Структурные основы регуляции метаболизма липопротеинов плазмы крови человека при нормо- и гипертриглицеридемии

На правах рукописи

Дергунов Александр Дмитриевич СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ 03.00.04 – биохимия и 03.00.02- биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Государственный научно исследовательский центр профилактической медицины" Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится "_" _ 2009 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственном учреждении "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального медико биологического агенства по адресу: 119435, Москва, улица Малая Пироговская, дом 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального медико-биологического агенства.

Автореферат разослан "_" _ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук М.А. Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Помимо известной связи увеличенного содержания холестерина плазмы с развитием атеросклероза и ишемической болезни сердца, роль увеличенного содержания триглицеридов (ТГ) как независимого фактора риска становится все более очевидной (Austin, 2000). Гипертриглицеридемия часто ассоциирована с пониженным содержанием холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (Chapman et al., 2004). В метаболизме ТГ-богатых липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) и ЛВП ключевое значение играют апобелки апоE (Brown, 2007) и апоA-I (Frank and Marcel, 2000) соответственно. Патофизиологическая и прогностическая значимость отдельного метаболического компартмента (про- или анти атерогенный эффект в развитии атеросклероза) тесно зависит от состояния сети метаболизма липопротеинов в целом. Действительно, существующая неопределенность оценки роли апоЕ связана с концентрационно-зависимыми эффектами промотирования клиренса ремнантов триглицерид-богатых частиц в области физиологических концентраций апобелка и индукции гипертриглицеридемии его большими концентрациями (Kypreos and Zannis, 2007).

Аналогично, хорошо известная атеропротективная роль ЛВП может сменяться их про атерогенной активностью в некоторых условиях (Florentin et al., 2008;

Kontush and Chapman, 2006;

Norata et al., 2006). Становится необходимым использование интегративного подхода в вычленении вкладов отдельных компартментов и относительной роли отдельных метаболических реакций (гидролиз триглицеридов и фосфолипидов липазами, генерация и транспорт эфиров холестерина, рецептор-опосредованный клиренс). Роль апобелков эффекторов этих реакций в пулированности компартмента может реализоваться на уровне структурной организации липидной фазы и апобелков, придавая частице и пластичность и устойчивость к изменению сети (Pownall and Ehnholm, 2006), например, через модулирование отношений апоA-I : апоA-II в случае ЛВП и апоЕ : апоC-III в случае триглицерид-богатых частиц. Особенно актуальна предположенная ассоциация апоЕ как белка с внутренне-неупорядоченной структурой с развитием ишемической болезни сердца (Cheng et al., 2006). Помимо этого, постулированная роль апоЕ в биогенезе и метаболизме ЛВП (Kypreos and Zannis, 2007) предполагает участие апобелка в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Связь физико-химических свойств липопротеинов, их апобелков и параметров отклика сети при различных метаболических состояниях является одной из основных проблем липопротеомики (Alonzi et al., 2008;

Brown, 2007).

Цель исследования Изучение роли структуры апобелков и липидной фазы в эффективности основных реакций транспорта липидов и метаболизма липопротеинов плазмы крови человека при нормо- и гипертриглицеридемии и системное построение метаболических цепей.

Задачи исследования 1. Изучить структуру и стабильность апобелков в растворе и липид-ассоциированном состоянии и роль индивидуальных доменов и частично-свернутых структур в связывании и обмене апобелков между липопротеинами.

2. Изучить особенности организации и динамики липидной фазы и связь с субстратными и лигандными свойствами липопротеинов разных классов.

3. Изучить влияние апобелков через белок-белковые и апобелок-липидные взаимодействия на эффективности гидролиза триглицеридов, генерации эфиров холестерина и связывания с ЛНП-рецептором.

4. Разработать и использовать метаболом-подобный подход для визуализации структурно детерминированных компартментов системы транспорта липидов.

5. Оценить связи между липид- и апоЕ-содержащими компартментами и роль апоЕ в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых липопротеинов и липопротеинов высокой плотности при нормо- и гипертриглицеридемии.

Основные защищаемые положения 1. Разработан и использован метаболом-подобный подход для анализа системы транспорта липидов с параллельной детекцией распределения апоЕ и аналога церамида между липопротеинами.

2. Меньшая стабильность и специфическое междоменное взаимодействие в молекуле апоЕ4 приводят к накоплению апоЕ4 в ЛОНП.

3. Радиальная гетерогенность динамики дипальмитоилфосфатидилхолина в реконструированных дискоидальных ЛВП с апоA-I, имевшаяся в бинарных комплексах при температурах ниже температуры фазового перехода Tt, присутствовала в тройных комплексах с холестерином при температурах выше и ниже Tt. В трех холестерин содержащих комплексах степень исключения холестерина из пограничного липида вблизи апобелка возрастала в ряду апоA-I апоE апоA-II.

Схожесть локализации и упаковки -спиралей в С-доменах молекул апоA-I и апоЕ 4.

приводит к схожей природе взаимодействий двух апобелков с фосфатидилхолином и в условиях дефицита апоA-I в дискоидальных пре-ЛВП апоЕ может играть заместительную роль в генерации эфиров холестерина.

5. АпоЕ является лигандом при взаимодействии ЛОНП с ЛНП-рецептором и эффективность взаимодействия возрастает при кластеризации нескольких молекул апобелка на поверхности частиц.

6. Белок-белковые взаимодействия в частицах ЛОНП возрастают при гипертриглицеридемии и апоC-III модулирует апоЕ-опосредованное взаимодействие частиц с ЛНП-рецептором.

7. С увеличением содержания триглицеридов плазмы конкуренция ЛОНП и ЛНП за ЛНП рецептор in vivo нарастает.

8. АпоC-II активировал, а апоC-III бесконкурентно ингибировал гидролиз триглицеридов липопротеинлипазой коровьего молока in vitro.

9. Активация печеночной липазы и ингибирование липопротеинлипазы, наиболее -частиц выраженные для апоЕ2, приводят к дефициту ЛВП при гипертриглицеридемии.

10. Эффективность клиренса триглицеридов плазмы реципрокно контролируется апоЕ и апоC-III. Сниженный клиренс триглицеридов плазмы у пациентов с апоЕ4 по сравнению с апоЕ3 и апоЕ2 ассоциирован со сниженным клиренсом ЛНП.

Научная новизна Обнаружены двухдоменная организация апоЕ3, апоЕ2 и апоЕ4 и сниженная стабильность апоЕ4. Выяснена природа накопления апоЕ4 в частицах ЛОНП и учтен вклад распределения апобелка между липопротеинами разных классов в соотношения путей катаболизма ЛОНП и ЛНП при нормо- и гипертриглицеридемии, различающиеся для трех изоформ. Ассоциация апоЕ4 с ишемической болезнью сердца может объясняться наибольшей внутренней неустойчивостью молекулы апоЕ4. Охарактеризованы пути влияния С-апобелков на рецептор- и липолиз-зависимые пути катаболизма триглицерид-богатых частиц. Выявлена саморегуляция липолитической деградации ЛОНП через изменение содержания эффекторных апобелков. Описаны молекулярные механизмы увеличенного связывания ЛОНП с ЛНП-рецептором и сниженной эффективности их липолитической деградации при гипертриглицеридемии, лежащие в основе атерогенного действия триглицерид-богатых частиц. Выявлен вклад физического состояния липидной фазы в динамику молекулы апоВ в ЛНП. Предположен и использован алгоритм системного анализа метаболических связей между индивидуальными липид- и апоЕ-содержащими компартментами и выявлены изоформ-специфичные ассоциации. Изучены молекулярная архитектура, динамика липидной фазы, локализация и структура апобелка в реконструированных частицах ЛВП дискоидальной формы, содержащих индивидуальные апобелки апоA-I, апоE и апоA-II и предположен вклад структурно-динамической неоднородности фосфолипида в обратный транспорт холестерина с участием пре-ЛВП.

Теоретическое и практическое значение Изученные механизмы вклада структуры липопротеинов и их апобелковых компонент в регуляцию метаболизма липопротеинов определяют феноменологию гипертриглицеридемии как независимого фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Эти механизмы определяют основы будущей генной и пептидной терапии дислипидемий при индукции специфичной экспрессии генов ферментов и апобелков-регуляторов, при использовании рекомбинантных апоA-I и апоЕ, их фрагментов и комплексов апобелка с фосфолипидом для увеличения эффективности обратного транспорта холестерина и сопряжения метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Обнаруженная липидная гетерогенность дискоидальных ЛВП будет определять стратегию поиска модуляторов физического состояния липидной фазы пре-ЛВП для увеличения сорбции холестерина частицами. Разработанный на основе капиллярного изотахофореза и набора метаболических правил метаболом-подобный подход можно использовать для экспресс-диагностики и поиска молекулярных мишеней при функциональном и структурном нарушениях метаболизма липопротеинов. Обнаруженный фенотип-чувствительный ответ баланса изменения содержания триглицеридов плазмы и холестерина ЛВП определяет эффективность терапии статинами с позиций фармакогеномики. Пути коррекции таких конформационно-чувствительных патологических состояний, ассоциированных с апоЕ4, как болезнь Альцгеймера и атеросклероз, могут включать влияние на различные стабильность и распределение изоформ апоЕ между липопротеинами.

Апробация работы Материалы работы представлены на 9 отечественных и 36 международных симпозиумах, в том числе на 5 и 6 симпозиумах по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987;

Санкт-Петербург, 1994);

III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);

международном биофизическом когрессе (Ванкувер, 1990);

Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Йорк, 1991;

Лутраки, 1993;

Сан-Лоренцо де Эль Эскориал, 1997;

Твенте, 1999);

конгрессах Европейского общества изучения атеросклероза (Ницца, 1992;

Иерусалим, 1993;

Зальцбург, 2002;

Хельсинки, 2007;

Стамбул, 2008);

международных симпозиумах по атеросклерозу (Монреаль, 1994;

Париж, 1997;

Хельсинки, 2000;

Киото, 2003;

Рим, 2006;

Бостон, 2009);

международных симпозиумах по препаратам, влияющим на метаболизм липидов (Хьюстон, 1995;

Флоренция, 1998;

Нью-Йорк, 2001;

Венеция, 2004;

Нью-Йорк, 2007). Результаты работы обсуждены на межлабораторном семинаре отдела изучения биохимических маркеров 24 марта 2009 года.

Публикации По включенным в диссертацию материалам опубликовано 46 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 389 страницах и состоит из введения, обзора литературы ( главы), экспериментальной части с описанием материалов и методов (4 главы), результатов исследования и их обсуждения (5 глав) и выводов. Работа включает 47 таблиц, 95 рисунков, 89 уравнений и схем. Список цитированной литературы включает 729 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СТРУКТУРА АПОБЕЛКА Е В РАСТВОРЕ Сворачивание апоЕ (смесь изоформ пула плазмы) в растворе Меченный флуоресцеином апоЕ характеризовался высоким значением анизотропии флуоресценции. Рассчитанное значение молекулярной массы, равное 91 кДа, существенно превышало известную величину 34 кДа. Равновесный процесс денатурации/ренатурации апоЕ/Ф при действии гуанидин-гидрохлорида (рис. 1) включал два перехода с точками перегиба при концентрациях 1 М и 2,5 М GuHCl, что свидетельствует о существовании стабильных промежуточных форм. При проведении обмена молекулами апобелка между существующими самоассоциированными формами или ренатурации белка регистрировали индуктивно-резонансный перенос энергии между донор- и акцептор-меченными молекулами апоЕ. При "сшивании" препарата апоЕ водо-растворимым бифункциональным реагентом образовывались промежуточные димерные и тримерные формы и конечный продукт тетрамер. Таким образом, апоЕ/Ф в растворе существует в равновесии между тетрамером и мономером. Первая фаза денатурации может соответствовать диссоциации самоассоциированной формы;

при увеличении концентрации GuHCl выше 1 М начинается денатурация мономеров апоЕ/Ф и переход заканчивается при 4 М GuHCl.

Сложный процесс сворачивания апоЕ/Ф выявлен при измерении изменений во времени величин переноса, интенсивности, анизотропии и тушения флуоресценции флуоресцеина при инкубации апобелка при 0 °С (холодовая инкубация) или 24 °С (тепловая инкубация) после проведения диализа пре-денатурированных препаратов апобелка (табл. 1). При мономеризации апоЕ холатом Na эффективность переноса энергии флуктуировала вблизи значения 29% в процессе 6-часовой инкубации апобелка как при 0 °С, так и при 24 °С. Не менялась также анизотропия флуоресценции при холодовой инкубации, при тепловой инкубации наблюдалось снижение этого параметра с 0,146 до 0,135. Таким образом, инкубация после диализа выявляет по наличию переноса энергии и высокому значению r- I + 2I I536/I А N С мин Б GuHCl, моль N Рис. 1. Обратимость GuHCl-индуцированной денатурации апоЕ/Ф. Отношение I536/I508 индикатор положения максимума спектра С испускания (1). Интенсивность флуоресценции (2) равна сумме компонент (I + 2I), полученных при измерении анизотропии r (3). Изучена денатурация мин (зачерненные символы) и ренатурация В (открытые символы) апобелка.

N 9, 8, б С 8, r- мин 8, Г Tt=30,5 o N 7, 32 36 40 44 С a 7, мин Д r- 6, N С 6, 32 36 40 44 час (T/)x10-3, K/пз Рис. 2. Температурная индукция структуры Рис. 3. Кинетика протеолиза р-апоЕ апоЕ. Смесь апоЕ/Ф, апоЕ/Д и апоЕ химотрипсином (А), трипсином (Б), денатурировали в холате, детергент удаляли эластазой (В), субтилизином (Г), протеазой сорбцией при 4 °С (а) или 37 °С (б) и Staphylococcus aureus V8 (Д). Продукты регистрировали температурную зависимость разделяли электрофорезом в Ds-Na-ПААГ.

анизотропии флуоресценции апоЕ/Ф r.

Таблица 1. Сворачивание апоЕ при двух температурах.

Инкубация, ч Температура инкубации 0 °С 24 °С Перенос энергии, % 0 30,0±5,1 (4) 3 23,8±6,5 24,5±6,2 (4) 6 33,6±12,7 (4) 34,3±8,3 (3) Анизотропия 0 0,146±0,0025 (5) 3 0,146±0,0025 (5) 0,133±0,004 (4) 6 0,140±0,004 (4) 0,135±0,003 (4) Интенсивность, % 0 100 (5) 3 95,3±5,3 (4) 102,8±7,4 (5) 6 84,2±4,7 (4) 95,7±9,1 (4) Степень доступности f 0 0,79±0,12 (3) 6 0,71±0,05 (3) 0,45±0,07 (3) Константа тушения КШ-Ф, M-1 0 11,0±2,9 (3) 6 12,6±2,9 (3) 12,9±3,0 (3) анизотропии самоассоциированную форму апобелка. Снижение интенсивности флуоресценции при инкубации апоЕ/Ф при 24 °С было менее выраженным по сравнению с изменением интенсивности флуоресценции при инкубации при 0 °С. Температурная зависимость изменения интенсивности флуоресценции апоЕ/Ф указывает на вовлеченность гидрофобных взаимодействий, более стабильных для алифатических радикалов при комнатной температуре, чем при 0° С (Кушнер, 1977). Степень доступности хромофоров f для анионов I- не изменялась после холодовой инкубации и значимо снижалась при тепловой инкубации. Константа тушения Штерн-Фольмера КШ-Ф флуоресценции доступных хромофоров не изменялась в процессе инкубации при обеих температурах. Можно предположить протекание при тепловой инкубации конформационных изменений со снижением доступности хромофоров для водной фазы и переход "открытого" самоассоциированного состояния в более структурированное с образованием гидрофобного "ядра". Действительно, дополнительная тепловая инкубация препарата апоЕ/Ф индуцировала структурный переход при 30,5 °С (рис. 2). Сворачивание при пониженной температуре не вызывало появления структурированной формы.

Самоассоциация и доменная структура рекомбинантных изоформ При гель-фильтрации трех рекомбинантных изоформ р-апоЕ2, р-апоЕ3 и р-апоЕ регистрировали пять компонент. Компонента с величиной Rs 6,6 – 7,7 нм может соответствовать тетрамеру (до 65% массы для р-апоЕ2 и р-апоЕ4), а компоненты с радиусом Стокса Rs 4,7 – 5,2 нм и 4,0 – 4,1 нм (50% для р-апоЕ3) соответствуют менее самоассоциированным структурам. С использованием значений Rs для этих структур были рассчитаны коэффициенты диффузии D20,w (табл. 2). При скоростном ультрацентрифугировании обнаружено шесть компонент и из их положения определены коэффициенты седиментации s (табл. 2). Три основные компоненты обладали массами 153, – 175,8 кДа, 69,3 – 81,9 кДа и 32,4 – 47,6 кДа. Основной самоассоциированной формой является тетрамер с массой 156 кДа, компоненты с меньшими значениями s и Rs обладали массами димера и мономера. Данные по равновесному распределению соответствовали равновесию мономер-димер-тетрамер для р-апоЕ3, мономер-димер-тетрамер-октамер для р апоЕ2 и мономер-димер-тетрамер-октамер для р-апоЕ4. Растворы р-апоЕ2 и р-апоЕ содержали структуры, включавшие более четырех молекул апобелка и эти структуры отсутствовали в растворе р-апоЕ3.

Для изучения доменной структуры изоформ использовали ограниченный протеолиз.

При протеолизе р-апоЕ3 пятью протеазами образовывались две группы фрагментов (рис. 3).

Реакция с моноклональными антителами свидетельствует о принадлежности фрагментов первой группы с массой 20 - 38 кДа к N-домену апобелка и фрагментов второй группы с массой меньше 16 кДа к С-домену. Число и масса карбоксил-терминальных фрагментов р апоЕ4 отличались от таковых для р-апоЕ2 и р-апоЕ3. В начале протеолиза р-апоЕ генерировались фрагменты с массой 16 или 14 кДа (атака области 202-224) и затем они деградировали до фрагментов с массой 12-10 кДа (атака области 230-260). Однако в р-апоЕ и р-апоЕ3 атаковалась только область 230-260 и фрагменты 16 или 14 кДа не появлялись.

Можно предположить, что в р-апоЕ4, в отличие от двух других изоформ, область 230- менее доступна для протеаз из-за междоменного взаимодействия с вовлечением Glu255.

Таблица 2. Гидродинамические свойства и молекулярные массы трех рекомбинантных изоформ апоЕ в растворе. Представлены данные для трех основных компонент каждой изоформы. Коэффициенты диффузии D20,w рассчитаны из данных по скоростному центрифугированию (а) и из значений Rs (б).

р-апоЕ2 р-апоЕ3 р-апоЕ 1 2 3 1 2 3 1 2 Rs, нм 7,31 4,74 4,10 6,64 4,98 4,05 7,67 5,20 3, s20,w, S 5,65 3,68 2,64 5,61 3,35 1,96 5,51 3,80 2, 7 2 - (D20,w)x10, см ·с (а) 3,08 4,03 5,23 3,03 4,08 5,10 3,00 4,24 5, 7 2 - (D20,w)x10, см ·с (б) 2,93 4,51 5,22 3,22 4,30 5,28 2,79 4,11 5, MM, Да 171100 91800 44900 153500 69300 32400 175800 81900 Стабильность структуры рекомбинантных изоформ Температурная денатурация. Денатурационные зависимости по эллиптичности при 222 нм в диапазоне 15 - 80 °C для п-апоЕ3, р-апоЕ3 и р-апоЕ4 включали один переход в области 40 – 60 °C и второй минорный переход в области 20 – 40 °C для р-апоЕ2.

Наибольшие значения температуры перехода Tm и энтальпии H для р-апоЕ2 предполагают наибольшую температурную стабильность р-апоЕ2 среди трех рекомбинантных изоформ и Таблица 3. Индуцированная температурой денатурация изоформ и изолированных доменов апоЕ по данным КД в дальнем и ближнем ультрафиолете.

, ккал/моль S, ккал/моль/K Спектроскопия Tm, °C КД в дальнем УФ р-апоE2 58,7 ± 0,06 70,1 ± 1,70 0,21 ± 0, р-апоE3 49,6 ± 0,06 40,2 ± 0,83 0,12 ± 0, п-апоE3 55,9 ± 0,16 65,0 ± 3,89 0,19 ± 0, р-апоE4 47,3 ± 0,06 33,8 ± 0,73 0,10 ± 0, п-C-домен 60,6 ± 0,07 52,5 ± 0,00 0,15 ± 0, р-N-домен 65,5 ± 0,16 61,5 ± 1,76 0,18 ± 0, КД в ближнем УФ р-апоE2 61,6 ± 0,35 57,3 ± 5,37 0,17 ± 0, р-апоE3 39,3 ± 0,20 48,9 ± 3,00 0,15 ± 0, п-апоE3 56,6 ± 0,68 39,9 ± 8,52 0,12 ± 0, р-апоE4 39,1 ± 0,17 61,6 ± 4,14 0,19 ± 0, наименьшую для р-апоЕ4 (табл. 3). Стабильность р-N-домена выше по сравнению с п-С доменом. Денатурация обоих доменов включала два перехода в области 20 – 45 °C и 50 – °C и первый переход отсутствовал в интактном белке. Потеря вторичной структуры при нагревании трех рекомбинантных изоформ и апоЕ3 плазмы была необратимой, в отличие от обратимой температурной денатурации апоA-II (Gursky and Atkinson, 1996) и апоC-I (Gursky and Atkinson, 1998) и частичного восстановления структуры для апоA-I (Suurkuusk and Hallen, 1999). Отметим обратимость денатурации вторичной структуры изолированных доменов. Двух-доменная структура может усложнять ренатурацию интактного белка вследствие, например, междоменного взаимодействия.

Изменения третичной структуры при нагревании регистрировали по эллиптичности при 292 нм. Сравнение температур перехода (табл. 3) выявило возрастание стабильности в ряду р-апоЕ4 р-апоЕ3 п-апоЕ3 р-апоЕ2, идентично данным по стабильности по КД в дальнем УФ. Для р-апоЕ3 и р-апоЕ4 переход по КД в ближнем УФ происходил при меньших температурах по сравнению с КД в дальнем УФ (табл. 3), что соответствует состоянию "расплавленной глобулы";

переходы совпадали для п-апоЕ3 и р-апоЕ2. Эти результаты коррелируют с конформационным переходом при 30,5 °C плотно-упакованной при 24 °C самоассоциированной структуры в случае смеси изоформ белка плазмы.

Химическая денатурация. Из зависимости положения максимума спектра триптофановой флуоресценции и молярной эллиптичности при 222 нм от концентрации GuHCl оценивали долю нативной структуры. Для каждой рекомбинантной изоформы существовало два перехода. Первый переход между 0 и 1,5 M GuHCl соответствовал денатурации С-домена и второй переход между 1 и 5 M GuHCl – денатурации N-домена. Для каждого перехода рассчитывали свободную энергию денатурации (табл. 4). Устойчивости к химической денатурации интактных белков и доменов различались для трех изоформ.

Увеличенная стабильность р-апоЕ2 обусловлена увеличенной стабильностью N-домена.

Таблица 4. Индуцированная GuHCl денатурация изоформ и доменов апоЕ по данным флуоресценции и КД в дальнем ультрафиолете. GnHu2O, GnHi2O и GiHu2O соответствуют,,, свободным энергиям денатурации интактного белка, С-домена и N-домена.

Gn,i, Gi,u, Gn,u, nn,i ni,u nn,u Изоформа Kn,i Ki,u Kn,u ккал/моль ккал/моль ккал/моль 6,72-11 3,23- ФЛ р-апоЕ2 0,0481 1,8 7,0 13,6 20,2 15,4 27,2 0, 2,29-7 9,22- р-апоЕ3 0,0403 1,9 8,9 8,9 13,9 10,8 22,8 0, 3,25-6 2,21- р-апоЕ4 0,0681 1,6 8,2 7,4 11,4 8,9 19,6 0, 5,20-8 2,33- КД р-апоЕ2 0,00448 3,2 11,9 9,8 14,8 12,9 26,7 0, 5,74-7 1,18- р-апоЕ3 0,00206 3,6 11,2 8,4 13,9 12,0 25,1 0, 1,17-5 2,58- р-апоЕ4 0,0022 3,6 11,7 6,6 11,2 10,2 22,9 0, Стабильности С-доменов меньше стабильности N-доменов. Стабильности р-апоЕ4 и ее N домена были наименьшими среди трех изоформ. По данным гель-фильтрации в присутствии GuHCl, для мономера с развернутым С-доменом и свернутым N-доменом значение Rs составляло 4 нм, для развернутого мономера – 6,6 нм. Разворачивание р-апоЕ4 происходило при меньших концентрациях GuHCl, а разворачивание р-апоЕ2 – при наибольших.

Индивидуальные зависимости для N- и С-доменов каждой из изоформ по гель фильтрации, круговому дихроизму и флуоресценции не совпадали. При денатурации N домена всех изоформ первоначально происходило увеличение размера, затем последовательно менялись вторичная и третичная структуры. Несмотря на увеличение размера молекулы, окружение трех остатков триптофана (24, 34 и 38) первой -спирали, входящей в пучок из четырех спиралей, не изменялось. Это может отражать открытие пучка, наиболее выраженное в апоЕ4, аналогично изменению при ассоциации апоЕ с липидом (Weisgraber, 1994). При денатурации С-домена в каждой изоформе несовпадающие изменения по размеру и флуоресценции предшествовали потере вторичной структуры, что предполагает диссоциацию С-домена перед его денатурацией. Помимо интермедиата с развернутым С-доменом и свернутым N-доменом, разворачивание обоих доменов изоформ апоЕ может включать более двух состояний.

Обнаруженная относительно двух других изоформ сниженная стабильность апоЕ4 с максимальным числом аргининовых остатков (рассматриваемых как индуцирующих неупорядоченность) может лежать в основе ассоциации апоЕ как внутренне неупорядоченного белка с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Cheng et al., 2006).

СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ ДИСКОИДАЛЬНЫХ АПОБЕЛОК-ФОСФОЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ Структура и белок-белковые взаимодействия АпоЕ-содержащие комплексы. Согласно одной из моделей структуры дискоидальных комплексов апоA-I с фосфолипидом (Brasseur et al., 1992;

Vanloo et al., 1991), -спиральные участки ориентированы параллельно ацильным цепям фосфолипида по периметру диска, а гидрофобные аминокислотные остатки взаимодействуют с липидной фазой. Образующие пару соседние спирали расположены антипараллельно из-за наличия -структуры, ревертирующей ориентацию второй -спирали. Нами выполнен сравнительный анализ топографии, структуры и стабильности комплексов с апоЕ. Последовательность 206- включает наиболее стабильную пару -спиралей в силу возможного существования шести ионных связей. Для дискоидальных комплексов апоE3 плазмы и его двух доменов с дипальмитоилфосфатидилхолином (ДПФХ) по сравнению с белком в растворе наблюдался “голубой” сдвиг максимума флуоресценции триптофановых остатков, особенно заметный для С-домена. По данным КД и ИК-спектроскопии полного отражения, связывание с фосфолипидом приводило к увеличению содержания -спиралей на 10%. Из величины дихроичного отношения следует, что ацильные цепи фосфолипида и спиральные участки апоЕ3 ориентированы почти параллельно друг другу с отклонением от нормали на 20° и 30° соответственно. Образование комплекса сопровождалось возрастанием устойчивости вторичной структуры к GuHCl-индуцированной денатурации и для белка в комплексе применима модель одиночного перехода между нативным и денатурированным состояниями, в отличие от белка в растворе. По переносу энергии выявлена самоассоциация и/или тесный контакт по крайней мере двух молекул апоЕ (смесь изоформ) в дискоидальных и везикулярных комплексах. Обнаружена также самоассоциация апоA-I и апоC-III-1 в комплексах с димиристоилфосфатидилхолином в широком диапазоне отношения липид:белок.

Структура и белок-липидные взаимодействия Состав и размеры комплексов. Архитектура дискоидальных комплексов с индивидуальными апобелками апоA-I, апоE и апоA-II в отсутствие и в присутствии 4, вес% (9,1 моль%) холестерина (ХС) исследована с помощью флуоресцентных зондов цис паринаровой и транс-паринаровой кислот с преимущественной локализацией в твердом (транс-ПК) и жидком (цис-ПК) бислое. Начальное весовое соотношение ДПФХ:белок равнялось 3:1, что соответствует мольным отношениям 115:1 для апоА-I, 139:1 для апоЕ и 36:1 для апоА-II. Комплекс апоЕ/ДПФХ характеризовался увеличенным размером и большей гомогенностью. При включении холестерина его содержание в изолированных комплексах возрастало в ряду апоA-II апоE апоA-I и размер комплексов не менялся (табл. 5).

Встраивание цис-ПК и транс-ПК в комплексы с апоA-I оценено по коэффициенту распределения зондов Кр между липидной и водной фазами. Повышение значения Кр при и 50 °C (особенно выраженное для цис-ПК при 25 °C) в случае комплексов апоA-I/ДПФХ относительно липосом свидетельствует об индукции апобелком дефектов в фосфолипидной Таблица 5. Состав, размер и степень гомогенности комплексов с различными апобелками. Приведены среднее значение ± ошибка среднего (n 2) и число разделений.

Ширина пика, мл (**) Образец ДПФХ:ХС:апо- Диаметр Стокса, нм белок, М/М/М (*) A-I/ДПФХ 108:0:1 8,2±0,2 (5) 3,87±0,11 (5) A-I/ДПФХ/ХС 105:9,2:1 7,95±0,08 (3) 4,46±0,10 (3) E/ДПФХ 134:0:1 9,7±0,2 (4) 3,55±0,12 (3) E/ДПФХ/ХС 132:9,8:1 10,05 (2) 3,47 (2) A-II/ДПФХ 34:0:1 8,4 (2) 4,06 (1) A-II/ДПФХ/ХС 34:2,3:1 8,1 (2) 4,66 (1) (*) - репрезентативные значения для индивидуальных препаратов;

(**) - ширину пика измеряли на уровне базовой линии.

области, в которой преимущественно локализована цис-ПК. Включение холестерина в комплекс снижало встраивание цис-ПК при 25 °C, вероятно, из-за иммобилизующего действия холестерина, что совпадало со сниженным встраиванием при 50 °C транс-ПК в комплекс апоA-I/ДПФХ/ХС по сравнению с липосомами ДПФХ/ХС. Индуцированные температурой изменения Кр для обоих зондов в противоположном направлении в отсутствие и в присутствии холестерина сложно объяснить распределением зонда между водной и гомогенной липидной фазами. Можно предположить наличие разных фосфолипидных доменов в диске и различное температуро-чувствительное распределение зондов между ними. В этой связи изучены пространственные взаимоотношения в комплексах с помощью переноса энергии с триптофанилов апоA-I на молекулы зондов при температурах ниже и выше Tt (25 и 50 °С) (рис. 4).

транс-ПК, 50 °С квантовый выход, отн. ед.

квантовый выход, отн. ед.

цис-ПК, 50 °С 1, транс-ПК, 50°C () цис-ПК, 50°C )) 0,8 транс-ПК, 25°C () транс-ПК, 25 °С цис-ПК, 25°C (+) 0, 0, цис-ПК, 25 °С 0 1 2 3 4 [акцептор], мкМ [акцептор], мкМ Рис. 4. Эффективность переноса энергии с Рис. 5. Эффективность переноса энергии с апоA-I на зонды при 25 °С (сплошные апоA-I на зонды в ХС-содержащих комплексах линии) и 50 °С (пунктирные линии). при 25 °C и 50 °C.

Радиальная упаковка белка и липида в комплексе апоA-I/ДПФХ. При 25 °С перенос энергии с белка на цис-ПК более эффективен по сравнению с транс-ПК. Анализ данных в модели оккупированности зондами концентрических областей диска с различной удаленностью от центра диска при вариации размеров диска, областей локализации зондов, толщины и локализации слоя апобелка удовлетворял набору параметров: толщина бислоя в центре диска равна 4,0 нм, флуорофорные группы обоих зондов одинаково погружены в бислой, молекулы транс-ПК выталкиваются из периферической области бислоя в непосредственном контакте с апобелком шириной 0,7 – 1,2 нм, цис-ПК избегает центральной области диска с радиусом 1,0 - 2,5 нм и накапливается в области пограничного липида вблизи апобелка, триптофанилы апоA-I погружены в липидную фазу не более чем на 0,2-0, нм. При 50 °С концентрационные зависимости переноса для двух зондов совпадают и занимают промежуточное положение между зависимостями для 25 °С. Расположение зондов относительно белка стало одинаковым и вся липидная фаза реконструированных ЛВП (рЛВП) доступна для цис-ПК и транс-ПК. Оптимизация данных по переносу энергии при °С выявляет отсутствие заметного изменения расстояния от апобелка до центра частицы.

При 25 °С липидная фаза рЛВП менее упорядочена по сравнению с чисто липидным бислоем: регистрируемые по анизотропии вращательная подвижность и по интенсивности флуоресценции сегментальная подвижность обоих зондов увеличены;

температуро индуцируемый фазовый переход сдвигался на 2-4 °С в высокотемпературную область;

после плавления ДПФХ вращательная подвижность молекул зонда снижена относительно липосом;

в отличие от вращательной, сегментальная подвижность зондов после фазового перехода становится такой же, как в чисто липидном бислое. В модели дискоидальной частицы апоA-I/ДПФХ молекулы ДПФХ локализованы в трех радиальных зонах с увеличивающейся площадью молекулы So при удалении от центра: зона слабо-возмущенного липида (So = 0,53 нм2), промежуточная зона (So = 0,59 нм2), зона пограничного липида (So = 0,65 нм2). При T Tt возможно исчезновение вариации параметра So вдоль радиуса частицы и равномерное распределение молекул зонда в липидной фазе.

Влияние природы апобелка и холестерина на белок-липидные взаимодействия. В присутствии 8 моль% холестерина в рЛВП взаимное расположение апоA-I и паринаровых кислот изменялось (рис. 5). Вариация параметров локализации зондов при Т Тt выявила их локализацию на периферии диска с радиусом 5,4 нм. После фазового перехода транс-ПК оккупирует основную долю липидной фазы за исключением периферической области от 5 до 5,4 нм;

для цис-ПК центральная область с радиусом 1,5-2 нм остается недоступной. Таким образом, внедрение ХС в рЛВП при Т Тt сопровождается образованием области в центре частицы с радиусом 2,8 нм (средняя величина для цис-ПК и транс-ПК) и включающей 30% молекул ДПФХ. Фазовый переход сопровождается снижением размеров этой области, хотя зона радиусом 1,5 - 2 нм все еще недоступна для цис-ПК. Более того, латеральное распределение ХС не является гомогенным. Если транс-ПК исключается из ДПФХ-ХС области при Т Тt, то молекулы холестерина накапливаются в центре частицы. При Т Тt внедрение ХС приводило к снижению встраивания обоих зондов: снижение на 30% коэффициента распределения соответствует размерам ХС-обогащенной области. После фазового перехода увеличивается размер области, доступной для зондов, и коэффициент распределения возрастал в 2 и 1,5 раза для встраивания транс-ПК и цис-ПК в ХС содержащие комплексы. Однако ХС-обогащенная зона может все еще существовать при температурах выше Tt.

Таблица 6. Температуро-индуцированный переход в липосомах и рЛВП с разными апобелками, детектируемый по интенсивности F и анизотропии r флуоресценции цис-ПК и транс-ПК.

по интенсивности по анизотропии Tt, oC Tt, oC образец зонд Fs/Ff rs/rf Липосомы из ДПФХ цис-ПК (5) 41,1±0,3 1,58±0,06 40,2±0,2 2,14±0, транс-ПК (2) 41,5 3,51 40,8 1, Липосомы из ДПФХ/ХС цис-ПК (4) 39,8±0,3 1,54±0,07 38,5±0,2 1,86±0, транс-ПК (4) 40,3±0,1 2,86±0,12 39,2±0,2 1,62±0, A-I/ДПФХ цис-ПК (2) 43,2 1,42 42,3 1, транс-ПК (2) 46,4 2,66 44,7 1, A-I/ДПФХ/ХС цис-ПК (2) 43,2 1,32 37,1 8, транс-ПК (2) 42,2 2,19 39,7 1, E/ДПФХ цис-ПК (1) 42,4 1,34 41,1 1, транс-ПК (1) 42,7 3,04 40,8 1, E/ДПФХ/ХС цис-ПК (1) 42,0 1,28 41,6 1, транс-ПК (1) 42,4 2,07 40,3 1, A-II/ДПФХ цис-ПК (3) 43,3±0,1 1,35±0,09 42,7±0,1 1,45±0, транс-ПК (2) 43,5 3,74 41,6 1, A-II/ДПФХ/ХС цис-ПК (2) 41,3 1,36 44,9 2, транс-ПК (2) 43,8 1,54 42,3 1, Формирование комплексов индивидуальных апоA-I, апоA-II, апоE с ДПФХ приводило к подавлению амплитуды и кооперативности перехода, регистрируемого по флуоресценции обоих зондов в основном из-за снижения квантового выхода при температурах ниже Tt. Цис ПК не дискриминировала природу апобелка, тогда как падение выраженности перехода, детектируемого транс-ПК, было максимальным для комплексов с апоA-I, промежуточным для комплексов с апоЕ и минимальным для комплексов с апоA-II (табл. 6). В комплексах по сравнению с липосомами из ДПФХ переход сдвигался в область высоких температур.

Основываясь на концепции гидрофобного соответствия (Mouritsen and Bloom, 1984), можно предположить избыточную гидрофобную длину апоA-I по сравнению с апоA-II и преимущественное взаимодействие апобелка с фосфолипидом в гелевой фазе. Наличие белка приводило к флюидизации бислоя при T Tt и возрастанию его ригидности при температурах выше Tt. Для тройного комплекса апобелок/ДПФХ/ХС по сравнению с комплексом апобелок/ДПФХ выраженность перехода, детектируемого цис-ПК по отношению интенсивностей флуоресценции, максимально снижалась для комплексов с апоA-I, не менялась для апоA-II-содержащих комплексов и была промежуточной для комплексов с апоЕ. Выраженность снижения Tt, регистрируемая этим зондом в этих комплексах, была прямо противоположной. Противоположный по выраженности ответ на включение холестерина в комплексы детектировался по отношению интенсивностей флуоресценции транс-ПК: максимальным снижение этого параметра было для комплексов с апоA-II, минимальным - для апоA-I-содержащих комплексов. Изменения температуры фазового перехода, детектируемого транс-ПК, также вели себя противоположным образом по сравнению с изменением отношения интенсивностей флуоресценции (табл. 6). Различное распределение зондов в комплексах с тремя апобелками, лежащее в основе температуро индуцируемых ответов, может быть связано с различной степенью исключения молекул холестерина из зоны пограничного липида. Можно предположить более прочное взаимодействие апоA-II с фосфолипидом по сравнению с апоA-I. Молекулы ХС и апоA-I (но не апоA-II) взаимно компенсируют противоположное влияние на соответствие гидрофобной длине ацильных цепей с относительным обогащением пограничного липида холестерином в апоA-I-содержащих рЛВП относительно комплексов с апоA-II. Различное взаимодействие апобелков с ДПФХ и разное содержание ХС в комплексах может приводить к их различным субстратным свойствам в реакции с лецитин-холестерин ацилтрансферазой (ЛХАТ).

Влияние структуры липид-связанного апоЕ на активность ЛХАТ, акцепцию холестерина и связывание дискоидальных комплексов с ЛНП-рецептором Функциональными характеристиками комплексов апоЕ3 с фосфолипидом служили их субстратные свойства в реакции с ЛХАТ (рис. 6) и способность к акцепции клеточного холестерина. Снижение значения кажущейся максимальной скорости реакции Vmax (1, нмоль эфира ХС/час) для комплекса апоЕ3 с пальмитоиллинолеоилфосфатидилхолином (ПЛФХ) и ХС в 7 раз по сравнению с комплексами апоA-I/ПЛФХ/ХС может иметь в основе различную ориентацию/иммобилизацию молекул холестерина локальными участками апоA-I и апоЕ. Дискоидальные комплексы апоЕ3/ДПФХ акцептировали холестерин с нагруженных холестерином макрофагов J774 с эффективностью, составляющей 62% от акцепции комплексами апоA-I/ДПФХ (Rosseneu et al., 1993), возможно, в соответствии с пределом исключения ХС из пограничного липида. Сферические частицы получали при совместной инкубации комплексов апоЕ3/ДПФХ/ХС, ЛНП и ЛХАТ. В результате реакции ЛХАТ в апоЕ содержащих сферах накапливалось меньше эфиров холестерина (ЭХС) (62%) по сравнению с комплексами с апоA-I (86%) (Vanloo et al., 1992) вследствие лучших активаторных свойств апоA-I. Трансформация дискоидальных комплексов в сферические частицы приводила к снижению их размера. Изучение вторичной структуры апобелка методом ИК-спектроскопии 3, IC 50, 10 -7 M апоЕ Ka(ДПФХ) 2, Ka(ПОФХ) а Ka, 108 M- эфир ХС, % б 2, 1/vo IC50(ДПФХ) 40 IC50(ПОФХ) 0 1, 0 0, - 1/[ХС], мкМ 0 1, 100 150 200 250 0 8 16 ФХ/апоE, моль/моль время, ч Рис. 6. (а) - ЛХАТ-индуцированное Рис. 7. Влияние размера и/или состава рЛВП образование эфиров холестерина в с апоЕ на аффинность к ЛНП-рецептору и на дискоидальных комплексах способность рЛВП к конкуренции с ЛОНП за апоЕ3/ПЛФХ/ХС. (б) - линеаризованные ЛНП-рецептор. Значения IC50 даны как данные для расчета кинетических параметров концентрации апоЕ рЛВП, ингибировавшие реакции, vo - начальная скорость реакции связывание ЛОНП на 50%.

(нмоль/ч).

полного отражения выявило отсутствие изменения содержания -спиралей в результате такой трансформации, однако взаимопараллельная ориентация ацильных цепей фосфолипида и спиральных участков апобелка в дисках изменялась на хаотическую в сферах. Можно предположить основной вклад апоA-I-содержащих частиц в синтез ЛВП с заместительной ролью апоЕ в условиях дефицита или отсутствия апоA-I.

Были приготовлены и охарактеризованы комплексы апоЕ (смесь изоформ плазмы) с ДПФХ или пальмитоилолеоилфосфатидилхолином (ПОФХ). Эффективность связывания комплексов с иммобилизованным ЛНП-рецептором in vitro возрастала при увеличении размера комплекса и усредненная для обоих фосфатидилхолинов константа ассоциации Ka скачкообразно возрастала в 10 раз от 3,8·107 до 3,8·108 M-1 с величиной перехода при моль ФХ/моль апоЕ (рис. 7), что могло бы отражать изменение упаковки липидов и/или конформации апобелка. Комплексы эффективно конкурировали с изолированными частицами ЛОНП за связывание с ЛНП-рецептором. Вновь наблюдалось скачкообразное возрастание эффективности конкуренции при увеличении содержания фосфатидилхолина с величиной перехода 135 моль ФХ/моль апоЕ (рис. 7). Переходы в прямом и конкурентном вариантах связывания, возможно, соответствуют увеличению числа "активных" молекул апоЕ на поверхности комплексов при изменении размера и/или геометрии комплексов.

АПОЕ-ЗАВИСИМОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ТРИГЛИЦЕРИД-БОГАТЫХ ЧАСТИЦ С ЛНП РЕЦЕПТОРОМ IN VITRO Механизм взаимодействия ЛОНП и ЛНП с ЛНП-рецептором Сравнена аффинность препаратов ЛОНП и ЛНП из кинетических и квази-равновесных (2 ч при 37 °С) измерений в двух моделях связывания с иммобилизованным ЛНП рецептором (табл. 7). Кинетическая константа ассоциации Ka11 в модели образования лиганд рецепторного комплекса в случае ЛОНП совпадала с равновесной величиной Ka. Однако для связывания ЛНП в рамках этой модели величина Ka в среднем в 18 раз превышала величину Ka11, что привело к рассмотрению более сложной модели, включающей, помимо быстрой Таблица 7. Кинетическое и равновесное изучение связывания ЛОНП и ЛНП с ЛНП рецептором. Частицы изолированы из плазмы крови гипертриглицеридемиков с фенотипом Е3/3 ([ТГ] = 384±99 мг/дл, n = 3).

Модель "комплекса столкновений" k11, 104 М-1с-1 k21, 10-4 с-1 Ka11, 108 М-1 Ka, 108 М- ЛОНП 1,19±0,48* 2,15±0,12* 0,58±0,24*# 1,88±0,55* 0,03±0,01$ ЛНП 0,08±0,03 2,75±0,07 0,54±0, Модель "медленной изомеризации" k32, 10-4 с-1 k42, 10-4 с-1 Ka12, 108 М-1 Ka(общ), 108 М- Ka ЛНП 2,46±0,57 2,38±0,22 0,21±0,09 1,03±0,20 0,42±0, *) p 0,05 для сравнения ЛОНП и ЛНП в столбце с помощью одностороннего t-теста в модели "комплекса столкновений";

#) p 0,05 для сравнения ЛОНП и ЛНП в столбце с помощью одностороннего t-теста в модели "медленной изомеризации";

$) p 0,07 для сравнения с помощью одностороннего t-теста величин Ka11 и Ka12 для связывания ЛНП.

стадии образования лиганд-рецепторного комплекса с константой ассоциации Ka12, медленную стадию его конформационного превращения с константой равновесия Ka22. В этой модели исчезала разница между равновесными и кинетическими значениями констант ассоциации для ЛНП (табл. 7). Значения Ka соответствовали данным других авторов (Lund Katz et al., 1998) и в среднем Ka(ЛОНП) превышала Ka(ЛНП) в 2,8-3,5 раз. Рассчитанное отношение размеров лигандных зон в ЛОНП и ЛНП равнялось 2,5 и соответствовало среднему содержанию апоЕ в частице ЛОНП как 2-3 молекулы апобелка. Соответствие предполагает вклад апоЕ во взаимодействие частицы ЛОНП с ЛНП-рецептором и наличие континуума из близко-расположенных молекул апоЕ в ЛОНП. Действительно, при увеличении триглицеридов плазмы содержание апоЕ в ЛОНП возрастало и апобелок в гипертриглицеридемийных ЛОНП существовал в кластерах увеличивающегося размера, выявленных "сшиванием" апобелков.

Состав, структурные свойства и связывание с ЛНП-рецептором ЛОНП и ЛНП при нормо- и гипертриглицеридемии: связь с фенотипом апоЕ Структурное исследование. Были сформированы три группы пациентов из первой когорты по фенотипу апоЕ - гомозиготы Е3/3 (группа Е3), гомозиготы Е2/2 и гетерозиготы Е2/3 (группа Е2+), гомозиготы Е4/4 и гетерозиготы Е3/4 (группа Е4+) с разбиением на подгруппы с низким (ТГн 200 мг/дл) и высоким (ТГв 200 мг/дл) содержанием триглицеридов плазмы (табл. 8). В изолированных частицах ЛОНП и ЛНП измерено содержание липидов и апобелков и рассчитана относительная плотность упаковки триптофанилов ПТ на поверхности частиц, обратно зависящая от размера частиц (табл. 8).

В группе Е3 для частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением содержания ХС, апоЕ и апоC-III;

содержание апоЕ положительно коррелировало с ХС-ЛОНП, а содержание апоC-III положительно коррелировало с ТГ ЛОНП. Частицы ЛОНП гипертриглицеридемиков по сравнению с частицами из нормотриглицеридемиков увеличены в размере, ХС-обогащены и отношение ТГ/ХС снижено в 1,5 раза. Параметр ПТ отрицательно коррелировал с ТГ-ЛОНП, ХС-ЛОНП и с содержанием апоC-III в ЛОНП и положительно коррелировал с отношением апоЕ/апоC-III. Для частиц ЛНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением содержания ТГ и со снижением содержания ХС;

отношение ТГ/ХС соответственно возрастало и частицы ЛНП становились ТГ-обогащенными. Содержание апоЕ в ЛНП не изменялось. Относительная плотность упаковки триптофанилов возрастала вследствие снижения размера частиц при снижении содержания ХС (Berneis and Krauss, 2002). Действительно, параметр ПТ отрицательно коррелировал с ХС-ЛНП.

В группе Е2+ для частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с изменениями содержания ТГ и ХС, аналогичными для группы Е3 и содержание ХС в частицах гипертриглицеридемиков было значимо выше по сравнению с подгруппой Е3.

Аналогично группе Е3, частицы ЛОНП становились крупнее и ХС-обогащенными и напоминали ремнант-подобные частицы. Увеличенное по сравнению с группой Е содержание апоЕ и сниженное содержание апоC-III в ЛОНП гипертриглицеридемиков подгруппы Е2+ соответствует ремнантным свойствам частиц и данным других авторов о сниженном отношении апоC-III/апоЕ в ЛОНП пациентов с III типом дислипидемии и близком к нормальному для пациентов с IV типом (Fredenrich et al., 1997);

последнее соответствует гипертриглицеридемикам из группы Е3. Для частиц ЛНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с тенденцией к обогащению по ТГ, как для группы Е3. Однако в противоположность ЛНП из группы Е3, величина ПТ характеризовалась тенденцией к снижению и параметр ПТ отрицательно коррелировал с ТГ-ЛНП.

Таблица 8. Содержание липидов и апобелков плазмы и состав изолированных ЛОНП и ЛНП в группах пациентов первой когорты (структурное исследование). Представлены средние значения (± ошибка среднего, n 2) и первое и второе значения в скобках означают соответственно число пациентов-гомозигот и общее число пациентов в каждой подгруппе.

E3 E2+ E4+ ТГн ТГв ТГн ТГв ТГв ТГ плазмы, мг/дл 48 – 391 78 – 1280 75 – 97 ± 9 (18)2-3 287 ± 23 (7)*,2-3 146 ± 34 (0/3) 757 ± 292 (1/3)* 86 ± 11 (0/3) ХС плазмы, мг/дл 132 – 275 141 – 402 195 – 214 ± 13 (7)2- 193 ± 8 (18) 179 ± 19 (0/3) 301 ± 61 (1/3) 211 ± 15 (0/3) ХС-ЛНП, мг/дл 71 – 212 64 – 134 135 – 130 ± 8 (13) 118 ± 14 (7) 91 ± 28 (0/2) 115 ± 10 (1/3) 150 (0/2) ХС-ЛВП, мг/дл 30 – 60 30 – 42 48 – 44 ± 1 (13)3-4 40 ± 1 (0/2)2- 38 ± 1 (7)* 35 ± 3 (1/3) 51 (0/2) апоВ плазмы, г/л 0,49 – 1,62 0,80 – 1,68 0,80 – 1, 0,95 ± 0,05 (18) 1,32 ± 0,08 (7)* 0,91 ± 0,06 (0/3) 1,34 ± 0,17 (1/3)* 0,94 ± 0,09 (0/3) апоЕ плазмы, мг/л 24,9 – 76,6 45,8 – 210,8 30,2 – 31, 59,3 ± 3,1 (7)*,2-3 48,8 ± 2,0 (0/3)2-4 154,7 ± 45,7 (1/3)* 38,8 ± 2,4 (18) 30,9 ± 0,4 (0/3) ЛОНП ТГ/апоВ, моль/моль 8749 ± 956 (12) 9665 ± 906 (6) 11918 (0/2) 12785 (1/2) 8458 ± 1596 (0/3) 3288 ± 423 (12) 4938 ± 223 (6)*,2-3 4706 (0/2)2- ХС/апоВ, моль/моль 8945 (1/2)* 2321 ± 478 (0/3) 1,96 ± 0,17 (6)2- ТГ/ХС, моль/моль 2,96 ± 0,33 (12) 2,71 (0/2) 1,34 (1/2)* 3,86 ± 0,73 (0/3) 1,87 ±0,32 (11)2-3 3,24 ± 0,70 (6)* 5,00 (0/2)2- апоЕ/апоВ, моль/моль 4,97 (1/2) 2,73 ± 0,71 (0/3) 10,1±0,93 (13)2-3 12,9 ± 1,2 (7)*,2- апоC-III/апоB, моль/моль 15,06 (0/2) 8,46 ±1,23 (1/3)* 10,44 ± 1,7 (0/3) 0,25 ± 0,03 (6)2- Апо/апоC-III, моль/моль 0,23± 0,05 (15) 0,32 ± 0,01 (0/3) 0,52 (1/2)* 0,27 ± 0,07 (0/3) (ПТ)x106, Трп/нм2 3,70 ± 0,11 (6)2- 3,79 ± 0,15 (12) 3,49 (0/2) 3,14 (1/2) 3,98 ± 0,21 (0/3) 267 ± 26 (7)*,2- ЛНП ТГ/апоВ, моль/моль 189 ± 9 (17) 228 ± 34 (0/3) 479 ± 113 (1/3) 175 ± 29 (0/3) ХС/апоВ, моль/моль 2187 ± 60 (17) 1784 ± 62 (7)* 2136 ± 204 (0/3) 1968 ± 101 (1/3) 2351 ± 132 (0/3) ТГ/ХС, моль/моль 0,090 ± 0,006 (17) 0,150 ± 0,019 (7)* 0,11 ± 0,02 (0/3) 0,24 ± 0,05 (1/3) 0,075 ± 0,01 (0/3) апоЕ/апоВ, моль/моль 0,11 ± 0,01 (15) 0,11 ± 0,01 (7) 0,13 ± 0,06 (0/3) 0,18 ± 0,08 (1/3) 0,07 ± 0,02 (0/3) (ПТ)x106, Трп/нм2 7,89 ± 0,08 (17) 8,18 ± 0,08 (7)*2-3 7,84 ± 0,22 (0/3) 7,24 ± 0,46 (1/3) 7,67 ± 0,15 (0/3) Надстрочные индексы обозначают значимые (p 0,05) различия при сравнении: *), в строке подгрупп ТГн и ТГв внутри индивидуальной группы;

2-3), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E3;

2-4), в строке идентичных подгрупп ТГн в группах E2+ и E4+;

3-4), в строке идентичных подгрупп ТГн в группах E3 и E4+.

Таблица 9. Тушение триптофановой флуоресценции апобелков ЛОНП и ЛНП анионами I- при 25 и 40°C (структурное исследование).

°C E3 E2+ E4+ ТГн ТГв ТГн ТГв ТГн 0,46 ± 0,03 (11)# 0,43 ± 0,02 (6)2- ЛОНП 25 0,36 (0/2) 0,33 ± 0,04 (1/3) 0,53 (0/2) f 40 0,28 ± 0,02 (11) 0,38 ± 0,03 (6)* 0,31 (0/2) 0,27 ± 0,03 (1/3) 0,25 (0/2) KШ-Ф, M -1 25 6,02 ± 1,30 (11) 4,85 ± 0,71 (6) 6,24 (0/2) 5,52 ± 1,32 (1/3) 3,22 (0/2) 40 9,43 ± 2,04 (11) 3,64 ± 0,55 (6)* 5,29 (0/2) 4,92 ± 1,29 (1/3) 7,54 (0/2) ЛНП 25 0,55 ± 0,02 (12) 0,48 ± 0,02 (7) 0,75 (0/2) 0,48 ± 0,02 (1/3) 0,51 (0/2) f 40 0,65 ± 0,06 (12) 0,59 ± 0,09 (7) 0,55 (0/2) 0,42 ± 0,03 (1/3)* 0,69 (0/2) KШ-Ф, M -1 3,73 ± 0,32 (12)# 25 4,65 ± 0,71 (7) 3,22 (0/2) 4,65 ± 0,86 (1/3) 4,26 (0/2) 40 2,07 ± 0,29 (12) 3,10 ± 0,62 (7) 2,41 (0/2) 4,77 ± 0,58 (1/3)* 1,94 (0/2) Таблица 10. Эффективность связывания липопротеинов с ЛНП-рецептором и содержание липидов плазмы в группах пациентов второй когорты, сформированных на основе содержания ТГ плазмы и фенотипа апоЕ (функциональное исследование).

E3 E2+ E4+ ТГн ТГв ТГн ТГв ТГн ТГв ТГ плазмы, мг/дл 62 – 391 56 – 317 42 – 130 ± 7 (22) 286 ± 15 (13)* 105 ± 19 (0/6) 279 ± 20 (0/3)* 115 ± 32 (1/4) 321 (1/2)* ХС плазмы, мг/дл 152 – 317 141 – 281 174 – 225 ± 7 (22)2-3 244 ± 14 (13) 187 ± 12 (0/6) 245 ± 18 (0/3)* 200 ± 16 (1/4) 207 (1/2) ХС-ЛНП, мг/дл 51 – 233 73 – 180 97 – 156 ± 7 (19)2-3 148 ± 16 (11) 112 ± 14 (0/5) 158 (0/2) 147 (0/2) 105 (1/2)* ХС-ЛВП, мг/дл 28 – 67 38 – 68 36 – 47 ± 1 (20) 40 ± 3 (11)* 52 ± 5 (0/5) 41 (0/2) 49 ± 1 (1/4) 37 (1/2)* 8 -1 3- ЛОНП Ka, 10 М 3,32 ±0,36 (22) 4,63 ± 0,72 (13)* 3,91 ± 0,31 (0/6) 4,00 ±1,22 (0/3) 6,99 ± 2,07 (1/4) 2,97 (1/2) 1,10 ±0,07 (12)2-3 0,78±0,14 (0/4)2-4 1,62 (0/2)*,2- Bmax, A492 1,06 ± 0,07 (22) 1,18 ± 0,09 (1/3) 1,28 (1/2) Ka, 108 М- ЛНП 1,04 ± 0,13 (14) 0,85 ± 0,12 (8) 1,03 ± 0,31 (0/4) 0,61 ± 0,25 (0/3) 1,03 ± 0,20 (1/3) 0,72 ± 0,19 (1/3) 1,52 (0/2)2- Bmax, A492 1,12 ± 0,05 (14) 1,20 ± 0,09 (7) 1,12 ± 0,33 (0/2) 1,05 ± 0,09 (1/3) 0,96 ± 0,09 (1/3) IC50, мг ХС-ЛНП/дл 77 ± 18 (12) 39 ± 9 (7) 22 ± 5 (0/3) 12 (0/2) 30 (0/2) 20 (1/2) ) Надстрочные индексы обозначают значимые (p 0,05) различия при сравнении: *, в строке подгрупп ТГн и ТГв внутри индивидуальной группы;

2-3), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E3;

2-4), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E4+;

3-4), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E3 и E4+;

#), в колонке параметра для ЛОНП или ЛНП при 25 и 40 °C.

В группе Е4+ (только подгруппа ТГн) в частицах ЛОНП снижено содержание ХС и апоЕ по сравнению с пациентами группы Е2+. В отличие от частиц ЛОНП из группы Е3, для частиц ЛОНП из группы Е4+ отношение ТГ/ХС положительно коррелировало с содержанием ТГ плазмы. Для величины ПТ отмечена тенденция к максимальному значению для трех групп и отрицательная корреляция с ТГ плазмы и ТГ-ЛОНП. Для частиц ЛНП, содержание ТГ и отношение ТГ/ХС были наименьшими для трех групп и величина ПТ имела тенденцию к минимальному значению для трех подгрупп.

Упаковка и динамика молекул апобелков на поверхности изолированных частиц ЛОНП и ЛНП изучена с помощью тушения триптофановой флуоресценции апобелков анионами I при температурах 25 и 40 °С для учета влияния фазового перехода липидов (табл. 9). Для частиц ЛОНП, доступность триптофанилов f при 40 °С положительно коррелировала с ХС ЛОНП и с содержанием апоЕ в ЛОНП для группы Е3 и отрицательно коррелировала с ТГ плазмы для группы Е2+. Параметр КШ-Ф для флуоресценции ЛОНП при 40 °С отрицательно коррелировал с содержанием ТГ плазмы, ХС-ЛОНП и с содержанием апоЕ в ЛОНП для группы Е3. Для частиц ЛНП, доступность триптофанилов характеризовалась тенденцией к увеличению при нагревании частиц из Е3 группы безотносительно содержания ТГ плазмы и частиц E4+/TGн и тенденцией к снижению для частиц группы Е2+ безотносительно уровня ТГ плазмы. Параметр f для флуоресценции ЛНП при 40 °С отрицательно коррелировал с содержанием ТГ плазмы для группы Е2+.

При совместном рассмотрении данных для трех групп обнаружено возрастание доступности триптофанилов ЛОНП при 25 °С с минимальным значением fmin = 0,28 ± 0, при увеличении плотности упаковки триптофанилов (рис. 8). Значение fmin хорошо соответствует наименьшему экспериментальному значению f и может служить оценкой доступности триптофанилов в полностью ассоциированных молекулах апобелков в частицах ЛОНП. Константа тушения флуоресценции апоВ в составе ЛНП при 40 °С возрастала при увеличении отношения ТГ/ХС в частицах (рис. 8), возможно, за счет “замораживающего” действия ХС на подвижность апоВ. Значение KШ-Ф(min) = 0,97 M-1 может служить нижней оценкой динамики триптофанилов в ХС-“замороженных” частицах ЛНП.

Функциональное исследование. Три группы пациентов из второй когорты, сформированные аналогично структурному исследованию, характеризовались сопоставимым содержанием липидов плазмы. Для трех групп изучены параметры связывания изолированных ЛОНП и ЛНП с ЛНП-рецептором in vitro (табл. 10). В группе Е3 для связывания частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением константы ассоциации Ka, максимальное число участков Bmax не менялось. Для связывания ЛНП, значение Ka характеризовалось тенденцией к снижению, значение Bmax не менялось.

0, Е4+(ТГн) f(ЛОНП при 25 C) o 0,5 Е3(ТГн) 0, Е3(ТГв) Е2+(ТГн) 0, а Е2+(ТГв) 0, 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4, 6 ПТx10, Trp/нм Е2+(ТГв) - KШ-Ф (ЛНП при 40 C), M o Е3(ТГв) Е2+(ТГн) Е3(ТГн) б Е4+(ТГн) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0, ТГ/ХС, моль/моль Рис. 8. Влияние состава ЛОНП и ЛНП на динамику и топографию апобелков. (а) – доля f триптофанилов ЛОНП, доступных для анионов I- при 25 °C как функция плотности триптофановых остатков ПТ на поверхности частиц. (б) – константа тушения Штерн Фольмера КШ-Ф флуоресценции ЛНП при 40 °C как функция отношения ТГ/ХС для частиц.

Значения констант ассоциации для связывания ЛОНП ((3,3-4,6)·108 M-1) и ЛНП ((0,8-1,0)· M-1) соответствовали данным других авторов (Chappell et al., 1992;

Chappell and Medh, 1998).

Зависимости между Ка(ЛОНП), содержанием апоЕ в ЛОНП и плазме, с одной стороны, и содержанием ТГ плазмы с другой, аппроксимировали функцией с насыщением. Для трех параметров средние величины содержания триглицеридов ТГ1/2, при которых достигалось 50% максимального эффекта, составляли 88-103 мг/дл. Область значений 2ТГ1/2 близка к "отрезному" значению концентрации ТГ 1,5 ммоль/л (133 мг/дл) (Packard and Shepherd,1997), при превышении которого заметно накопление небольших плотных ЛНП-III. В группе E2+ - Е4+(ТГн) Ka(ЛОНП), 10 M Е3(ТГв) Е2+(ТГв) 4 Е3(ТГн) Е2+(ТГн) а Е4+(ТГв) 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4, апоЕ/апоВ, моль/моль 1, Е2+(ТГв) e-1+j j-1+e e-1+j (E3i )(C-IIIj )(E2e-i ) 1, ТГн (jmax=15) минBmax Bmax(ЛОНП), A 1, ТГв (jmax= 8) максBmax Е4+(ТГн) 1,2 Е3(ТГв) 1, Е3(ТГн) Е2+(ТГн) 0, б 0, 6 8 10 12 14 16 апоC-III/апоВ, моль/моль 1, 1, Е3(ТГн) Е4+(ТГн) - Ka(ЛНП), 10 M 1, Е2+(ТГн) 0, Е3(ТГв) Е2+(ТГв) 0, в 0, 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8, 6 ПТх10, Trp/нм Рис. 9. Влияние состава ЛОНП и ЛНП на связывание липопротеинов с ЛНП-рецептором.

Схема: вставка молекул апоC-III между лигандными молекулами апоЕ3. Нижний индекс соответствует стехиометрии конкретного апобелка в комплексе апоЕ-апоC-III, верхний индекс соответствует максимальному числу возможных контактов между прилегающими молекулами одного или другого апобелка, e – общее число молекул апоЕ, i – общее число молекул апоЕ3, j – общее число молекул апоC-III.

(только E2/3 гетерозиготы) для связывания ЛОНП, при увеличении содержания ТГ плазмы начально высокое значение Ka не менялось, тогда как значение Bmax возрастало, будучи значимо выше значений для групп E3 или E4+. В группе Е4+ для связывания частиц ЛОНП, при увеличении содержания ТГ плазмы изначальное высокое по сравнению с группой Е значение Ka характеризовалось тенденцией к снижению, тогда как параметр Bmax не изменялся.

Изучена связь Ka и Bmax с содержанием апоE и апоC-III в частицах ЛОНП для всех трех групп. Константа ассоциации возрастала при увеличении содержания апоЕ в ЛОНП (рис. 9).

Максимальное число участков связывания снижалось при увеличении содержания апоC-III в ЛОНП (рис. 9) с максимальной выраженностью эффекта для группы Е2+. Возможно, это отражает вставку дополнительных молекул апоC-III между прилежащими друг к другу молекулами апоЕ с увеличением среднего расстояния между лигандными молекулами (”спейсерный” эффект). Для ЛНП, связь параметра Ka с относительной плотностью упаковки триптофанилов описывалась зависимостью, проходящей через максимум (рис. 9), что соответствует данным других авторов (Lund-Katz et al., 1998) о максимальных значениях Ka для связывания ЛНП промежуточного размера.

Оценена возможная конкуренция между ЛОНП и ЛНП за связывание с ЛНП рецептором in vivo. Параметр IC50 соответствует концентрации ЛОНП, ингибирующей связывание ЛНП на 50% (табл. 10). Для трех групп при увеличении содержания ТГ плазмы параметр IC50 характеризовался тенденцией к снижению, что соответствует увеличенной эффективности связывания ЛОНП и/или сниженной для ЛНП. Действительно, для группы Е3 параметр IC50 отрицательно коррелировал с Ka(ЛОНП) и положительно с Ka(ЛНП), то есть в сосудистом русле гипертриглицеридемика ЛОНП и ЛНП могут конкурировать за связывание с ЛНП-рецептором. Значения IC50 проявляли тенденцию к наибольшим значениям для группы Е3 безотносительно содержания ТГ плазмы.

РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИЗА IN VITRO Обратимое связывание амфипатических апобелков с ЛОНП Исходя из известных параметров связывания апобелков с ЛОНП, рассчитано остаточное содержание апоЕ, апоC-II и апоС-III на поверхности ЛОНП при разведении частиц. При разведении от 1 до 0,01 мг белка/мл степень насыщения уменьшалась от 100% до 35-39% для апоC-II и апоC-III и до 7% для апоЕ. Таким образом, степень диссоциации апобелков в разбавленных растворах ЛОНП может достигать заметных значений. В этой связи сравнена доступность эпитопов этих апобелков в растворе и в составе ЛОНП. Fab фрагменты антител связывались с флуоресцеин-мечеными апобелками в растворе с высокой аффиностью: значение константы диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе составило 12 нМ для апоС-II и 20-75 нМ для апоС-III при стехиометрии, близкой к 1.

Разведение препаратов ЛОНП приводило к увеличению доступности антигенных детерминант апоЕ от 7% при концентрации белка ЛОНП 0,6 мг/мл до 48% при 0,077 мг/мл, но доступность апоC-II и апоC-III была низкой и разведение влияло незначительно. Различия в реакции Fab-фрагментов с апобелками в растворе и в ЛОНП могут объясняться маскированием антигенных детерминант апобелков в частицах;

при разведении препарата ЛОНП апобелки диссоциируют от поверхности частиц. Оценка размера лигандной зоны при связывании ЛОНП с ЛНП-рецептором и "сшивание" апобелков ЛОНП выявили кластерный характер локализации апоЕ на поверхности частицы. Наличие маскированных эпитопов апобелков за счет белок-белкового и/или белок-липидного взаимодействия может объяснять гетерогенность пула апобелков в реакции обмена между апобелок-содержащими частицами (Bukberg et al., 1985;

Ibdah et al., 1991) и низкую иммунохимическую реактивность апобелков в нативных липопротеинах (Barr et al., 1981;

Mao et al., 1980).

Эффекторная роль амфипатических апобелков в ЛПЛ-катализируемом гидролизе триглицеридов Активаторные свойства апоC-II в гидролизе псевдосубстрата. Измерены app app кинетические параметры Vmax (кажущаяся максимальная скорость реакции) и Km (кажущаяся константа Михаэлиса) гидролиза эмульгированного триолеина липопротеинлипазой (ЛПЛ) из коровьего молока при нескольких фиксированных концентрациях апоС-II относительно контрольных значений в его отсутствие (табл. 11).

app Значение Vmax в присутствии апобелка увеличивалось в 3-4 раза и не изменялось при app варьировании его содержания. Значение Km при небольшой концентрации апоС-II было существенно меньше контрольного значения, а затем увеличивалось при возрастании содержания апобелка, превысив контрольное значение при концентрации апоС-II 72 мкг/мл.

app app Km и меньшее по выраженности увеличение Vmax Существенное снижение при концентрации апоС-II 8,5 мкг/мл объясняются увеличенной скоростью распада комплекса ЛПЛ-триолеин-апоC-II по сравнению со скоростью катализа в отсутствие активатора.

Активатор в небольших концентрациях увеличивает эффективность катализа за счет индукции конформационного изменения молекулы ЛПЛ, что экспериментально обнаружено (Posner et al., 1983). При увеличении концентрации активатора в среде инкубации фермент app насыщается активатором и Vmax не зависит от содержания апоC-II. Монотонное увеличение app Km может иметь в основе мицеллирование субстрата (из-за недостаточной стабилизации детергентом) при добавлении апобелка с суммарным снижением размеров частиц.

Связывание ЛПЛ прямо коррелирует с размером липопротеина (Fisher et al., 1995) или микроэмульсий (Yamamoto et al., 2003). Итак, апоC-II активирует ЛПЛ in vitro за счет прямого взаимодействия фермент-активатор.

Таблица 11. Влияние апоС-II на гидролиз липопротеинлипазой эмульгированного триолеина Параметр апоС-II, мкг/мл 8,5 17 46 3,0 3,4 2,7 3, app app V (+апоC-II)/ V (-апоC-II) max max очень мало 0,23 0,53 1, app app K (+апоC-II)/ K (-апоC-II) m m Апобелки ЛОНП и регуляция липолиза. При возбуждении в полосе поглощения триптофановых и тирозиновых остатков (281 нм) спектр флуоресценции частиц ЛОНП с апоВ, апоЕ и апоС имел максимум при 332 нм и полуширину 58 нм, при чисто “триптофановом” возбуждении (295 нм) соответствующие параметры равнялись 335 и 55 нм.

Спектр флуоресценции частиц ЛНП с апоВ при возбуждении 281 нм имел максимум при нм и полуширину 55 нм, при “триптофановом” возбуждении эти величины равнялись 332 и 51 нм. Эти параметры характерны для гидрофобного расположения флуорофоров обоих классов частиц;

в то же время наличие амфипатических апоЕ и апоС на поверхности ЛОНП отражается в более длинноволновом и более гетерогенном спектре испускания. Константа тушения флуоресценции триптофанилов ЛОНП акриламидом превышала аналогичную величину для ЛНП в 1,58 раза, доступность флуорофоров ЛОНП для молекул тушителя была ЛОНП меньше доступности триптофанилов ЛНП на 8%. Большее значение К Ш Ф может отражать увеличенную подвижность апоЕ и апоС в составе ЛОНП по сравнению с апоВ в составе ЛНП и/или сниженную микровязкость частиц ЛОНП. Снижение значения f ЛОНП может быть связано с кластерным характером расположения амфипатических апобелков на поверхности ЛОНП и (или) их частичным экранированием апобелком В. Действительно, при изучении кинетики протеолиза трипсином апобелков ЛОНП обнаружена быстрая деградация апоВ, протеолиз амфипатических апобелков происходит с существенно меньшей скоростью.

Обнаружена диссоциация амфипатических апобелков ЛОНП при обработке частиц неионным (твин-20) и ионным (дезоксихолат натрия) детергентами в не-солюбилизирующих частицы концентрациях: в реизолированных нативных и подвергнутых действию твин- частицах ЛОНП при одинаковом содержании апоВ снижалось содержание апоС и особенно апоЕ в обработанных детергентом частицах. Свободные жирные кислоты как продукты липолиза могут обладать схожим действием. Действительно, сравнение кинетик накопления свободных жирных кислот, изменений интенсивности флуоресценции и светорассеяния при добавлении к частицам ЛОНП липопротеинлипазы выявило, что появление свободных жирных кислот в мономерной форме, когда еще нет возрастания светорассеяния, характеризуется более быстрой кинетикой по сравнению с диссоциацией апобелков.

Накопление продуктов липолитической деградации частиц ЛОНП, обладающих детергентными свойствами, приводит к диссоциации апобелков, которые являются эффективными регуляторами липолиза. Изучена связь между содержанием апоС-II относительно суммы (апоС-II + апоC-III) в частицах ЛОНП, реизолированных после действия твин-20, и первоначальным отношением детергент/белок ЛОНП (рис. 10). Эта связь характеризовалась зависимостью с максимумом, возможно, из-за различного сродства апоС II и апоС-III к поверхности частиц ЛОНП. Связь между изменением кажущихся кинетических параметров липолиза и отношением детергент/белок ЛОНП описывалась Vmax(+твин)/Vmax (-твин) Кm(+твин)/ Кm(-твин) Кm(+твин)/ Кm(-твин) C-II/(C-II + C-III), % Vmax(+твин)/ Vmax(-твин) мг твин-20/мг белка ЛОНП app Рис. 11. Связь кинетических параметров Km Рис. 10. Влияние твин-20 на относительное содержание апоС-II среди суммарных С- app и Vmax липолиза ЛПЛ частиц ЛОНП, app апобелков (1) и кинетические параметры Km реизолированных после действия твин-20 (n app = 23).

(2) и Vmax (3) липолиза ЛПЛ частиц ЛОНП, реизолированных после действия детергента.

аналогичными зависимостями (рис. 10). Для липолиза обработанных детергентом частиц по app сравнению с нативными образцами относительное изменение Km линейно зависело от app app относительного изменения Vmax (рис. 11) (для нативных частиц ЛОНП Vmax = 50,5 ± 6, мкмоль Н+/мин на 1 мг белка липопротеинлипазы, Km = 0,128 ± 0,036 мг/мл (n = 23)). Эти app результаты могут быть связаны с бесконкурентным ингибированием активности ЛПЛ апобелком С-III. Бесконкурентное ингибирование исключает возможность прямого взаимодействия ингибитора и липопротеинлипазы и согласуется с результатами других авторов (Matsuoka et al., 1980), которые показали отсутствие взаимодействия между апоC-III и иммобилизованным на сорбенте ферментом. Возможно, ингибитор и фермент-субстратный комплекс взаимодействуют на поверхности частиц. Снижение каталитической активности фермента наряду с его увеличенной сорбцией в присутствии ингибитора может отражать взаимодействие амфипатических спиральных участков апоС-II и апоС-III. Если фосфолипид связывающий фрагмент апоС-II необходим для проникновения активного центра ЛПЛ к sn-I ацильной связи (Vainio et al., 1983), то взаимодействие фосфолипид-связывающих фрагментов апоC-II и апоС-III может затруднять образование комплекса ЛПЛ-(апоC-II)-ТГ.

Нельзя, однако, полностью исключить ингибирующее действие и апоЕ, так как добавление апоЕ приводило к снижению кажущихся максимальной скорости и константы Михаэлиса в апоС-II-активируемом гидролизе ТГ в эмульсиях ФХ/ТГ (Yamamoto et al., 2003), а добавление твин-20 в наших условиях приводило к выраженной диссоциации апоЕ от частиц ЛОНП. Относительное содержание апобелковых эффекторов на поверхности частицы ЛОНП может определять эффективность липолитического процесса.

ВЛИЯНИЕ АПОЕ НА ОСНОВНЫЕ ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ ПРИ НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ IN VIVO Соотношение путей для изоформы апоЕ Липопротеины плазмы крови пациентов третьей когорты с фенотипом Е3/3, окрашенные флуоресцентным зондом 6-((N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4 ил)амино)гексаноил)сфингозином как аналог церамида, с помощью капиллярного изотахофореза (КИТФ) разделялись на 11 компонент. Первые шесть компонент В1 - В обозначены как быстрые (В1, В2), промежуточные (В3, В4, В5) и медленный (В6). Среди четырех Н1 - Н4 компонент аналогично выделяли быстрый (Н1), промежуточный (Н2) и медленные (Н3, Н4) компоненты. Компоненты В1 - В6, (О+П) и Н1 -Н4 содержали ЛВП, ЛОНП и ЛНП соответственно и масса В- и Н-пулов, пересчитанная на содержание ХС, значимо коррелировала с содержанием ХС-ЛВП и ХС-ЛНП, определенным с помощью преципитации. Можно предположить полную или частичную идентичность компонент Н1 и (промежуточные ЛНП-II + небольшие ЛНП-III), Н2 и больших ЛНП-I соответственно.

Действительно, отношение Н1/Н2 возрастало в 2 раза при увеличении содержания ТГ плазмы от 53 до 381 мг/дл. Отношение Н1/Н2 можно рассматривать как индикатор накопления небольших плотных ЛНП-III, специфичных для про-атерогенного В-фенотипа.

Внутри В-пула, как промежуточные (В4+В5), так и медленный (В6) компоненты значимо возрастали в 1,4 и 1,7 раза соответственно при увеличении содержания ТГ. Основываясь на увеличении содержания пре-1-ЛВП при ожирении (Sasahara et al., 1997), можно предположить идентичность пре-ЛВП и компонента В6. Медленный, промежуточные и быстрые В-компоненты могут быть ассоциированы с начальным, промежуточным и конечным компартментами в цепи генерации эфиров ХС с участием ЛХАТ. Тогда отношения (В1+В2)/(В4+В5) и (В4+В5)/В6 могут служить индикаторами эффективности двух этапов ЛХАТ-катализируемой трансформации ЛВП. Оба параметра проявляли тенденцию к снижению при увеличении содержания ТГ и эффективность реакции с участием ЛХАТ может снижаться при гипертриглицеридемии;

аналогичный вывод сделан в работе (Brites et al., 2000).

Возможные связи между метаболизмом ЛВП и ЛОНП могут отражаться в зависимости двух отношений (В4+В5)/(О+П) и В6/(О+П) от содержания ТГ. Первый параметр отрицательно коррелирован с содержанием ТГ и отношение изменялось в 2,4 раза для крайних концентрационных точек. Аналогичная тенденция получена и для отношения В6/(О+П). Дефицит насцентных частиц ЛВП при гипертриглицеридемии, несмотря на увеличение их относительного содержания в В-пуле, может отражать изменение метаболизма ЛОНП, например, нарушение их липолиза. Помимо этого, причинами развития гипертриглицеридемии могут являться избыточный синтез больших ЛОНП (Packard and Shepherd, 1997) с накоплением апоЕ в частицах (Batal et al., 2000) и наоборот, апоЕ может индуцировать синтез ТГ (De Beer et al., 2000;

Tsukamoto et al., 2000). Возможное ингибирующее действие апоЕ на активность ЛПЛ может приводить к снижению образования пре-ЛВП при липолизе ЛОНП - одного из основных путей генерации пре-частиц (Fielding and Fielding, 1995);

это может являться "отрицательным" вкладом апобелка в стационарный уровень пре-ЛВП, сопряженным с увеличением содержания ТГ плазмы. "Положительный" вклад апоЕ в генерацию пре-ЛВП может быть предположен из активаторного действия апоЕ на активность печеночной липазы (ПЛ) при гидролизе фосфолипидов апоЕ содержащих ЛВП (Thuren et al., 1991;

Thuren et al., 1992). Распределение апоЕ между ЛВП и ТГ-богатыми частицами сдвигается при гипертриглицеридемии. В этой связи проанализировано распределение апоЕ между липопротеинами и метаболические связи в стационарных условиях и при индукции липолиза in vivo в зависимости от фенотипа апоЕ.

Влияние изоформ на распределение апоЕ между липопротеинами При разделении липопротеинов плазм, окрашенных флуоресцирующим аналогом церамида в условиях увеличенного разрешения, в профиле КИТФ присутствовало компонент. В профиле распределения флуоресцеин-меченного апоЕ между липопротеинами присутствовало 11 компонент (рис. 12). Частицы ЛОНП содержались в пике 8, что следовало из селективного увеличения пика при добавлении к образцу плазмы аутологичных ЛОНП.

Можно соотнести первые семь пиков в церамидном (1-7Cb) и апоЕ-профилях (1-7Eb) с ЛВП, пик 8 (8Cb, 8Еb) с ЛОНП, последние четыре пика в церамидном (9-12Cb) и три пика в апоЕ профилях (9-11Еb) с липопротеинами промежуточной/низкой плотностей. Содержание ХС и апоЕ в ЛОНП, рассчитанное из относительных площадей пика ЛОНП и содержания ХС и апоЕ плазмы, значимо коррелировало с содержанием ХС и апоЕ в изолированных ЛОНП.

Таким образом, можно измерить содержание ХС и апоЕ в индивидуальных липопротеинах, разделенных с помощью КИТФ, после окрашивания плазм церамидным зондом и апоЕ/Ф.

Сформированные по фенотипу апоЕ три группы пациентов четвертой когорты – гомозиготы Е3/3, гетерозиготы Е2/3 и Е3/4 – не различались между собой по антропометрическим и базальным (“before” - до введения гепарина) величинам содержания липидов и апобелков в плазме. Спустя 10 мин после внутривенного введения гепарина (“after”) в дозе 50 м.е./кг для стимуляции липолиза in vivo, содержание ТГa плазмы снизилось в среднем на 21%, 21% и 12% для групп Е33, Е23 и Е34 соответственно. Содержание ТГ относительно базального значения в частицах ЛОНП, изолированных из пост-липолизных плазм, снижалось в среднем на 38%, 40% и 43% для групп Е33, Е23 и Е34 соответственно.

Содержание апоЕ в пост-липолизных частицах ЛОНП имело тенденцию к снижению.

Аналогично содержание апоC-III снижалось, значимо для группы Е34.

29000 1,1e+05 1,1e+ б а I, отн. ед.

I, отн. ед.

50000 50000 14000 -10000 -10000 -1000 - 340 360 380 400 340 360 380 время, с время, с 29000 1,1e+05 1,1e+ в г c I, отн. ед.

I, отн. ед 50000 50000 14000 -10000 -10000 -1000 - 330 350 370 390 410 340 360 380 время, с время, с отн. площадь отн. площадь д е 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рис. 12. Локализация ЛОНП в профиле КИТФ (пациент 13). Церамидные (а,в,д) или апоЕ/Ф профили (б,г,е) получали до (а,б) или после (в,г) добавления ЛОНП;

приведены изменения площадей пиков (д,е). Содержание ТГ плазмы – 1,32 мМ, ХС-ЛВП – 1,27 мМ, фенотип E3/4.

относительная площадь относительная площадь 0, E а E 0,2 E 2-3)** 2-4)** 0, 0, 0 2 4 6 8 10 С-липопротеин 0, 3-4)* б 0, 0, 0, 0 2 4 6 8 10 Е-липопротеин в апоE в 8Е, нM 0 100 200 300 апоC-III в "контейнере" 8, нM Рис. 13. Фенотип-зависимое распределение интенсивности флуоресценции при окрашивании плазмы церамидным зондом (а) и апоЕ/Ф (б) и вытеснение апобелка (в). Вытеснение апоЕ/Ф из ЛОНП при титровании апобелком C-III-1 плазмы из пациента 8 с фенотипом Е3/ описывали уравнением: y = A1 + A2*exp(-A3*x).

Для трех групп пациентов изучено распределение церамидного зонда и апоЕ/Ф до введения гепарина (рис. 13). При сравнении сигнала зонда из пулов ЛВП, ЛОНП и ЛПП/ЛНП три группы не различались между собой. При окрашивании апоЕ/Ф основная доля сигнала соответствовала "быстрым" ЛВП (1Eb, 3Eb) и липопротеинам 9Eb (Е33) или 8Eb (Е34) (рис. 13). Содержание апоЕ в ЛОНП пациентов с фенотипом Е3/3 по сравнению с Е3/ значимо снижено. Таким образом, связывание апоЕ с ЛОНП было фенотип-зависимым и максимальным для гетерозигот Е3/4. Предположенное взаимодействие между N- и C доменами в молекуле апоЕ4, но не апоЕ3, может лежать в основе преимущественного связывания апоЕ4 с частицами больших размеров по сравнению с ЛВП и отсутствия влияния кривизны поверхности частицы на связывание апоЕ3.

Относительное сродство апоЕ к липопротеинам изучено при титровании плазм in vitro апоC-III-1 и последующем анализе остаточного содержания апоЕ/Ф. Расчитаны размер невытесняемого пула (параметр А1), предельная сорбционная емкость липопротеина для апоЕ в отсутствие интерференции со стороны апоC-III (параметр A2) и эффективность вытеснения апоЕ апобелком C-III (параметр A3) (рис. 13). Связывание апоЕ с пиком 8Eb для группы Е34 относительно Е33 характеризовалось увеличенным размером невытесняемого пула апоЕ и тенденциями к увеличению предельной сорбционной емкости и снижению эффективности вытеснения, что может определять преимущественное связывание апоЕ с ЛОНП для группы Е34 в сравнении с Е33. Для группы E33, содержание апоЕ в липопротеине 9Eb положительно коррелировало с размером невытесняемого пула. Возможно, белок белковые взаимодействия контролируют содержание апоЕ в этом ремнантном липопротеине.

Кроме того, содержание апоЕ может контролироваться относительным сродством апоЕ (1Eb) или предельной сорбционной емкостью (2Eb, 5Eb, 8Eb). На содержание апоЕ в других липопротеинах апоС-III может не оказывать влияния. Из сравнения величин отношения абсолютных площадей апоЕ/Ф- и церамид-окрашенных пиков следует, что по крайней мере для групп Е33 и Е34 есть два типа упаковки апоЕ – первый в частицах ЛВП с промежуточной электрофоретической подвижностью (Е3b) и второй в липопротеинах 4Eb (не включен для Е34), 5Eb, 7Eb, 9Eb и 10Eb. Остальные частицы занимают промежуточное положение. Второй тип упаковки хорошо соответствовал более сложному, чем опосредованному влиянием апоC-III, контролю содержания апоЕ в липопротеинах 1Eb, 4Eb, 5Eb, 9Eb, 10Eb, 11Eb.

Изоформ-зависимые метаболические сети Бивариантный анализ принадлежности идентифицированных по распределению липидного зонда и апоЕ/Ф индивидуальных липопротеинов к одному метаболическому компартменту при положительной корреляции (равновесие между липопротеинами) и отношения субстрат-продукт при отрицательной корреляции позволил обозначить стационарные метаболические сети для групп с разными фенотипами (рис. 14). Для группы Е33, предполагается равновесие между 1Cb и 2Cb, 8Cb и 9Cb, 8Cb и 11Cb. Липопротеины 1Cb и 7Cb, 8Cb и 7Cb, 11Cb и 10Cb вовлечены в отношения субстрат-продукт. Можно предположить вовлеченность активностей ЛПЛ и ПЛ в вариабельность содержания 7Cb. Положительная корреляция между 8Cb и 11Cb может отражать обмен ТГ и ЭХС, катализируемый белком переносчиком эфиров холестерина. Метаболическая сеть на основе распределения апоЕ (а) 2Cb 1Cb 1Eb 2Eb 6Cb 3Eb 6Eb 9Cb 8Cb 4Eb 5Eb 11Cb 8Cb 7Eb 3Cb 8Eb 4Cb 9Eb 5Cb 10Eb 7Cb 11Eb 10Cb 12Cb (б) 4Cb 1Eb 5Eb 11Cb 4Cb 2Eb 11Cb 2Eb 11Cb 5Cb 2Eb 12Cb 1Cb 3Eb 2Cb 4Eb 3Cb 6Eb 8Cb 7Eb 6Cb 8Eb 7Cb 9Eb 9Cb 10Eb 10Cb 11Eb Рис. 14. Метаболические компартменты в сети обмена липопротеинов в группах пациентов Е33 (а) и Е34 (б), детектируемые по распределению церамидного зонда и апоЕ/Ф. Связи установлены на основании положительной (принадлежность к одному компартменту) или отрицательной (отношение субстрат-продукт) корреляций между индивидуальными липопротеинами.

содержит больше связей и включает 9 компартментов: (1Eb + 2Eb);

3Eb;

(4Eb + 5Eb);

6Eb;

7Eb;

8Eb;

9Eb;

10Eb;

11Eb. Связи в двух типах карт не совпадали и липопротеины 1Eb и 3Eb участвуют в сопряжении обмена апоЕ между ТГ-богатыми частицами и ЛВП. Реципрокные связи 11Eb-3Eb и 8Eb-3Eb, возможно, отражают липидный обмен между 11Сb и 8Сb.

Отрицательные корреляции между 7Eb (и 6Eb) и 2Eb или 3Eb отражают роль липопротеина 7Eb как продукта липолиза "быстрых" ЛВП и/или начального субстрата в цепи генерации ЭХС с участием ЛХАТ. Липопротеин 3Eb отрицательно коррелирует с 9Cb и находится в равновесии с 6Cb, за липидную фазу которого конкурируют апоЕ, апоC-III и апоA-I.

Содержание 3Eb отрицательно коррелировало с предельной сорбционной емкостью по апоЕ для 4Eb и содержание 6Eb аналогично зависело от A2:5Eb;

можно предположить связи субстрат-продукт (4Eb-3Eb и 5Eb-6Eb) из-за разно-направленных потоков, контролируемых активностями ЛПЛ и ПЛ. Содержание апоЕ в пост-липолитических частицах ЛОНП отрицательно коррелировало с содержанием апоC-III и ХС в частицах-предшественниках (вследствие ассоциации увеличенного клиренса ЛОНП с увеличенным содержанием апоЕ и/или увеличенной диссоциации апоЕ при липолизе частиц с увеличенным содержанием ХС);

содержание апоЕ в ЛОНП при липолизе контролируется апобелком C-III. Изменение абсолютного и относительного содержания апоЕ и апоC-III при липолизе ЛОНП соответственно отрицательно и положительно коррелировало с содержанием липопротеина 4Cb. Перенос апоC-III на липопротеин 4Cb ассоциирован со снижением размера невытесняемого пула апоЕ (1Eb, 2Eb, 3Eb, 4Eb, 6Eb) и максимальной сорбционной емкости по апоЕ (2Eb, 3Eb, 6Eb) в частицах ЛВП. Наличие положительных корреляций между изменением 2С или 7С и содержанием триглицеридов плазмы и содержанием апоC-III в плазме и ЛОНП до и после введения гепарина предполагает увеличение прироста 2С и 7С при ингибировании клиренса ЛОНП апобелком C-III. Появление ЛВП2 (Forte et al., 1979) и частиц ЛВП с пребета-подвижностью (Barrans et al., 1994) при гепарин-индуцированном липолизе показано и другими авторами. Увеличение прироста 2С и 7С положительно коррелировало с максимальной сорбционной емкостью по апоЕ липопротеинов 2Eb и 3Eb.

Максимальная сорбционная емкость по апоЕ липопротеина 6Eb отрицательно коррелировала с 6Ca-b;