авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Разработка технологии биосинтеза фер мента лакказы базидиальными грибами рода trametes cпециальность

На правах рукописи

Русинова Татьяна Витальевна Разработка технологии биосинтеза фер мента лакказы базидиальными грибами рода Trametes Cпециальность 03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва 2007 1

Работа выполнена в Московском Государственном Университете инженерной экологии Научный руководитель кандидат биологических наук Е.С. Горшина

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А.П. Синицын доктор технических наук, профессор С.Е. Строгов

Ведущая организация: ОАО ГосНИИ биосинтеза белковых веществ, Москва

Защита состоится « 29» мая 2007 г в часов на заседании диссертационно го совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лакказа (п-дифенол:кислород оксидоредукта за, КФ 1.10.3.2) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиа тов. Лакказы из базидиальных грибов отличаются высоким окислительно восстановительным потенциалом и широкой субстратной специфичностью, что делает возможным их широкое, совместно с медиаторами, являющимися одно временно их первичными субстратами, использование в промышленности, на пример, при производстве современных экологически чистых древесно волокнистых плит (в качестве биосвязующего агента, заменяющего фенол формальдегидные смолы);

тонком органическом синтезе (например, синтезе электропроводящих полимеров);

текстильной промышленности (экологически чистое отбеливание тканей);

пищевой промышленности (удаление следов ки слорода в продуктах питания для увеличения срока хранения);

для биодеграда ции ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ;

синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков);

в биосенсорах, иммуноферментном ана лизе и других областях.

В настоящее время промышленная технология лакказы в РФ отсутствует.

В связи с этим работа по созданию технологии производства лакказы является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание технологии биосинтеза фермента лакказы грибами рода Trametes Fr.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг коллекционных штаммов грибов рода Trametes в глу бинной культуре и на агаризованных средах и выбрать наиболее перспектив ный в качестве продуцента лакказы штамм;

2. Изучить влияние компонентов полусинтетической питательной среды на ок сидазную активность (ОА);

3. Сравнить ОА штамма на комплексных средах из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья и подобрать дополнительные компоненты пита тельной среды. Изучить влияние индукторов на ОА штамма-продуцента;

4. Оптимизировать по ОА в качестве критерия оптимизации состав питательной среды с применением математических методов планирования эксперимента;

5. В условиях культивирования в ферментационном аппарате изучить влияние на синтез оксидаз рН, температуры, перемешивания и аэрации и определить оп тимальные режимы культивирования;

6. На основании полученных результатов разработать технологический процесс стадии культивирования процесса производства лакказы.

Научная новизна работы.

• На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования впервые проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes – потенциальных проду центов высокопотенциальных лакказ, относящихся к 4 видам: T.versicolor, T.pubescens, T.ochracea, T.hirsuta. Показано, что штаммовая вариабельность ОА в рамках одного вида рода Trametes превышает видовые различия по это му показателю. Диапазон ОА составил 0,00 – 0,90 ЕОА. Показано, что резуль таты первичного отбора штаммов, проведенного на основании реакции Бавен дамма, зависят от состава питательной среды и субстрата фермента и не сов падают с результатами, полученными в глубинной культуре.

• Показано, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз являются саха роза, глюкоза, фруктоза и мальтоза. Продуктивность по ОА существенно по вышается в присутствии кукурузного экстракта и дрожжевого автолизата. Ис точники азота и фосфора в меньшей степени влияют на ОА. Установлено, что содержание 0,03 мМ Cu2+ в пересчете на CuSO4 в среде достаточно для мак симального синтеза лакказы штаммом. Определено сельскохозяйственное во зобновляемое сырье, обеспечивающее высокую ОА (пшеничная мука).

• Определен режим рН-статирования (4,0) для достижения максимальной ак тивности и продуктивности по оксидазам. Показано, что оптимальная темпе ратура для достижения высокой ОА (32 оС) не соответствует наиболее благо приятной для роста и накопления биомассы (28-30 оС). Подобран режим пере мешивания и аэрации, обеспечивающий достаточную массопередачу кислоро да при отсутствии травмирования мицелия и определен соответствующий объемный коэффициент массопередачи кислорода. Установлена критическая линейная скорость мешалки (3,0-3,2 м·с-1), при превышении которой проис ходит механическое воздействие на мицелий гриба, приводящее к снижению ОА.



• Показано, что основным ферментом, продуцируемым штаммом T.hirsuta на разработанной среде является высокопотенциальная (780±20 мВ) лакказа.

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследо ваний выбран штамм T. hirsuta 56 для промышленного использования в качест ве продуцента лакказы. Проведено более 70 ферментаций в аппарате объемом 30 л. ОА штамма-продуцента за счет оптимизации среды и условий культиви рования повышена более, чем в 40 раз. Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента с получением высокоактивной культу ральной жидкости, на основании которой создан проект опытно промышленного регламента на производство технического препарата лакказы.

Проведены технологические испытания на производственной базе ООО «Фир ма «Макофарм»» (п. Лотошино), показавшие практическую реализуемость и эффективность разработанной технологии. Проведены испытания наработан ных образцов и опытной партии технического ферментного препарата в качест ве биосвязующего в производстве древесно-волокнистых плит (ЗАО ВНИИДРЕВ) и в тонком органическом синтезе (Институте биохимии им А.Н.

Баха РАН), которые подтвердили соответствие полученных препаратов необхо димым для производства требованиям. Предварительная технико экономическая оценка с учетом стадии концентрирования показала, что при го довом объеме производства культуральной среды 4400 м3, что составляет по требность одного предприятия при переводе всего производства древесно волокнистых плит на использование биосвязующих, себестоимость получаемой продукции будет составлять 1339,2 рубля за 1 кг или 13,39 рубля за 1000 МЕ.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладыва лись на 1-м (14-18 октября 2002 г.) и 2-м (10-14 ноября 2003 г.) Международ ных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва;

VI (20-24 мая 2002 г.) и VII (14-18 апреля 2003 г.) Междунар. симпозиумах «Техника и технология экологически чистых производств», Москва;

7-ой (14- апреля 2003 г.) и 8-ой (17-21 мая 2004 г.) Пущинской школе-конференции мо лодых ученых «Биотехнология – наука XXI века», Пущино;

V междунар. кон фер. «Инженерная защита окружающей среды», Москва, 14 – 15 апреля 2003 г.;

2 Междунар. конфер. «Наука-Бизнес-Образование», 10-13 мая 2005, Пущино.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ и подано 3 заявки на патенты РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введе ние, обзор литературы, описание объектов, материалов и методов исследова ния, 5 глав, в которых изложены результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, заключение, список цитируемой литературы, содержащий наимено ваний и 8 приложений. Материал изложен на страницах, содержи рисунков и таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель ис следования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов, указан личный вклад соискателя.

1. Обзор литературы. В обзоре рассмотрены возможные природные ис точники лакказы и показано, что промышленно значимыми высокопотенциаль ными лакказами являются лакказы ксилотрофных базидиомицетов, преимуще ственно принадлежащих к грибам белой гнили. Показано, что наиболее пер спективными для обнаружения промышленного штамма-продуцента лакказы являются базидиальные грибы рода Trametes Fr, и приведены данные об осо бенностях культивирования грибов этого рода. Проанализированы работы по влиянию на биосинтез лакказы различных компонентов питательных сред и ус ловий культивирования. На основании анализа научной и патентной литерату ры показаны известные способы получения лакказ и области их применения.

2. Объекты и методы исследования В работе использовали 4 вида грибов (20 коллекционных штаммов) рода Trametes Fr., традиционно относимых [А.С. Бондарцев, 1953] к семейству Polyporaceae, порядку Aphyllophorales, классу Basidiomycetes: T.hirsuta (Wulfen) Pilt - 3 штамма, T.ochracea (Pers.)Gib. & Ryvarden – 6 штаммов, T.pubescens (Schumach.) – 6 штаммов, T.versicolor (L.) C.G.Loyd– 5 штаммов.

Чистые культуры в разные годы были получены из коллекций Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН;

Сенежской лаборатории защиты древесины ЦНИИ механической обработки древесины;

Института микробиологии АН Бе лоруссии;

Института зоологии и ботаники АН Эстонии;

Сельскохозяйственного института им. В. Коларова (Болгария);

ГосНИИ биосинтеза белковых веществ и поддерживались на агаризованном сусле при температуре +4 оС с пересевами каждые 6 месяцев.

Штаммы выращивали на агаризованном сусле в чашках Петри диамет ром 90 мм и методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера объ емом 750 мл с объемом среды 150 мл на круговой качалке при скорости враще ния 200 об/мин, температуре 28 оС и исходном рН среды 5,8 - 6,0. Питатель ные среды инокулировали блоками (d-8 мм), вырезанными из зоны роста ко лонии соответствующего штамма на агаризованном сусле (1 блок на чашку Петри, 10 блоков на колбу), или глубинной культурой 2-3 пассажей в количе стве 10 об%.

Влияние источников углерода, азота и фосфора изучали, внося их в коли чествах, эквивалентных по соответствующему элементу.





Индукторы вносили при засеве в 3 мл 96 % этанола в концентрациях: та ниновая кислота 0,2 мМ, сирингалдазин 0,11 мкМ, кофейная кислота 0,2 мМ, 3,4-диметоксибензиловый спирт 0,2 мМ, 2,6-диметоксифенол 5 мкМ, этанол 20 г/л;

и в 3 мл воды: лигнин дубовый 2 г/л, стружки древесные 2 г/л, лузга подсолнечная 2 г/л, гребни виноградные 2 г/л.

Культивирование проводили на средах следующего состава:

1. Глюкозо-пептонная среда (Koroleva-Skorobogat`ko et al., 1998), г/л: глюкоза -10,0;

пептон – 3,0;

KH2PO4 – 0,6;

K2HPO4 – 0,4;

MgSO4 – 0,5;

CuSO4 –250 мг;

MnSO4 – 50 мг;

ZnSO4 –1 мг;

FeSO4 – 0,5 мг;

вода водопроводная.

2. Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л: глюкоза – 20,0;

(NH4)2SO4 – 2,5;

мочевина – 0,7;

KH2PO4 – 1,2;

кукурузный экстракт – 10,0;

про пинол Б-400 – 0,5;

вода водопроводная.

3. Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л: глюкоза – 20,0;

NH4NO3 – 4,0;

мочевина – 0,7;

KH2PO4 – 0,6;

K2HPO4 – 0,6;

MgSO4 – 0,5;

MnSO – 50 мг;

CuSO4 – 50 мг;

ZnSO4 – 1 мг;

FeSO4 – 0,5 мг;

кукурузный экстракт – 10,0;

вода водопроводная.

4. Среда с мукой, г/л: мука пшеничная – 20,0;

NH4NO3 – 4,0;

мочевина – 0,7;

KH2PO4 – 0,6;

K2HPO4 – 0,6;

MgSO4 – 0,5;

MnSO4 – 50 мг;

CuSO4 –50 мг;

ZnSO – 1 мг;

FeSO4 – 0,5 мг;

кукурузный экстракт –10,0;

вода водопроводная.

5. Среда c мукой, г/л: мука пшеничная – 20,0;

NH4NO3 – 2,8;

KH2PO4 – 1,2;

ку курузный экстракт – 10,0;

пропинол Б-400 – 0,5.

6. Оптимизированная среда с мукой, г/л: мука пшеничная – 29,0;

кукурузный экстракт – 6,4;

NH4NO3 – 2,0;

KH2PO4 – 1,2;

вода водопроводная.

7. Среда с глюкозой высокопродуктивная, г/л: глюкоза – 29,0;

кукурузный экс тракт – 6,4;

NH4NO3 – 2,0;

KH2PO4 – 1,2;

вода водопроводная.

Глубинное культивирование проводили также в ферментационном аппа рате «Marubishi» (Япония) объемом 30 л, с рабочим объемом 20 л, в условиях (если не указано иначе) исходного рН 6,0;

при температуре 26-28 оС;

аэрации 1,0 л/лмин с механическим перемешиванием 250 об·мин-1 двухъярусной тур бинной мешалкой открытого типа (нижний ярус – d = 120 мм, 6 лопастей;

верх ний ярус – d =100 мм, 4 лопасти).

Концентрацию биомассы определяли весовым способом в пробах по мл в трех повторностях по воздушно сухой массе (ВСМ) и в пересчете на абсо лютно сухую массу (АСМ).

Концентрацию растворенного кислорода (парциальное давление) опреде ляли с использованием кислородного датчика типа Кларка в процентах от на сыщения питательной среды.

Объемный коэффициент массопередачи кислорода KLa определяли суль фитным методом.

Редуцирующие вещества (РВ) в культуральном фильтрате определяли методом Бертрана [Плевако, Бакушинская, 1964].

ОА штаммов по методу Бавендамма определяли в чашках Петри на ага ризованном сусле с галловой кислотой (0,4%) [Метод. экспер. микол., 1982] и на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином (0,12 %) – мо дифицированный нами метод Бавендамма.

Определение экстрацеллюлярной ОА в глубинной культуре проводили в фильтрате культуральной жидкости спектрофотометрически при 410 нм с ис пользованием пирокатехина (10-2 М) в качестве субстрата в 0,1 М цитратно фосфатном буфере (рН 4,5). При проведении скрининга штаммов определение проводили на спектрофотометре СФ-26 (Ломо, Россия), в дальнейшей работе на Shimadzu UVmini 1240 (Япония). За единицу оксидазной активности (ЕОА) при нимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пере счете на 1 мл культурального фильтрата.

Коэффициент выхода фермента рассчитывали по формуле ypx = ОА / ВСМ, где ОА – общая оксидазная активность в ЕОА, ВСМ – воздушно сухая масса в мг/мл.

Для статистической оценки результатов использовали усредненный по большому массиву экспериментов расчет дисперсии воспроизводимости отно сительного значения величины (Бирюков, 2004).

3. Выбор штамма-продуцента 3.1. Определение фенолоксидазной активности методом Бавендамма На агаризованном сусле с галловой кислотой (метод Бавендамма) все штаммы за исключением T.versicolor 188 давали положительную реакцию на экстрацеллюлярные фенолоксидазы. Наибольшие диаметры окрашенной зоны (более 60 мм на 4 сутки роста) отмечены у T.hirsuta 86-43, T.versicolor 80-1, 86-59 и М 78, T.ochracea М 103, М 106 и у всех штаммов T.pubescens (таблица 1). Однако на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином (модифицированный нами метод Бавендамма) наибольшие диаметры окра шенных зон наблюдали у других штаммов: T.hirsuta 56, T.pubescens 923-3, T.pubescens 115, T.923-1, T.pubescens 78-12.

3.2. Сравнение ОА штаммов в глубинной культуре Активность экстрацеллюлярных оксидаз в условиях глубинного культиви рования определяли на жидкой глюкозо-аммонийной среде № 3 (таблица 1).

Опыт показал наличие у всех видов значительной штаммовой вариабельно сти по этому признаку. Все изученные штаммы вида T. versicolor обладали низ кой ОА, вплоть до нулевой. Наиболее активными были штаммы видов T. hirsuta и T. pubescens. Активность различных штаммов T. pubescens отличалась в 9, а T. hirsuta – в 11 раз. Наиболее высокую оксидазную активность имели (в поряд ке убывания): T.hirsuta 56, T.pubescens 78-12, T.hirsuta НРБ-2, T.ochracea 92-78, T.ochracea 92-83, T.ochracea 239. T.pubescens 923-8. Расчет показал, что по про дуктивности эти штаммы также являются лучшими.

Существенной разницы в накоплении биомассы наиболее и наименее про дуктивными штаммами, а также штаммами, практически не обладающими ОА, не выявлено, что подтверждает, что низкая ОА не связана со слабым ростом культуры. Расчет коэффициента выхода фермента показал, что у высокопро дуктивных штаммов этот показатель выше.

3.3. Сравнение отобранных штаммов в условиях глубинного культи вирования в ферментационном аппарате. Выбор штамма-продуцента Культивирование 5 штаммов, проведенное в ферментационном аппарате на глюкозо-пептонной среде № 1, показало, что в этих условиях наиболее про дуктивным штаммом так же является T.hirsuta 56 (ОА – 0,73 ЕОА).

Исследование лакказ, выделенных из культуральных фильтратов, полученных в результате культивирования штаммов в ферментационном аппарате, проведен ное совместно с Институтом биохимии им А.Н. Баха РАН, показало, что основ ные биохимические параметры данных лакказ соответствуют характеристикам лакказ других базидиальных грибов (Baldrian, 2006). Выход гомогенного фер мента по данным градиентного электрофореза составлял 25–35 мг с литра куль туральной жидкости для T.hirsuta 56 и 5-7 мг с литра для T. ochracea 92-78.

При выборе штамма-продуцента учитывали максимальную ОА, продуктив ность, стабильность в культуре, а также преимущественный синтез лакказы штаммом, редокс потенциал получаемого фермента и количество образуемых пигментов в процессе культивирования. По результирующим показателям для дальнейшей работы был выбран штамм T. hirsuta 56.

Таблица 1 – Распределение штаммов по величине ОА и накоплению биомассы в глубинной культуре и диаметру окрашенной зоны (реакция Бавендамма) Глюкозо-аммонийная среда, Сусло, пирокатехин галловая к-та Глубинная культура Агаризованная среда Штаммы ОА в Накопле- Диаметр Диаметр окра глубинной ние био- окрашен шенной зоны культуре* массы ной зоны T.hirsuta НРБ-2 3 - T.hirsuta 86-43 13 5 T.hirsuta 56 1 1 T.pubescens 115 14 3 T.pubescens 78-12 2 6 T.pubescens НРБ-1 8 4 T.pubescens 923-2 18 8 T.pubescens 923-3 11 2 T.pubescens 923-8 7 7 T.versicolor 237 17 11 T.versicolor 188 19 20 T.versicolor 80-1 20 20 T.versicolor 86-59 10 4 T.versicolor М 78 9 9 T.ochracea 92-78 6 - T.ochracea 92-83 4 - T.ochracea 117 15 - T.ochracea М 103 12 - T.ochracea M 106 16 10 T.ochracea 239 5 20 * на основании данных по максимальной оксидазной активности в ЕОА.

4. Подбор компонентов и оптимизация состава полусинтетиче ской питательной среды 4.1. Изучение влияния источников углерода на ОА На среде № 3 определено влияние на ОА источников углерода (глюкоза, сахароза, мальтоза, фруктоза, лактоза, галактоза, манит, сорбит, этанол, глице рин, уксусная кислота, лимонная кислота). Диапазон ОА на средах с разными источниками углерода составил 0,16 – 1,34 ЕОА. Наиболее высокой ОА штамм достигал на средах с сахарозой, глюкозой, фруктозой и мальтозой. Продуктив ность по ОА составляла на этих субстратах 0,18;

0,19;

0,16;

0,15 ЕОА·сут- соответственно на 7-е сутки культивирования.

4.2. Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА Определено влияние источников азота и фосфора на ОА штамма T.hirsuta 56 на среде № 3, содержащей в качестве источника углерода сахарозу. Диапа зон ОА на средах с разными источниками азота составил 0,18 – 1,4 ЕОА. Наибо лее высокой ОА штамм достигал на средах с пептоном, мочевиной, сульфатом аммония и нитратом аммония на 4 сутки роста (продуктивность по ОА на этих источниках – 0,36;

0,35;

0,33;

0,26 ЕОА·сут-1 соответственно). Из калийно фосфорных солей, обычно применяемых в микробиологической промышленно сти, максимальную ОА наблюдали на средах с фосфатом калия двузамещен ным. Однако окончательный подбор источника фосфора следует проводить в условиях рН-статирования.

5. Подбор компонентов и оптимизация состава комплексной пита тельной среды 5.1. Изучение влияния основного сырья на ОА Влияние комплексных субстратов из числа возобновляемого сельскохо зяйственного сырья на ОА изучали на среде № 3. Показано, что диапазон ОА на средах с разными источниками углерода составил 0,3 – 1,4 ЕОА. Максимальную ОА наблюдали на средах с крахмалом, мелассой, пшеничной мукой, пивным суслом. Продуктивность штамма на этих субстратах составляла: 0,19;

0,19;

0,17;

0,29 ЕОА·сут-1 соответственно.

Использование глюкозы, сахарозы, пивного сусла и крахмала ограничено их высокой ценой, а использование мелассы – нестабильностью качества и со держанием пигментированных веществ, которые затрудняют последующую очистку фермента. В то же время пшеничная мука как сырье относительно де шева, и ее использование вписывается в общую схему переработки зерна, что удешевляет процесс производства. Поэтому для дальнейших исследований в качестве основного сырья была выбрана пшеничная мука.

5.2. Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА На среде № 4 с пшеничной мукой и кукурузным экстрактом определено влияние различных форм азотного питания ((NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, KNO3, пептон, мочевина) на ОА. Для дальнейших исследований в качестве ис точника азота отобран нитрат аммония. ОА на среде с широко распространен ным в средах для получения лакказы пептоне оказалась даже несколько ниже, чем на средах с аммонийным азотом (1,3 и 1,1 ЕОА соответственно). Сочетание аммонийных солей с мочевиной не оказало положительного влияния на ОА. В результате проведенных опытов по изучению влияния на ОА источника фосфо ра (KH2PO4, (NH4)2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, Na2HPO4) для дальнейших исследо ваний был выбран 1-замещенный фосфат калия как эффективный и дешевый.

5.3. Изучение влияния ростовых факторов на ОА Определено влияние внесения в состав среды № 4 природных компонен тов, содержащих ростовые факторы и микроэлементы, в том числе медь. Куку рузный экстракт и дрожжевой автолизат были испытаны в концентрациях 0,25, 0,5 и 0,75 % по сухим веществам. Показано, что внесение в среду ростовых факторов приводит к существенному увеличению ОА (с 0,14 до 0,67 ЕОА для 0,25 % дрожжевого автолизата и 0,47 ЕОА для 0,25-0,5 % кукурузного экстрак та). Для использования в составе промышленной среды выбран кукурузный экстракт как более дешевый и менее дефицитный продукт.

5.4. Оптимизация состава промышленной питательной среды Оптимизацию состава питательной среды проводили по методу Бокса Уилсона на пятикомпонентной среде: мука пшеничная, NH4NO3, мочевина, KH2PO4, кукурузный экстракт. В качестве базового было взято соотношение основных компонентов среды № 4. Дробный факторный эксперимент проводи ли по двухуровневому плану. На основе рассчитанных коэффициентов регрес сии определяли программу крутого восхождения. Полученные результаты по зволили выбрать наиболее близкий к оптимальному состав питательной среды (среда № 6). Максимальная ОА на оптимизированной среде к 7 суткам состав ляет 5,4 ЕОА и превышает максимальную ОА на базовой среде в 2,7 раза. Соот ношение С:N (при учете крахмала муки в качестве источника углерода и амин ного азота кукурузного экстракта и аммонийного азота нитрата аммония) в оп тимизированной среде составило 11:1.

5.5. Изучение влияния количества сульфата меди на ОА Пшеничная мука и кукурузный экстракт, входящие в состав питательной среды № 6, содержат медь в своем составе (0,82 мкМ и 0,01 мкМ в пересчете на CuSO4 соответственно). Однако основное количество сульфата меди (31 мкМ) попадает в питательную среду с посевным материалом. Показано, что внесение CuSO4 в концентрации 1-250 мг/л (6,2 мкМ–1,57 мМ) не оказывает ингиби рующего действия на рост штамма-продуцента, но и не увеличивает ОА, как при внесении при посеве, так и при внесении на 3 сутки роста. Таким образом, показано, что концентрация меди 0,03 мМ в среде является достаточной для получения максимальной ОА.

5.6. Изучение влияния индукторов на ОА На среде оптимизированного состава изучена возможность дополнитель ного увеличения ОА за счет введения в состав среды веществ, известных как индукторы синтеза лакказы. Как видно из таблицы 2, максимум ОА наблюдает ся на среде с древесными стружками и составляет 7,3 ЕОА, что превышает ОА в контрольной среде в 1,5 раза. Близкий результат дают и виноградные гребни (7,1 ЕОА) Таблица 2 – Влияние индукторов на ОА Продолжительность культивирования, сут Индукторы 3 5 7 Таниновая кислота 4,4 6,9 6,3 2, Сирингалдазин 3,4 6,9 6,4 3, Кофейная кислота 5,4 7,0 5,5 1, Вератриловый спирт 4,7 5,0 1, 7, 2,6-диметоксифенол 2,9 4,5 4,8 2, Лигнин дубовый 5,9 6,2 4,1 2, Стружки древесные 6,6 3,5 1, 7, Этанол 3,7 6,5 2, 7, Лузга подсолнечная 6,0 6,6 4,2 2, Гребни виноградные 6,2 4,1 1, 7, Контроль 4,9 4,5 3,1 1, Доверительный интервал ±10,2% Продуктивность по ОА на среде с древесными стружками составляет 2, ЕОА·сут-1, тогда как на среде с этанолом только 1,4 ЕОА·сут-1. ОА на среде с ве ратриловым спиртом, кофейной кислотой, сирингалдазином и таниновой ки слотой (6,9 ЕОА) не превышает ОА на среде с этанолом, однако, учитывая, что эти компоненты вводились в том же количестве этанола, что и в варианте, где этанол был в качестве индуктора, можно сделать вывод, что внесение указан ных веществ в количествах и условиях нашего опыта не приводит к увеличе нию ОА.

6. Изучение влияния условий культивирования на ОА T.hirsuta 56 и оптимизация режимных параметров процесса ферментации Важнейшими параметрами, оказывающими влияние на ферментативную активность, являются рН, температура культивирования и коэффициент массо передачи кислорода, а для механолабильных культур, к которым относятся ба зидиальные грибы, при использовании аппаратов с механическим перемешива нием ограничивающим фактором является также критическая линейная ок ружная скорость мешалки, при превышении которой происходит травмирова ние гиф гриба.

6.1. Влияние рН на ОА штамма-продуцента Влияние рН изучали в ферментационном аппарате в режиме автоматиче ского поддержания рН (рН-статирования) при температуре 26оС на глюкозо аммонийной среде № 2 и среде с мукой № 5 при 32 оС.

На глюкозо-аммонийной среде показано, что максимальной ОА штамм достигает при рН=4,0. По сравнению с процессом при нерегулируемом рН ак тивность повысилась в 1,5 раза. рН 4,0 оказывается лучшим как по абсолютно му значению ОА (2,0 ЕОА), так и по продуктивности (0,03 ЕОА·ч-1). Коэффици ент выхода фермента в Биомасса, г/л;

0,1рО2,% точке максимума ОА со 12 2, ставляет 0,31 ЕОА·мг-1. рН 10 4,0 обеспечивает также и ОА, ЕОА 1, наиболее высокую ско рость роста культуры.

Как видно из рисун 0, ка 1, при оптимальном рН 0 ОА достигает максимума 0 Время, час при исчерпании редуци Концентрация биомассы, г/л рующих сахаров в среде и Концентрация растворенного кислорода 0,1рО2,% переходе культуры в ста Оксидазная активность, ОА, Е ОА ционарную фазу и фазу Редуцирующие вещества, % отмирания. Этому соот Рисунок 1 – Динамика параметров синтеза окси- ветствует и увеличение доредуктаз в ферментационном аппарате в усло- концентрации растворен виях рН-статирования при оптимальном значении ного кислорода в среде, рН (4,0) на глюкозо-аммонийной среде свидетельствующее о снижении его потребления затухающей культурой. Сходные зависимости получены и на среде с мукой.

На рисунке 2 приве 2,5 рН дены сводные графики свободный процессов на среде с пше 2 рН = 4. ничной мукой № 5 в диапа ОА, ЕОА 1,5 рН = 3. зоне рН-статирования 3,5 – 5,5. Максимальная ОА на 1 рН = 4. блюдалась так же как и на 0, глюкозо-аммонийной среде рН = 5. при рН=4,0. Близкие зна 0 рН = 5, чения ОА дает проведение 0 20 40 60 80 Время,ч процесса ферментации при рН=3,5.

Рисунок 2 – ОА в процессах с различными значе ниями рН-статирования и при нерегулируемом рН на среде с мукой 6.2. Влияние температуры на ОА Влияние температуры изучали в ферментационном аппарате при рН 4, на оптимизированной среде с мукой № 6. На рисунке 3 приведены сводные данные по максимальной ОА в ферментациях при разных температурах. Пока зано, что максимальной ОА (5,8 ЕОА) штамм дости гает при температуре 32 оС (продуктивность 0, ОА, Е ОА - ЕОА·ч ). Максимальная ОА в изученном диапазоне температур различалась в 1,8 раза, коэффициент вы хода фермента в 3 раза.

27оС 30оС 32оС 34оС 36оС Отмечено, что температура для максимальной продук Рисунок 3 – Максимальная ОА при культивиро- тивности по биомассе не вании при разных температурах в ферментацион- сколько ниже, чем для син ном аппарате на оптимизированной среде с му- теза оксидоредуктаз, а кой именно 28-30 оС.

6.3. Влияние интенсивности перемешивания на ОА Определено влияние скорости перемешивания на ОА штамма. Серия ферментаций, проведенных на глюкозо-аммонийной среде №2 при рН=4,0, температуре 26 оС и аэрации 1 л·л-1·мин-1 показала, что максимальной ОА штамм достигает при 250 об·мин-1 (2,0 ЕОА), что в 1,2 раза выше, чем при об·мин-1. Продуктивность по 2, биомассе была наибольшей при 350-450 об·мин-1. Нако ОА, Е ОА пление биомассы было наи 1, большим при 550 об·мин- (9,2 г/л), но при этом проис ходило частичное дисперги 0, рование биомассы. Коэффи 0 20 40 60 80 циент выхода фермента при Продолжительность культивирования,ч 250 об·мин-1 составлял 0, 350 об/ мин 250 об/мин 200 об/мин ЕОА·мг-1, что в 1,9 раза пре Рисунок 4 – Динамика ОА в процессах при раз- вышает выход фермента при личной интенсивности перемешивания в фер- 550 об·мин-1.

ментационном аппарате на среде с мукой Уточняющие экспери менты по влиянию переме шивания, проведенные на среде с мукой № 5, показали (рисунок 4), что режим перемешивания 250 об·мин-1 и на этой среде является оптимальным. Продук тивность при этом режиме в 1,5 раза выше, чем при 200 и 350 об/мин. Таким образом, максимально допустимой скоростью перемешивания в использован ном аппарате является скорость 450-550 об·мин-1, чему соответствует критиче ская линейная окружная скорость мешалки 2,8–3,5 м·с-1. Оптимальному режиму перемешивания (250 об·мин-1 ) при аэрации 1 л·л-1·мин-1 соответствует КLa ч-1.

6.4. Влияние аэрации на рост и ОА штамма-продуцента При оптимальном значении рН и скорости перемешивания (250 об·мин-1) на оптимизированной сре де с мукой № 6 проведены ферментации с различными условиями аэрации. Как ОА, Е ОА видно из рисунка 5, значе ние аэрации 1 л·л-1·мин- 2 0.8/ является оптимальным для максимального накопления 1/ фермента в культуральной 0 10 20 30 40 50 60 70 1.2/ жидкости. Продуктивность Время, ч при этом режиме составля Рисунок 5 – Динамика ОА при различной ин ла 0,09 ЕОА·ч-1, что в 1,2-1, тенсивности аэрации в ферментационном аппара раза больше, чем при ре те с перемешиванием 250 об·мин- жимах 0,8 и 1,2 об·мин-1.

При проведении ферментаций в отсутствие механического перемешивания увеличение уровня аэрации приводит к увеличению ОА. Так, при аэрации 1,5 л·л-1·мин-1 макси мальная ОА составляет 4,4 ЕОА, что в 1,7 раза превышает ОА при аэрации 1,0 л·л-1·мин-1. Таким образом, аэрация без перемешивания в недостаточной степени обеспечивает условия для достижения высокой ОА.

В условиях используемого аппарата оптимальным режимом следует счи тать аэрацию 1,0 л·л-1·мин-1 при перемешивании 250 об·мин-1, что соответству ет КLa 175 ч-1.

6.5. Изучение ОА T.hirsuta 56 при проведении многоциклических процессов На оптимизированной среде с мукой № 6 в оптимизированных условиях культивирования проведены две серии многоциклических процессов. После достижения максимума ОА культуральную среду сливали, оставляя 10 % в ка честве посевного материала, и добавляли стерильную питательную среду до исходного объема. Показана принципиальная возможность получения высокой ОА в таких процессах. Время достижения максимума ОА составляло 42-68 ча сов.

6.6. Сравнение ОА T.hirsuta 56 в исходных и оптимизированных средах и условиях культивирования На рисунке 6 приведены графики ОА при культивировании штамма продуцента в ферментационном аппарате, отражающие этапы работы. Показа на ОА штамма в исходных условиях (глюкозо-пептонная среда №1, условия культивирования не оп тимизированы);

в процес се работы: глюкозо № аммонийная среда №2, условия не оптимизиро № ванные;

среда с мукой № ОА, Е ОА 5, условия оптимизирова № ны;

глюкозо-аммонийная среда № 7 в оптимизиро № ванных условиях;

опти мизированная среда с му №7 кой № 6 в оптимизиро 0 20 40 60 80 ванных условиях. В ре Время,час зультате проведенной ра Рисунок 6 – Сравнение динамики ОА в фермен боты достигнуто повы тациях, проведенных на исходной среде и на раз шение ОА более, чем в работанных средах и условиях культивирования 40 раз (0,13 ЕОА до 5, ЕОА). Продуктивность по -1 - ОА увеличилась с 0,002 ЕОА·ч до 0,085 ЕОА·ч. Максимальная ОА, однократ но достигнутая в ферментационном аппарате составляла 17,6 ЕОА.

7. Разработка технологии производства лакказы, проведение опытно промышленных испытаний и характеристика получаемого фермента 7.1. Определение критериев масштабирования, разработка промыш ленной технологии и опытно-промышленного регламента на произ водство ферментного препарата лакказы Интенсивный процесс биосинтеза лакказы штаммом T.hirsuta 56, как по казали наши исследования, происходит при обеспечении за счет аэрации и пе ремешивания КLa =175 ч-1. В то же время штамм-продуцент лакказы, как и все базидиальные грибы, относится к числу механолабильных культур, клетки ко торого повреждаются вращающимися частями механической мешалки при пре вышении критической скорости, равной по нашим экспериментальным данным 3,0–3,2 м·с-1. Эти показатели могут служить критериями масштабирования про цесса производства лакказы.

На основании проведенных исследований разработана промышленная технология получения высокоактивной культуральной жидкости и стадия куль тивирования опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата технической лакказы мощностью 20 т в год (ОПР № 02068798-01 06).

7.2. Опытно-промышленные испытания технологического процесса На производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п. Лотошино, Мо сковской обл.) проведены испытания технологии производства ферментного препарата лакказы. В ферментационных аппаратах вместимостью 0,25м3 полу чены 2 партии культуральной жидкости с активностью 12,1 и 12,3 МЕ. Биомас су отделяли на рамном пресс-фильтре с использованием капроновой фильт рующей ткани и сушили в полочной конвекционной сушилке при температуре 65-90 оС. Культуральный фильтрат подвергали концентрированию в 10 раз ба ромембранным методом. Опытно-промышленные испытания подтвердили реа лизуемость разработанной технологии.

Наработанную опытную партию ферментного препарата лакказы передали ЗАО «ВНИИДРЕВ» для испытаний в процессе получения древесно волокнистых плит на биосвязующих и Институту биохимии им. А.Н.Баха РАН для получения высокоочищенного препарата лакказы для ферментативного синтеза полианилина.

7.3. Биохимические характеристики препарата лакказы Работы, поведенные совместно с Институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН, подтвердили, что основным ферментом, продуцируемым штаммом T.hirsuta 56 на разработанной среде является лакказа. Фермент содержит 4 иона меди трех типов в активном центре и имеет высокий редокс потенциал (780± мВ). Молекулярная масса лакказы T.hirsuta 56 составляет 70±2 кДа, углеводная часть – около 12 % от молекулярной массы холофермента. Изоэлектрическая точка – 4,2±0,1, рН-оптимум – 4,5. Удельная активность гомогенного по данным электрофореза препарата лакказы по пирокатехину – 220-240 МЕ/мг. Эффектив ность катализа (kкат /Км)·10-6 – 2,75 М-1с-1 по пирокатехину;

7,38 М-1с-1 по гидро хинону.

7.4. Технико-экономическая оценка Технико-экономическую оценку проводили с учетом стадии концентриро вания ферментного препарата при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м3, что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесно-волокнистых плит на использование биосвязую щих. Расчет проводили в сопоставлении c препаратом DeniLite II фирмы Novozymes, содержащим лакказу в качестве основного компонента лакказа медиаторной системы (медиатор – пропионово кислый фенотиазин), стоимость 1000 ME лакказы которого по ориентировочной оценке составляет 142 рубля.

Стоимость 1000 МЕ нашего концентрированного ферментного препарата лак казы составляет 27 рублей.

Таким образом, концентрированный ферментный препарат лакказы, по лученный по разработанной технологии стадии культивирования, в пересчете на 1000 МЕ лакказы не уступает по стоимости препарату DeniLite II фирмы Novozymes и содержит высокопотенциальную лакказу, что существенно рас ширяет область его применения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes Fr. – потенциальных продуцен тов лакказы. Отобраны штаммы с высокой активностью экстрацеллюлярно го оксидоредуктазного комплекса (T. hirsuta 56 и НРБ-2, T.pubescens 78-12, T.ochracea 239). На основании продуктивности в условиях культивирования в ферментационном аппарате и биохимических характеристик синтезируе мой лакказы для дальнейших исследований отобран штамм-продуцент T.

hirsuta 56.

2. Для отобранного штамма установлено, что наиболее эффективными для син теза оксидаз на полусинтетической среде являются: сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза в качестве источника углерода;

пептон, мочевина и (NH4)2SO4 в качестве источника азота;

фосфат калия двузамещенный и од нозамещенный в качестве источника фосфора.

3. Определено возобновляемое сельскохозяйственное сырье, обеспечивающее высокую оксидазную активность штамма-продуцента (крахмал, меласса, пшеничная мука, сусло). Подобраны компоненты питательной среды с пше ничной мукой в качестве основного сырья (NH4NO3, KH2PO4 и кукурузный экстракт). Состав питательной среды оптимизирован с применением матема тических методов планирования эксперимента, что позволило увеличить ОА в 2,7 раза. Показано, что наличие в составе питательной среды 0,03 мМ CuSO4 достаточно для того, чтобы процесс синтеза лакказы не был лимити рован Cu2+. Показано, что добавление в состав среды древесных стружек, виноградных гребней и этанола позволяет увеличить ОА в 1,5 раза.

4. Изучено влияние режимов культивирования на ОА штамма-продуцента. Оп ределен оптимальный режим рН;

температуры;

перемешивания и аэрации.

Определены критерии масштабирования процесса биосинтеза лакказы – критическая линейная окружная скорость перемешивания и оптимальное значение КLа.

5. Экспериментально подтверждено стабильное увеличение ОА в результате подбора и оптимизации состава питательной среды и условий культивиро вания более, чем в 40 раз (до среднего значения 5,8 ЕОА). Время достиже ния максимальной ОА сокращено до 68 часов.

6. Разработана и апробирована промышленная технология стадии культивиро вания, на основании которой создан опытно-промышленный регламент. По казано, что основным ферментом T.hirsuta 56, получаемым по разработанной технологии, является высокопотенциальная лакказа.

Список публикаций 1. Горшина Е.С., Т.В. Русинова, В.В. Бирюков, С.В. Шлеев, А.И. Ярополов.

Изучение активности внеклеточных оксидоредуктаз дереворазрушающих гри бов рода Coriolus Quel. // Биотехнология: состояние и перспективы развития:

Матер. 1-го Междунар. конгресса.– М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И.

Менделеева, 2002.– С. 448- 2. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Кулакова О.А., Бирюков В.В. Дереворазру шающие грибы рода Coriolus как продуценты оксидазного ферментативного комплекса для биодеградации ксенобиотиков // Техника и технология экологи чески чистых производств: Матер. VI междунар. симп./ Под ред. Беренгартена М.Г. и др. – М: МГУИЭ, 2002.– С. 52-54.

3. Русинова Т.В., Горшина Е.С. Бирюков В.В. Выбор штамма-продуцента для биотехнологического получения лакказного ферментного комплекса // Биотех нология – наука XXI века: Тезисы 7-ой Пущинской школы-конференции моло дых ученых 14-18 апреля 2003 г.– Пущино, 2003.– С. 4. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В. Получение оксидазного фермен тативного комплекса культивированием дереворазрушающего гриба рода Trametes для биодеградации ксенобиотиков. // Инженерная защита окружаю щей среды: Докл. V междунар. конфер./ под ред. Баранова Д.А., Николайкиной Н.Е.– М.:МГУИЭ, 2003.–С. 172-173.

5. Русинова Т.В., Горшина Е.С., Бирюков В.В. Щеблыкин И.Н. Влияние соста ва среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes hirsuta. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Мос ковского междунар. Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003).– М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003.– ч. II, С. 6. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В. Изучение возможности ком плексного использования культуральной жидкости грибов рода Trametes для выделения фермента и получения биодобавки.// Техника и технология экологи чески чистых производств: Материалы VII междунар. Симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов.– М: 2003.– С. 87-89.

7. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н. Влияние соста ва среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes hirsuta. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Мос ковского междунар. Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003).– М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003.– ч. II, С. 8. Русинова Т.В., Горшина Е.С. Крамм Э.А., Бирюков В.В., Ярополов А.И., Шлеев С.В., Щеблыкин И.Н. Изучение трофических потребностей и технологи ческих характеристик продуцента лакказы Trametes hirsuta// Биотехнология – наука XXI века: Тезисы 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г.– Пущино, 2004.– С.277- 9. Халунина А.С., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И.

Электрохимическое поведение «голубых» лакказ базидиомицетов на электро дах из углеродных материалов // Биотехнология – наука XXI века: Тезисы 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г.– Пущино, 2004.– С.284.

10. К.И. Михайлова, Т.В. Русинова, Е.С. Горшина, В.В. Бирюков, А.И. Яро полов, И.Н. Щеблыкин. Опыт разработки технологии базидиальных лакказ // Наука-Бизнес-Образование. Тезис. Докл 2 Междунар. Конфер. 10-13 мая.– Пу щино.– 2005.– С. 31- 11. Shleev S.V., O.V. Morozova, O.V. Nikitina, E.S. Gorshina, T.V. Rusinova, S.A. Serezhenkov, D.S., Burbaev, I.G. Gazaryan, A.I. Yaropolov. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccase from different basidiomycetes // Biochimie.– 2004.–v. Sep-Oct 86 (9-10):, p. 693- 12. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Ярополов А.И.

Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens. (2005) Вестн. Моск. Ун-та, Сер. 2. Химия. Т. 46, 4, с. 272-278.

13. Никитина О.В., С.В. Шлеев, Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, В.А. Сережен ков, Д.Ш. Бурбаев, Л.В., Беловолова, А.И. Ярополов. Выделение и очистка ферментов лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.)Pilat и исследование их свойств // Биохимия.– 2005.–том 70.–вып. 11.– С. 1548- 14. Горшина Е.С., Т.В. Русинова, В.В. Бирюков, О.В. Морозова, С.В. Шлеев, А.И. Ярополов. Динамика оксидазной активности в процесе культивирования базидиального гриба рода Trametes Fr. // Прикладная биохимия и микробиоло гия.– 2006.–№ 6.–С.638- 15. Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, Н.С. Марьина, Н.А. Шкурина, В.В. Бирю ков, И.Н. Щеблыкин, М.А. Горбачева, О.В. Морозова, С.В. Шлеев, А.И.Ярополов. Биосинтез грибной лакказы – фермента для экологически безо пасных производств/ Сборник трудов МГУИЭ, 2006, 116-123.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.