авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Новые продукты липоксигеназного метаболизма в листьях льна

На правах рукописи

Блуфард Александр Сергеевич НОВЫЕ ПРОДУКТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ЛИСТЬЯХ ЛЬНА 03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань – 2011 2

Работа выполнена в лаборатории оксилипинов Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный консультант: доктор химических наук, академик РАН Гречкин Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Горшкова Татьяна Анатольевна (КИББ КазНЦ РАН, Казань) доктор биологических наук Соловченко Алексей Евгеньевич (МГУ им. М.В. Ломоносова)

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им. А.В.

Жирмунского ДВО РАН

Защита состоится 2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д.

2/31, а/я 30, тел/факс (843)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Оксилипины – оксигенированные производные непредельных жирных кислот – играют важную роль в клеточной сигнализации, а также механизмах защиты растений. Исследование этих процессов имеет существенное теоретическое и практическое значение. Липоксигеназный каскад, источник оксилипинов, контролируется липоксигеназами и ферментами метаболизма гидроперекисей жирных кислот. Ключевыми ферментами липоксигеназного пути являются липоксигеназы (ЛОГ), включая 13(S)-липоксигеназу (EC 1.13.11.12) и 9(S) липоксигеназу (EC 1.13.11.58). Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстрата С20-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений катализируют превращение С18-жирных кислот (линолевой и -линоленовой кислоты). Продукты первичного действия липоксигеназы – гидроперекиси жирных кислот – являются предшественниками таких важных биорегуляторов, как жасмоновая кислота в растениях [Blee, 2002] и лейкотриены у млекопитающих [Samuelsson,1997].

К ферментам липоксигеназного пути, утилизирующим гидроперекиси жирных кислот, относятся гидропероксидлиаза (ГПЛ), алленоксидсинтаза (АОС) и дивинилэфирсинтаза (ДЭС). Многие продукты действия этих ферментов являются значимыми биорегуляторами. В частности, достаточно хорошо изучена 12-оксо-ФДК – предшественник 7-изожасмоновой кислоты, а также собственно 7-изо-жасмоновая кислота и родственные соединения, «жасмонаты». Эта группа физиологически активных веществ составляет новый класс фитогормонов и играет важную роль в сигнализации, регуляции экспрессии генов и в синтезе «жасмонат-индуцируемых белков» (в том числе ингибиторов протеиназ), регуляции роста и старения [Mathew et al., 1977;

Hamberg, Gardner, 1992].

Значение дивиниловых эфиров в эндогенной регуляции у растений не так хорошо изучено, как роль жасмонатов. Впервые дивиниловые эфиры (8E,1’E,3’Z)-9-(1’,3’ нонадиенилокси)-8-ноненовая и (колнелевая) (8E,1’E,3’Z,6’Z)-9-(1’,3’,6’ нонатриенилокси)-8-ноненовая (колнеленовая) кислоты были открыты Галлиардом с коллегами при экспериментах in vitro с клубнями картофеля [Galliard, Phillips, 1972;

Galliard, Mathew, 1975]. Известно, что колнелевая и этеролевая кислоты ингибируют 9- и 13-липоксигеназы, соответственно [Corey et al., 1987;

Weber et al., 1999]. Вебер с соавт.

наблюдали специфическую экспрессию гена ДЭС и накопление колнелевой и колнеленовой кислот в листьях картофеля, зараженных патогеном Phytophthora infestans, и в листьях табака, зараженных вирусом табачной мозаики. Данные об ингибировании роста P. infestans колнелевой и колнеленовой кислотами позволили Веберу с соавт. предположить фунгицидную и протекторную роль дивиниловых эфиров и ДЭС [Weber et al., 1999].

До сих пор остается открытым вопрос о биологической роли оксилипинсодержащих сложных липидов. Наиболее изученными представителями этой группы соединений являются арабидопсиды. Они представляют собой моно- или дигалактозилдиацилглицерины, содержащие остатки (15Z)-12-оксо-10,15-фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) или динор-12-оксо-ФДК. Обнаружено участие арабидопсидов в механизмах защиты растений от патогенов. Таким образом, сведения о липоксигеназном каскаде в целом и его метаболитах в частности остаются весьма отрывочными. Это касается в первую очередь оксилипинсодержащих сложных липидов, в состав которых входят дивиниловые эфиры.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования: изучить липоксигеназный путь в растениях льна.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать основные метаболиты -линоленовой кислоты в растениях льна.

2. Исследовать содержание этерифицированных оксилипинов в липидном составе листьев льна.

3. Изучить состав липидов, образующихся в листьях льна в ответ на дейтсвие экстремальных факторов.





Научная новизна работы. Полученные результаты расширяют представления о таком малоизученном классе соединений, как сложные оксилипины. Впервые показана активность дивинилэфирсинтазы в листьях льна, выделены и охарактеризованы метаболиты дивинилэфирсинтазного пути – (5Z)-этеролевая и (5Z)-этероленовая кислоты.

Впервые обаружена новая группа галактолипидов, содержащих этерифицированные остатки (5Z)-этероленовой кислоты. Для этой группы соединений предложено тривиальное название линолипины. Были выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя этого семейства - 1-O--линоленоил-2-O-(5Z) этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин (линолипин А), 1,2-ди-O-(5Z) этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин (линолипин В), 1-O-этероленоил-2 O-(5Z)--линоленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn-глицерин (линолипин С) и 1,2 ди-O-(5Z)-этероленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn-глицерин (линолипин D).

Показано, что содержание линолипинов зависит от возраста растений. Кроме того, состав и содержание линолипинов претерпевает значительные изменения при инфицировании растений фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum и замораживании-оттаивании.

Научно-практическая значимость работы. Изучение роли окислительного метаболизма С18-полиеновых кислот в жизнедеятельности растений имеет большое значение для понимания фундаментальных основ функционирования живых систем, а также для решения многих прикладных вопросов, связанных с использованием физиологически активных метаболитов как ростовых веществ, фунгицидов и др.

Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям.

Разработан комплекс подходов для выделения и очистки оксилипинсодержащих сложных липидов потенциальных физиологически-активных веществ.

– Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся современными проблемами липидологии, изучением защитных и сигнальных систем растений, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2007 по 2010 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов – эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер 01200901959). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантами РФФИ, программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и ВНШ академика А.Н.Гречкина. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);

на международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008);

на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009);

на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009);

на III Азиатском симпозиуме по растительным липидам (Япония, Йокогама, 2009);

на 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2009);

на Четвертом съезде ВМСО с международным участием (Москва, 2009);

на Третьем Европейском симпозиуме по липидным медиаторам (Париж, 2010);

на Третьем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 219 источников, из них зарубежных. В работе представлено 4 таблицы и 42 рисунка.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1 Материалы В исследовании использовали немеченые линолевую и -линоленовую кислоты, а также соевую липоксигеназу тип V производства Sigma;

боргидрид натрия и силилирующие реагенты производства Fluka (Букс, Швейцария);

липазу Rhizopus arrhizus производства Boehringer (Мангейм, Германия). (9Z,11E,13S)-13-гидроперокси 9,11-октадекадиеновую кислоту (13-ГПОД) и (9Z,11E,15Z,13S)-13-гидроперокси-3-окса 9,11,15-октадекатриеновую кислоту (3-окса-13-ГПОТ) получали инкубацией линолевой и 3-окса--линоленовой кислот, соответственно, с соевой липоксигеназой при 0 °С, рН 9,0, при продолжительном барботировании кислородом, за которым следовали экстракция и очистка методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ-ВЭЖХ). Растения льна (Linum usitatissimum L., сорт Новоторжский) выращивали в условиях вегетативного опыта в Казани летом 2007 и 2008 года. Для хранения листья льна фиксировали жидким азотом и сохраняли при -85 °С.

1.2 Инкубация бесклеточного препарата листьев и корней льна с линолевой кислотой, 13-ГПОД и с 3-окса-13-ГПОТ Листья и корни 35-дневных растений льна (навеска массой 5г) измельчали в Tris/HCl буфере (рН 7,5) на гомогенизаторе Ultra-Turrax T25 при температуре +4 °С.

Полученный гомогенат центрифугировали на 15000g в течение 15 мин. Супернатант декантировали и немедленно использовали в качестве ферментного препарата в инкубации. Фементный препарат инкубировали с линолевой кислотой, 13-ГПОД или с 3-окса-13-ГПОТ в течение 40 мин при комнатной температуре.

1.3 Экстракция, предварительная очистка и дериватизация продуктов инкубации Инкубационную смесь подкисляли уксусной кислотой до рН 6,0 и трижды экстрагировали смесью гексан – этилацетат 1:1 (по объему). Жирные кислоты выделяли из реакционной смеси и очищали для анализа при помощи LC–NH2 картриджей Supelclean по методике, описанной ранее [Grechkin et al., 2007], и силикагельного картриджа Supelclean. Продукты метилировали диазометаном CH2N2, а также последовательно подвергали восстановлению боргидридом натрия, метилированию диазометаном и обработке силилирующей смесью, состоящей из пиридина – гексаметилдисилазан – триметилхлоросилана 2:1:2 (по объему).

1.4 Анализ и разделение продуктов Метиловые эфиры продуктов (или восстановленные триметилсилильные производные) после предварительной очистки на картридже и дериватизации исследовали при помощи газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС). Также, метиловые эфиры продуктов предварительно разделяли при помощи НФ-ВЭЖХ.

1.5 Получение липидного экстракта Для выделения липидного экстракта листья льна выдерживали в кипящем изопропаноле в течение 10 минут. Затем полученный экстракт гомогенизировали.

Гомогенат центрифугировали в течение 5 минут при 8000 об/мин. Осадок повторно подвергали экстракции смесью гексан/изопропанол 1:1 и центрифугированию в тех же условиях. Надосадочную жидкость упаривали на три четверти по объему и отмывали от водорастворимых белков водой в делительной воронке. Отмытый экстракт усушивали и перерастворяли в смеси гексан/изопропанол 1:1.

1.6 Фракционирование липидного экстракта методом колоночной хроматографии Липидный экстракт разделяли на фракции, соответствующие разным классам сложных липидов, используя колоночную хроматографию. Фосфолипиды элюировали смесью хлороформ/ацетон 9:1, галактолипиды – смесью ацетон/метанол 9:1, нейтральные липиды – этанолом. Для дальнейшего разделения каждую фракцию упаривали на роторном испарителе и перерастворяли в гексане.



1.7 Тонкослойная хроматография Все фракции, собранные после колоночной хроматографии, прежде чем исследовать при помощи ВЭЖХ, предварительно анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого использовали пластинки для ТСХ «Merck» (Германия) 20х20 см с концентрационной линией 2,5х20 см, на которую наносили образец.

1.8 Высокоэффективная жидкостная хроматография Галактолипидную фракцию экстракта листьев льна разделяли при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. Собранные после ОФ-ВЭЖХ фракции, соответствующие отдельным пикам продуктов с поглощением max 267 нм, повторно очищали при помощи нормально-фазовой ВЭЖХ. УФ-спектры соединений, очищенных с помощью ВЭЖХ, записывали с помощью диодно-матричного детектора SPD-M20A (Shimadzu).

1.9 Определение положения заместителей в глицериновом остатке молекул линолипинов Для определения положения заместителей в глицериновом остатке молекул линолипинов проводили ферментативный гидролиз липазой Rhizopus arrhizus.

Реакционную смесь экстрагировали смесью гексан/этилацетат 1:1. Продукты реакции разделяли методом твердофазной экстракции на аминном картридже. Экстракт высушивали, перерастворяли в смеси хлороформ/изопропанол 2:1 и пропускали через картридж, отделяя тем самым фракцию лизолинолипина. Затем смесью этилацетат/уксусная кислота 98:2 с картриджа элюировали жирнокислотную фракцию.

Остаток жирной кислоты идентифицировали при помощи газовой хромато-масс спектрометрии. Лизолинолипин определяли при помощи масс-спектрометрии с ионизацией в электроспрее.

1.10 Содержание этерифицированных дивиниловых эфиров (ЭДЭ) в листьях льна в зависимости от возраста растений Галактолипиды выделяли из листьев 14-, 23-, 35-, 63- и 76-дневных растений льна, очищали при помощи колоночной хроматографии, как было описано выше, и повторно очищали с использованием ТСХ. Исследовали широкие зоны с Rf 0,2-0,26 и 0,63-0,77, содержащие дигалактозилдиацилгрицерины (ДГДГ) и моногалактозилдиацилглицерины (МГДГ), соответственно. Из силикагеля пластинок липиды элюировали метанолом. УФ спектры ДГДГ и МГДГ записывали с использованием спектрофотометра Cary 50 Bio.

Количество ЭДЭ (галактолипид-связанной (5Z)-этероленовой кислоты) оценивалось по поглощению 267 нм.

1.11 Инфицирование растений льна фитопатогенной бактерией Pectobacterium atrosepticum Клетки P. atrosepticum SCRI1043 культивировали на среде LB [Bell et al., 2004].

Титр культуры 2х109 КОЕ/мл. Суспензию бактериальных клеток вводили инъекцией в стебель льна (по 10 мкл на стебель) на высоте 6 см от земли. Контрольным растениям вводили питательную среду. Листья собирали через 4 и 24 часа после инфицирования и фиксировали жидким азотом.

1.12 Влияние метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты и (2Е) гексеналя на прорастание семян льна Семена льна стерилизовали 0,05% раствором марганцевокислого калия (30 мин), промывали дистиллированной водой и проращивали в темноте при 230С. Для определения ростовой функции семена проращивали на растворах (5Z)-этероленовой кислоты и (2Е)-гексеналя в концентрациях 1 нМ и 1мкМ в течение 20 часов (оптимального интервала времени для регистрации проклюнувшихся семян). Семена льна проращивали в стерильных чашках Петри по сто семян в каждой. Каждый вариант опыта состоял из трех аналитических повторностей. О прорастании семян судили по проклевыванию. Используемые оксилипины растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) [Takeda et al., 1998]. В контроль добавляли равное опытному варианту количество растворителя.

1.13 Выделение гексеналя листьями льна Для детектирования выделения гексеналя листьями льна навеску листьев поместили в грушевидную делительную воронку, расположенную горизонтально. С одной стороны через плотно пришлифованную пробку с отводом в течение 20 минут подавали поток воздуха, с другой стороны все летучие соединения выводились в предварительно подготовленный NH2-картридж, на который был нанесен 0,2 мM О (2,3,4,5,6-пентафторбензил)-гидроксиламин (ПФБ). Затем продукты взаимодействия летучих соединений с ПФБ элюировали с картриджа метанолом, экстрагировали гексаном и анализировали при помощи ГХМС.

1.14 Спектральные исследования УФ-спектры выделенных продуктов записывали на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 25. Также, УФ-спектры оксилипинов записывали с использованием детектора с диодной матрицей SPD-M20A (Shimadzu) в режиме реального времени в ходе разделения на ВЭЖХ. Анализы методом ГХМС проводили при помощи масс спектрометра Shimadzu QP5050A, соединенного с газовым хроматографом Shimadzu Масс-спектры высокого разрешения очищенных галактолипидов GC-17A.

регистрировали с использованием масс-спектрометра Bruker microTOF-Q с ионизацией в электроспрее (ESI-MS). Спектры 1H ЯМР и 2D–COSY очищенных соединений записывали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance 400, 400 MHz, в растворителе CD3CN при температуре 296 K.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1 Изучение направленности метаболизма линолевой кислоты в листьях льна Для предварительного исследования липоксигеназного пути, проводили инкубацию супернатанта гомогената листьев льна с линолевой кислотой [Chechetkin et al., 2008]. Продукты инкубации подвергали метилированию, восстановлению водородом и силанизации. ГХМС анализ дериватизированных продуктов показал, что Рис.1. Продукты взаимодействия ДЭС льна с Рис.2. ГХМС анализ оксилипинов, выделенных линолевой кислотой, ее 13-гидроперекисью и после инкубации 13-ГПОД с супернатантом аналогом -линоленовой кислоты – 3-окса-- гомогената листьев льна. (a) Хроматограмма по линоленовой кислотой полному ионному току;

(б), (в), (г) – масс-спектры и схемы фрагментаций соединенй 1а, 4 и 2а, соответственно преобладающей гидроксикислотой была 13-гидроксистеариновая кислота. Это говорит о том, что основным продуктом липоксигеназного окисления была 13-гидроперекись линолевой кислоты (13-ГПОД). Таким образом, в листьях льна преобладает 13 липоксигеназная активность. Наряду с гидроперекисями жирных кислот, в ходе ГХМС анализа выделенных оксилипинов обнаружены соединения 1а, 2а и 3а (Рис.1).

Для дальнейшего изучения путей метаболизма проводили инкубацию 13-ГПОД с супернатантом гомогената листьев льна. В результате ГХМС анализа триметилсилильных метиловых эфиров продуктов инкубации обнаружены оксилипины 1а, 2а и 3а.

2.2 Идентификация соединения Соединение 1а (Рис.2а) являлось основным продуктом превращения линолевой кислоты in vitro. Для изучения его структуры регистрировали масс-спектр электронного удара. Картина масс-спектрометрической фрагментации продукта 1а (Рис.2б) оказалась идентична описанным ранее фрагментациям дивиниловых эфиров (9Z,11E,1’E)-12-(1’ гексенилокси)-9,11-додекадиеновой (этеролевой) [Grechkin et al., 1997] и (5Z) этеролевой кислот [Hamberg,1998].

Каталитическое восстановление водородом соединения 1а привело к образованию продукта 4 с характеристической фрагментацией (Рис. 2в). Эти данные позволили идентифицировать соединение 4 как 13-окса-нонадекановую кислоту.

Очищенное соединение 1а обладает специфическим поглощением в УФ диапазоне с максимумом при 250 нм, что характерно для этеролевой кислоты [Grechkin et al., 1995;

Hamberg;

1998]. Для окончательной идентификации и определения геометрии двойных связей продукта 1а регистрировали спектры 1H-ЯМР и 2D–COSY.

Данные демонстрируют, что в структуре присутствуют три двойные связи с конфигурацией (1Z,3E,1’Z). Значение константы спин-спинового взаимодействия (6 Гц) показывает, что 1’-двойная связь имеет цис-конфигурацию. На основе полученных данных сделан вывод, что соединение 1 является (9Z,11E,1’Z)-12-(1’-гексенилокси)-9,11 додекадиеновой, то есть (5Z)-этеролевой кислотой.

2.3 Идентификация соединения Соединение 2 поглощает в УФ-диапазоне с максимумом при 267 нм. Масс спектр электронного удара метилового эфира продукта 2 показал молекулярный ион с m/z 306 (Рис.2г) и картину фрагментации, схожую с фрагментацией метиловых эфиров этероленовой [Grechkin et al., 1997] и (5Z)-этероленовой кислот [Hamberg, 1998].

Каталитическое восстановление соединения 2а привело к образованию уже описанной выше 13-окса-нонадекановой кислоты. Таким образом, исходя из разницы масс молекулярных ионов соединений 4 и 2а, сделан вывод, что последнее имеет четыре двойные связи. Их положение и геометрию устанавливали на основании спектров 1H ЯМР и 2D-COSY (Рис.3d). На основании полученных данных сделан вывод, что соединение 2 является (9Z,11E,1’Z,3’Z)-12-(1’,3’-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой, то есть (5Z)-этероленовой, кислотой. Для дальнейшего подтверждения активности ДЭС in vitro и биосинтеза (5Z)-этероленовой кислоты в листьях льна провели инкубацию гомогената листьев льна с 13-гидроперекисью 3-окса--линоленовой кислоты. 3-Окса--линоленовая кислота – это недавно синтезированный и охарактеризованный аналог -линоленовой кислоты, используемый в качестве метки для изучения биосинтеза оксилипинов.

Рис.3. Анализ оксилипинов, выделенных после инкубации 3-окса-13-ГПОТ с супернатантом 15000 g гомогената листьев льна. (a) Хроматограммы продуктов по полному ионному току;

(б), (в) – масс-спектры и схемы фрагментации соединений 5а и 7, соответственно;

(г) данные H ЯМР для соединения 2а (400 MHz, CD3CN, 298 K) Провели инкубацию супернатанта гомогената с 3-окса-13-ГПОТ. Анализ метиловых эфиров продуктов инкубации методом ГХМС позволил обнаружить (наряду с эндогенным метиловым эфиром (5Z)-этероленовой кислоты) присутствие новых продуктов 5 и 6 в виде их метиловых эфиров 5а и 6а (Рис.3). По данным масс-спектра электронного удара соединения 5а предложена схема его фрагментации, изображенная на Рис.3b. Каталитическое восстановление соединения 5а привело к образованию продукта 7, по масс-спектрометрической фрагментации которого установили, что это кислота. Полученные результаты подтверждают 3,13-диокса-нонадекановая идентификацию соединения 5 как 3-окса-(5Z)-этероленовую кислоту.

Эксперимент с 3-окса-13-ГПОТ подтверждает присутствие активности ДЭС и эндогенной (5Z)-этероленовой кислоты в листьях льна. Сравнение хроматограмм по полному ионному току показало, что содержание эндогенной (5Z)-этероленовой кислоты в листьях достигает 10% от общего количества свободных жирных кислот.

2.4 Идентификация соединения Масс-спектр метилового эфира соединения 3 выявил характеристическую картину фрагментации, идентичную описанной для метилового эфира цис-12-оксо 10,15-фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) [Hamberg, 1998]. Каталитическое восстановление над платиной привело к образованию соединения 8. Его масс фрагментация (Рис. 4в) свидетельствовала о том, что соединение 8 представляет собой 12-оксо-фитоновую кислоту – полностью восстановленный аналог 12-оксо-ФДК. Таким образом, полученные данные показали, что соединение 3а является метиловым эфиром цис-12-оксо-ФДК.

Рис.4. Масс-спектры и схемы фрагментации для соединений 3а (а);

6a (б);

8 (в) и 9 (г). Соединения 8 и 9 являются продуктами каталитического восстановления соединений 3а и 6а, соответственно В результате инкубации супернатанта гомогената листьев льна с 3-окса-13-ГПОТ наряду с соединением 3 и дивиниловыми эфирами образовался продукт 6, масс-спектр метилового эфира которого и схема фрагментации представлены на Рис. 4.

Полученные данные позволили установить, что соединение 6 является 3-окса-12 оксо-ФДК, то есть производным 12-оксо-ФДК, полученным в результате ферментативного превращения 3-окса-13-ГПОТ. Каталитическое восстановление соединения 6а привело к образованию соединения 9, масс-спектр и схема фрагментации которого позволили идентифицировать вещество как 3-окса-12-оксо-фитоновую кислоту. Полученные данные показывают, что добавленная экзогенно 3-окса-13-ГПОТ послужила предшественником циклопентенона 6, 3-окса-12-оксо-ФДК.

2.5 Биосинтез оксилипинов in vitro в гомогенате корней льна Проводили инкубацию супернатанта гомогената корней льна с линолевой кислотой. ГХМС анализ триметилсилильных производных метиловых эфиров продуктов инкубации показал присутствие -кетола как основного продукта и небольшое количество метилового эфира 12-оксо-ФДК. По характеристической картине фрагментации -кетола установлена его структура – (9Z)-12-оксо-13-гидрокси-9 октадеценовая кислота. Дивиниловые эфиры в корнях не обнаружены.

2.6 Изучение состава липидного экстракта листьев льна Липидный экстракт листьев 35-дневных растений льна разделяли на классы при помощи колоночной хроматографии на силикагеле: нейтральные липиды, галактолипиды, фосфолипиды [Chechetkin et al., 2009]. УФ-спектр фосфолипидной фракции не показал присутствия этерифицированных 12-оксо-ФДК (max 221 нм) и (5Z)-этероленовой кислоты (max 267 нм).

Моногалактозилдиацилглицерин (МГДГ) и дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ) выделены из галактолипидной фракции при помощи микропрепаративной тонкослойной хроматографии. УФ-спектр как МГДГ, так и ДГДГ показал сильное поглощение при нм и отсутствие поглощения с максимумом 221 нм, что позволило предположить присутствие дивинилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты, связанной с галактолипидами.

Для проверки этой гипотезы, разделяли молекулярные виды галактолипидов при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя запись УФ-спектра в режиме реального времени с помощью диодно-матричного детектора. В галактолипидной фракции, выделенной из неинфицированных листьев льна, наблюдался только один молекулярный вид, поглощающий при 267 нм. Инфицирование растений клетками фитопатогенной бактерии Pectobacterium atrosepticum привело к изменению галактолипидного профиля.

Через 4 часа после инфицирования в липидном профиле появились два Рис.5. ОФ-ВЭЖХ профиль молекулярных видов новых молекулярных вида галактолипидов листьев льна. А) неинфицированное галактолипидов, а через 24 часа растение, В) инфицированное растение (через 4 часа после инфицирования), С) инфицированное растение наблюдались более значительные изменения. В частности отмечалась (через 24 часа после инфицирования) депигментация листьев. Кроме того, наряду с молекулярными видами 10 и 11, наблюдали появление соединений 12 и 13. Все упомянутые продукты обладали сильным поглощением в УФ-диапазоне с максимумом 267 нм, что свидетельствовало об обнаружении этерифицированных дивиниловых эфиров (Рис.5).

Ни в инфицированных растениях, ни в контрольных не наблюдалось присутствие молекулярных видов галактолипидов с максимумом поглощения 221 нм. Это говорит об отсутствии арабидопсидов или схожих галактолипидов, содержащих этерифицированную 12-оксо-ФДК. ГХМС анализ метиловых эфиров жирных кислот, полученных в результате переэтерификации галактолипидов, не показал присутствия 12-оксо-ФДК. Подробнее инфицирование растений льна клетками Pectobacterium atrosepticum рассматривается в главе 2.13.

Для дальнейшего установления структуры при помощи обращено-фазовой ВЭЖХ выделяли соединения 10, 11, 12 и 13 и очищали с использованием нормально-фазовой ВЭЖХ.

2.7 Идентификация соединения 10, линолипина А УФ-спектр очищенного соединения 10 показал поглощение с максимумом при 267нм и был идентичен вышеописанному дивиниловому эфиру (5Z)-этероленовой кислоте [Hamberg, 1998].

В результате ГМХС анализа метиловых эфиров жирных кислот – полученных переэтерификацией соединения 10 – были выявлены метиловые эфиры -линоленовой и (5Z)-этероленовой кислот. Чтобы подтвердить структуру (5Z)-этероленовой кислоты, мы изучили ее масс-спектр. По данным масс-спектрометрии электронного удара, спектр метилового эфира продукта переэтерификации соединения 10 идентичен спектру ранее описанного метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты. Кроме того, по данным ГХМС анализа, каталитически восстановленные метиловые эфиры жирных кислот после переэтерификации представляли собой метилстеарат и метиловый эфир 13-окса нонадекановой кислоты. Образование последнего соединения указывает на присутствие (5Z)-этероленовой кислоты среди продуктов переэтерификации.

Рис.7. Область низких полей спектра 1H ЯМР Рис.6. Данные масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электроспреем и MS MS линолипинов. Частичный спектр для а) для соединения 10. а) Схема фрагментации иона линолипина А и б) линолипина В. Сигналы [M–H]-, m/z 787,4909 в режиме отрицательных выше 5,25 м.д. принадлежат олефиновым ионов и MS MS;

б) полный ESI-масс-спектр протонам, а ниже 5,25 м.д. – протонам соединения 10 в режиме отрицательных ионов;

в) глицеринового и галактозильного остатков.

спектр MS/MS от иона m/z с 787,4909 Отнесение всех сигналов было установлено по данным 2D-COSY Масс-спектр соединения 10 с ионизацией в электроспрее в режиме отрицательных ионов (Рис.6) дал квазимолекулярный ион [M–H]- с m/z 787,4909 (C45H71O11) и аддукт [M+CH3COO]- с m/z 847,5229 (C47H75O13). MS/MS спектр от иона с m/z 787,4909 показал ионы с m/z 291,1954 (C18H27O3, анион (5Z)-этероленовой кислоты) и с m/z 277, (C18H29O2, анион -линоленовой кислоты). В результате съемки в режиме положительных ионов был обнаружен ион [M+NH4]+ с m/z 806,5418 (C45H76O11N).

MS/MS от иона с m/z 806,5418 привела к образованию характеристического фрагмента с m/z 529,3287 (C27H47O9N, потеря остатка -линоленовой кислоты).

В результате обработки данных МС и ЯМР (Рис.7а) установлено, что соединение представляет собой моногалактозилдиацилглицерин (МГДГ) с брутто-формулой C45H72O11, содержащий один остаток -линоленовой кислоты и один – (5Z) этероленовой. Однако, ни данные МС, ни ЯМР не позволяют установить точное положение остатков -линоленовой и (5Z)-этероленовой кислот в молекуле глицерина.

С тем, чтобы уточнить их расположение, проводили региоспецифичный гидролиз с использованием sn-1-специфичной липазы Rhizopus arrhizus. По данным ГХМС анализа, в результате действия липазы отщеплялась только -линоленовая кислота. В то же время, при обработке соединения 10 неспецифичной липазой Mucor javanicus высвобождались обе жирные кислоты, и -линоленовая, и (5Z)-этероленовая.

Полученные данные демонстрируют, что остатки -линоленовой и (5Z)-этероленовой кислот этерифицированы в положениях sn-1 и sn-2, соотвественно. Полученные для соединения 10 результаты, показывают, что вещество представляет собой 1-O- линоленоил-2-O-(5Z)-этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин. Это первый представитель нового семейства сложных оксилипинов – галактолипидов, содержащих этерифицированные дивиниловые эфиры. Нами предложено тривиальное название линолипин А для соединения 10 и общее название линолипины для этого нового семейства сложных оксилипинов.

2.8 Идентификация соединения 12, линолипина В Соединение 12 имело спектр УФ поглощения, идентичный спектру соединения 10. Однако, в отличие от линолипина А, в результате переэтерификации соединения 12, наблюдался только один продукт, а именно метиловый эфир (5Z) этероленовой кислоты. Его идентификация подтверждена образованием 13-окса-нонадекановой кислоты в результате каталического восстановления продукта Рис.8. Данные масс-спектрометрии высокого переэтерификации. Масс-спектр разрешения с ионизацией в электроспрее и MS/MS для соединения 12. а) Схема фрагментации иона [M– соединения 12 (электроспрей) в режиме H]-, m/z 801,4765 в режиме отрицательных ионов и MS отрицательных ионов (Рис.8) дал MS;

б) полный ESI-масс-спектр соединения 12 в квазимолекулярный ион [M–H]- с m/z режиме отрицательных ионов;

в) спектр MS/MS от 801,4765 (C45H69O12) и ион аддукта иона m/z с 801, [M+CH3COO]- с m/z 861, (C47H73O14). В режиме MS/MS квазимолекулярный ион m/z 801,4765 диссоциировал с образованием иона при m/z 291,1951 (C18H27O3, анион (5Z)-этероленовой кислоты).

При съемке в режиме положительных ионов наблюдался ион [M+NH4]+ с m/z 820, (C45H76O11N). По результатам полученных данных масс-спектрометрии высокого разрешения, а также данных MS и MS/MS, соединение 12 представляет собой моногалактозилдиацилглицерин с брутто-формулой C45H70O12, в структуре которого содержится два остатка (5Z)-этероленовой кислоты.

Данные 1H ЯМР и 2D-COSY для соединения 12 оказались весьма схожими с таковыми для линолипина А (Рис.7б). Во-первых, в спектре присутствовали идентичные сигналы глицерина и -D-галактопиранозильного остатка. Во-вторых, присутствовали те же восемь сигналов олефиновых протонов остатка (5Z)-этероленовой кислоты в области 5,25 – 5,80 м.д. Однако, наблюдались значительные отличия. В частности, в спектре соединения 12 отсутствовал мультиплетный сигнал олефиновых протонов линоленовой кислоты. Это указывает на отсутствие -линолената в составе соединения 12, что полностью согласуется с данными MS и MS/MS. Кроме того, интегральная интенсивность олефиновых сигналов в спектре соединения 12 вдвое выше интенсивности сигналов тех же протонов соединения 10. Это говорит о том, что соединение 12 содержит два остатка (5Z)-этероленовой кислоты этерифицированных в положениях sn-1 и sn-2 остатка глицерина.

По результатам полученных данных установлено, что соединение 12 представляет собой МГДГ, содержащий два остатка (5Z)-этероленовой кислоты, то есть 1,2-ди-O (5Z)-этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин. Мы предложили для этого соединения тривиальное название линолипин В.

2.9 Идентификация соединения 11, линолипина С Как и первые два линолипина, соединение 11 поглощает в УФ-диапазоне с max 267 нм. ГХМС анализ метиловых эфиров продуктов переэтерификации показал наличие в структуре соединения 11 и -линоленовой, и (5Z)- этероленовой кислот.

Масс-спектр соединения 11 с ионизацией в электроспрее в режиме положительных ионов показал пик аддукта молекулярного иона с аммонием (Рис.9) [M+NH4]+ с m/z 968,6018 (C51H86O16N). По данным 1Н ЯМР и 2D-COSY это соединение сходно с линолипином А и имеет идентичные сигналы протонов -линоленовой и (5Z) этероленовой кислот, однако дополнительные сигналы протонов в области от 2,8 до 4, м.д. говорят о наличии второго остатка галактозы в молекуле линолипина.

На рис.10 приведены спектры 1H ЯМР линолипинов А и С. Хорошо виден характерный пик сигнала протона при первом атоме углерода второго остатка галактозы H1'''''(4,84 м.д.). Сигналы остальных протонов, относящиеся ко второму остатку галактозы, перекрываются с сигналами протонов глицерина и первого остатка галактозы. Благодаря отнесению кросс-пиков спектра 2D-COSY и данных одномерного ЯМР удалось расшифровать этот фрагмент спектра. Пики протонов жирнокислотной части соединения 11 идентичны аналогичным пикам линолипина А.

Таким образом, исследуемое соединение представляет собой дигалактозилдиацилглицерин, у которого один заместитель – -линоленовая кислота, а другой – (5Z)-этероленовая. Для того чтобы установить положение заместителей в молекуле глицерина, проводился ферментативный гидролиз соединения 11 sn- специфичной липазой Rhizopus arrhizus. В результате ГХМС анализа метиловых эфиров масс-спектрометрии Рис.10. Спектры 1H ЯМР линолипинов А (сверху) и С Рис.9. Данные высокого разрешения с ионизацией в (снизу) электроспрее для соединения жирных кислот – продуктов гидролиза – установлено, что из sn-1 положения гидролизуется (5Z)-этероленовая кислота. Таким образом, соединение 11 представляет собой 1-O-(5Z)-этероленоил-2-O--линоленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn глицерин.

2.9 Идентификация содинения 13, линолипина D Соединение 13, как и три предыдущих, показало в УФ-спектре максимум поглощения при 267нм. ESI масс-спектр соединения 13 дал аддукт [M+NH4]+ с m/z 982,6. По данным масс спектрометрии высокого разрешения (Рис.11) точная масса иона [M+NH4]+ составила 982,6763, что соответствует брутто-формуле C51H84O17N. Таким образом, молекулярный ион соединения Рис.11. Данные масс-спектрометрии высокого 13 имеет брутто-формулу C51H80O17.

разрешения с ионизацией в электроспрее для Олефиновая часть 1Н ЯМР спектра соединения соединения 13 (Рис. 12) подобна той же области спектра ЯМР для линолипина В. Интенсивность сигналов протонов (5Z)-этероленовой, а также отсутствие сигналов -линоленовой кислот в области спектра, характерной для олефинов, указывает на присутствие двух остатков (5Z) этероленовой кислоты. Часть спектра, характерная для сигналов протонов галактозы, Рис.12. 1Н ЯМР спектр соединения показывает, что в структуре соединения 13 присутствует два остатка галактозы. В частности, четко виден пик сигнала протона при первом атоме углерода второго остатка галактозы 4,83 м.д. Идентификация сигналов протонов подтверждается данными спектра 2D-COSY. Таким образом, соединение 13 представляет собой дигалактозилдиацилглицерин, содержащий два остатка (5Z)-этероленовой кислоты, то есть 1,2-ди-O-(5Z)-этероленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn-глицерин.

2.10 Изменение галактолипидного профиля в результате повреждения листьев льна однократным циклом замораживания–оттаивания По данным литературы [Andersson et al., 2006], образование новых сложных оксилипинов, ацилированных по галактозе, происходит в ответ на реакцию сверхчувствительности, вызванной распознаванием микробного avr-белков происхождения. При этом авторы отмечали, что в их биосинтезе принимает участие фермент МГДГ-ацилтрансфераза. Ранее считалось, что этот фермент не имеет физиологического значения, поскольку он активируется при нефизиологических условиях, такие как низкий pH и незабуференная система. В нашем случае быстрое замораживание в жидком азоте с последующим оттаиванием в течение 30 минут при температуре 23°С позволяет моделировать процесс клеточного повреждения Рис.13. Галактолипидный профиль экстракта листьев Рис.14. Масс-спектры высокого разрешения льна после однократного цикла замораживания- соединений 14 (а), 15 (б) и 16 (в). R1, R2, R3 – оттаивания остатки -линоленовой или (5Z) этероленовой кислот.

[Angersbach et al., 2002]. Проведенный нами ВЭЖХ анализ показал, что в результате повреждения листьев льна в этих условиях происходит как образование уже описанных линолипинов A, B, C и D, так и появление в галактолипидном профиле новых, менее полярных соединений 14, 15 и 16 (Рис.13).

Все эти соединения имеют максимум поглощения в УФ-диапазоне при 267 нм, что говорит о присутствии, по крайней мере, одного остатка (5Z)-этероленовой кислоты в их структуре. При помощи масс-спектрометрии высокого разрешения (Рис.14) установлены точные массы этих соединений. На основании данных хроматографии, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии выдвинуто предположение, что соединения 14, 15 и 16 являются ацилированными по галактозе моногалактозилдиацилглицеринами, имеющими в своей структуре три, два и один остатка (5Z)-этероленовой кислоты, соответственно.

2.11 Возрастная зависимость содержания линолипинов в листьях льна До сих пор малоизученным остается вопрос о физиологической роли сложных оксилипинов, особенно их участие в онтогенезе.

Мы изучили содержание линолипинов в листьях льна на различных стадиях развития растения (Рис.15).

В молодых листьях льна (14- и 23 дневных) не наблюдалось присутствие этерифицированных дивиниловых эфиров.

Рис.15. Содержание линолипинов в листьях льна. Содержание ЭДЭ оценивалось по Однако, линолипины были обнаружены в УФ-поглощению фракций МГДГ и ДГДГ с листьях льна на более поздних стадиях max 267 нм онтогенеза, включая период быстрого роста ( дней), бутонизацию (63 дня) и цветение (76 дней). Содержание этерифицированных дивиниловых эфиров (ЭДЭ) в листьях на этих стадиях развития растений составляло 50 71 нмоль на грамм сырого веса.

Отсутствие ЭДЭ в молодых листьях согласуется с отсутствием свободной (5Z) этероленовой кислоты. В связи с этой зависимостью содержания ЭДЭ и активности ДЭС нам представлялось интересным изучить влияние метилового эфира (5Z) этероленовой кислоты и (2E)-гексеналя (продукт деградации (5Z)-этероленовой кислоты) на прорастание семян льна.

2.12 Влияние метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты и (2E) гексеналя на прорастание семян льна Степень прорастания семян, замоченных на 20 часов в присутствии метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты (1нМ и 1мкМ), уменьшалась вдвое по сравнению с контролем (Рис.16). (2Е)-гексеналь (1нМ и 1мкМ) вызывал 49 и 100% ингибирование прорастания семян, соответственно. Эффекты ингибирования были статистически достоверными (Р 0.05). Таким образом, взаимосвязь между онтогенезом и содержанием линолипинов представляется неслучайной.

2.13 Влияние инфицирования на содержание линолипинов По данным литературы известно, что уровень содержания арабидопсидов увеличивается при инфицировании или поранении растения [Andesson et al., 2006]. Это побудило нас исследовать влияние инфицирования на содержание линолипинов в листьях льна. Показано, что инфицирование растений льна бактерией Pectobacterium atrosepticum индуцирует накопление ЭДЭ в листьях.

Рис.16. Процент прорастания семян льна в Рис.17. Влияние инфицирования растений льна зависимости от воздействия (5Z)-этероленовой бактерией на содержание P. atrosepticum кислоты и (2Е)-гексеналя. линолипинов в листьях. Черные столбцы – инфицированные растения;

белые столбцы контрольные (необработанные) растения;

светло серые столбцы – второй контроль – растения, которым ввели питательную среду.

Через четыре часа после инфицирования, уровень содержания ДГДГ и МГДГ увеличился в 3 и 5,5 раз, соответственно. Через 24 часа после инфицирования содержание ЭДЭ значительно выросло (Рис.17), свыше 800 нмоль на грамм сырого веса.

Накопление линолипинов достоверно (Р0,01) в отношении двух контролей: а) необработанных растений и б) растений, которым введена среда, не содержащая бактериальные клетки. (Рис.17).

2.14 Деградация (5Z)- этероленовой кислоты и линолипинов Ранее было показано, что дивиниловые эфиры неустойчивы в кислотной области рН (Galliard et al., 1974). Нами проведён сравнительный анализ степени распада при рН 5,5 линолипинов А и В, (5Z)-этероленовой кислоты и ее метилового эфира.

Степень деградации оценивалась при помощи спектрофотометрии при 267 нм, что соответствует максимуму поглощению (5Z)-этероленовой кислоты. Показано, что этерификация карбоксильной группы стабилизирует (5Z)-этероленовую кислоту.

Исходя из этих соображений, можно предположить, что линолипины более стабильны, чем (5Z)-этероленовая кислота. Однако показано, что линолипин А за 7 минут распадается примерно на 45%, а линолипин В на 80% (Рис.18).

Таким образом, можно предположить, что стерическая загруженность окружения (5Z) этероленовой кислоты оказывает влияние на стабильность соединения. Установление точного механизма деградации требует проведения дальнейших исследований.

На основании полученных Рис.18. Деградация линолипинов А и В, (5Z) этероленовой кислоты и ее метилого эфира при рН 5,5 данных предложена гипотетическая схема катаболизма линолипинов (Рис.19). Мы предполагаем два варианта катаболизма линолипинов в живом растении: во-первых, ферментативное отщепление (5Z)-этероленовой кислоты, выступающей в роли антипатогена;

во вторых, спонтанный гидролиз распад этерифицированной (5Z)-этероленовой кислоты с образованием (2Е)-гексеналя и этерифицированного остатка травматина.

Рис.19. Гипотетическая схема катаболизма линолипинов на примере линолипина А Таким образом, в результате деградации по второму пути образуется сразу два физиологически активных агента – (2Е)-гексеналь и этерифицированный травматин. В пользу последнего предположения говорит то, что в отсутствие гидропероксидлиазной активности мы установили выделение гексеналя листьями льна. Кроме того, по спектру Н ЯМР продуктов деградации линолипина D можно сказать, что в результате катаболизма линолипинов происходит отщепление С6 фрагмента от остатка (5Z) этероленовой кислоты. На рис.20 видно, что в результате деградации линолипина D полностью исчезают сигналы протонов H1’’’, H2’’’, H3’’’, H4’’’.

В пользу нашей гипотезы катаболизма линолипинов также свидетельствует исчезновение сигнала протона у двенадцатого атома углерода (5Z)-этероленовой кислоты (H12’’). Это наблюдение может быть объяснено гидролизом простой эфирной связи дивинилового эфира с образованием альдокислоты (травматина), по прежнему связанной с глицерином МГДГ и освобождением гексеналя.

Рис.20. Спектр 1H ЯМР линолипина D (сверху) и продуктов его деградации (снизу) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые обнаружен метаболический путь, контролируемый 13-липоксигеназой и дивинилэфирсинтазой, в листьях льна. Основным продуктом нового пути является дивиниловый эфир (5Z)-этероленовая кислота. Кроме того, в составе сложных липидов была выявлена этерифицированная (5Z)-этероленовая кислота. Обнаружена новая группа сложных оксилипинов – моно- или дигалактозилдиацилглицеринов, содержащих один или два остатка (5Z)-этероленовой кислоты. Для этих соединений предложено тривиальное название линолипины. Нами полностью охарактеризованы четыре представителя этой группы сложных оксилипинов – линолипины A, B, C и D.

Содержание линолипинов в листьях льна зависит от возраста растения.

Линолипины накапливаются только во взрослых растениях, но не в проростках.

Следовательно, их биосинтез и превращение зависит от онтогенеза. Наши данные показывают, что (5Z)-этероленовая кислота ингибирует прорастание семян льна и развитие корня.

Наблюдалось образование трех новых, не описанных ранее, соединений при повреждении листьев льна однократным циклом замораживания-оттаивания. На основании данных хроматографии, УФ-спетроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения выдвинуто предположение, что эти соединения представляют собой моногалактозилтриацилглицерины, у которых один из жирнокислотных остатков имеет сложноэфирную связь с остатком галактозы.

Уровень линолипинов в листьях льна значительно увеличивается при инфицировании бактерией Pectobacterium atrosepticum. Эти данные показывают, что накопление этерифицированных оксилипинов (линолипинов) может представлять новый тип стратегии защиты растений. У льна обнаружена специфическая стратегия:

дивинилэфирсинтаза экспрессируется конститутивно, но биосинтез линолипинов стимулируется в ответ на инфицирование. Накопление отдельных линолипинов, таких как линолипины В, C и D в ответ на инфицирование особенно велико. Механизм действия линолипинов остается неустановленным. Нами предложена гипотетическая схема катаболизма линолипинов – распад этерифицированной (5Z)-этероленовой кислоты с образованием этерифицированной альдокислоты (травматина) и (2Е) гексеналя. Таким образом, в отсутствие гидропероксидлиазной активности линолипины могут служить предшественниками продуктов действия гидропероксидлиазы.

Полученные в нашей работе результаты расширяют современное понимание липоксигеназного пути в растениях, а также открывают новые возможности в изучении роли сложных оксилипинов в жизни растений.

ВЫВОДЫ Установлено, что окислительный метаболизм полиеновых жирных кислот в 1.

листьях льна контролируется 13-липоксигеназой. Первичными продуктами являются 13(S)-гидроперекиси –линоленовой и линолевой кислот.

Превращения гидроперекисей жирных кислот в листьях льна происходят по двум 2.

преобладающим направлениям. Одно контролируется алленоксидсинтазой и алленоксидциклазой, другое – дивинилэфирсинтазой.

Циклопентенон (15Z)-12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота и дивиниловый эфир 3.

(5Z)-этероленовая кислота являются основными оксилипинами листьев льна.

Впервые выделены, очищены и охарактеризованы четыре представителя новой 4.

группы сложных липидов, для которой предложено тривиальное название линолипины. Установлена структура линолипинов: 1-O--линоленоил-2-O-(5Z) этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин (линолипин А), 1,2-ди-O (5Z)-этероленоил-3-O--D-галактопиранозил-sn-глицерин (линолипин В), 1-O этероленоил-2-O-(5Z)--линоленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn-глицерин (линолипин С) и 1,2-ди-O-(5Z)-этероленоил-3-O--D-дигалактопиранозил-sn глицерин (линолипин D).

В ответ на инфицирование растений льна фитопатогенной бактерией 5.

Pectobacterium atrosepricum происходит биосинтез новых линолипинов (линолипины В, С и D) и резкое увеличения общего уровня содержания линолипинов.

Установлено, что на разных стадиях онтогенеза содержание ЭДЭ в листьях льна 6.

неодинаково. У молодых растений льна (14- и 23-дневных) отсутствует липид связанная (5Z)-этероленовая кислота, в то время как на более поздних этапах развития растения (35, 63 и 76 дней) уровень содержания линолипинов весьма высок.

Обнаружено три новых галактолипида, содержащих остатки (5Z)-этероленовой 7.

кислоты. Эти галактолипиды образуются в результате повреждения листьев льна однократным циклом замораживания-оттаивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК 1. A lipoxygenase-divinyl ether synthase pathway in flax (Linum usitatissimum L.) leaves / Chechetkin I.R., Blufard A., Hamberg M., Grechkin A.N. // Phytochemistry. – 2008. – Vol. 69, № 10. – P. 2008-2015.

2. Unprecedented pathogen-inducible complex oxylipins from flax: linolipins A and B. / Chechetkin I.R., Mukhitova F.K., Blufard A.S., Yarin A.Y., Antsygina L.L., Grechkin A.N. // FEBS J. – 2009. – Vol. 276, № 16. – P. 4463-4472.

Работы, опубликованные в материалах конференций Обнаружение активности дивинилэфирсинтазы в листьях льна / Чечеткин 3.

И.Р., Ярин А.Ю., Блуфард А.С., Гнездилов О.И., Гречкин А.Н. // Сб. трудов / Изд. Арта. - Новосибирск, 2008. – С. 407.

Обнаружение дивинилэфирсинтазной активности и новых оксилипинов в 4.

листьях льна (Linum usitatissimum) / Чечеткин И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К. Гнездилов О.И., Хамберг М., Гречкин А.Н. // Сб.

тезисов / Изд. КГУ. – Казань, 2008. – С. 67.

Масс-спектрометрия новых оксилипинов из листьев льна / Мухитова Ф.К., 5.

Блуфард А.С., Чечеткин И.Р., Гречкин А.Н. // Сб. тезисов / Изд. ВМСО. – Москва, 2009. – С. 77.

Биосинтез новых оксилипинов в растениях льна при патогенезе / Чечеткин 6.

И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К., Гречкин А.Н. // Сб. материалов / Изд. НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2009. – С. 519-521.

Листья льна – источник нового семейства сложных оксилипинов / Блуфард 7.

А.С., Чечеткин И.Р., Мухитова Ф.К., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Гречкин А.Н. // Сб. тезисов / Изд. Пущинского НЦ РАН. – Пущино, 2009. – С. 62.

8. Linolipins: a new family of complex oxylipins / Chechetkin I.R., Blufard A.S., Mukhitova F.K., Yarin A.Y., Antsygina L.L., Grechkin A.N. // Abstracts / Yokohama (Japan), 2009. – P. 62.

9. Linolipin biosynthesis as a new kind of plant defense strategy / Chechetkin I.R., Blufard A.S., Yarin A.Y., Antsygina L.L., Mukhitova F.K., Grechkin A.N. // Abstracts / Paris (France), 2010. – P. 15.

10. Структура и возможные функции линолипинов – новой группы сложных оксилипинов в листьях льна / Блуфард А.С., Чечеткин И.Р., Мухитова Ф.К., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Гречкин А.Н. // Тез. докл. / Изд. Казанского университета. Казань, 2010. – С. 14.

11. Новые метаболиты липоксигеназной сигнальной системы / Чечеткин И.Р., Блуфард А.С., Ярин А.Ю., Анцыгина Л.Л., Мухитова Ф.К., Гречкин А.Н. // Тез.

докл./ Изд. «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. – Казань, 2011. – С. 211-212.



 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.