авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения

на правах рукописи

Парфенов Игорь Александрович ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЯ специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Т. А. Валуева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор биологических наук, профессор М. А. Белозерский

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН

Защита состоится «22» марта 2012 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071,Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33.

строение 1.

Автореферат разослан «21» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А. Ф. Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) – это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [Rawlings et al., 2004].

Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [Валуева, Мосолов, 1999;

Otlewski et al., 2005]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.

В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [Rawlings et al., 2004]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Белковые ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [Wei et al., 2009]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями: выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [Lawrence, Koundal, 2002;

Мосолов, Валуева, 2005].

В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов, изучение белков-ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.

К настоящему времени проведено много исследований и накоплено достаточное количество данных о белках-ингибиторах, представленных в картофеле (Solanum tuberosum L.), который является одной из важнейших мировых сельскохозяйственных культур [Bauw et al., 2006]. Часть этих белков объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и C-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых – PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C – относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994;

Heibges et al., 2003;

Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI, выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.



Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.

2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI и охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты:

-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин.

Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.

3. Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней картофеля. Для этого синтезировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации кДНК из генома картофеля.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы: Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor), который одинаково эффективно действовал на -химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы. Таким образом, выделенный белок PKCI, является «двуглавым» ингибитором трипсина и химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра.

Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физико химические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и pH-стабильностью. Показано, что ингибитор угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.

Определена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Разработан метод экспрессии этой кДНК в E. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность -химотрипсина и трипсина и так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-B. Сравнительный анализ восстановленных аминокислотных последовательностей белка PKCI с последовательностями белков группы PKPI-B, присутствующих в клубнях различных сортов картофеля и действующих как ингибиторы протеиназ, показал, что наиболее вариабельным является С-концевой участок их молекул, расположенный между остатками Cys147 и Cys164, в котором локализован реактивный центр, ответственный за связывание -химотрипсина.

Сделано заключение, что в состав реактивного центра, ответственного за связывание трипсина, входят остатки Arg68-Phe69, а в центре, ответственном за связывание химотрипсина, находятся остатки Met153 Ser154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов PKPI определяет специфичность их действия.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009);





XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011);

Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010);

Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (г. Екатеринбург, 2010);

I Всероссийской виртуальной интернет – конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2010);

V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011);

Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 8 тезисов в материалах конференций.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 135 страницах;

содержит 22 рисунка и 6 таблиц;

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 232 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

В обзоре литературы рассматривается структура, механизм действия и функции сериновых протеиназ. Подробно рассматривается классификация, молекулярная структура и механизмы действия белковых ингибиторов протеиназ, а также их различные функции в растениях.

Делается акцент на ингибиторах семейства SKTI, а также, подсемействе PKPI из картофеля.

Глава 2. Основные результаты и их обсуждение Выделение и очистка белка-ингибитора -химотрипсина Для первичного скрининга белковых ингибиторов, белки, осажденные сульфатом аммония (75% насыщения) из сока картофеля (S. tuberosum, сорт Юбилей Жукова), разделяли методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75. В полученных фракциях измеряли ингибиторную активность по отношению к сериновым протеиназам.

В результате гель-хроматографии были получены три белковых компонента: I, II и III. В компоненте I присутствовали высокомолекулярные белки, большая часть которых является представителями семейства пататинов (Mr ~ 50000). Белки, содержащиеся в компоненте II (Mr ~ 20 25000), обладали способностью эффективно ингибировать -химотрипсин.

В состав компонента III входили белки (Mr ~ 10000), не действующие на химотрипсин.

Белки компонента II разделяли с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B, уравновешенной 0,4 М Na ацетатным буфером, pH 4,3. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0 до 0,5 M в стартовом буфере. Белки разделялись на три основных компонента, обозначенных как Iа, IIа и IIIа (рис. 1А, кривая 1). Все три белковых компонента эффективно подавляли активности -химотрипсина и трипсина, в то же время значительно слабее действовали на субтилизин Карлсберг (рис. 1А, кривые 2-4 соответственно).

Диск-электрофорез полученных компонентов в Ds-Na-ПААГ показал, что только компонент IIIа, элюировавшийся при концентрации NaCl, равной 0,38 M, содержал единственный белок с молекулярной массой 23 ± 1 кДа, молекула которого состоит из одной полипептидной цепи (рис. 1В). Это дало основание предположить, что выделенный белок является представителем подсемейства PKPI.

Рис. 1. А - Ионообменная хроматография белков с молекулярной массой 20-25 кДа из клубней картофеля на КМ-сефарозе CL-6B и Ds-Na ПААГ-электрофорез (Б) компонентов, обладающих активностью ингибиторов протеиназ А - Ia,IIa,IIIa, – белковые компоненты, 1 – А280;

2-4 – активность ингибиторов трипсина, химотрипсина и субтилизина соответственно (в % от исходной активности фермента), в качестве субстратов использовали BAPA, Suc-GGF-pNa и Z-AAL-pNa;

5 - концентрация NaCl [M].

Б - М – белки-маркеры, I – компонент Iа;

II – компонент IIа;

III – компонент IIIа.

Было изучено влияние белка PKCI на активность сериновых протеиназ (рис. 2). Ингибитор слабо подавлял активность субтилизина Карлсберг и не действовал на цистеиновую протеиназу, папаин (рис. 2, кривые 3 и 4 соответственно), но в равной степени эффективно подавлял -химотрипсина активность и трипсина. Зависимости степени их ингибирования от количества внесенного ингибитора сохраняли линейный характер практически до полного угнетения (рис. 2, кривые 1 и 2). Расчеты показали, что с 1 молем ингибитора связывается 1 моль, как химотрипсина, так и трипсина.

Оказалось, что с -химотрипсином белок PKCI связывается несколько сильнее, чем с трипсином, поскольку для него линейный характер данной зависимости сохраняется на более протяженном участке вплоть до 85% ингибирования.

Рис. 2. Влияние белка PKCI на активность трипсина (1), -химотрипсина (2), субтилизина Карсберг (3) и папаина (4) Измеряли остаточную активность ферментов (% от исходной) при различных соотношениях ингибитор/фермент. Для определения активностей трипсина, -химотрипсина, субтилизина и папаина использовали в качестве субстратов BAPA, Suc GGF-pNa, Z-AAL-pNa и pGFL-pNa соответственно.

Расчет равновесных константы диссоциации (Кi) комплексов химотрипсин/трипсин-PKCI показал, что для -химотрипсина значение Кi, рассчитанное при гидролизе Suc-GGF-pNa (0,3 мМ), составило величину, равную 0,3 ± 0,1 нМ, а для трипсина - 1,2 ± 0,1 нМ при гидролизе BAPA (1,35 мМ) (табл. 1). Это подтверждает сделанное выше заключение о том, что белок PKCI сильнее связывает -химотрипсин, чем трипсин.

Таблица 1. Константы диссоциации (Кi) комплексов PKCI с исследуемыми ферментами Фермент (нM)* Субстрат (мM) Ki, нM 0,3 ± 0, -химотрипсин (13,95) Suc-GGF-pNa (0,3) Трипсин (4,71) BAPA (1.35) 1,2 ± 0, * - реальные концентрации активных ферментов, определенные титрованием активных центров [Shonbaum et al., 1961: Chase, Shaw, 1967].

Рис. 3. ВЭЖХ белка PKCI (A) и его смесей с ферментами (Б и В) Оптическую плотность измеряли при 280 нм, Б - смесь эквимолярных количеств трипсина и PKCI: В- смесь эквимолярных количеств трипсина, -химотрипсина и PKCI. Белки маркеры: I – БСА (67 кДа), II – яичный альбумин ( кДа), III – химотрипсиноген (25 кДа) Определение молекулярной массы ингибитора и его комплексов с химотрипсином и трипсином При ВЭЖХ ингибитор PKCI элюировался в виде одного гомогенного белкового компонента (рис. 3А).

Рассчитанное значение его молекулярной массы 23 ± 1 кДа соответствовало величине, определенной методом Ds-Na-ПААГ электрофореза. Совпадение значений молекулярной массы, полученных двумя различными способами, подтверждало, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи.

При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI и -химотрипсин или трипсин, в элюатах присутствовали более тяжелые компоненты. Их молекулярные массы составляли величины 46 и 45 (± 1) кДа (рис. 3Б), что практически равно сумме молекулярных масс белка PKCI и -химотрипсина/трипсина, соответственно. Это указывает на то, что ингибитор взаимодействует с ферментами в соотношении 1:1, образуя с ними стехиометрические комплексы (моль/моль), устойчивые в условиях ВЭЖХ. При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI, -химотрипсин и трипсин, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 63 ± 1 кДа (рис.

3В), представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKCI связывались одновременно одна молекула -химотрипсина и одна молекула трипсина.

Это давало основания предположить, что ингибитор является «двуглавым» и содержит два независимых реактивных центра, ответственных за связывание каждой из этих протеиназ.

Определение N-концевой последовательности Секвенированием по Эдману были установлены первые аминокислотных остатков белка PKCI. На рис. 4 приведено сравнение его N-концевой аминокислотной последовательности с последовательностями белков: PSPI-21-6.3, PKTI-22, PKSI, P1H5, KPI A-k1, KPi B-k2 и PI-2, выделенных из клубней картофеля сортов Истринский [Ревина и др., 2010;

Valueva et al., 2000], Provita [Heibges et al., 2003], Kuras [Bauw et al., 2006] и Elkana [Pouvreau et al., 2003] соответственно.

Белки PKPI принято разделять на три структурные группы: PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C [Ishikawa et al., 1994]. Белки PKPI, относящиеся к указанным трем структурным группам, имеют различное строение N- и C концевых участков, а также обладают различной специфичностью действия на протеиназы [Ishikawa et al., 1994].

Видно, что последовательности белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI- P1H5, KPi B-k2 и PI-2 значительно отличались от последовательностей белков PKSI и KPI A-k1 (рис. 4), что указывает на их принадлежность к различным структурным группам ингибиторов PKPI. В работе [Ревина 2004] было показано, что белок PKSI входит в состав группы PKPI-C. Белок KPI A k1 входит в группу PKPI-A [Bauw et al., 2006]. В тоже время первые аминокислотных остатков белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI-22, P1H5, KPi B-k и PI-2 полностью совпадали (рис. 4). Эти остатки обнаружены в последовательностях всех белков структурной группы PKPI-B и являются консервативными [Ishikawa et al., 1994]. Таким образом, белок PKCI был отнесен именно к этой структурной группе.

Рис. 4. Сравнение N-концевых последовательностей белков PKPI, выделенных из клубней картофеля различных сортов и действующих как ингибиторы протеиназ 1 – PKCI, 2 – PKTI-22 [Ревина и др., 2010], 3 – PSPI-21-6.3 [Valueva et al., 2000], 4 – PKSI [Ревина и др., 2004], 5 - P1H5 [Heibges et al., 2003], 6 - KPi B-k2 [Bauw et al., 2006], 7 - PI-2 [Pouvreau et al., 2003], 8 - KPI A-k1 [Bauw et al., 2006].

Различающиеся остатки выделены серым цветом.

Определение pH и термостабильности белка PKCI Были исследованы рН- и термостабильность белка PKCI (рис. 5) Видно, что при инкубации белка в течение 20 ч при различных значениях pH наблюдалось определенное снижение его активности по отношению к химотрипсину, наиболее выраженное при pH 2,0 и 12,0 (рис. 5а), где ее потеря составила 30 и 70%, соответственно.

Рис. 5. Зависимость активности белка PKCI по отношению к химотрипсину от рН (а) и температуры (б) 1 – инкубация при рН 6,0, 2 – инкубация при рН 2,0. В качестве субстрата использовали Suc-GGF-pNa. Измеряли степень ингибирования фермента (%) при соотношении ингибитор/фермент (моль/моль).

Нагревание белка PKCI в течение 10 мин при температурах от 50 до 90°С приводило к значительному снижению активности ингибитора по отношению к -химотрипсину, как при pH 6,0, так и при pH 2,0 (рис.5б). При 9 0 °С температуре ингибитор практически полностью терял свою активность. Таким образом, имеются все основания предполагать, что при сильно кислых и щелочных значениях pH, а также при высоких температурах среды белок PKCI теряет конформацию нативной молекулы.

Изучение фунгицидной активности белка PKCI Ранее в нашей лаборатории было установлено, что некоторые белки PKPI накапливаются в тканях клубней картофеля сорта Истринский при инфицировании оомицетом P. Infestans [Валуева и др., 2003]. Было показано, что эти белки in vitro не только подавляют активность экзопротеиназ, секретируемых патогенными микроорганизмами [Гвоздева и др., 2004], но и угнетают их рост и развитие [Ревина и др., 2010]. В связи с этим было исследовано действие на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов белка PKCI, выделенного из картофеля сорта Юбилей Жукова, который обладает к ним повышенной устойчивостью. На рис. представлены результаты изучения влияния белка PKCI на рост гиф и развитие макроконидий гриба F. culmorum и зооспор оомицета P. infestans.

Гриб F. culmorum вызывает у растения картофеля фузариозное увядание, а оомицет P. infestans – фитофтороз.

Рис. 6. Влияние белка PKCI на рост гиф и повреждение макроконидий гриба F. culmorum (а) и зооспор оомицета P. infestans (б) 1 - длина гиф;

2 – количество лизированных макроконидий или зооспор. Приведены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.

На рис 6а, видно, что при добавлении 400 мкг белка PKCI длина растущих гиф гриба уменьшалась на 60% по сравнению с контролем (кривая 1), при этом более чем 50% макроконидий оказывались поврежденными (кривая 2). При той же концентрации белка PKCI длина гиф оомицета уменьшалась на 50% (рис. 6б, кривая 1) и разрушению подвергались всего 30% его зооспор (рис. 6б, кривая 2). Это свидетельствует о том, что белок PKCI слабее действовал на рост и развитие оомицета чем актиномицета. На основании этого можно предположить, что данный белок наряду с другими известными факторами включен в защитную систему картофеля.

Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI-B в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова.

Методом обратной транскрипции, используя мРНК как матрицу, выделенную из 2-х недельных проростков картофеля сорта Юбилей Жукова, была получена полная кДНК картофеля. Затем с помощью ПЦР со специфическими праймерами, синтезированными нами, была получена кДНК, обозначенная как PKPIJ-B. Последовательность нуклеотидов в этой кДНК характеризовалась высокой степенью сходства (от 95,2 до 96,6% идентичных н.п.) с генами PKPI-B9 (AY693424), PKPI-B10 (AF536175.1) [Сперанская и др., 2005], PI-2 (AY166690) [Pouvreau et al., 2003], KPi B-k (DQ168333.1) [Bauw et al., 2006], P1H5 (AF492359), P4D11 (AF4955584) и S1C1 (AF492769) [Heibges et al., 2003], которые были обнаружены в картофеле сортов Истринский, Elkana, Kuras, Provita и Saturna, соответственно. Однако она значительно отличалась от последовательности gCDI-B1 (Q41484) из сорта Danshaku, содержащей только 90,7% идентичных н.п. [Ishikawa et al., 1994]. Оценка степени сходства последовательностей генов и полученной кДНК PKPIJ-B, кодирующих белки PKPI-B в картофеле семи сортов, показала, что они содержат от 89 до 99% идентичных н.п. При этом, наиболее вариабельные участки последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул.

Анализируя положения замен нуклеотидов в этих последовательностях можно сделать заключение, что они локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

На рис. 7 приведено филогенетическое дерево, из которого видно, что сорта японской и европейской (в том числе российской) селекции находятся на разных ветвях «дерева», что соответствует гипотезе, предложенной в работе [Heibges et al., 2003], о высокой внутри- и межсортовой вариабельности белков PKPI. Действительно, замены в нуклеотидных последовательностях могут приводить к полиморфизму аллелей одного и того же генного локуса в геноме тетраплоидного картофеля Рис. 7. Филогенетическое дерево генов, кодирующих белки PKPI-B в различных сортах картофеля Построено с использованием программы MEGA 4 по принципу максимального подобия.

Числа в узлах ветвей (bootstraps) – индексы поддержки каждого узла, полученные при расчете 100-кратной повторности.

Гетерологичная экспрессия белка PKPIJ-B Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPIJ-B в E. coli штамма BL-21(DE3), была создана на основе экспрессионного вектора pET23а.

Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPIJ-B, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве в растворимой фракции клеточных белков E. coli штамма BL 21(DE3). Молекулярная масса полученного рекомбинантного белка PKPIJ-B, определенная методом DS-Na-ПААГ-электрофореза, имела значение около 25 кДа, что совпадало с расчетной величиной. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pET23a, не содержащим вставки, белковый продукт с такой молекулярной массой не был обнаружен.

Для получения рекомбинантного белка PKPIJ-B клетки E. coli разрушали ультразвуком. Нерастворимая фракция с тельцами включения E.

coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Наши предварительные эксперименты показали, что присутствие небелковых и белковых примесей отрицательно сказывается на процессе его ренатурации и низкому выходу целевого белка. В связи с этим денатурированные тельца включения были подвергнуты очистке от примесей на колонке (2,5х30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М Трис-HCl-буфером, pH 8,0, содержащим М мочевину. Связанный с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Данная процедура позволила практически полностью отделить целевой продукт от белковых и небелковых примесей, содержащихся в клеточном лизате E. сoli.

Рефолдинг солюбилизированных белков телец включения E. coli проводили путем диализа против 0,05 М Трис-HCl-буфера, pH 7,5 при 4°С в течение 24 ч. Ренатурированный белок PKPIJ-B дополнительно очищали до гомогенности методом анионообменной FPLC-хроматографии на ДЭАЭ Toyopearl, уравновешенном 0,05 М Трис-HCl-буфере, pH 7,5. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере.

По данным DS-Na-ПААГ-электрофореза компонент I-1, элюировавшейся при 0,15 М NaCl, содержал гомогенный белок PKPIJ-B с молекулярной массой 25 кДа (рис 8А). Можно заключить, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи. Следует отметить, что молекулярная масса рекомбинантного белка несколько выше, чем у PKCI, выделенного из клубней картофеля. Это связано с присутствием дополнительных аминокислотных остатков, которые был введены при создании экспрессионной плазмиды.

Была исследована активность рекомбинантного белка PKPIJ-B по отношению к протеолитическим ферментам. Показано, что он эффективно подавлял активность -химотрипсина и в меньшей степени трипсина (рис.

8Б).

Зависимость степени подавлении активности -химотрипсина от количества добавленного ингибитора сохраняла линейный характер до достижения 80%-ного ингибирования (рис. 8Б, кривая 1). Расчеты показали, что 1 моль ингибитора стехиометрически связывался с 1 молем химотрипсина, а также с 1 молем трипсина.

Исследования при помощи ВЭЖХ, смесей, содержащих избыток рекомбинантного белка PKPIJ-B, -химотрипсина и трипсина, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 65 ± 1 кДа, представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKPIJ-B связывались одновременно одна молекула -химотрипсина и одна молекула трипсина.

Таким образом, рекомбинантный белок PKPIJ-B и выделенный нами из клубней картофеля белок PKCI обладают одинаковым характером действия на протеиназы и способны образовывать тройные комплексы, в которых одна молекула ингибитора связывается одновременно две молекулы химотрипсина и трипсина. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что белок PKCI идентичен рекомбинантному белку PKPIJ-B.

Рис. 8. А - Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPIJ-B (А) и его влияние (Б) на активность -химотрипсина (1) и трипсина (2) А: М – белки-маркеры, 1 – белок PKPIJ-B Б: Влияние рекомбинантного белка на активность -химотрипсина (1) и трипсина (2). Для определения активностей -химотрипсина и трипсина использовали в качестве субстратов Suc-GGF-pNa и BAPA, соответственно.

4.8. Аминокислотная последовательность белка PKCI На основании сравнения N-концевых участков белков PKCI и PKPIJ-B, их молекулярных масс, а также действия на протеиназы с возможностью образовывать тройные комплексы позволило утверждать, что белок PKCI кодируется в геноме картофеля выделенным фрагментом гена PKPIJ-B.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы PKPI-B, приведенных на рис. 9, показало, что они содержат от 86,5 до 98,6% идентичных остатков, часть из которых является консервативной. Прежде всего, это два консервативных остатка цистина, образующих дисульфидные связи, соединяющие остатки Cys49-Cys98 и Cys147Cys164, первая из которых формирует большую пептидную петлю в N-концевой части молекулы, а вторая – малую в ее С-концевой части. Несмотря на высокое сходство первичных структур, рассматриваемые белки различаются по специфичности действия на -химотрипсин и трипсин. Так, белок PSPI-21 6.3, который кодируется геном PKPI-B9, эффективно подавлял активность эластазы из лейкоцитов человека и значительно слабее действовал на трипсин и -химотрипсин [Valueva et al., 2000]. Такой же специфичностью действия на протеиназы характеризуется белок PSPI-21-5.2, который кодируется гибридным геном, содержащем на 3’-участке фрагмент гена PKPI-B9, а на 5’-участке - PKPI-A6 [Сперанская и др., 2005]. Белок PKTI-22, кодируемый геном PKPI-B10, является специфическим ингибитором трипсина [Ревина и др., 2010], а белки PKCI и P1H5 с одинаковой эффективностью действуют на -химотрипсин и трипсин [Heibges et al., 2003].

Все белки, аминокислотные последовательности которых представлены на рис. 9, являются ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по «каноническому» субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на своей поверхности специфическую структуру - «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь Р1-Р1’, образующая реактивный центр ингибитора.

Действительно, как видно на рис. 9, в аминокислотных последовательностях всех ингибиторов PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий остатки Arg68-Phe69, расположенные в большой пептидной петле. Показано, что они входят в состав реактивного трипсин-связывающего центра ингибиторов [Valueva et al., 2000]. Таким образом, в пространственной организации их молекул создаются условия для образования «канонической петли» связывания трипсина.

Как было установлено, белок PKCI способен одновременно связать молекулы трипсина и -химотрипсина. Кроме того, белки P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1, обладают способностью действовать как на трипсин, так и достаточно эффективно на -химотрипсина [Bauw et al., 2006;

Heibges et al., 2003;

Pouvreau et al., 2003]. Следовательно, второй реактивный центр, связывающий -химотрипсин, должен присутствовать в их молекулах.

Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей белков PKPI B из различных сортов картофеля 1 – PKPIJ-B (PKCI), 2 – PSPI-6.3 [Valueva et al., 2000], 3 - PKTI-22 [Ревина и др., 2010], 4 PSPI-21-5.2 [Valueva et al., 2000], 5 - P1H5 [Heibges et al., 2003;

], 6 - gCDI-B1 [Ishikawa et al., 1994], 7 - KPi B-k2 [Bauw et al., 2006], 8 - P4D11 [Heibges et al., 2003], 9 - PI-2 [Pouvreau et al., 2003], 10 - S1C1 [Heibges et al., 2003]. Аминокислотные остатки, идентичные во всех последовательностях, не окрашены, а различающиеся обозначены серым цветом.

Вариабельные участки окрашены в бирюзовый цвет. Реакционные центры указаны стрелками, дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cys147-Cys164)- * и **, соответственно В работе [Heibges et al., 2003] была продемонстрирована важность остатка Met153, входящего в мотив Thr152-Met153-XX-Pro156, для проявления ингибиторами PKPI-B, действующими на трипсин, также активности по отношению к -химотрипсину. Так оказалось, что удаление остатка Met153 в результате делеции в гене P1H5 приводило к значительному снижению активности белка по отношению к -химотрипсину, при этом активность по отношению к трипсину оставалась неизменной. Это указывало на то, что остаток Met153 может входить в состав реактивного центра, связывающего -химотрипсин и локализованного в «канонической петле», образующейся между остатками Cys147-Cys164.

В аминокислотной последовательности белка gCDI-B1 в результате делеции в нуклеотидной последовательности кодирующей его ДНК также отсутствует остаток Met153. В молекуле белка PKTI-22 этот остаток присутствует, но существуют препятствия для образования «канонической» петли связывания -химотрипсина, поскольку между остатками Cys147 Cys164 расположена еще одна дисульфидная связь Cys155-Cys158. И, действительно, белок gCDI-B1 не действует на -химотрипсин [Ishikawa et al., 1994], а белок PKTI-22 очень слабо подавляет активность этого фермента [Ревина и др., 2010]. Только в молекулах белков PKCI, P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1 возможно образование «канонической» петли между остатками Cys147-Cys164, в которой локализован мотив Thr152 Met153-XX-Pro156, входящий в состав химотрипсинсвязывающего реактивного центра.

Таким образом, ингибитор -химотрипсина и трипсина PKCI содержит два независимых реактивных центра связывания ферментов. В одном из них локализованы остатки Arg68-Phe69, ответственные за связывание трипсина, в другом - Met153-Ser154, по которым связывается химотрипсин.

ВЫВОДЫ:

1. Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный как PKCI, эффективно подавляющий активность -химотрипсина и трипсина. Белок PKCI содержал два независимо действующих реактивных центра и был способен одновременно связать оба фермента. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность белка PKCI, позволившая отнести его к группе белков ингибиторов PKPI-B.

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Полученный рекомбинантный белок PKPIJ-B действует на протеиназы аналогично белку PKCI. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что при развитии клубней картофеля белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки семейства PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

4. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Показано, что остаток Met153 входит в состав реактивного центра связывания химотрипсина, который локализован в С-концевом участке между остатками Cys147 и Cys164.

5. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растение картофеля, что свидетельствует об его участии в защитной системе растения при поражении этими патогенами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах Ревина Т.A., Парфенов И.A., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева 1.

Т.A. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-272.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева 2.

Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле // Прикладная биохимия и микробиология. 2011.

Т. 47. № 4. С. 402–407.

Valueva T.A., Parfenov I.A., Revina T.A., Morozkina E.V., Benevolensky 3.

S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V. 52. P. 83-90.

Тезисы конференций Ревина Т.A., Кладницкая Г.В., Гвоздева Е.Л., Парфенов И.A., Валуева 1.

Т.A. Специфические ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и кодирующие их гены / Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова.

Москва. 2009. Т. 1. С. 335.

Парфенов И.А., Ревина Т.А. Белок-ингибитор трипсина и химотрипсина 2.

из клубней картофеля / Тез. XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2010. С. 48.

Парфенов И.А. Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из 3.

клубней картофеля / Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". Москва. 2010. С. 60.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующий 4.

белок ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле / Всероссийская молодежная научная конференция с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации". Екатеринбург. 2010. С. 97.

Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина из 5.

клубней картофеля и кодирующий его ген / I Всероссийская виртуальная интернет – конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий". Казань. 2010. С. 124.

Парфенов И.А. Молекулярное клонирование генов, кодирующих белки 6.

ингибиторы сериновых протеиназ в картофеле / Тез. XXIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии". Москва. 2011. С. 52.

Парфенов И.А., Валуева Т.А. Новый ингибитор химотрипсина из 7.

клубней картофеля. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного белков / V Российский симпозиум "Белки и пептиды".

Петрозаводск. 2011. С. 289.

Парфенов И.А., Валуева Т.А. Исследование свойств нового ингибитора 8.

химотрипсина из клубней картофеля Solanum tuberosum / Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва. 2011. Т. 2.

С. 52.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.