авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Накопление меди и марганца в клетках цианобактерии spirulina platensis

На правах рукописи

ЧЕРНИКОВА Анна Александровна НАКОПЛЕНИЕ МЕДИ И МАРГАНЦА В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ SPIRULINA PLATENSIS 03.00.12 – Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2009

Работа выполнена в Лаборатории управляемого фотобиосинтеза Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им.

К.А. Тимирязева РАН, г. Москва НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Пронина Наталия Александровна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Тамбиев Александр Хапачевич кандидат биологических наук Серегин Илья Владимирович ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится 30 июня 2009 г. в 14 ч. 30 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им.

К.А. Тимирязева РАН по адресу:

127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977-80- e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «26» мая 2009 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук М. И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) становится все более актуальной. Металлы представляют серьезную угрозу для биоты вследствие острой токсичности и постепенного накопления в окружающей среде до опасного значения.

В последние годы экологи наряду с оценкой уровня загрязнений и определения их источников всё больше обращают внимание на выявление «судьбы» попавших в природную среду веществ, их превращений и взаимодействий с живыми организмами. Удобным объектом для таких исследований служат цианобактерии, которые способны накапливать в высоких концентрациях многие элементы и переводить их в нетоксичную форму, что в настоящее время широко применяется в целях биоремедиации - для очистки водных стоков (Жубанова & Заядан, 2004;

do Nascimento & Xing, 2006;

Saeed & Iqbal, 2006).

Поскольку процесс поступления металлов в окружающую среду является неизбежным по мере интенсификации промышленности и сельского хозяйства, следует признать актуальным вопрос прогнозирования развития водных биоценозов в условиях загрязнения водной среды. В этой связи возникает необходимость исследований устойчивости широкого круга микроорганизмов к различным химическим элементам.

Металлы, как главные природные ресурсы, образуют группу опасных загрязнителей среды, и, в то же время, они являются необходимой частью ферментативных систем живых организмов (Babula et al., 2008). Физиологическая роль меди и марганца, а также их фитотоксичность (в высоких концентрациях) определяют важность изучения закономерностей их накопления и распределения у разных видов растений и цианобактерий.

Цианобактерия Spirulina platensis широко распространена в природе и является перспективным объектом биотехнологии благодаря богатству белкового состава, наличию витаминов и высших жирных кислот (Richmond, 1986;

Mosulishvini et al.

2002;

Тамбиев и др., 2006). Пластичность метаболизма S. platensis позволяет получать биомассу, обогащенную необходимыми элементами, путем направленного изменения условий культивирования, что используется при создании биологически активных добавок (Мазо и др., 2004;

Попова и др., 2006;

Кравченко и др., 2008). Для понимания физиологических механизмов адаптации цианобактерий к действию ТМ и оптимизации условий культивирования с целью получения биомассы, обогащенной эссенциальными микроэлементами, представляется важным выявить специфику накопления и токсического действия ионов Cu и Mn в клетках цианобактерии Spirulina platensis.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование возможности адаптации Spirulina platensis к действию ионов меди и марганца, а также способности клеток к накоплению металлов для получения биомассы, обогащенной этими элементами.

В связи с этим были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние меди и марганца на рост S. platensis, определить оптимальные и летальные концентрации этих элементов.

2. Исследовать влияние меди и марганца на ультраструктурную организацию клеток S. platensis.

3. Изучить динамику накопления Cu и Mn в клетках S. platensis.

4. Исследовать влияние света на накопление Cu и Mn.

5. Исследовать включение Cu и Mn в состав клеточных компонентов.

6. Идентифицировать металлсвязывающие внутриклеточные компоненты.

Научная новизна. Показана высокая степень устойчивости S. platensis к ионам меди и марганца на различных стадиях роста культуры. Впервые показано, что цианобактерия способна восстанавливать Cu2+ до Cu+ и переводить ТМ в недоступную для клетки форму. Впервые показано, что Cu и Mn накапливаются в клетках в основном в составе низкомолекулярных белков, которые по ряду характеристик могут быть отнесены к фитохелатинам или металлотионеинам.

Впервые показано влияние света на накопление Cu и Mn. Показано влияние меди и марганца на изменение ультраструктурной организации клетки.

Практическая значимость. Полученные в работе данные об особенностях накопления меди и марганца имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптационных процессов и механизмов устойчивости цианобактерий к действию ТМ. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование цианобактерии S. platensis для биоремедиации промышленных стоков и городских водоемов от тяжелых металлов, а также могут быть использованы в биотехнологии для получения биомассы обогащенной Cu и Mn при производстве биологически активных добавок к пище человека и животных (патент РФ № 2277124).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме «Molecular genetics and biotechnology» (Москва, 2001);

на международной конференции «Biotechnology of Microalgae» (Германия, 2003);

на 5-ом съезде Всероссийского общества физиологов растений (Пенза, 2003);

на 6-м съезде Всероссийского общества физиологов растений (Сыктывкар, 2007);

на Всероссийской научной конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, включая патент РФ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, заключения и выводов. Работа изложена на … стр. машинописного текста, включая … таблиц, … рисунок, библиография содержит … источника.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве объекта исследования использовали термофильную нитчатую цианобактерию Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (IPPAS).

Культивирование цианобактерии осуществляли на среде Заррука в стерильных условиях при круглосуточном освещении (30 Вт/м2) и непрерывном барботировании газо-воздушной смесью содержащей 1.7-2% СО2, при 35оС (Семененко, 1991). В опытных вариантах в стандартную среду Заррука добавляли сульфат меди или хлорид марганца в концентрациях: 0.04;

0.06;

0.08 мМ и 1.3;

2.5;

5.1 мМ соответственно. Соли вводили в питательные среды либо одновременно с внесением посевного инокулята, либо при выходе культуры на линейную фазу.

Биохимические анализы проводили на линейной стадии роста в клеточной массе предварительно отмытой от культуральной среды. Образцы хранили при -200С.

Содержание белка определяли по методу Lowry (Lowry et al., 1951).

Содержание хлорофилла измеряли спектрофотометрически в метанольных экстрактах (Porra et al., 1989).

Содержание липофильных соединений оценивали весовым методом в пробах, экстрагированных метанолом при 60°С (Клячко-Гурвич, 1966).

Разрушение клеток проводили в гомогенизаторе Retsch-ММ2 (Германия) в течение 10 мин при 90000 уд/мин с использованием стеклянных бус, при соотношении бусы/суспензия 1:1.

Фракционирование бесклеточного гомогената на фракции, обогащенные растворимыми белками и нерастворимыми клеточными компонентами осуществляли центрифугированием при 14000 об/мин, 30 мин при 4°С. Экстракцию липофильных соединений проводили при обработке фракции нерастворимых клеточных компонентов метанолом при 60°С.

Хроматографический анализ белков проводили с использованием колоночной хроматографии высокого давления на колонке 1,650 см. В качестве матрицы использовали Superosa-12 («Pharmacia», Швеция). Белок элюировали с колонки фосфатным буфером, содержащим 0,05М KH2PO4, 0,15M NaCl (рН 6,8), со скоростью мл/мин.

Электрофоретическое разделение белков проводили в 12% трицин-ПААГ (Schagger & Jagow, 1987).

Хелатирование меди и марганца осуществляли с использованием ЭДТА (Steiner & Winden, 1970).

Содержание меди и марганца в культуральной среде, а также в биомассе S.

platensis или выделенных из нее фракциях, озоленных путем мокрого сжигания в смеси азотной и хлорной кислот, определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Hitachi 270», Япония).

Определение Cu+ проводили аналитическим методом путем проведения качественной реакции с N-диметиламино-бензилиденроданином (Грива и др., 1967).

Для получения электронно-микроскопических снимков клетки обрабатывали по методике Владимировой с соавт. (1978).

Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных результатов эксперименты проводили в 2-3-х биологических и не менее чем в 3-х аналитических повторностях. В результатах работы представлены данные характерных опытов и относительные стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние меди и марганца на рост S. platensis. Добавление CuSO4 (0.04 и 0. мМ Cu) в начальный период культивирования одновременно с внесением инокулята приводило к удлинению лаг-фазы, которая составляла около суток в контроле и суток в опыте, с последующим более быстрым линейным ростом (рис. 1А).

Внесение 0.04 мМ меди на 2-е сутки культивирования (в начале линейной фазы) приводило к активации роста культуры (рис.1Б), но снижению ее продуктивности.

При увеличении концентрации меди до 0.06 мМ скорость роста и продуктивность культуры снижались и к 4-м суткам культура погибала, чего не происходило при внесении меди одновременно с инокулятом. В присутствии 0.08 мМ меди клетки погибали независимо от времени внесения соли.

Сравнение ростовых кривых рис. 1А и Б показывает, что при внесении металла на логарифмической стадии роста порог чувствительности культуры к меди снижается.

Вероятно это связано с тем, что в течение индукционного периода, в который не происходит сколько-нибудь значительного увеличения биомассы, клетки лучше адаптируются к новым условиям, что позволяет цианобактерии увеличить устойчивость к более высоким концентрациям меди.

Введение хелатирующего агента повышало устойчивость S. platensis к токсическому действию меди. В присутствии комплексов Cu с ЭДТА культура сохраняла способность к росту даже при летальной концентрации меди (0.08 мМ).

9 Оптическая плотность, 750 нм Оптическая плотность, 750 нм Б А 7 2 5 4 3 1 0 2 4 0 2 4 6 8 Время, сутки Время, сутки Рис. 1. Влияние CuSO4 на рост S. platensis.

Соль вносили вместе с инокулятом (А) и на 2-е сутки после начала культивирования (Б). Количество добавленной в среду Заррука меди составляло (мМ): 0 (1, контроль), 0.04 (2);

0.06 (3);

0.08 (4).

При внесении марганца в концентрациях до 2.5 мМ одновременно с инокулятом не отмечено расхождений с контролем в ходе ростовых кривых в течение лаг-фазы и на линейном участке (рис. 2А).

Оптическая плотность, 750 нм Оптическая плотность, 750 нм А Б 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 0 2 4 Время, cутки Время, сутки Рис. 2. Влияние MnCl2 на рост S. platensis.

Соль вносили вместе с инокулятом (А) и на 2-е сутки после начала культивирования (Б). Количество добавленного в среду марганца составляло (мМ):

0 (1, контроль), 1.3 (2);

2.5 (3), 5.1 (4).

Внесение таких же концентраций Mn на 2-е сутки культивирования приводило к активации роста культуры (рис. 2Б) по сравнению с контролем. При этом максимальная плотность биомассы была выше, чем в контроле и при действии эквивалентой концентрации Mn, добавленной одновременно с инокулятом.

Однако независимо от времени внесения MnCl2 в присутствии 1.3 и 2.5 мМ марганца наблюдалось существенное сокращение стационарной фазы с последующим быстрым лизисом клеток. Возможно, на фоне отсутствия активного деления клетки и замедления метаболизма токсичность Mn проявляется острее в силу снижения способности S. platensis включать поглощенный клетками марганец в метаболические процессы. При увеличении концентрации марганца до 5.1 мМ скорость роста снижалась независимо от стадии внесения металла.

Накопление меди и марганца клетками S. platensis. Анализ накопления меди в процессе культивирования S. platensis при внесении в культуральную среду соли с содержанием меди 0.06 мМ показал, что содержание Cu в клетках резко (на порядка) возрастало уже через 1 ч и в дальнейшем в течение 6 сут постепенно снижалось с 13.4 до 7.7 мкмоль/г сухой массы (рис. 3).

Содержание Cu, мкмоль/г сух. массы Рис. 3. Динамика накопления меди клетками S.

platensis при культивировании в присутствии сульфата меди.

Соль с содержанием 0.06 мМ меди вносили 8 вместе с инокулятом.

-100 20 50 80 110 Время, час Как видно из рис. 4А, с повышением концентрации меди в среде наблюдалось увеличение ее содержания в биомассе, которое зависело от времени инкубации цианобактерии с металлом. Через час при всех концентрациях металла в среде до 0.06 мМ его содержание в клетках было значительно выше (кривая 1), чем через сутки (кривая 2), 3 суток (кривая 3) и 6 суток (кривая 4). Однако, при культивировании клеток в присутствии 0.08 мМ Cu2+ эта закономерность нарушалась, что говорит о подавлении механизмов, ограничивающих поступление и накопление меди. Содержание металла одинаково высокое (17,3 мкмоль/г сухой массы) через 1 ч и через 1 сут, что приводило в дальнейшем к гибели клеток как это видно из ростовой кривой на рис. 1А, кривая 4.

Снижение содержания меди у S. platensis в ходе адаптации цианобактерии к избытку металла (рис. 3) свидетельствует об индукции механизмов, способствующих выносу Cu из клетки.

Содержание Mn, мкмоль/г сух. массы Б Содержание Сu, мкмоль/г сух.массы А 12 8 0 0 0,04 0,08 0 2 4 Концентрация Mn в среде, мМ Концентрация Cu в среде, мМ Рис. 4. Зависимость количества связанных меди (А) и марганца (Б) в клетках S.

platensis от количества элементарных Cu2+ и Mn2+, введенных в среду культивирования.

Пробы отбирали через 1 ч (1), 1 сут (2), 3 сут (3) и 6 сут (4) после внесения разных концентраций CuSO4 и MnCl2 в среду культивирования.

Накопление марганца клетками S. platensis происходило пропорционально времени культивирования и увеличению концентрации металла в среде с выходом на насыщение около 2.5 мМ (рис. 4Б). Пороговой внутриклеточной концентрацией этого металла, по-видимому, следует считать около 30 мкмоль/г сухой. Выход кривых накопления марганца на плато показывает, что клетки способны каким-то способом ограничивать поступление и накопление Mn, защищая их от токсического действия этого металла.

Влияние света на накопление меди и марганца клетками S. platensis. Анализ кинетики содержания меди в биомассе при инкубировании S. platensis в присутствии 0.06 мМ Cu2+ на свету и в темноте показал, что клетки не способны накапливать медь в темноте (табл. 1). Таким образом, накопление меди является светозависимым процессом, что также установлено и для других организмов (Verma & Singh, 1990).

Таблица 1. Накопление Cu и Mn при внесении металла в суспензию S. platensis на свету и в темноте Содержание металла в клетке (мкмоль/г сух. массы) Металл Время свет темнота 1 час 13.5±0.8 следы следы 1 сут 12.0±0. 0.06 мМ Cu следы 3 сут 9.5±0. следы 6 сут 7.7±0. 1 час 9.5±0.7 7.2±0. 2.5 мМ Mn 1 сут 11.6±1.0 56.0±2. 3 сут 16.9±0.9 20.1±2. В отличие от меди марганец накапливался в клетках S. рlatensis как в темноте, так и на свету (табл. 1). При внесении соли в темноте содержание марганца в клетках в 1 сутки, в расчете на единицу сухой массы, было почти в 5 раза выше, чем на свету.

Далее содержание металла в клетках снижалось, приближаясь через 3 суток к значению установленному на свету. Возможно, что различие в динамике содержания марганца в темноте и на свету связано с особенностями сорбции металла клеточными стенками S. рlatensis.

Биотрансформация и вынос меди из клетки. Для изучения природы механизмов ограничивающих аккумуляцию меди (рис. 3, 4А), мы исследовали изменение содержания металла в среде культивирования и в клетках. Для сопоставления выноса меди из среды и включения ее в клеточные структуры суспензию S. platensis, выращенную в присутствии 0.04 мМ Cu2+, центрифугировали для полного отделения клеток от среды. На поверхности осадка содержащего клетки, обнаруживался слой красноватого цвета, который был нами отобран и проанализирован на присутствие меди. Содержание меди определяли также в супернатанте (среда) и в осадке (клетки), трижды промытом буфером для полного отделения клеток от элементов среды.

Анализ хода кривых 1 и 2 рис. 5 показал, что количество меди, вынесенной из среды, значительно превышает количество меди, включенной в биомассу в течение всего цикла культивирования. Это различие показано на рис. 5 пунктирной линией 3. Мы предположили, что баланс распределения меди в среде и биомассе не сошелся из-за возможного образования нерастворимых комплексов меди, которые осаждались вместе с клетками и были утрачены при многократной отмывке клеток от среды. С этой целью мы провели анализ красноватого осадка, полученного при отделении клеток от среды, который показал наличие в нем восстановленной меди (Cu+). Поскольку в среду добавляли сульфат меди можно полагать, что S. platensis способна восстанавливать Cu2+ и переводить ее в недоступную для клетки форму.

Процессы поглощения (кривая 1) и восстановления (кривая 3) меди являются достаточно быстрой ответной реакцией цианобактериальной клетки и сопоставимы по масштабам. Уже через 1 ч после внесения сульфата меди отмечается высокое содержание Cu+, а в дальнейшем накопление в среде восстановленной меди замедляется.

Содержание Cu, мкмоль/л суспензии Рис. 5. Изменение содержания меди в клетках S.

platensis (1) и в среде культивирования (2).

Культуру выращивали в присутствии CuSO (0.04 мМ Cu2+). Пунктиром (3) отмечена расчетная кривая концентрации + восстановленной меди (Cu ), рассчитанная по формуле:

Свос = Свн – (Скл + Сср), где Свос – конц. восстановленной меди, Свн – конц. меди, внесенной в среду культивирования, Скл – конц. меди в клетке, Сср – конц. меди в среде культивирования.

-20 0 20 40 60 Время, час Осаждение металла из среды культивирования снижает токсическое действие меди и ограничивает накопление меди в клетке, позволяя пройти полный цикл развития. При концентрации меди свыше 0.08 мМ клетки утрачивали способность к выносу металла в среду (рис. 4А), что вызывало лизис клеток уже на ранних этапах культивирования (рис 1). Очевидно также, что секреция ТМ из клетки (рис. 3) по крайней мере, отчасти может быть связана с образованием восстановленной меди Cu+.

Адсорбция меди и марганца сухой биомассой S. platensis. Для исследования вклада биосорбции в накопление меди и марганца лиофилизированную биомассу S.

platensis ресуспендировали в среде, содержащей 0.06 мМ меди и 2.5 мМ марганца. В «мертвых клетках» уже через 1 час наблюдалось резкое увеличение количества металлов, которое далее не изменялось (рис. 6).

Таким образом, показана принципиальная возможность клеточных стенок S.

platensis сорбировать ТМ. Однако отсутствие какого-либо накопления меди в темноте (табл. 1.) может указывать, что вклад биосорбции в накопление металлов живыми и «мертвыми» клетками может различаться.

Содержание Mn, мкмоль/г сух.массы Содержание Cu, мкмоль/г сух.массы Б А 6 -20 0 20 40 60 -20 0 20 40 60 Время, час Время, час Рис. 6. Динамика накопления меди (А) и марганца (Б) при внесении 0.06 мМ Cu2+ и 2.5 мМ Mn2+ в суспензию S. platensis (1) и сухую биомассу (2).

Содержание Cu и Mn в живых клетках S. platensis значительно выше, чем у «мертвых» (рис. 6), что свидетельствует о включении металлов в состав внутриклеточных структур.

Идентификация металлсвязывающих клеточных компонентов. Для оценки способности клеток S. platensis сорбировать металлы, а также включать медь и марганец в состав клеточных компонентов, на первом этапе было проведено разделение биомассы на отдельные фракции – растворимых белков, нерастворимых клеточных компонентов и липофильных соединений.

Как видно из рис. 7, большая часть ТМ содержалась в составе фракции обогащенной растворимыми белками - меди около 55%, марганца более 80%. Около 20% меди обнаруживалось в липофильных соединениях, содержащих в основном пигменты и липиды тилакоидных мембран. Во фракции нерастворимых клеточных компонентов, которая включала белки тилакоидных мембран, элементы клеточных стенок и углеводы, содержалось около 17 % меди и марганца. Таким образом, можно полагать, что доля сорбированных живыми клетками металлов не превышает 20 – 30 %.

А Б Л Нк Л Р Нк Р Рис. 7. Распределение Cu (А) и Mn (Б) в биомассе S. platensis.

Л – липофильные соединения, Нк – фракция нерастворимых клеточных компонентов, Р – фракция растворимых белков.

Для поиска металлсвязывающих белков было проведено разделение растворимых белков, выделенных из клеток S. platensis, с использованием колоночной хроматографии высокого давления. На рис. 8А, Б представлены профили белков из клеток, выращенных на стандартной среде (контроль) и при внесении 0.06 мМ меди или 2.5 мМ марганца (опыт).

А Б 0,1 П оглощ ение 280 н.м.

0, П оглощ ение 280 н.м.

1 0 50 0 5 10 15 20 0 В Г 5 С одержание C u, отн. ед.

С одерж ание M n, отн. ед.

0,5 0,5 4 0 2*10 2*10 14,1 1,82 0, 126 126 25 14,130 1,82 40 0, 5 0 5 10 20 35 45 Молекулярная масса, кДа Молекулярная масса, кДа Рис. 8. Спектры хроматографического разделения белков (HPLC) S. platensis и идентификация металлсвязывающих белков.

А, Б - профиль эллюции белка, выделенного из клеток, выращенных на стандартной среде Заррука (1) и при добавлении 0.06 мМ меди (2) или 2. мМ марганца (3).

В, Г - содержание металлов в расчете на единицу белка в контроле (4) и при добавлении меди (5) или марганца (6).

Сравнение профилей эллюции белков показало, что количественное содержание низкомолекулярных белков возросло более чем в пять раз, по сравнению с контролем при культивировании S. platensis в присутствии металлов. При этом анализ полученных в ходе хроматографического разделения фракций на содержание металлов показал, что именно эти белки с молекулярными массами 2 – 15 кДа содержат медь и марганец (рис. 8В, Г). Можно полагать, что данные белки относятся к классу металлсвязывающих белков S. platensis.

При электрофоретическом разделении медь- и марганец-содержащих белковых фракций было обнаружено несколько полос, соответствующих белкам с молекулярными массами 13 кДа и 8-9 кДа (рис. 9).

Таким образом, S. platensis обладает способностью синтезировать специфические индуцируемые белки, связывающие тяжелые металлы, что способствует повышению устойчивости клетки к стрессовому воздействию ТМ.

Контроль Cu М Mn 26. 17. 14.0 ~ ~ 8- 6. (кДа) Рис. 9. Электрофоретическое разделение Cu- и Mn-содержащих белков S. platensis.

М – маркеры молекулярной массы.

Влияние меди и марганца на ульраструктуру клетки. Анализ влияния повышенных концентраций меди на ультраструктуру S. platensis показал, что в присутствии Cu ламеллы утрачивают параллельную ориентацию и закручиваются.

Под действием Cu увеличивалось количество запасающих продуктов: появляются цианофициновые и полифосфатные гранулы, повышается количество карбоксисом (рис. 10Б).

При выращивании клеток S. platensis в присутствии марганца ультраструктура клеток также менялась (рис. 10В). Отмечалось существенное увеличение расстояния между ламеллами. В промежутках между тилакоидами накапливалось значительное количество углеводов. В то же время, при инкубировании клеток S. platensis в темноте в присутствии эквивалентной концентрации марганца ультраструктура клеток не подвергалась существенным изменениям по сравнению со световыми условиями (рис. 10Г). В клетках обнаруживалось увеличение количества цианофициновых и -гликановых гранул, что может быть обусловлено действием темноты.

Б А Г В Рис. 10. Влияние меди и марганца на изменение ультраструктуры клеток S. platensis.

Цианобактерию выращивали на стандартной среде Зарркука (А), при добавлении 0.06 мМ меди (Б), 2.5 мМ марганца (В). Г – клетки инкубировали в присутствии 2.5 мМ марганца в темноте.

ВП – внутритилакоидное пространство, Ка – карбоксисома, КС – клеточная стенка, Пф – полифосфатные гранулы, ТМ – тилакоидные мембраны, У – углеводы, ЦГ – цианофициновые гранулы, – гликоген.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, Spirulina platensis, в отличие от большинства фотосинтезирующих микроорганизмов, проявляет высокую толерантность к меди и марганцу. Согласно предложенной Baker (1981) классификации растений и микроорганизмов по степени накопления ТМ S. platensis можно отнести к гипераккумуляторам меди. Клетки способны накапливать около 1 мг/г сухой массы Cu, что является пороговой величиной накопления меди клетками гипераккумуляторами. По способности S. platensis накапливать марганец (1,6 мг/г сух. массы) культуру можно отнести к аккумуляторам. Пороговое значение концентрации марганца в клетках водорослей-гипераккумуляторов значительно выше и составляет около 10 мг/г сух. массы (Baldisserotto et al, 2007).

Механизмы детоксикации токсического действия меди и марганца в клетках S.

platensis связаны с сорбцией ТМ на клеточной поверхности, ограничением их поступления в клетку, индукцией синтеза металлсвязывающих белков и, возможно, компартментацией ТМ в полифосфатные гранулы и липиды тилакоидных мембран.

При адаптации к высоким концентрациям меди клетки S. platensis могут восстанавливать Cu (II) до Cu (I) с последующим экспортом в среду культивирования в недоступных для клетки соединениях восстановленной меди.

Способность S. platensis к выносу меди является условием выживания клеток в присутствии этого ТМ.

Проведенные комплексные исследования позволяют определить оптимальные концентрации меди и марганца для внесения в среду культивирования, которые не вызывают ингибирования роста культуры, изменений биохимического состава биомассы и ультраструктуры клеток для оптимизации внутриклеточного накопления этих элементов и получения биомассы, обогащенной медью и марганцем.

ВЫВОДЫ 1. S. platensis устойчива к действию высоких концентраций меди и марганца.

Культура сохраняет способность к росту при концентрациях меди до 0.06 мМ, марганца до 5 мМ.

2. Содержание внутриклеточной меди находится в прямой зависимости от концентрации металла в среде, что, очевидно, говорит о неспособности клеток S. platensis лимитировать накопление Cu вплоть до летальных величин.

3. В присутствии неингибирующих рост концентраций меди (до 0.06 мМ) максимальное накопление Cu клетками S. platensis наблюдается уже в первый час, с последующим выносом металла из клетки. Способность S. platensis к выносу меди является условием выживания клеток в присутствии этого ТМ.

S. platensis восстанавливает Cu2+ до Cu+, с последующим экспортом в среду в 4.

недоступной для клеток форме, что ограничивает поступление металла в клетку и снижает его токсическое действие.

5. Накопление марганца происходит пропорционально времени культивирования и увеличению его концентрации в среде с выходом на насыщение при 2.5 мМ. Пороговой внутриклеточной концентрацией Mn следует считать 30 ± 3 мкмоль/г сухой массы.

6. Накопление Mn и Cu зависит от освещения. В отличие от марганца, медь не накапливается клетками S. platensis в темноте.

7. Показано, что медь и марганец преимущественно включаются в белковую фракцию. Хроматографический анализ белков с последующим электрофоретическим разделением показал, что металлы обнаруживаются в полипептидах с молекулярной массой около 13 и 8-9 кДа.

8. Способность S. platensis сорбировать металлы на клеточной поверхности, восстанавливать металлы и переводить их в нетоксичную форму, хелатировать с помощью металлсвязывающих белков обеспечивает устойчивость цианобактерии к тяжелым металлам.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

:

1. Nalimova A.A. (Chernikova A.A.), Popova V.V., Pronina N.A. Enrichment of Spirulina platensis cells whith Cu and Zn.// Molecular genetics and biotechnology:

Abstr. Intern. Symp. Moscow. 2001.

2. Попова В.В., Налимова А.А. (Черникова А.А), Пронина. Н.А. Накопление эссенциальных микроэлементов клетками Spirulina platensis.// Тез. Докл. 5-го съезда ВОФР. Пенза. 2003. С.321.

3. Nalimova A.A. (Chernikova A.A.), Pronina N.A. The effect of light on the accumulation of Cu and Mn in Spirulina cells.// Biotechnology of Microalgae: Abstr.

5th European Workshop. Germany. 2003.

4. Налимова А.А. (Черникова А.А.), Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А.

Влияние меди и цинка на рост и аккумуляция клетками Spirulina platensis тяжелых металлов.// Физиология растений. 2005. Т.52. №2. С.259-265.

5. Попова В.В., Черникова А.А., Бедбенов В.С., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А.

Способ получения биомассы спирулины (Spirulina platensis). Патент РФ № 2277124. 2006.

6. Черникова А.А., Цоглин Л.Н., Маркелова А.Г., Зорин С.Н., Мазо В.К., Пронина Н.А.. Способность Spirulina platensis к накоплению марганца и его распределение в клетке.// Физиология растений. 2006. Т.53. №6. С.903-909.

7. Черникова А.А., Пронина Н.А. Способность S. platensis к накоплению марганца и его распределение в клетке.// Тезисы 6-го съезда ВОФР.

Сыктывкар. 2007. часть 2. С. 419.

8. Черникова А.А., Пронина Н.А., Маркелова А.Г. Влияние меди и марганца на ультраструктурную организацию клетки S. platensis. // Тезисы Всероссийская науч. конф. «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах». Москва. 2009.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.