авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Четвертичная структура и конформационные изменения потенциал-зависимых калиевых каналов kv2.1 и kv10.2

На правах рукописи

Гризель Анастасия Владимировна ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ Kv2.1 И Kv10.2 Специальность: 03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова.

Научный консультант:

Соколова Ольга Сергеевна кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Рубцов Александр Михайлович доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова Крупянский Юрий Федорович доктор физико-математических наук, профессор, руководитель лаборатории динамики биополимеров Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «19» апреля 2012 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, «Новая» аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «16» марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Калиевые потенциал-зависимые каналы (Kv) играют важную регуляторную роль в разнообразных клеточных процессах: в функционировании возбудимых клеток, в процессах регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки и роста, при выделении нейротрансмиттеров, гормонов, обеспечении сердечной деятельности и других процессах (Wang et al, 1996;

Schrader et al., 2002). Нарушение их функционирования приводит к тяжелым наследственным заболеваниям (Wray, 2001) и развитию опухолей, в том числе раковых (Camacho, 2006). Так как функционирование Kv каналов можно регулировать, применяя активаторы или блокаторы, они представляют собой перспективные мишени для лекарственных средств.

Для понимания механизма функционирования ионных каналов, необходимы данные об их пространственной структуре. Зная пространственную структуру, можно детально изучать конформационные перестройки при активации/инактивации канала, в частности, методами молекулярного моделирования (ММ) (Pathak et al., 2007).

К настоящему времени механизм функционирования Kv каналов до конца не известен. Хотя многие гены, кодирующие ДНК Kv каналов, клонированы, четвертичная структура большинства мембранных белков остается неизвестной, так как они с большим трудом поддаются кристаллизации. Внемембранные части белка (как правило, N- и С-концы) осложняют кристаллизацию из-за своей гибкости, поэтому для получения кристаллов белок подвергают транкированию по N- и С-концам. В то же время, объединение подходов просвечивающей электронной микроскопии макромолекул (ПЭММ) и ММ предоставляет уникальную возможность изучать строение полноразмерных каналов, имеющих обширные цитоплазматические части. Это особенно актуально для изучения структур Kv каналов, для которых показана высокая степень гомологии (более 20%) трансмембранных частей и большая вариабельность цитоплазматических участков, которые в основном и отвечают за разнообразие выполняемых функций Kv каналов различных семейств. У каналов Kv10.2 и Kv2. цитоплазматическая часть особенно велика (составляет ~75% всего белка), и играет ключевую роль в регуляции активационных свойств (Wray, 2009).

Таким образом, получение структурных данных о Kv каналах методом ПЭММ, в особенности о строении их цитоплазматической части, а также изучение конформационных перестроек и роли внутриклеточных доменов в функционировании этих каналов является актуальной задачей биофизики и открывает широкие перспективы для планирования экспериментов по направленному мутагенезу и дизайну новых лекарственных средств.

Цели и задачи иссдедования. Целью данной диссертационной работы является исследование четвертичной структуры и конформационных изменений эукариотических калиевых потенциал-зависимых каналов Kv2.1 и Kv10.2.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:

Получить трехмерные структуры (3D) транкированных каналов крысы 1.

Kv2.1 с помощью метода ПЭММ и определить локализацию их цитоплазматических доменов Kv 2 и CTA;

Определить влияние цитоплазматических доменов канала Kv2.1 на 2.

конформацию его трансмембранного участка;

Получить 3D структуру полноразмерного человеческого канала Kv10. 3.

с помощью метода ПЭММ и определить локализацию его цитоплазматических доменов PAS и cNBD;

Определить особенности локализации в цитоплазматической мембране 4.

каналов Kv10.2 и Kv 2.1 и выявить роль C-концевых доменов в этом процессе.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе с помощью метода ПЭММ впервые определены 3D структуры мутантных каналов Kv2.1CTA и Kv2.1C с разрешением в 23 и 24,5, соответственно. Впервые получена 3D структура Kv канала в закрытой конформации (Kv2.1CTA). На основе 3D реконструкций впервые получены данные о локализации цитоплазматических доменов канала Kv2.1, которые играют важную роль в его функционировании. Показано, что цитоплазматический C-конец канала Kv2.1 влияет на конформационые перестройки, происходящие в мембранном домене при активации канала.





Впервые была получена 3D структура полноразмерного канала семейства EAG (Kv10.2) с разрешением в 34.

На живой клеточной культуре была показана кластерная организация каналов Kv2.1 в мембране клетки, а также получены данные о том, что цитоплазматический С-конец канала Kv2.1 выполняет важную роль в поверхностной экспрессии канала. Впервые было показано, что полноразмерный канал Kv10.2 образует кластеры на поверхности клеток. В отличие от Kv2.1, кластеры Kv10.2 колокализуются с актиновыми филаментами.

Практическая значимость работы заключается в выяснении структурных особенностей макромолекул Kv каналов, которые до настоящего времени не были подвергнуты кристаллизации, и их атомная структура не расшифрована. Полученные знания в дальнейшем могут быть применены для теоретических исследований в области строения мембранных белков, белок белковых комплексов, и как структурные предпосылки для моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях, опубликованных в российских и международных реферируемых научных журналах и одном учебном пособии, подготовленном в соавторстве. Материалы работы были представлены на студенческом симпозиуме по биоинженерии, 2007, 2009, Москва;

на научно практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», 2007, 2009, Москва;

на международной конференции «Ломоносов» 2008, 2010, Москва;

на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, 2008, Москва;

на международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (2008, 2009), Москва;

на международных курсах «The EMBO practical course on cryo-EM and 3D image processing at EMBL», 2009, Лондон, Великобритания;

на международных курсах «EMBN Train Advanced Course on „proteins – production, purification, stabilisation and structures», 2009, Лидс, Великобритания;

EDICT annual General Assembly meeting, 2009, Испания;

EDICT annual General Assembly meeting, 2010, Таллин, Эстония;

на всероссийском конкурсе научно исследовательских работ студентов вузов в области нанотехнологий и наноматериалов, 2010, Москва;

на виртуальной интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии», 2010, Казань.

Работе присвоена медаль «За лучшую научную студенческую работу» на всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов вузов в области нанотехнологий и наноматериалов 2010 года, Москва.

Исследования частично поддержаны грантом РФФИ (08-04-01348-a) и седьмой рамочной программы Европейского союза – проектом EDICT.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение) и Выводов.

Работа проиллюстрирована 43 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель содержит 250 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении сформулированы основные цели и задачи исследования, и обоснована его актуальность и практическая важность. Глава 1 представляет собой обзор литературы. Он посвящен современным данным о строении потенциал-зависимых калиевых каналов и их конформационных перестройках, особое внимание уделено строению цитоплазматических частей и их роли в функционировании каналов, а также строению и функциям каналов Kv2.1 и Kv10.2, изучаемых в данной работе.

Описание методов, использованных в работе, дано в Главе 2.

Полученные результаты и их обсуждение приведены в Главе 3.

Третичная структура калиевых потенциал-зависимых каналов (Kv).

Рисунок 1. Схема строения мономера каналов.

Kv Трансмембранные сегменты S1-S6, петля “P”, формирующая пору, N- и C-концы подписаны.

Сенсор мембранного потенциала S4 обозначен плюсами. А. Kv2.1. Показаны домены T1, Kv2 и CTA. Б.

Kv10.2. Показаны домены PAS и сNBD.

Каждый ген канала Kv кодирует -субъединицу (Kv). Четыре Kv тетрамеризуются с образованием функционального канала.

Трансмембранный домен всех Kv каналов состоит из шести сегментов (S1 S6) (рис.1). Пора формируется участками S5 и S6, а петля между ними образует селективный фильтр (P). Спирали S1-S4 являются доменом, чувствительным к изменению потенциала. В ответ на деполяризацию мембраны, сенсор мембранного потенциала S4 изменяет свое положение, и канал активируется (Long et al., 2005, 2007). N- и С-концевые участки расположены в цитоплазме и имеют различное строение у Kv каналов разных семейств. Так, цитоплазматический С-конец у канала Kv2.1 разделен на два домена: Kv2 домен (463-711 а.о.) и CTA (741-853 а.о.), а N-конец содержит T домен (Ju et al., 2003). Внутриклеточная часть канала Kv10.2 содержит PAS (31-131 а.о.) домен на N-конце и сNBD (551-660 а.о.) домен на C-концевом участке (Bauer et al., 2001) (рис.1).

Экспрессия, выделение и очистка потенциал-зависимых каналов Kv2.1 и Kv10.2.

Для проведения структурных исследований мутантные каналы Kv2.1CTA, Kv2.1C, а также каналы дикого типа Kv2.1 и Kv10.2 были экспрессированы в эукариотической клеточной линии Vero. У канала Kv2.1CTA был удален цитоплазматический C-концевой домен CTA (741 853а.о.), у Kv2.1C полностью отсутствует внутриклеточный C-конец, включающий Kv2 и CTA домены (рис.1). К С-концу каждого гена через линкер (12 а.к.) пришита специфическая последовательность – фрагмент 1D4, используемая для аффинной очистки белка (Oprian et al, 1987).

Рисунок 2. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях очищенного белка каналов Kv2.1 и Kv10.2.

A. Kv2.1CTA. дорожка 1- маркер молекулярных весов белков (MW);

– элюция белка с афиннной колонки, – вестерн-блотт клеточного экстракта, 4 – вестерн блотт элюции с аффинной колонки;

Б. Kv2.1C.

дорожка 1 – MW;

2 – элюция белка с афиннной колонки;

3 – вестерн блотт элюции с аффинной колонки.

В. Kv10.2. Дорожка 1- MW;

2 – элюция белка с афиннной колонки;

Г. Kv10.2. Результат вестерн-блотта.

1 – маркер молекулярных весов белков;

2 – элюция белка с аффинной колонки Значения молекулярных весов белков маркеров подписаны в кДа.

При очистке белка каналов производилось его растворение в детергенте CHAPS (2,5%), заменяющем липидное окружение белка, и, тем самым, сохраняющим его нативное состояние. Очистка белков каналов производилась на аффинной колонке с моноклональными 1D4 антителами (Sokolova et al, 2001). Элюция проводилась с помощью оригинального 1D пептида, имеющего большее сродство к антителам, чем рекомбинантная последовательность.

В результате очистки было получено достаточное количество чистых белков двух мутантных каналов Kv2.1 и полноразмерного канала Kv10.2 для изучения их структуры методом ПЭММ (рис.2).

Флуоресцентные тесты каналов, экспрессированных in vitro Определение корректности фолдинга и уровня экспрессии каналов Kv2.1 и Kv10.2.

Проверка корректности фолдинга тетрамеров каналов, а также определение эффективности трансфекции и особенностей расположения каналов в цитоплазматической мембране клеток были проведены на живой клеточной культуре с помощью теста на основе флуоресцентно-меченого рекомбинантного блокатора каналов – аджитоксина скорпиона AgTx (Карлова и др., 2011). Аджитоксин обратимо связывается с поровой частью только тех молекул калиевых потенциал-зависимых каналов, расположенных в мембране клетки, которые образуют правильный гомотетрамер (MacKinnon et al., 1988). Окраска при этом наблюдается только с внешней стороны клеток. Этим методом было показано, что эффективность трансфекции составляет 50-60%.

Кластеризация Kv каналов в мембране клеток и влияние С-концевых доменов на этот процесс:

Каналы Kv2.1 экспрессируются в виде кластеров на поверхности клеток (Mohapatra and Trimmer, 2006;

Tamkun et al., 2007). Согласно предыдущим исследованиям удаление 318 а.о. с С-конца этого канала, содержащих PRC последовательность, приводит к разрушению кластеров (Lim et al., 2000), а делеция последних 396 а.о. C-концевого участка полностью нарушает транспорт каналов в направлении плазмалеммы (Mohapatra et al., 2008).

С использованием живых клеточных культур и флуоресцентно меченного AgTx2 мы уточнили данные о кластерной локализации каналов Kv2.1 (рис.3). При удалении СТА доменов сохранялась способность канала к образованию кластеров, но их размер уменьшался (рис.4А). При удалении всего С-конца каналы продолжали транспортироваться к поверхности и образовывали кластеры, однако общая площадь кластеров на поверхности клетки достоверно уменьшалась (рис.4Б).

Рисунок 3. Экспрессия белка каналов на поверхности клеток, исследуемая флуоресцентным методом. А-Г. Поверхностное распределение кластеров каналов, связанных с флуоресцентно меченным AgTx-Cy3 A. Полноразмерный канал Kv2.1. Б. Kv2.1CTA. В. Kv2.1C. Г. Kv10.2. N – ядро. Масштабный отрезок 20 мкм. Д-З. Изображения клеток в проходящем свете, соответствующие изображениям А-Г.

Таким образом, наши данные указывают на то, что PRC фрагмент не является единственным детерминантом кластеризации каналов Kv2.1.

Уменьшение диаметра кластеров при удалении СТА домена указывает на то, что этот домен участвует в процессе кластеризации. Возможно, он создает конформацию, необходимую для эффективной работы участка PRC.

Рисунок 4. Диаграммы средних значений диаметра кластеров каналов (А) и доли площади клетки, занимаемой кластерами (Б). Столбцы слева-направо:

Kv2.1wt, Kv2.1CTA, Kv2.1C.

Мы впервые продемонстрировали, что канал Kv10.2 также способен к образованию кластеров в мембране клетки (рис.3 Г,З). Отличительной особенностью кластеров Kv10.2 является то, что они колокализуются с актиновым цитоскелетом, что свидетельствует о том, что эти каналы могут взаимодействовать с актиновыми филаментами в отличие от каналов Kv2. (Tamkun et al., 2007). Различия во взаимодействии с актином у каналов Kv2. и Kv10.2 можно объяснить значительными различиями в строении их цитоплазматических доменов и выполняемых ими функциях. Для исследования структур каналов Kv2.1 и Kv10.2 применялся метод ПЭММ.

Исследование структур каналов Kv2.1C, Kv2.1CTA и Kv10. методом ПЭММ.

Для получения трехмерных структур очищенный белок канала дикого типа K10.2wt, а также мутантных каналов Kv2.1CTA и Kv2.1C исследовали методом ПЭММ с негативным окрашиванием 1% уранил ацетатом. В результате были получены электронные микрофотографии каналов Kv2.1CTA, Kv2.1C и Kv10.2 с увеличением 52 000.

При исследовании белков методом ПЭММ в целях минимизации радиационного повреждения используется режим низкой дозы (10e-/2), вследствие чего возрастает уровень шума. Для его снижения и увеличения сигнала используется суммирование множества одинаковых изображений канала в одно, для чего необходимо получить большое их количество (Boekema et al., 2009). Отбор удачных изображений одиночных каналов Kv2. и Kv10.2 проводился вручную с помощью программы Signature (Chen and Grigorieff, 2007). Всего было отобрано 3989 изображений канала Kv2.1CTA, 4042 изображений - Kv2.1C и 1400 изображений Kv10.2. Изображения были отфильтрованы от шума, нормализованы, выровнены (рис. 5(1)) и разбиты на классы с помощью программы IMAGIC (Heel et al., 1996). Каждый класс представляет собой суммированные одинаковые изображения канала, то есть находящиеся в одной ориентации. Классы лучшего качества, включающие большее количество изображений (рис.5(2)), использовались для расчета начальной трехмерной структуры с помощью угловой реконструкции (Heel, 1987).

Затем были получены 2D проекции начальной трехмерной структуры (обратные проекции) (рис.5(3)), которые используются для улучшения классификации частиц, выступая в качестве образцов при новом разбиении всего массива частиц на классы. Всего было проведено по 10 итеративных циклов для канала Kv2.1C и Kv10.2 и 27 для Kv2.1CTA. Предварительные 3D реконструкции каналов представлены на рис. 5(4).

Рисунок 5. Процесс обработки изображений каналов Kv2.1C (А), Kv2.1CTA (Б) и Kv10.2 (В). 1. Выбранные изображения каналов, отфильтрованные от шума;

2. Некоторые классы, использованные при расчете трехмерной реконструкции каналов;

3. Обратные проекции трехмерной структуры, находящиеся в той же ориентации, что и классы на рисунке (2);

4. 3D структура каналов. Масштабный отрезок равен 10 нм В дальнейшем 3D структура была улучшена с помощью программы FREALIGN (Grigorieff, 2007): сначала 3D структуры были скорректированы согласно частотно-контрастной характеристике электронного (CTF) микроскопа, а затем было произведено их улучшение путем систематического поиска и улучшения углов Эйлера в Фурье-пространстве.

Финальные 3D структуры представлены на рис 7 (Kv2.1) и рис. 11 (Kv10.2).

Разрешение полученных трехмерных структур каналов Kv2.1C, Kv2.1CTA и Kv10.2 вычислялось с помощью коэффициента объемной корреляции Фурье (FSC) (Harauz and Heel, 1988) (рис.6). В результате были получены следующие значения: Kv2.1CTA-22,7, Kv2.1C-24,5, и Kv10. - 34,2.

Рисунок 6. Определение разрешения структур каналов Kv2.1CTA, Kv2.1C и Kv10.2. График зависимости коэффициента объемной корреляции Фурье (FCS) от пространственной частоты для каналов Kv2.1CTA (мелкий пунктир), Kv2.1C (крупный пунктир) и Kv10.2 (сплошная кривая). Итоговое разрешение структур, находится как величина, обратная пространственной частоте при которой коэффициент FSC равен 0,5.

3D структуры мутантных каналов Kv2.1C и Kv2.1CТА:

3D структура канала с удаленным С-концом (Kv2.1C) имеет пирамидальную форму. Ее можно разделить на две части: большую (~80) и меньшую (~50), которые разделяются резким сужением канала в центральной части (~40) (рис.7А). 3D структура канала Kv2.1CTA имеет размеры: длина ~80, ширина в верхней части канала ~80, в нижней части ~35, в средней части канал имеет диаметр ~65 (рис.7В).

Верхняя часть 3D структур обоих мутантных каналов Kv2.1 плоская, она структурно гомологична мембранной части полноразмерного человеческого канала Kv2.1 (рис.12А) (Adair et al, 2008). При этом она отличается от мембранной части канала Shaker (Sokolova et al., 2001), которая имеет колоколообразный выступ на внеклеточной поверхности (рис. 7Б), исчезающий при экспериментальном дегликозилировании. Известно, что у канала Kv2.1 N-гликозилирование отсутствует (Shi and Trimmer, 1999).

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что верхняя часть 3D структур Kv2.1 является трансмембранной. Этот вывод подтверждают результаты докинга кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) в полученную электронную плотность (рис.8). Мембранно-связанный домен канала Kv1.2 соответствует по размерам верхней части обеих 3D реконструкций (для Kv2.1C R=0,88;

для Kv2.1CTA R=0,9).

Рисунок 7. Финальные 3D структуры каналов: А. Kv2.1C Б. 3D структура канала Shaker (Sokolova et al., 2001). Белой стрелкой показаны «окна». Серой стрелкой показан выступ мембранной части, образованный гликозилированием.

В. Kv2.1CTA. Слева направо: две боковые ориентации, вид на канал с цитоплазматической стороны. Масштабный отрезок - 10 нм Нижняя часть 3D структур каналов Kv2.1C и Kv2.1CТА (рис.7), соответственно, представляет собой цитоплазматический домен.

Цитоплазматический домен канала Kv2.1C (рис. 7А) обладает небольшими размерами и имеет четыре выступа, повернутые относительно мембранной части канала на 45о. Докинг кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) показал, что эти выступы по объему соответствуют тетрамеру N концевых Т1 доменов (рис.8А) (R=0,98). В более ранних работах (Mohapatra et al., 2008) было показано, что домен T1 канала Kv2.1 в своей нижней части имеет специфичный для семейства Kv2 мотив, который регулирует взаимодействие с C-концом канала Kv2.1 и его экспрессию на поверхности клетки. Этот мотив представляет собой дополнительную петлю (55-71 а.о.), наличие которой было предсказано методом моделирования по гомологии (Ju et al., 2003;

Mohapatra et al., 2008). На полученной нами структуре канала Kv2.1C, в нижней части домена T1 находится дополнительный выступ, отсутствующий у канала Kv1.1 (Sokolova et al., 2001) (рис.7Б), который вероятно образован данной петлей (стрелка на рис.8А).

Рисунок 8. Докинг структуры канала Kv1. (Long et al., 2005) (показана спиралями) в трехмерные структуры каналов Kv2.1C (А) и Kv2.1CTA (Б). Стрелкой показана оптическая плотность, занимаемая T1 петлей Цитоплазматическая часть канала Kv2.1CTA отличается от Kv2.1C массивными выступами в нижней части канала (рис.7В);

они повернуты 60о.

относительно мембранной части на В результате докинга кристаллической структуры канала Kv1.2 (Long et al., 2005) большая часть цитоплазматической части вокруг T1 домена остается свободной (рис.8Б).

Следовательно, есть все предпосылки считать, что она занята C-концевым доменом Kv2, присутствующим в Kv2.1CTA.

Рисунок 9. 3D структура Kv2.1C (светло-серая) с наложенной разностной структурой (показана темно-серой).

Серые стрелки указывают на Kv домены, черные стрелки указывают на разность мембранной части мутантных каналов.

Для проверки этой гипотезы мы сравнили две полученные 3D структуры между собой, путем вычитания трехмерной модели Kv2.1C из модели Kv2.1CTA с помощью программы IMAGIC (рис.9). Объем и масса разностных пиков (около 30 кДа каждый) достаточна для помещения 250 а.о., соответствующих домену Kv2. При сравнении структур транкированных Kv2.1 каналов со структурой полноразмерного человеческого Kv2.1 канала (Adair et al, 2008), видно, что у обоих мутантных каналов отсутствует массивная нижняя часть, очевидно, являющаяся CTA доменом (рис.12).

Таким образом, полученные нами электронно-микроскопическое данные о строении мутантных каналов Kv2.1 подтверждают гипотезу, высказанную ранее на основе физиолого-биохимических экспериментов (Ju et al., 2003) о том, что в 3D структуре канала Kv2.1 обширные цитоплазматические С концевые домены Kv2 и CTA частично окружают N-концевой Т1 домен. Мы показали, что при этом четыре домена Kv2 расположены по бокам Т1 домена, а CTA-домены занимают дистальную часть цитоплазматического домена.

3D структура канала Kv10.2:

3D структура канала Kv10.2wt имеет трапециевидную форму с высотой ~95, шириной в верхней части канала ~100, в нижней части ~120, в средней части имеется небольшое сужение до ~90 (рис.10).

Верхняя часть канала, в отличие от Kv2.1CTA и Kv2.1C, не плоская, а имеет куполообразный выступ диаметром ~30, который может являться результатом N-гликозилирования белка. Данную гипотезу подтверждает наличие сходного выступа на поверхности мембранного домена N гликозилированного канала Shaker (Sokolova et al.,2001) (рис.7Б).

Рисунок 10. 3D реконструкция канала Kv10.2. Показаны два боковых вида (отличающиеся друг от друга поворотом на 90), а также вид сверху (с внеклеточной стороны). Масштабный отрезок равен 10 нм. М – трансмембранный домен;

Р и D – цитоплазматические домены;

О – окно.

Для интерпретации полученной 3D структуры канала использовался докинг молекулярной модели мембранной части Kv10.2 (Соколова и др., 2012), рассчитанной по гомологии с кристаллической структурой бактериального канала MlotiK1 (Clayton et al., 2008). Моделирование проводилось нашими коллегами с каф. биоинженерии биологического ф-та МГУ. Полученная модель трансмембранного домена хорошо соответствует по размерам верхней части полученной реконструкции Kv10.2 (рис.11А), выступы которой имеют крестообразную форму со слегка закрученными лопастями (R=0,62). Таким образом, верхняя часть модели, скорее всего, является трансмембранной, а нижняя часть - цитоплазматической. Обширная цитоплазматическая часть структурно подразделяется на субдомены «P» и «D», которые, видимо, сформированы N- и C-концевыми доменами (рис.10).

В отличие от трехмерных структур каналов Kv2.1, верхнюю и нижнюю части канала Kv10.2 разделяют линкеры, которые ограничивают характерные для большинства Kv каналов «окна». Размеры «окон» в нашей модели составляют около 0.25 х 0.3 нм2, что согласуется с данными, полученными ранее для канала Shaker (Sokolova et al., 2001).

Kv10.2: Расположение цитоплазматических доменов.

Для определения локализации цитоплазматических доменов канала Kv10.2 мы проводили докинг моделей N- и С-концевых доменов Kv10.2, построенных по гомологии с моделями других ионных каналов (рис.11).

Для построения модели N-концевого домена PAS в качестве шаблона была выбрана структура гомологичного домена Kv канала человека hErg Для построения модели С-концевого сNBD-домена была (Kv11).

использована кристаллическая структура человеческого cAMP-зависимого канала HCN4. Докинг модели тетрамера сNBD привел к результатам, не согласующимся с полученной реконструкцией (R=0,1) (рис. 11В). Однако, перемещая отдельные мономеры сNBD в направлении, указанном стрелками на рис 11В, их можно встроить в область субдоменов «D». В пользу этого варианта свидетельствует относительное соответствие объемов субдоменов и мономеров сNBD (R=0,89) (рис. 11Г). Докинг модели N-концевых доменов (PAS) в область субдоменов «Р» позволил разместить эти домены дальше от центральной оси канала, в непосредственном контакте с С-концевыми доменами (R=0,89) (рис. 11 Д, Е) (Соколова и др., 2012).

Рисунок 11. Интерпретация реконструкции канала Kv10.2. А.

Докинг смоделированного трансмембранного домена в верхнюю часть реконструкции канала Kv10.2;

Б. Вид сбоку: ТМ трансмембранный домен;

В. вид снизу: докинг тетрамера cNBD доменов, моделированного по гомологии с кристаллической структурой человеческого цАМФ зависимого канала HCN4 (PDB ID:

3OTF);

Г. вид снизу: докинг cNBD доменов (красный) в область субдоменов «Р»;

Д. Вид сбоку:

докинг доменов PAS (голубой) и cNBD (красный) в цитоплазматическую часть. ТМ – трансмембранный домен;

Е. Вид снизу, обозначения, как на рис. 5Д.

Таким образом, в данной работе при сочетании методов электронной микроскопии и молекулярного моделирования была впервые определена локализация цитоплазматических доменов канала Kv10.2. Выявленное расположение цитоплазматических доменов PAS и сNBD соответствует современным данным об их строении и функционировании. Как и было предсказано (Stevens and Wray, 2009) домены PAS и сNBD тесно объединены, образуя олигомерную структуру, способствующую их взаимодействию, при этом домены сNBD не располагаются в центре канала, как предполагалось ранее, а находятся на его периферии.

Роль С-концевых цитоплазматических доменов в активации канала В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что активация Kv каналов регулируется посредством цитоплазматических N- и C-концов (Ju et al. 2003). Удаление N-концевого участка приводит к значительному снижению скорости активации и сдвигу порога активации в сторону деполяризации на 30 мВ. Удаление C-конца канала приводит к увеличению скорости активации канала и гиперполяризационному сдвигу порога активации (VanDogen et al., 1990). Во время деполяризации Kv2.1 C-конец перемещается к периферии белка параллельно плоскости мембраны на расстояние 1-2 нм (Kobrinsky et al., 2006).

Рисунок 12. Сравнение 3D структур каналов Kv2.1. А. 3D структура полноразмерного канала Kv2.1 (Adair et al., 2008). Б. 3D структура канала Kv2.1CTA. В. 3D структура канала Kv2.1C. Цитоплазматические домены CTA, T и Kv2 отмечены. M1, M2, M3, M4– субдомены мембранного домена.

Для того чтобы установить, как изменения, происходящие в цитоплазматической части отражаются на строении мембранного участка мы сравнили структуры мутантных каналов Kv2.1C и Kv2.1CTA между собой и со структурой полноразмерного канала Kv2.1 (Adair et al., 2008) (рис.12).

Мембранная часть всех приведенных на рис. 12 каналов содержит характерные структурные элементы (субдомены M1-М4). Расположение субдоменов M1,M3 и М4 схоже у всех трех структур, а локализация субдомена M2 заметно меняется (движение ~10). Возможно, такая разница положений субдоменов связана с изменением активационного состояния канала при удалении C-концевых доменов.

Для проверки этого предположения мы сравнили полученные 3D реконструкции мутантных каналов с моделями трансмембранной части канала Kv2.1 в открытой и закрытой (Kv2.1open) (Kv2.1closed) конформациях. Молекулярные модели были получены коллегами из лаборатории молекулярного моделирования каф. биоинженерии биологического ф-та МГУ.

Рисунок 13. Модели канала Kv2.1 в закрытом (А) и открытом (Б) состоянии, вид сверху. Структуры моделей представлены в виде спиралей, а также показана сгенерированная с разрешением в 20 3D поверхность. Петля S3-S подписана.

В качестве шаблона для моделирования были использованы модели открытого и закрытого состояний канала Kv1.2 (Han et al., 2008), основанные на модели активации (Pathak et al., 2007). Согласно этой модели наибольшие движения при активации канала совершают спирали S3-S4, верхние части которых движутся вместе в направлении к периферии канала (рис.13).

Рисунок 14. Сравнение моделей Kv2.1close и Kv2.1open (3D структуры с разрешением 20) со структурами каналов Kv2.1CTA и Kv2.1C. А. Сверху – модель Kv2.1close (голубая). Снизу – канал Kv2.1CTA (синий). Б. Сверху – модель Kv2.1open (светло-зеленая). Снизу – канал Kv2.1C (темно-зеленый). Обозначены субдомены M1-M4. Черная стрелка показывает направление движения субдомена M2 (спирали S3-S4).

Сравнение молекулярных моделей с мембранной частью мутантных каналов показало высокий уровень сходства (рис.14). У 3D структур и соответствующих моделей совпадает расположение субдоменов М1-М4.

Докинг показал лучшее соответствие модели Kv2.1open со структурой Kv2.1C (R=0,95), а Kv2.1close с Kv2.1CTA (R=0,95), чем структуры Kv1. (Long et al, 2005): R=0,88 при докинге в Kv2.1C;

R=0,9 при докинге в Kv2.1CTA.

Гипотеза конформационных изменений потенциал-зависимого канала при активации: Наши исследования структуры Kv каналов, в сочетании с данными мировой литературы позволили создать модель конформационных изменений цитоплазматических доменов потенциал зависимого канала при активации (рис.15) (Pischalnikova et al., 2009).

Рисунок 15. Схема конформационных изменений в Kv каналах при активации. 3D схема субъединицы Kv канала в “закрытой” конформации.

Спирали S1-S6, и петля показаны S4-S5, цилиндрами. Спираль S разделена на две: S3a и S3b (как в Jiang et al., 2003). Символами “+” обозначены заряженные а.о. в спирали S4. N концевой Стрелочки указывают направления движения спиралей. В рамке-кристаллическая структура мономера химерного канала Kv1.2/Kv2.1 в открытой конформации (Long et al., Стрелка 2007).

показывает направление движения ионов в поре канала. (Pishalnikova and Sokolova, 2009) Согласно последним данным, при активации канала наибольшие движения в мембранной части происходят в спиралях S3-S4, которые движутся к периферии канала, оказывая воздействие на S4-S5 линкер, который тянет спираль S5 в сторону от оси поры. Спирали S5 формируют “манжету” на периферии спиралей S6, и возможно, что при расширении “манжеты” спиралей S5 спирали S6 следуют за ними наружу, открывая пору (Yellen 2002;

Long et al. 2005a, b, Pathak et al., 2007). Так как сегмент S участвует в открытии и закрытии ворот канала, C-конец, напрямую с ним связанный, может влиять на этот процесс (Long et al., 2005) (стрелочка 7) (Kobrinsky et al. 2006;

Wray 2008). Действительно, было показано, что при активации канала C-конец канала Kv2.1 движется в том же направлении (к периферии), что и сегмент S6 (рис.15).

Эта гипотеза подтверждается нашими данными ПЭММ. Субдомен M включает верхнюю часть спиралей S3-S4, совершающую наибольшие движения (Pathak et al., 2007). У канала в открытом состоянии он располагается на периферии белка, а при закрытии смещается внутрь (рис.14). Удаление С-концевых доменов приводит к конформационным изменениям в мембранной части каналов, что является выражением изменения активационного состояния канала.

ВЫВОДЫ 1. Определена 3D структура С-концевых мутантов крысиного канала Kv2.1 - Kv2.1CTA и Kv2.1C с разрешением в 23 и 24,2 соответственно.

Локализованы цитоплазматические домены канала Kv2.1: С-концевые домены Kv2 и CTA окружают N-концевой Т1 домен, домены Kv расположены по бокам Т1, а CTA-домены занимают дистальную часть цитоплазматического домена.

2. Получены структурные доказательства того, что цитоплазматический С-конец принимает участие в изменении активационного состояния канала Kv2.1.

3. Определена 3D структура полноразмерного человеческого канала Kv10.2 с разрешением в 34,2 и выявлена локализация его цитоплазматических доменов. Домены PAS и cNBD образуют структуру по типу «висящей гондолы». Домены cNBD находятся на периферии цитоплазматической части канала, ниже доменов PAS.

4. На живой клеточной культуре была показана кластерная организация каналов Kv2.1. Цитоплазматический С-конец канала Kv2.1 выполняет функции вспомогательной субъединицы и участвует в поверхностной экспрессии канала. Показана кластерная организация канала Kv10. Кластеры Kv10.2 колокализуются с актиновыми филаментами.

5. Выдвинута гипотеза, объясняющая конформационные изменения доменов потенциал-зависимого калиевого канала при переходе из закрытого состояния в открытое.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи и учебные пособия:

1. Pischalnikova A.V., Sokolova O.S. The domain and conformational organization in potassium voltage-gated ion channels.// Journal of Neuroimmune Pharmacology, 2009. V.4(1). P. 71- М.Г.Карлова, А.В.Пищальникова, А.А.Рамонова, М. М. Мойсенович, О.

2.

С. Соколова, К. В. Шайтан. Тест-система для изучения фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов, экспрессируемых in vitro. Биофизика, 2011, т.56, вып.2, стр 272- О.С.Соколова, К.В.Шайтан, А.В.Гризель, А.В.Попинако, М.Г.Карлова, 3.

М.П.Кирпичников. 3D структура человеческого канала Kv10.2 по данным электронной микроскопии макромолекул. Биофизика, 2012, №2, стр.1-8.

О.С.Соколова, А.Г.Богданов, А.В. Гризель. Учебно-методический 4.

комплекс для магистров по дисциплине – Электронная микроскопия нанобиообъектов. – М.: НОУДПО «Институт АйТи», 2011.

Тезисы конференций:

Пищальникова А.В. Четвертичная структура человеческого калиевого 5.

канала с удаленным цитоплазматическим доменом по данным электронной микроскопии. // Тезисы докладов второго студенческого симпозиума по биоинженерии 21 октября 2007. - М.: изд-во Биологического ф-та МГУ, 2007. – с.21- Пищальникова А.В. 3D структура человеческого калиевого канала 6.

Kv2.1С по данным электронной микроскопии. // Перспективы развития инноваций в биологии. Материалы научно-практической конференции в рамках международной научно-образовательной школы-конференции по биоинженерии и приложениям 23 ноября 2007 года. - М.: Изд-во «Инноватика», 2007. - c.63- Пищальникова А.В. Трхмерная структура калиевого канала Kv2.1 C.

7.

// Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - М.: Издательский центр Факультета журналистики МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008. – с. Пищальникова А.В, Соколова О.С. Локализация С-концевых 8.

цитоплазматических доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов докладов Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. – М.: Роснано, 2008. –с.493- Пищальникова А.В., Соколова О.С. Локализация цитоплазматических 9.

доменов человеческого канала Kv2.1. // Сборник тезисов. Первая международная конференция 17-19 июня 2008 г. Современные достижения бионаноскопии.– М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2008. – с. 10. Карлова М.Г., Пищальникова А.В., Рамонова А.А., Мойсенович М.М., Соколова O.C. In-vitro флуоресцентный тест на правильность фолдинга калиевого потенциал-зависимого канала // Сборник тезисов. Вторая международная конференция 16-18 июня 2009 г. Современные достижения бионаноскопии. – М.: изд-во Физического факультета МГУ, 2009. – с. 11. Пищальникова А.В., Карлова М.Г., Рамонова А.А, Мойсенович М.М., Соколова О.С. Разработка флуоресцентного теста in-vitro на правильность фолдинга калиевых потенциал-зависимых каналов // Тезисы докладов четвертого студенческого симпозиума по биоинженерии 30 октября 2009. М.: изд-во Биологического фак-та МГУ, 2009. – с.45-48.

12. Пищальникова А.В., Карлова М.Г., Рамонова А.А, Мойсенович М.М., Соколова О.С. Флуоресцентный метод скрининга лигандов калиевых потенциал-зависимых каналов // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы III научно-практической конференции, 11-13 ноября 2009 г., Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет. – М.: МАКС пресс, 2009. – с. 134 – 135.

13. Пищальникова А.В. Получение потенциал-зависимого калиевого канала Heag2 для исследования методом электронной микроскопии. // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010». – М.: МАКС Пресс, 2010. – с. 14. Пищальникова А.В., Соколова О.С. Получение потенциал-зависимого калиевого канала Heag2 для структурных исследований. // Современные проблемы биохимии и биохимии и бионанотехнологии. Сборник трудов Всероссийской Виртуальной Интернет-конференции. Казань, 17-22 Ноября 2010 г. – Казань. Издательство Казанского Университета с. 129 – 131.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. – аминокислотный остаток ММ – молекулярное моделирование ПААГ – полиакриламидный гель ПЭММ – просвечивающая электронная микроскопия макромолекул CTF – частотно-контрастная функция электронного микроскопа (contrast transfer function) FSC – коэффициент объемной корреляции Фурье Kv – потенциал-зависимые калиевые каналы

 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.