авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Экспрессные иммунохимические тест-системы для определения токсикантов в продуктах питания

На правах рукописи

На правах рукописи БЕЛОГЛАЗОВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА ЭКСПРЕССНЫЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА – 2011

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Еремин Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович кандидат биологических наук Кузьмина Нина Сергеевна

Ведущая организация:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится " 1 " февраля 2011 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "28" декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская Актуальность темы. Ужесточение мер контроля качества продуктов питания, увеличение количества регулируемых в них токсикантов и одновременное снижение законодательно регулируемых максимально допустимых их количеств определяет актуальность разработки быстрых и простых в исполнении методик пробоподготовки образцов и определения в них загрязнителей. К одним из наиболее опасных классов токсикантов можно отнести полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), микотоксины и антибиотики различных классов. Применяемые в настоящее время методы определения токсикантов в продуктах питания в основном относятся к хроматографии, которую отличает длительность проведения единичного анализа и невозможность его проведения вне лаборатории.

Наиболее полно требованиям по чувствительности и специфичности отвечают иммунохимические методы анализа. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) отличает простота в исполнении, что позволяет использовать данный метод для разработки и оптимизации способов снижения матричного эффекта в сложных образцах (красное вино, пиво, молоко). Так как ПФИА не всегда обладает высокой чувствительностью по сравнению с другими иммунохимическими методами, его применяют для выбора оптимальных для работы антител, характеристики аффинности антител, а также для определения аналитов, установленные значения предельно допустимых концентраций (ПДК) на которые достаточно высоки (как, например, для антибиотиков в молоке).

Часто ситуация требует дать заключение о присутствии или отсутствии загрязнителя в образце хотя бы на качественном или полуколичественном уровне в течение короткого промежутка времени. Поэтому проводилась разработка колоночного иммунохимического тест-метода. Он позволяет отказаться от стадии предварительной пробоподготовки и достичь высокой чувствительности, объединив очистку образца, концентрирование и определение токсиканта. Этот метод дает возможность получить точный и быстрый ответ о присутствии/отсутствии определяемого соединения в анализируемом образце в концентрации, соответствующей установленному значению ПДК на данный аналит.

Цели и задачи исследования. Целью работы явилась разработка экспрессных иммунохимических методик для определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов и антибиотиков) в продуктах питания, характеризующихся как простыми матрицами (вода), так и сложными (красное вино, пиво, молоко). В качестве методов определения в работе применяли колоночный иммунохимический тест-метод и ПФИА.

Особый акцент делали на разработке простого, надежного и быстрого способа пробоподготовки образца, хорошо сочетающегося с данным методом определения. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

осуществить синтез иммунореагентов: конъюгатов ПАУ (пирена, бензо[a]пирена), микотоксинов (охратоксина А и афлатоксина В1), антибиотиков (цефалексина, цефалотина и гентамицина) с флуоресцентными и ферментными метками, белками-носителями;

оптимизировать условия определения токсикантов в образцах, характеризующихся простыми матрицами, колоночным иммунохимическим тест-методом, что включает в себя выбор оптимального носителя для иммобилизации антител и способа их иммобилизации, выбор оптимальных концентраций иммунореагентов;

предложить быстрый и простой в исполнении способ очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (пиво, красное вино, молоко) перед определением содержания в нем загрязнителей и разработать методики определения токсикантов в таких образцах на основе ПФИА;

разработать методики определения как индивидуальных загрязнителей, так и нескольких загрязнителей родственной и неродственной природы колоночным иммунохимическим тест-методом в образцах, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пищевые добавки);

предложить методику получения количественных результатов колоночным иммунохимическим тест-методом;

осуществить сравнение меток различной природы для детектирования аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Научная новизна Модернизирован колоночный иммунохимический тест-метод путем введения в колонку контрольного слоя, помещения в колонку нескольких детектирующих иммунослоев для определения нескольких аналитов родственной и неродственной природы.

Предложена методика простой и быстрой очистки красного вина и пива фильтрацией через колонки, наполненные твердофазным сорбентом, перед определением микотоксинов методом ПФИА.

Разработана методика очистки красного вина и определения в нем токсикантов колоночным иммунохимическим тест-методом путем пропускания образца через систему совмещенных очищающей и детектирующей колонок.

Впервые были разработаны методики ПФИА определения афлатоксина В1 в пиве, цефалексина и гентамицина в молоке.

Разработан количественный колоночный иммунохимический тест-метод при использовании портативного фотометра.

Проведено сравнение детектирующих меток различной природы (фермент пероксидаза хрена, наночастицы золота, Cd/Te квантовые точки) для использования в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Практическая значимость работы Разработан ряд иммунохимических методик для определения полиароматических углеводородов, микотоксинов и антибиотиков в образцах с различными матрицами.

Предложены быстрые и простые в исполнении методики очистки образцов перед определением токсикантов различными методами.

Иммунохимический колоночный тест-метод адаптирован для определения одного или нескольких токсикантов в образцах со сложными окрашенными матрицами и получения количественных результатов.

Проведено сравнение детектирующих меток в колоночном иммунохимическом тест методе.

На защиту автор выносит Разработку колоночного иммунохимического тест-метода для определения аналитов в образцах, характеризующихся простыми матрицами (на примере пирена и бензо[а]пирена в различных водных образцах).

Модифицирование колоночного иммунохимического тест-метода введением в него контрольного слоя.

Методики очистки образцов, характеризующихся сложными матрицами (красное вино, пиво), основанные на фильтрации образцов через колонки, наполненные сорбентом.

Методики ПФИА определения содержания афлатоксина В1 в пиве, антибиотиков (цефалексина, гентамицина) в молоке.

Методику очистки образцов со сложными окрашенными матрицами для определения как индивидуального соединения (охратоксина А), так и двух аналитов неродственной природы (охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола) в красном вине колоночным иммунохимическим тест-методом.

Результаты сравнения детектирующих меток для регистрации аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест-методе.

Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных по теме диссертационной работы, в разработке методик определения токсикантов различной природы (ПАУ, микотоксинов, антибиотиков) в образцах, характеризующихся как простыми (вода), так и сложными окрашенными (красное вино, пиво, молоко) матрицами двумя иммунохимическими методами (колоночным иммунохимическим тест-методом и методом ПФИА), в развитии и модифицировании колоночного иммунохимического тест-метода, в обработке результатов и апробации методик для анализа реальных образцов. Постановка исследовательских задач, анализ полученных результатов и их обобщение, формулирование выводов проводились совместно с научным руководителем. В публикациях в соавторстве личный вклад соискателя состоит в экспериментальном выполнении как части работы, так и всей работы целиком, интерпретации и обработке полученных им результатов, написании статей.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: VI Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (2007 г., Саратов, Россия);

Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008», «Ломоносов 2009», «Ломоносов 2010» (Москва, Россия);

Всероссийской школе семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы» (2008 г., Белгород, Россия);

Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (2008 г., Москва, Россия);

Втором Съезде микологов России (2008 г., Москва, Россия);

«4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA)» (2009 г., Prague, Czech Republic);

Междисциплинарном микологическом форуме (2010 г., Москва, Россия);

Международной конференции студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (2010 г., Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 18 работ, в том числе 5 статей в международных и отечественных журналах, 12 тезисов докладов международных и российских конференций. По материалам работы получен 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждение (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы (291 источник), приложений и списка сокращений. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков и 47 таблиц.

Финансовая поддержка работы осуществлялась NATO Collaborative Linkage Grant “New strategy for biodetection of explosive nitrochemicals in environmental samples”, совместных проектов DAAD и РФФИ (projects A/07/71207 и A/07/71208), Bijzonder Onderzoeksfonds (BOF) of the Ghent University (011D02803), Bilateral cooperation Flanders and Russia (01S04106), DAAD «Forschungskurzstipendium» стипендиальной программы, Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг." (государственный контракт 16.740.11.0158 от 2 сентября 2010 г.) ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и объекты исследования.

В работе были использованы ПАУ (пирен и бензо[а]пирен (Б[а]П), «Sigma Chemical Co»), микотоксины (Охратоксины А и В, «Sigma Chemical Co»;

афлатоксины B1, B2, G1, G2, «Sigma Aldrich Corporation»), антибиотики (цефалексина гидрат, цефалотина натриевая соль, гентамицина сульфат, хлорамфеникол, стрептомицина сульфат, ампициллин безводный, «Sigma Aldrich Corporation»), 2,4,6-трихлорфенол («Sigma Chemical Co»). Поликлональные антитела против пирена и моноклональные антитела против бензо[а]пирена были предоставлены проф. D. Knopp (Technical University Minich, Германия), различные моноклональные и поликлональные антитела против микотоксинов охратоксина А и афлатоксина В1 были предоставлены проф. Duck-Hwa Chung (Gyeongsang National University, Южная Корея), проф. F.-Y. Yu (Chung Shan Medical University, Тайвань), проф.

Свешниковым П.Г. (Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ), проф. Ch. Xu (School of Food science and Technology, Southern Yangtze University, WuXi, Китай). и приобретены в «Soft Flow Hungary Ltd.» (Pecs, Венгрия).

Специфичные к цефалексину, цефалотину и гентамицину поликлональные антитела были предоставлены проф. Ch. Xu (School of Food science and Technology, Southern Yangtze University, WuXi, Китай). Специфичные поликлональные антитела против 2,4,6 трихлорфенола были предоставлены проф. M.-P. Marco (CIBER de Bioingenieria, Biomateriales y Nanomedicina, Испания).

В качестве объектов исследования были взяты образцы природной и бутилированной воды, красное вино, пиво, молоко и пищевые добавки от производителей России, Китая, Бельгии.

1. Определение загрязнителей продуктов питания в образцах с простыми матрицами 1.1. Принцип колоночного иммунохимического тест-метода Колоночный иммунохимический тест-метод позволяет быстро получить точный ответ о присутствии/отсутствии определяемого соединения в анализируемом образце в концентрации, эквивалентной установленному значению ПДК на данный аналит. Он объединяет в одном цикле анализа концентрирование аналита с помощью иммуноаффинной колонки и его определение в формате прямого конкурентного иммуноферментного анализа.

Данный метод позволяет достичь низких значений предела обнаружения.

Общая схема процедуры анализа колоночным иммунохимическим тест-методом практически идентична процедуре проведения твердофазного ИФА. Для тест-метода использовали полимерную прозрачную трубку емкостью 1 мл, в которую между двумя пористыми фильтрами помещали детектирующий иммунослой. Через колонку с помощью шприца пропускали аликвоту анализируемого образца. Аналит, если он присутствовал в пробе, связывался со специфичными антителами, иммобилизованными на поверхности носителя (в качестве материала носителя использовалась CNBr-активированная сефароза).

Затем в детектирующую колонку вносили конъюгат определяемого вещества с меткой. В качестве детектирующей метки в колоночном иммунохимическом тест-методе традиционно использовали фермент пероксидазу хрена (ПХ). Конъюгат связывался с оставшимися незанятыми аналитом специфичными антителами. После каждой стадии был необходим промывочный шаг. Затем в колонку вносили хромогенный субстрат на основе 3,3',5,5' тетераметилбензидина, ПХ катализировала окисление субстрата, в результате чего образовывались визуально детектируемые продукты. Схематично процедура анализа представлена на рис. 1.

Рис. 1. Общая схема проведения анализа колоночным иммунохимическим тест-методом и схема детектирующей колонки для колоночного иммунохимического метода.

Предел обнаружения тест-метода определяли как наименьшую концентрацию аналита, не вызывающую окрашивания детектирующего слоя в течение установленного времени детектирования. Ограничение, связанное с емкостью впитывающего сорбента отсутствует, так как колоночный иммунохимический тест-метод является проточным.

Чувствительность колоночного иммунохимического тест-метода, как любого конкурентного иммунохимического метода, находится в обратной зависимости от концентрации антител.

Варьирование концентрации конъюгата позволяет изменять интенсивность окраски иммунослоя, а, следовательно, и варьировать время детектирования.

1.2 Выбор оптимального носителя и способа иммобилизации антител для приготовления детектирующего иммунослоя Было произведено сравнение двух видов сефарозы (CNBr-активированной сефарозы 4В и CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow) в качестве носителей для иммобилизации антител в колоночном иммунохимическом тест-методе. Характеристики двух носителей очень похожи, отличие CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow от CNBr-активированной сефарозы 4В состоит только в большей степени сшивки структуры. В процессе эксперимента было найдено, что гели, приготовленные на основе CNBr-активированной сефарозы 4Fast Flow, характеризовались сильным неспецифическим взаимодействием.

Нивелирование данного взаимодействия привело к повышению предела обнаружения тест метода. Был сделан вывод, что CNBr-активированная сефароза 4Fast Flow не подходит в качестве носителя для иммобилизации антител, поэтому в дальнейшем все определения проводили с использованием иммунослоев на основе CNBr-активированной сефарозы 4В.

Также сравнивали способы иммобилизации специфичных антител в геле:

непосредственная иммобилизация специфичных антител и связывание первичных специфичных к аналиту антител через иммобилизованные на геле вторичные антивидовые антитела. Было установлено, что никакого влияния на чувствительность анализа способ иммобилизации антител в геле не оказывает. Преимуществом приготовления геля с привитыми через вторичные антивидовые антитела специфичными к аналиту антителами является возможность при подборе оптимальных условий для проведения эксперимента варьировать чувствительность анализа, изменяя концентрацию специфических антител. Если все условия уже подобраны, и задача стоит лишь в быстром скрининге образцов, то оптимальным является приготовление геля с напрямую привитыми специфичными антителами. Это позволяет сократить количество стадий (убрать стадию внесения в тест колонку специфичных к аналиту антител), а соответственно, и время анализа. Таким образом, выбор способа приготовления геля определялся в дальнейшем только целями эксперимента. Процент иммобилизации антител на геле, был определен спектрофотометрически и составил 97-98%.

1.3 Определение пирена и бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом Так как структуры пирена и Б[а]П очень похожи, были разработаны колоночные иммунохимические тест-методы для определения пирена и Б[а]П на основе геля с привитыми специфичными к пирену поликлональными антителами. Оценку возможности использования данных антител в иммуноанализе проводили с помощью метода ПФИА.

Рассчитанные константы связывания данных антител с пиреном и Б[а]П составили (8.6±0.6)108 М и (5.3±0.4)108 М соответственно. Разработанные методики ПФИА позволили получить предел обнаружения 8 мкг/л для пирена,, и 5 мкг/л для Б[а]П в образцах воды. Предел обнаружения Б[а]П на три порядка превышает установленные РФ (5 нг/л) и Евросоюзом (10 нг/л) значения ПДК в питьевой воде. ПФИА осуществлялась оценка влияния матричного эффекта различных образцов воды на проведение иммунохимического анализа. Процент открытия Б[а]П в различных типах речной воды оказался довольно высоким (больше 90%), что свидетельствовало о низком влиянии матрицы на иммунохимическое определение Б[а]П.

Экспериментально установлено, что для определения пирена и Б[а]П колоночным иммунохимическим тест-методом оптимально использовать только соответствующий конъюгат молекулы ПАУ с ПХ: для определения пирена – Пир-БК-ПХ, для определения бензо[а]пирена - Б[а]П-БК-ПХ. Это связано с понижением чувствительности тест-метода при использовании для определения вещества гетерологичного конъюгата, а не меченого производного самого вещества.

Для определения бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом была использована усовершенствованная модель колонки, которая содержала не только детектирующий слой, представляющий собой гель с привитыми к нему специфичными к пирену поликлональными антителами, но и контрольный слой, содержащий иммобилизованные на геле специфичные к ПХ антитела. Между слоями оставляли воздушный зазор для предотвращения диффузии иммунореагентов и перехода окраски из контрольного слоя в детектирующий, что могло привести к появлению ложноотрицательных результатов. Контрольный слой помещали в детектирующую колонку для оценки ее пригодности к работе и предотвращения появления ложных результатов. Развитие окраски контрольного слоя при внесении в систему конъюгата аналита с пероксидазой хрена указывало на то, что колонка функциональна. (рис. 2).

Рис. 2. Схема детектирующей колонки для определения бензо[а]пирена.

Определение пирена и бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом проводили, используя гель с привитыми специфичными к пирену поликлональными антителами. Для уменьшения предела обнаружения тест-метода варьировали количество специфичных антител, ковалентно связанных с гелем.

Одновременно варьировали состав промывочного буферного раствора, в качестве которого были проверены разные объемы фосфатно-солевого буферного раствора и фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего различные концентрации Твин 20.

Было установлено, что оптимальным для целей удаления и примесей, и избытка конъюгата являлся фосфатно-солевой буферный раствор с 0,05% (об.) Твин 20 (5 мл на каждый промывочный шаг для определения пирена и 10 мл на каждый промывочнй шаг для определения Б[а]П, т. к. тест-колонка на Б[а]П содержит 2 иммунослоя). Присутствие поверхностно активного вещества в составе промывочного буферного раствора позволяет более полно удалять несвязавшийся конъюгат.

Показано, что разработанный колоночный иммунохимический тест-метод позволяет детектировать присутствие пирена в водных образцах в концентрациях 0,04 мкг/л и выше.

Предел обнаружения, бензо[а]пирена составил 0,005 мкг/л, что эквивалентно установленной РФ величине ПДК на бензо[а]пирена в питьевой воде и вдвое меньше установленного Евросоюзом предельно допустимого содержания бензо[а]пирена в питьевой воде.

Аналитические характеристики разработанных тест-методов были рассчитаны статистически. Процентные значения появления ложноположительных и ложноотрицательных результатов оказались ниже 5%, а рассчитанные значения чувствительности, специфичности и правильности очень высокими (табл. 1).

Метрологические характеристики разработанных тест-методов соответствовали рекомендациям ЕС (Commission Decision 2002/657/EC). Показано, что данные тест-методы пригодны для определения пирена и бензо[а]пирена в реальных образцах.

Таблица Аналитические характеристики колоночного иммунохимического тест-метода Характеристика Значение,% тест-метода Пирен Бензо[а]пирен Охратоксин А 2,4,6-трихлорфенол Предел обнаружения, 0.04 0.005 2 мкг/л Процент ложноположит.

1.2 3.1 3.4 4. результатов, % Процент ложноотриц.

4.7 4.5 2.4 3. результатов, % Правильность, % 97.3 96.2 97.2 98. Специфичность, %, 95.6 95.5 97.8 97. Чувствительность, % 99.1 96.9 97.7 96. Для оценки селективности определения пирена и бензо[а]пирена данным иммунометодом была изучена селективность по отношению к другим представителям класса ПАУ: фенантрену, флуорантену, нафталину, антрацену. Для этого через тест-колонки пропускали стандартные растворы ПАУ: концентрации стандартных растворов пирена и бензо[а]пирена соответствовали значениям пределов их обнаружения данным тест-методом (0.04 мкг/л и 0.005 мкг/л, соответственно), фенантрен, флуорантен, нафталин и антрацен заведомо брались в большом избытке (концентрации 20 мкг/л).

время развития окраски, мин Время развития окраски, мин 14 12 0 0 Ант Флуор Фе н Нафт Б[а]П Пир 0 Ант Флуор Фе н Нафт Пир Б[а]П ПАУ (с (все х, кроме Б[а ]П)=20нг/мл), ПАУ (с (все х, кроме Пир)=20нг/мл), с(Б[а ]П)=0.005 нг/мл) с(Пир)=0.04 нг/мл) Рис. 3. Зависимость времени появления окраски от типа определяемого ПАУ для системы «специфичные к пирену антитела - Пир-БК-ПХ» (А), для системы «специфичные к пирену антитела – Б[а]П-БК-ПХ» (Б).

Окраска детектирующего слоя в колонках, через которые пропускали родственные определяемому веществу соединения появлялась уже через 1,5-2 минуты, тогда как детектирующие слои в колонках, через которые пропускали пирен (для системы «специфичные к пирену антитела – конъюгат пирена с пероксидазой хрена») и бензо[а]пирена (для системы «специфичные к пирену антитела – конъюгат бензо[а]пирена с пероксидазой хрена») оставались белыми в течение 17 и 20 минут, соответственно (рис. 3).

Таким образом, при установленном времени детектирования (4 мин) использование иммобилизованных в геле специфичных к пирену антител в сочетании с меченым производным пирена позволяет селективно определять пирен, а при использовании в качестве конъюгата меченого производного бензо[a]пирена реализуется селективное определение бензо[a]пирена.

Так как выбранные условия позволяли достичь высокой чувствительности определения пирена и Б[а]П данным иммунохимическим тест-методом, было выполнено определение этих ПАУ в водных объектах (табл.2). Данные, полученные с помощью колоночных иммунохимических тест-методов, хорошо коррелируют с результатами, полученными методом ВЭЖХ с флуоресцетным детектированием (ВЭЖХ-Фл), что указывает на применимость данных тест-методов для определения пирена и бензо[а]пирена в водных объектах. Кроме того, необходимо отметить высокую чувствительность и специфичность разработанных тест-методов.

Таблица Определение пирена и бензо[а]пирена в водных образцах колоночным иммунохимическим тест-методом и ВЭЖХ-Фл Определяемое вещество бензо[а]пирен, пирен колоночный ВЭЖХ- колоночный ВЭЖХ Объект иммунохимический Фл, иммунохимический Фл, тест – метод нг/мл тест – метод нг/мл (n = 3) (n = 3) (n = 3) (n = 3) озерная вода + 0.16 + 0. водопроводная вода + 0.06 + 0. речная вода (р.Сазанка) + 0.71 нд бутилированная вода 1 нд нд талый снег + 0.47 + 0. бутилированная вода 2 нд нд речная вода (р.Волга) + 0.12 + 0. () – отрицательный результат – развитие синей окраски детектирующего иммунослоя;

концентрация пирена 0.04 нг/мл, концентрация бензо[а]пирена 0.005 нг /мл;

(+) – положительный результат – отсутствие окраски детектирующего иммунослоя;

концентраця пирена 0. нг/мл, концентрация бензо[а]пирена 0.005 нг /мл;

нд – не детектируется данным методом 2. Определение загрязнителей продуктов питания в образцах, характеризующихся сложными матрицами 2.1 Колоночный иммунохимический тест-метод для определения аналитов в красном вине Высокие значения пределов обнаружения, достигнутые при разработке тест-методов на пирен и бензо[а]пирен, позволяют говорить о колоночном иммунохимическом тест методе, как о перспективном для контроля качества продуктов питания. Но большую часть потребляемой пищи составляют продукты, характеризующиеся сложными матрицами, такие как, например, красное вино, пиво и молоко. Для анализа таких продуктов необходима разработка и оптимизация быстрых и простых способов пробоподготовки образцов.

Первоначально производили разработка тест-метода для определения охратоксина А (ОТА) в красном вине. Отличие разрабатываемого тест-метода от описанных ранее тестов на ПАУ состоит в способе иммобилизации антител на носителе. В данном случае специфичные к ОТА антитела иммобилизовывали на геле через вторичные антивидовые антитела. Это позволило упростить процедуру оптимизации условий: для варьирования чувствительности тест-метода изменяли не разведение геля с привитыми антителами, а концентрацию добавляемых специфичных к ОТА антител. Так как предельно допустимое содержание ОТА в вине, установленное Европейским Союзом, составляет 2 мкг/л (Commission Regulation (EC) no 1881/2006. 2006), целью разработки этого тест-метода была возможность на качественном уровне определять образцы, загрязненные ОТА в концентрации равной или большей этой величины.

Первым шагом в оптимизации методики определения ОТА в образцах вина стал выбор конъюгата, используемого для визуализации результатов определения. Для определения ОТА сравнивали два конъюгата: ОТА-ПХ и конъюгат молекулы ОТА с щелочной фосфатазой (ОТА-ЩФ). Было показано, что использование конъюгата ОТА-ПХ позволяет определять более низкие концентрации аналита в стандартных растворах, чем использование ОТА-ЩФ. Кроме того, при использовании ОТА-ЩФ детектирующий слой в случае негативного результата (отсутствия ОТА в растворе) окрашивался в красный цвет, практически неотличимый от цвета красного вина, что затрудняло верную интерпретацию результатов. Таким образом, для дальнейшего использования был выбран ОТА-ПХ. В оптимизированных условиях достигнутый предел обнаружения тест-метода составил мкг/л.

Так как вино - это напиток, содержащий алкоголь, то изучали влияние содержания этанола в образце на чувствительность тест-метода. Было обнаружено, что интенсивность окраса детектирующего слоя зависит только от концентрации ОТА в образце, но не от содержания в нем этанола (вплоть до концентрации этанола 20 % (об.)). Аналитические характеристики методики были посчитаны статистически и полностью соответствовали рекомендациям ЕС (Commission Decision 2002/657/EC) (табл. 1).

Ключевым шагом в разработке методики скрининга образцов вина тест-методом был выбор способа очистки образца. Очистка должна быть достаточно быстрой, и при этом процент открытия аналита после очистки должен быть значительным.

Разработка методики пробоподготовки образцов, характеризующихся сложными окрашенными матрицами, производилась с использованием метода ПФИА для количественной оценки степени нивелирования матричного эффекта и количественного определения процента открытия. Для решения поставленной задачи была выбрана рабочая пара иммунореагентов (трейсер – антитела), построена градуировочная зависимость для определения ОТА, относительно которой и производилась оценка степени очистки красного вина. В качестве методики пробоподготовки была выбрана фильтрация через колонку, наполненную очищающим сорбентом. В качестве сорбентов были протестированы силикагель с привитыми аминопропильными группами (NH2), силикагель с активными октадецильными группами (С18), и силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами (ТМАП). Перед пропусканием его через очищающую колонку красное вино разводили 1:1 (об.) водным раствором, содержащим 1% ПЭГ-6000 и 5% NaHCO3. Это помогало минимизировать мешающее влияние компонентов, препятствующее определению охратоксина А. Оптимальное количество сорбента в очищающей колонке (200 мкг на 1 мл вина) подбирали опытным путем.

Градуировочные графики определения ОТА были построены на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол/вода (10/90% об.), на стандартных растворах, приготовленных в красном вине и на стандартных растворах, приготовленных в вине, подвергнувшемся очистке соответствующим сорбентом (рис. 4).

Рис. 4. Градуировочные зависимости определения охратоксина А в красном вине, построенные на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол-вода;

в неподвергавшемся очистке вине;

в вине, пропущенном через очищающие колонки с соответствующим сорбентом. (n=3) Градуировочный график, построенный с использованием растворов, приготовленных на красном вине, характеризуется отсутствием вытеснения охратоксина А, что можно объяснить влиянием матрицы вина. Использование в качестве очищающего сорбента С18 не позволило избавиться от матричного влияния. Градуировочная зависимость, построенная на красном вине, подвергшемся очистке данным сорбентом, характеризовалась худшими метрологическими параметрами. ТМАП и NH2 позволяли произвести очистку вина в достаточной для целей анализа степени. Предел обнаружения ОТА при использовании в качестве очищающего вещества NH2 составил 10 нг/мл, при использовании ТМАП – нг/мл.

Для оценки количества ОТА, способного сорбироваться на очищающем веществе, был проведен тест на открытие. Для этого образец красного вина, заведомо не содержащий ОТА, загрязняли токсином в выбранных концентрациях. Затем загрязненные образцы подвергали очистке описанным выше способом. Содержание аналита определяли методом ПФИА по градуировочной зависимости, построенной на подвергнувшемся очистке соответствующим сорбентом вине. Полученные значения процентов открытия высоки для обоих сорбентов (порядка 80-85%). Это свидетельствует о том, что методика может быть применима для анализа реальных образцов.

Рассчитанные пределы обнаружения ОТА в красном вине с помощью разработанной методики ПФИА оказались в 5 раз больше установленного Европейским Союзом максимально допустимого уровня содержания ОТА в красном вине, что делает возможным использовать данный метод только для сильнозагрязненных проб, либо необходимо проводить процедуру концентрирования ОТА. Однако можно сделать вывод, что разработанная методика очистки красного вина является достаточно эффективной, простой и быстрой в исполнении, а, следовательно, пригодной к применению ее в практических целях.

Разработанная методика пробоподготовки красного вина была применена для определения ОТА колоночным иммунохимическим тест-методом. Для этого детектирующий и очищающий (200 мг NH2) слои помещали в разные колонки, которые соединяли между собой переходником (рис.5). Через систему колонок пропускали разведенные 1:1 (об.) водным раствором, содержащим 1% ПЭГ-6000 и 5% NaHCO3, образцы красного вина.

Была изучена возможность одновременного определения двух совершенно разных по своей природе аналитов – охратоксина А и 2,4,6–трихлорфенола (ТХФ). Для этого использовали колонку, содержащую два детектирующих иммунослоя, каждый из которых представлял собой гель с привитыми специфичными к определенному аналиту антителами.

Для контроля пригодности системы к анализу в колонку дополнительно помещали контрольный слой, аналогично описанному в создании тест-метода на бензо[а]пирен (рис. 6).

Предел обнаружения 2,4,6-трихлорфенола данным тест-методом составил 2 мкг/л.

Помещение в одну колонку трех иммунослоев (двух детектирующих и одного контрольного) порождало некоторые трудности в подборе условий для одновременного точного и корректного определения двух разных по своей природе аналитов в выбранных концентрациях. При работе с колонкой, содержащей несколько иммунослоев на различные аналиты, в качестве конъюгата пропускали смесь равных количеств меченных пероксидазой хрена производных охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола.

Рис. 6. Схема колонки для одновременного Рис. 5. Схема для определения определения охратоксина А и 2,4,6-трихлор охратоксина А в образцах красного вина фенола колоночным иммунохимическим колоночным иммуно-химическим тест тест-методом.

методом.

Отсутствие влияния иммунореагентов друг на друга подтверждалось количественно.

Для этого производилось сканирование образцов и последующая обработка полученных данных с помощью программы Adobe PhotoShop. У полученных сканированием изображений рассчитывался параметр S (насыщенность). Было показано, что при отсутствии аналитов в пробе развитие окраски контрольного и обоих детектирующих слоев происходило одновременно, а присутствие в пробе обоих аналитов приводило к заметной разнице в насыщенности окраски контрольного и детектирующих иммунослоев (рис.7).

Аналиты не мешали определению друг друга, равно как и конъюгаты не оказывали влияния на иммунослои с привитыми специфичными к другому аналиту антителами.

А. Б.

S, S, усл.ед.

усл.е д.

контрольный слой детектирующий слой на ТХФ детектирующий слой на контрольный слой 10 ОТА детектирующий слой на ТХФ детектирующий слой наОТА 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Вре мя, мин Время, мин Рис. 7. Кривые зависимости интенсивности окраски иммунослоев от времени. (А) Для колонки, через которую был пропущен образец вина, не содержащий ОТА и ТХФ. (Б) Для колонки, через которую пропускался образец вина, загрязненный ТХФ и ОТА. Концентрация обоих аналитов 2 мкг/л.

Была изучена возможность определения трех аналитов с помощью одной тест колонки. Для этого в разработанную колонку для одновременного определения ОТА и ТХФ помещался детектирующий иммунослой на афлатоксин В1. Необходимо отметить отсутствие влияния различных иммунореагентов на определение аналитов. Этот опыт демонстрировал возможность создания высокочувствительной и специфичной тест-колонки для детектирования нескольких токсикантов неродственной природы.

Данным тест-методом были проанализированы образцы красного вина на содержание в них охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола (табл. 3). В качестве проверочных методов были использованы стандартные хроматографические методики: ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием для определения охратоксина А и ЖХ-МС для определения 2,4,6 трихлорфенола.

Данные, полученные при измерении образцов колоночным иммунохимическим тест методом, хорошо коррелируют с данными, полученными с помощью стандартных методик.

Из сказанного выше можно сделать вывод, что тест-колонки для мультианализа показали на практике хорошие результаты, тем самым подтвердив возможность использования их для потребительских целей. Разработка колоночного иммунохимического тест-метода на ОТА и ТХФ сделала возможным простой и быстрый контроль качества вина не только службами контроля качества, но и самим потребителем.

Таблица Определение охратоксина А и 2,4,6-трихлорфенола в образцах красного вина колоночным иммунохимическим тест-методом и хроматографическими методами 2,4,6-трихлорфенол охратоксин А Колоночный Колоночный иммунохимический иммунохимический ВЭЖХ тест-метод, (n = 3) тест-метод, (n = 3) Образец ЖХ-МС, ФлД, Вино, Вино, вина (n = 3) (n = 3) загрязненное загрязненное Вино ТХФ в Вино ОТА в концентрации концентрации 2 мкг/л 2 мкг/л нд 1 + 1.2 + нд 2 + + + 3. 3 + нд + нд 4 + нд + + 2. 5 + + 5.5 + нд 6 + нд + нд 7 + нд + + 1. (–): детектирующий слой окрашивается в голубой цвет, отрицательный результат, концентрация аналита мкг/л. (+): отсутствие окраса детектирующего слоя (он остается белым), положительный результат, концентрация аналита 2 мкг/л, 1 нд: концентрация аналита 0.5 мкг/л, 2 нд: концентрация аналита 1 мкг/л.

ПФИА афлатоксина В1 в пиве Разработанная методика пробоподготовки образцов красного вина была использована для нивелирования матричного эффекта образцов пива перед определением в нем афлатоксина В1 (АфВ1) методом ПФИА (рис. 8).

Рис. 8. Градуировочные зависимости определения афлатоксина В1 в пиве, построенные на стандартных растворах, приготовленных в смеси метанол-вода;

в неподвергавшемся очистке пиве;

в пиве, пропущенном через очищающие колонки с соответствующим сорбентом. (n=3) В качестве сорбентов были взяты уже выбранные ранее ТМАП и NH2, с которыми был проведен тест на открытие. Данным тестом контролировали количество аналита, сорбирующегося в процессе анализа на материале твердофазного сорбента. Полученные данные величин процентов открытия оказались высоки для обоих сорбентов (80-85%) и свидетельствуют о том, что методика может быть применима для анализа реальных образцов. Для дальнейшей работы был выбран NH2. Предел обнаружения АфВ1 составил нг/мл.

Были проанализированы образцы пива от различных производителей. Среди образцов были фильтрованные и нефильтрованные, темные и светлые сорта. Для подтверждения пригодности методики и предотвращения получения ложноотрицательных результатов, возможных вследствие мешающего влияния примесей, кроме анализа образцов пива дополнительно проводили определение порций тех же образцов, предварительно загрязненных АфВ1 в концентрации 10 нг/мл. Ни в одном образце пива АфВ1 обнаружен не был, однако при анализе предварительно загрязненных образцов получены удовлетворительные результаты, что подтверждает достоверность результатов разработанной методики ПФИА. Кроме того, проведенный эксперимент позволил сделать вывод о незначительном влиянии матрицы образца на результаты анализа, что делает возможным применение данной методики пробоподготовки образцов пива для практических целей. Разработанная методика ПФИА может использоваться для быстрой предварительной оценки подозрительных на содержание АфВ1 образцов.

ПФИА антибиотиков в молоке Была разработана методика пробоподготовки молока перед определением в нем антибиотиков – цефалексина и гентамицина методом ПФИА. В качестве пробоподготовки был использован метод одновременного разбавления образца и осаждения в нем белков. В качестве реагентов-осадителей использовали метанол, этанол, ацетонитрил и насыщенный раствор сульфата аммония. Для выбора оптимального реагента каждым из них обрабатывали две пробы молока (отсутствие антибиотика в котором подтверждали хроматографически):

незагрязненная проба и проба, в которую был искусственно добавлен антибиотик в концентрации 10 нг/мл. В каждую пробу вносили осаждающий агент, пробы перемешивали и центрифугировали. Для анализа использовали надосадочную жидкость. Насыщенный раствор сульфата аммония добавляли к молоку в соотношении 1:1 (об.), а органические растворители – в соотношении 2:1 (об.). После проведения анализа проб сравнение осадителей проводилось на основании полученных значений поляризации флуоресценции.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что оптимальным осадителем для обработки молока является метанол. Высокое значение величины поляризации флуоресценции незагрязненного молока, пробоподготовленного с помощью данного реагента, свидетельствует о довольно эффективном удалении из пробы белков молока, мешающих анализу, и незначительном матричном эффекте этого раствора по сравнению с дистиллированной водой. Относительное понижение аналитического сигнала при изменении концентрации препарата от 0 нг/мл до 10 нг/мл в пробе молока, обработанной метанолом, также было высоко (табл.4). Этот же осадитель использовался и при определении в молоке гентамицина.

Таблица Выбор осадителя для пробоподготовки молока перед определением в нем цефалексина методом ПФИА. (n=5, P=0.95) Значение поляризации флуоресценции для проб молока, Концентрация цефалексина в обработанных различными осадителями, mP (±4) пробе молока, нг/мл CH3OH C2H5OH CH3CN (NH4)2SO4 насыщ Н2O дист 0 102 98 103 91 10 93 93 100 88 Относительное понижение аналитического сигнала, 8.8 % 5.1 % 2.9 % 3.3 % 12.5 % (mP0 нг/мл - mP 10 нг/мл)/ mP 0 нг/мл Для учета матричного влияния образцов молока строили градуировочные зависимости для определения антибиотиков с использованием стандартных растворов, приготовленных на подготовленных образцах молока, не содержащих аналиты. (рис. 9).

Рис. 9. Градуировочные зависимости определения цефалексина и гентамицина, построенные на пробоподготовленном молоке. (n=3) Достигнутый предел обнаружения цефалексина составил 24 нг/мл (с учетом разбавления), гентамицина – 15 нг/мл (с учетом разбавления). Для оценки возможности использования данной методики в анализе реальных образцов был проведен тест на открытие антибиотиков по методике «введено - найдено», характеризующий количество цефалексина и гентамицина, адсорбировавшихся на белках в процессе пробоподготовки (табл. 5). Тест на открытие показал хорошие результаты, что позволяет сделать вывод о том, что данные методики пригодны для определения цефалексина и гентамицина в образцах молока.

Были проанализированы образцы стерилизованного и пастеризованного молока от различных российских и китайских производителей, а также образцы, взятые с фермерских хозяйств на содержание гентамицина и цефалексина. Оценку применимости разработанных методик производили либо сопоставляя данные, полученные ПФИА и ВЭЖХ для определения цефалексина, либо определяя содержание в искусственно загрязненных пробах (для определения гентамицина).

Разработанные методики определения цефалексина и гентамицина в молоке оказались достаточно чувствительными, так как конечные пределы обнаружения (даже с учетом разбавления) оказались ниже установленных величин ПДК, составляющих 100 нг/мл для каждого аналита. Это говорит о потенциальной возможности применения данной методики пробоподготовки молока для определения антибиотиков даже в образцах с более сложной матрицей (другие молочные продукты).

Таблица Тест на открытие антибиотиков (n=5, P=0,95) Гентамицин Цефалексин «Введено» «Найдено» Процент «Введено» «Найдено» Процент открытия, % открытия, % 20 17±4 85 30 24±4 30 27±5 90 40 44±5 50 48±2 96 50 43±4 100 82±5 82 100 94±8 3. Разработка колоночного иммунохимического тест-метода с количественной интерпретацией результатов Серьезнымнедостатком использования колоночного иммунохимического тест-метода является качественный или полуколичественный (при обсчете результатов с помощью компьютерной программы Adobe PhotoShop) характер получаемых результатов. Это делает его пригодным лишь для первичного скрининга образцов. Для получения количественных результатов были протестированы детектирующие системы фирмы «Senova» (Германия).

Несомненным преимуществом их использования является наличие измерительного прибора – фотометра, позволяющего определять оптическую плотность детектирующего иммунослоя. Отличие этой системы от используемого ранеетест-метода заключается в способе иммобилизации антител на детектирующем слое: вместо ковалентного связывания антител с активными группами сефарозы, в колонках «Senova» реализуется физическая адсорбция антител в порах носителя. Иммунохимическая система «Senova» представляет собой компактную прозрачную пластиковую колонку, содержащую полиэтиленовый фильтр с пористой 3D-структурой. Средний размер пор составляет 20 мкм, пористость материала – около 50%. Для сравнения с системой на основе сефарозы,этот метод был оптимизирован для определения бензо[а]пирена. Для работы использовали моноклональные специфичные к бензо[а]пирену антитела. В оптимизированных условиях была построена градуировочная зависимость определения Б[а]П (рис. 10). Достигнутый предел обнаружения составил нг/мл. Аналитический сигнал, полученный в данном методе, оказался низким (максимальное значение составляет 0.6 отн. ед.), а разница между оптическими плотностями колонки, через которую пропускался нулевой стандарт, и колонки, через которую пропускался стандартный раствор Б[а]П с концентрацией 1000 нг/л, составила всего порядка 0.3 отн. ед. Маленький перепад на градуировочной кривой затруднял корректную интерпретацию результатов и уменьшал точность измерения.

Рис. 10. Градуировочная зависимость определения бензо[а]пирена с помощью иммунохимической системы «Senova». (n=3) Предел обнаружения метода оказался высоким по сравнению с пределом обнаружения тест-метода с использованием сефарозы и не позволял определять бензо[а]пирен в питьевой воде в концентрациях, близких к значению установленной ПДК.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что иммунохимическая система «Senova» неприменима для определения бензо[а]пирена в питьевой воде.

Было решено попробовать использовать фотометр «Senova» для измерения оптических плотностей детектирующих слоев на основе сефарозы. Появление неспецифического взаимодействия в системе крайне отрицательно сказывалось на результатах определения. Поэтому для уменьшения неспецифического взаимодействия конъюгат разводили в фосфатно-солевом буферном растворе с добавкой Твин 20 (0.05%, об.). В процедуру приготовления гелей вводили дополнительный блокировочный шаг:

помимо двухчасовой обработки раствором глицина, гели два часа инкубировали в трехкратном избыткаефосфатно-солевого буферного раствора, содержащем 1% казеина.

После выбора концентраций иммунореагентов устанавливали время детектирования.

Для этого строили зависимости величины оптической плотности от времени детектирования.

Было найдено, что величина оптической плотности спустя 6 минут после добавления субстрата была еще очень низкой. Поэтому оптимальное время детектирования устанили как 20 минут (рис. 11). Градуировочная зависимость определения бензо[а]пирена приведена на рис. 12. Аналитический сигнал достигал высоких значений (1 ед.), а перепад между максимальным и минимальным значением составил порядка 0.8 отн.ед.

Рис. 11. Кинетическая кривая определения Рис. 12. Градуировочная зависимость определения бензо[а]пирена колоночным тест-методом с бензо[а]пирена колоночным иммунохимическим тест-методом с количественной интерпретацией количественной интерпретацией результатов. (n=3) результатов. (n=3) Предел обнаружения бензо[а]пирена данным методом составил 4 нг/л, что делает возможным его использование для количественного определения Б[а]П в продуктах питания и питьевой воде в концентрациях, близких к установленным максимально допустимым значениям содержания аналита. Колоночный иммунохимический тест-метод с возможностью получения количественных результатов был разработан впервые. Для апробации разработанной методики были выбраны экстракты пищевых добавок. Такой выбор был обусловлен желанием проверить пригодность колоночного иммунохимического тест-метода для анализа реальных твердых образцов, характеризующихся очень сложной матрицей. Для контроля за матричным влиянием образца (появлением ложно отрицательных результатов благодаря влиянию различного рода примесей) был построен градуировочный график с использованием стандартных растворов бензо[а]пирена, приготовленных в экстракте пищевой добавки, заведомо не содержащей аналит. Предел обнаружения составил 9 нг/кг. Результаты определения содержания бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок приведены в табл.6:

Таблица Определение бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок Концентрация Концентрация Образцы Образцы бензо[а]пирена, мкг/л бензо[а]пирена, мкг/л пищевых пищевых Колоночный Колоночный добавок добавок ВЭЖХ ВЭЖХ тест-метод тест-метод Чеснок 1 0.68 0.50 Редис 3 15 Чеснок 2 2.10 1.70 Мака 1 0.22 0. Чеснок 3 19 150 Мака 2 0.31 0. Чеснок 4 0.31 0.20 Мака 3 0.62 0. Чеснок 5 0.28 0.30 Мака 4 0.24 0. Чеснок 6 0.16 0.20 Мака 5 0.18 0. Редис 1 0.56 0.50 Мака 6 0.26 0. Редис 2 23. Полученные результаты определения содержания бензо[а]пирена в образцах пищевых добавок колоночным иммунохимическим тест-методом с визуальной детекцией хорошо коррелируют с результатами, полученными с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

4. Варьирование детектирующих меток в иммунохимических тест-методах Для детектирования аналитического сигнала в колоночном иммунохимическом тест методе традиционно применялась только ферментная (пероксидаза хрена) метка. Этот стандартный тип детекции позволял получать четкий сигнал при определении аналитов в различных средах, как бесцветных (питьевая вода), так и окрашенных (вино, пиво). Но, наряду с неоспоримыми достоинствами, использование в качестве метки ПХ имеет и ряд существенных недостатков. Во-первых, чувствительность ферментативной реакции к различного рода примесям, присутствующим в анализируемых образцах. Примеси могут влиять на интенсивность окраски и тем самым приводить к появлению ложноотрицательных результатов. Во-вторых, при использовании ферментной метки, как упоминалось выше, процедура анализа включает минимум 5 шагов: пропускание образца, промывочный шаг, добавление меченого ферментом конъюгата, промывочный шаг и добавление хромогенного субстрата. Кроме того, необходимо отметить, что ферментативная реакция протекает во времени, и зависимость интенсивности окраски детектирующего иммунослоя от этого параметра может стать причиной некорректной оценки результатов.

В настоящее время известно большое число детектирующих меток, из которых особой популярностью пользуется коллоидное золото ввиду простоты, легкости и дешевизны его приготовления, стабильности в жидком и высушенном состоянии. Несомненным достоинством квантовых точек является их яркость и возможность регулирования их спектральных характеристик. Применение в качестве метки коллоидного золота или квантовых точек позволяет сократить процедуру анализа: стадия добавления хромогенного субстрата уже не требуется.

Использование в качестве метки коллоидного золота Методика детектирования аналитического сигнала с помощью коллоидного золота в колоночном иммунохимическом тест-методе разрабатывалась на уже оптимизированной для определения бензо[а]пирена системе.. Первым шагом в разработке нового способа детектирования был синтез конъюгата бензо[а]пирена, меченого коллоидным золотом.

Сложность его получения заключалась в том, что -электронная система ароматических колец бензо[а]пирена способна вступать во взаимодействие с наночастицей золота. Таким образом, получить конъюгат методом физической адсорбции не удалось, поэтому были использованы связывающие мостиковые соединения (спейсеры). В качестве спейсеров использовались соединения с двумя функциональными группами, такие как 1,6 диаминогексан, 1,7-диаминогептан, 4-аминобутановая кислота, 6-аминогексановая кислота, 3-меркаптопропионовая кислота, 11-меркаптоундекановая кислота. Таким образом, варьировали способ связывания наночастиц золота с белком-носителем, конъюгированным с бензо[а]пиреном, а так же расстояние между ними. Для получения конъюгата спейсер пришивали к частице золота через NH2- или SH-группы. Концентрация спейсера была выбрана в 10 раз выше, чем концентрация наночастиц золота. Конъюгат, полученный при использовании в качестве спейсеров 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 4 аминобутановой кислоты, 3-меркаптопропионовой кислоты не связывался с иммобилизованными на геле специфичными антителами, иммунослой оставался белым после добавления конъюгата. Связывающиеся со специфичными антителами конъюгаты были получены с 6-аминогексановой и 11-меркаптоундекановой кислотами. С полученными конъюгатами была проведена процедура анализа. Было обнаружено, что конъюгаты характеризуются сильным неспецифическим взаимодействием с материалом иммуногеля (сефарозой), в особенности, конъюгат, полученный с использованием 6-аминогексановой кислоты. При его использовании стадия дополнительного блокирования геля в процессе его приготовления и увеличение объема промывочного буфера после удаления несвязавшегося конъюгата не дали желаемых результатов. Таким образом, для дальнейшей работы был выбран конъюгат, полученный на основе 11-меркаптоундекановой кислоты. В процедуру приготовления геля был включен дополнительный блокировочный шаг: связанный и несвязанный гели со специфичными антителами, кроме двухчасовой обработки раствором глицина, два часа инкубировали при добавлении к ним трехкратного избытка фосфатно солевого буферного раствора, содержащего 1% БСА. Кроме того, объем промывочного буферного раствора (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0.05% Твин 20) был увеличен вдвое (10 мл вместо 5 мл). Увеличение объема промывочного буферного раствора привело к ослаблению окраски детектирующего иммунослоя в случае отрицательного результата, что могло стать причиной появления ложноположительных результатов. Во избежание этого была увеличена концентрация антител в детектирующем слое и концентрация конъюгат. Это привело к тому, что предел обнаружения для данной системы составил 25 нг/л.

Использование в качестве метки Cd/Te квантовых точек Квантовые точки можно назвать «идеальной» меткой для колоночного иммунохимического тест-метода ввиду легкости получения конъюгата бензо[а]пирена, меченого квантовыми точками и отсутствия у него неспецифического взаимодействия с материалом геля. Для работы нами были использованы карбоксидериватизированные Cd/Te квантовые точки. Достигнутый предел обнаружения бензо[а]пирена данным методом составил 5 нг/мл. В процессе анализа было выяснено, что полученный конъюгат позволяет упростить процедуру анализа (убрать из нее шаг добавления субстрата) и сократить процент ложных результатов. Так, процент ложноположительных результатов при использовании в качестве метки квантовых точек составил 2.3 %, вместо 3.1% при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. А процент ложноотрицательных результатов уменьшился с 4.5% (при использовании ферментной метки) до 2.5% (табл.7).

Таблица 7.

Аналитические характеристики колоночного иммунохимического тест-метода с различными детектирующими метками Метка Характеристика тест-метода Пероксидаза Коллоидное Квантовые хрена золото точки Процент ложнополож. результатов 4.8 2. 3. Процент ложноотриц.результатов 2.9 2. 4. 96.0 97. 96. Правильность 97.6 96. 95. Специфичность 94.1 97. 96. Чувствительность Результаты сравнения детектирующих меток приведены в таблице 8.

Таблица 8.

Сравнение детектирующих меток для колоночного иммунохимического тест-метода Коллоидное Квантовые Фермент золото точки Предел обнаружения, нг/л (визуальная детекция) 5 25 Число шагов в процедуре анализа 5 4 Неспецифическое взаимодействие + Дополнительные шаги в процедуре + приготовления гелей Возможность получения количественных + результатов Таким образом, использование квантовых точек значительно упрощает процедуру анализа и интерпретацию результатов, однако недостатком их использования является отсутствие в настоящий момент портативного прибора, позволяющего получать количественные результаты. Использование в качестве метки коллоидного золота значительно повышает предел обнаружения, однако процедура отличается простотой.

Применение ферментной метки позволяет достигать низких значений пределов обнаружения и получать количественные результаты. Недостатком ее использования является более сложная, чем для применения частиц коллоидного золота и квантовых точек, процедура анализа.

Выводы:

1. Разработаны колоночные иммунохимические тест-системы, позволяющие чувствительно и специфично детектировать токсиканты в продуктах питания, значения предела обнаружения составили: 40 нг/л для пирена в воде;

5 нг/л и 9 нг/кг для бензо[а]пирена в воде и в пищевых добавках, соответственно;

2 мкг/л для охратоксина А в красном вине;

2 мкг/л для 2,4,6 –трихлорфенола в красном вине.

Достигнутые значения предела обнаружения тест-методов на бензо[а]пирен и охратоксин А эквивалентны установленным значениям максимально допустимых содержаний этих аналитов в исследованных продуктах питания. Были оценены возможности применения разработанных тест-методов для определения загрязнителей в реальных образцах.

2. Модернизирован колоночный иммунохимический тест-метод введением в колонку контрольного слоя и нескольких детектирующих иммунослоев для одновременного определения нескольких аналитов. Впервые был разработан колоночный иммунохимический тест-метод с количественной интерпретацией результатов при использовании портативного фотометра.

3. Предложены методики простой и быстрой очистки жидких продуктов питания для последующего определения в них токсикантов поляризационным флуоресцентным иммуноанализом и колоночным иммунохимическим тест-методом. Для определения микотоксинов в качестве пробоподготовки была предложена фильтрация через колонки, наполненные очищающим сорбентом. Показано, что оптимальными сорбентами для очистки красного вина и пива являются силикагель с привитыми аминопропильными группами и силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами.

4. Разработаны методики определения цефалексина и гентамицина в молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Показано, что оптимальным методом пробоподготовки молока является одновременное разбавление образца и осаждение в нем белков метанолом. Достигнутые значения предела обнаружения составили 15 нг/мл для гентамицина и 24 нг/мл для цефалексина.

5. Проведено сравнение детектирующих меток различной природы для использования в колоночном иммунохимическом тест-методе. Установлено, что лучшими метками для колоночного тест-метода являются пероксидаза хрена и квантовые точки на основе селенидов Cd/Te (предел обнаружения составляет 5 нг/л для обеих меток).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Горячева И.Ю., Белоглазова Н.В., Басова Е.Ю., Карагушева М.А., Русанова Т.Ю.

Тест-система для иммуноферментного определения токсикантов // Патент на изобретение. Патент на изобретение № 2374649. Дата приоритета 04.05.2008.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Rusanova T.Yu., Yurasov N.A., Galve R., Marco M. P., De Saeger S. Gel-based immunotest for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine // Anal. Chim. Acta. 2010. Vol. 672. P. 3-8.

2. Горячева И. Ю., Русанова Т. Ю., Белоглазова Н. В., Воронов И. И., Де Саегер С.

Определение охратоксина а в окрашенных продуктах питания: пробоподготовка и иммунохимический тест-метод // Журн. Аналит. Химии. 2010. Т. 65. №7. С. 776- 3. Rusanova T.Yu., Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Lobeau M., Van Peteghem C., De Saeger S. Non-instrumental immunochemical tests for rapid ochratoxin A detection in red wine // Anal. Chim. Acta. 2009. Vol.653. P.97–102.

4. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Mikhirev D.A., De Saeger S., Niessner R., Knopp D. New immunochemically-based field test for monitoring benzo[a]pyrene in aqueous samples // Analytical Sciences.2008. Vol.24. P.1613-1617.

5. Goryacheva I.Yu., Beloglazova N.V., Eremin S.A., Mikhirev D.A., Niessner R., Knopp D.

Gel-based immunoassay for non-instrumental detection of pyrene in aqueous samples // Talanta. 2008. Vol.75. P.517-522.

Материалы конференций:

1. Белоглазова Н.В. Определение цефалоспориновых антибиотиков в молоке методом поляризации флуоресценции // «Ломоносов 2010 – международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2010. Москва, Россия. Материалы конференции.

2. Белоглазова Н.В., Еремин С.А. Определение афлатоксина В1 в пиве методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. 2010. №1. С.183-184.

3. Beloglazova N.V., Goryacheva I.Yu., Rusanova T.Yu. Development of gel-based immunochromatographic test for simultaneous detection of 2,4,6-trichlorophenol and ochratoxin A in red wine // «4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA)». 2009. Prague, Czech Republic. Book of Abstracts. P 439.

4. Beloglazova N.V., Eremin S.A., Li Zh., Xu Ch.. Determination of cephalosporin antibiotic in milk samptes by fluorescence polarization immunoassay // «Xth International Conference on Agri-Food Antibodies (ICAFA)».Wageningen, the Netherlands. 2009. Book of Abstracts. P 43.

5. Белоглазова Н.В. Иммунохимические методы детектирования охратоксина А в красном вине // «Ломоносов 2009 – международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2009. Москва, Россия. Материалы конференции.

6. Еремин С.А., Нестеренко И.С., Белоглазова Н.В. Скрининг пищевых продуктов на токсиканты методом поляризационного флуороиммуноанализа // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты».

2008. Москва, Россия. Материалы конференции. Т. 1. С.367.

7. Белоглазова Н.В., Еремин С.А., Сахаров И.Ю. Пробоподготовка красного вина методом твердофазной экстракции для определения охратоксина а методом поляризационногофлуоресцентного иммуноанализа // Международная научно практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 2008.

Москва, Россия. Материалы конференции. Т. 1. С.412.

8. Еремин С.А., Бондаренко А.П., Белоглазова Н.В., Колосова А.Ю., Lobeau M., De Saeger S. Одновременное определение микотоксинов зеараленона и охратоксина А методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Второй Съезд микологов России. 2008. Москва, Россия. Современная микология в России: тезисы докладов. Т. 2, Р. 9. С. 251-252.

9. Белоглазова Н.В., Еремин С.А., Сахаров И.Ю. Пробоподготовка красных вин методом твердофазной экстракции для определения охратоксина А методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа // Второй Съезд микологов России. 2008. Москва, Россия. Современная микология в России: тезисы докладов. Т.

2, Р. 9. С. 243-244.

10. Белоглазова Н.В., Горячева И.Ю. Разработка иммунохимического неинструментального тест-метода для определения пирена в водных объектах // «Ломоносов 2008 – международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых». 2008. Москва, Россия. Материалы конференции. Т.1. С. 15.

11. Левина Н., Белоглазова Н., Русанова Т. Иммуноаффинные колонки для концентрирования пирена на основе нанопористых золь-гель материалов // Всероссийская школа-семинар для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнология: проблемы и перспективы». 2008. Белгород, Россия. Материалы конференции. Т.1. С. 18-19.

12. Белоглазова Н.В., Горячева И.Ю. Иммунохимическое определение полициклических ароматических углеводородов // «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: VI российская конференция молодых ученых». 2007.

Саратов, Россия. Материалы конференции.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.