распределении показателей в том случае, когда тип распределения сложно восстановить по малым выборкам или распределение существенно отклоняется от нормы. В ходе исследования было выявлено достоверное повышение уровня активности АПФ в плазме пациентов с саркоидозом и болезнью Гоше (уровень значимости составил 0,019 и 0,000014, соответственно).

Для анализа связывания мАт с АПФ в норме и при развитии патологии использовали мАт, специфичных к N-домену, и 8 мАт, специфичных к С-домену АПФ. В случае саркоидоза отдельно проводили сравнение связывания мАт с АПФ из плазмы крови пациентов с саркоидозом с повышенной активностью со связыванием мАт с АПФ из плазмы крови здоровых доноров и связывание мАт с АПФ из плазмы крови пациентов с саркоидозом с нормальной активностью АПФ со связыванием мАт с АПФ из плазмы крови здоровых доноров. Данные представлены на рис. 14.

Оказалось, связывание мАт 3G8, специфичных к N-домену АПФ, с АПФ плазмы крови достоверно увеличивалось при развитии болезни Гоше (уровень значимости составил 0,041).

В случае саркоидоза с повышенной активностью фермента связывание нескольких мАт – 3G8, 1G12, 6A12, специфичных к N-домену АПФ, и мАт 1B3 и 1E10, специфичных к С домену – с АПФ при развитии патологии отличалось от связывания с АПФ в норме. В то же время, связывание лишь Болезнь Гоше / норма 1. одного мАт к N-домену 1. 1. фермента – 3G8 – отличается 0. с АПФ из плазмы крови 0. 0. FсАПФ при патологии/FсАПФ в норме больных саркоидозом с 0. 0. нормальной активностью Саркоидоз, повышенная активность АПФ / норма фермента и АПФ из плазмы 4. крови здоровых доноров. 3. Таким образом, значительное 2. изменение связывания АПФ 1. с мАт при саркоидозе, по- 0. видимому, характерно лишь Саркоидоз, нормальная активность АПФ / норма 4. для форм саркоидоза с 3. высокой активностью АПФ.

2. Для определения 1. связывания мАт с АПФ из 0. плазмы крови больных ХОБ i2H 2H 9B 3A i1A 3G 1G 6A 5F 1B 1B 3F 1E 4E 3F 2B и здоровых доноров были Моноклональные антитела выбраны несколько мАт, Рис. 14. Сравнение связывания мАт с АПФ в норме и связывание которых при развитии болезни Гоше и саркоидоза. F – сигнал отличалось с АПФ при флюоресценции.

развитии саркоидоза с повышенной активностью фермента и в норме. Изменения связывания мАт в случае развития ХОБ не наблюдалось. Таким образом, можно полагать, что при развитии ХОБ, не происходит выработка в кровь конформационно измененного АПФ.

Следует отметить, что эпитоп связывания мАт 3G8 содержит два потенциальных сайта гликозилирования – Asn25 и Asn82, эпитопы связывания мАт 1G12 и 6А12 – потенциальный сайт гликозилирования Asn416, мАт 1В3 – Asn1196, мАт 1Е10 – Asn666. Возможно, различное связывание мАт с АПФ в норме и при развитии болезни Гоше и саркоидоза объясняется различным гликозилированием АПФ в крови в норме и при развитии этих патологий.

Таким образом, нами показана возможность применения мАт для выявления АПФ в плазме крови пациентов с болезнью Гоше и саркоидозом, продуцируемого не эндотелием сосудов и легких (как у здоровых доноров), а макрофагами в случае болезни Гоше и саркоидными гранулемами при саркоидозе. Полученные данные в будущем могут быть использованы для упрощения диагностики саркоидоза и болезни Гоше.

ВЫВОДЫ 1. Определено связывание 8 моноклональных антител с тестикулярным АПФ, выявлены антитела 4Е3, ингибирующие активность тАПФ, определены константы диссоциации комплексов мАт 1В3, 1В8, 2Н9 и 3F11 с нативным тАПФ, мАт 1В8 и 2Н9 с рекомбинантным тАПФ и мАт 1В8 с С-доменом в составе соматического АПФ.

2. Определено расположение эпитопов связывания 8-ми моноклональных антител на поверхности С-домена АПФ человека на основе конкуренции антител к С-домену АПФ человека за связывание с тестикулярным АПФ, сравнения аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ из различных организмов и анализа связывания антител с АПФ из различных организмов, а также анализа связывания моноклональных антител с различными химерами и мутантами фермента.

3. Проведен анализ связывания моноклональных антител с С-доменом и двудоменным АПФ, выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена экранирован N-доменом в составе полноразмерного фермента, выявлены мАт, эпитопы которых на разных доменах АПФ пространственно сближены друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента. Предложена модель двудоменного АПФ.

4. Показаны различия в связывании моноклональных антител с нативным и рекомбинантным тестикулярным АПФ, а также с АПФ из различных тканей и биологических жидкостей человека.

5. Выявлены различия в связывании моноклональных антител с АПФ из сыворотки крови в норме и при развитии саркоидоза и болезни Гоше.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Наперова И.А., Балясникова И.В., Петров М.Н., Вахитова А.В., Евдокимов В.В., Данилов С.М., Кост О.А. Характеристика связывания моноклональных антител с С-доменом ангиотензинпревращающего фермента человека. Биоорганическая химия, 2008, 34, 3, 358-364.

2. Naperova I.A., Balyasnikova I.V., Schwartz D.E., Watermeyer J., Sturrock E.D., Kost O.A., Danilov S.M. Mapping of conformational mAb epitopes to the C domain of human angiotensin I-converting enzyme (ACE). J. Proteome Res., 2008, 7, 3396-3411.

3. Напёрова И.А., Кост О.А., Данилов С.М. Эпитопное картирование С-домена ангиотензин превращающего фермента. Материалы Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ – 2006», Москва, 2006, том 2, с. 35.

4. Наперова И.А., Кост О.А., Данилов С.М. Эпитопное картирование ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител. Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2007, с. 854.

5. Наперова И.А., Петров М.Н., Вахитова А.В., Кост О.А., Данилов С.М. Структурный анализ С домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител. Материалы VI Симпозиума по химии протеолитических ферментов, Москва, 2007, с.94.

6. Наперова И.А. Эпитопное картирование С-домена ангиотензин-превращающего фермента.

Материалы IV Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2007, часть 2, с. 296-297.

7. Naperova I.A., Arablinskaya N.E., Borisov S.E., Schwartz D.E., Kost O.A., Danilov S.M.

Conformational Fingerprinting of Blood ACE in Sarcoidosis. ATS International Conference, Toronto, 2008, р. A351.

8. Наперова И.А. Изменение нанотопографии ангиотензин-превращающего фермента как индикатора развития патологии. Материалы Всероссийской школы-семинара "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы", Белгород, 2008, с. 108-110.

9. Наперова И.А., Букина Т.М., Яровая Е.Б., Данилов С.М., Кост О.А. Конформационная характеристика ангиотензин-превращающего фермента крови в норме и при болезни Гоше.

Материалы V Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2009, часть 1, с. 181-182.

10. Naperova I.A., Baskin I.I., Palyulin V.A., Danilov S.M., Kost O.А. Epitope mapping of monoclonal antibodies to angiotensin-converting enzyme (ACE) as a tool for somatic ACE modeling. International conference Biocatalysis-2009: fundamentals and applications, Arkhangelsk, 2009, с. 80.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.