авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ВЕРХУША Владислав Витальевич ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ТАЙМЕРЫ, ПОСТОЯННО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ И ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ БЕЛКИ 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна в Нью-Йорке

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Туроверов Константин Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Левицкий Дмитрий Иванович Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН доктор биологических наук, профессор Пермяков Евгений Анатольевич Учреждение Российской академии наук Институт биологического приборостроения РАН доктор физико-математических наук Тимковский Андрей Леонидович Учреждение Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им.

Б.П. Константинова РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «_» 2011 года в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института: (812) 297-03-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте цитологии РАН

Автореферат разослан «_» 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прижизненная визуализация процессов, происходящих в клетках и организмах, с высоким пространственным разрешением в реальном масштабе времени с использованием в качестве флуоресцентных маркеров зеленого флуоресцентного белка (GFP), его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков, стала в последнее десятилетие одним из наиболее востребованных методов исследования в биологии и медицине. В отличие от других природных пигментов, GFP-подобные белки формируют хромофор без участия внешних ферментных систем или кофакторов, кроме молекулярного кислорода.

Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентных белков (FP) с белками-мишенями. Это свойство делает FP уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами – незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров на различные внутриклеточные метаболиты.

В настоящее время FP широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов как прокариот, так и эукариот.

Возможность одновременного использования нескольких FP с разными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие исследования посттрансляционных изменений, структуры и свойств GFP-подобных белков позволили разработать подходы для целенаправленного создания новых FP с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биологии и биотехнологии.

Все красные FP дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение FP. Получение улучшенных вариантов FP остается важной задачей, решение которой значительно расширяет возможности применения FP в молекулярной и клеточной биологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных FP является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективной техникой сортировки и отбора клеток.

Практическая значимость красных FP особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, поскольку свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Более того, использование красных FP повышает чувствительность детекции флуоресценции, так как автофлуоресценция клеток и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.

Ввиду уникальных биохимических свойств белков семейства GFP, большой практической значимости FP для молекулярной и клеточной биологии, а также биомедицинских исследований, изучение механизмов, лежащих в основе спектральных, фотохимических и биохимических свойств FP, и создание новых FP является актуальной задачей.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось создание новых постоянно флуоресцирующих FP, фотоактивируемых флуоресцентных белков (PAFP) и белков, флуоресценция которых изменяется со временем (т.н. флуоресцентных белков-таймеров (FT)), позволяющих производить флуоресцентное мечение в живых клетках и тканях. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Создание мономерных вариантов FP, PAFP и FT с различными спектральными характеристиками и паспортизация их фотохимических и биохимических свойств.

2. Определение пространственной структуры вновь созданных FP, PAFP и FT белков, изучение структуры их хромофоров, а также аутокаталитических и фотоиндуцированных механизмов их формирования.

3. Изучение свойств новых FP, PAFP и FT в связи с перспективами их использования в качестве маркеров в различных современных методах микроскопии и цитофлуорометрии.

4. Применение улучшенных вариантов FP, PAFP и FT, созданных в ходе выполнения работы, в конструкциях слияния с клеточными белками для решения ряда конкретных задач клеточной биологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Формирование Tyr-содержащих хромофоров красных FP, PAFP и FT происходит через стадию образования синего интермедиата, хромофор которого состоит из имидазольного кольца и N-ацилиминовой группы, не объединенных в систему сопряженных -связей с фенольным кольцом тирозина 64.

2. Автокаталитическая трансформация синего интермедиата в красный хромофор может быть замедлена, полностью остановлена или преобразована в фотоиндуцированный процесс методом сайт-направленного мутагенеза. Тем самым был показан путь целенаправленного превращения мономерных FP в PAFP и FT.

3. Предложен рациональный молекулярный подход, направленный на получение вариантов FP с большим стоксовым сдвигом флуоресценции посредством формирования в них цепей водородных связей для переноса протона в возбуждённом состоянии хромофора.

4. Созданные в работе FP, PAFP и FT являются оптимизированными маркерами для стандартных методов флуоресцентной микроскопии, микроскопии сверхвысокого разрешения и для флуоресцентной визуализации процессов в тканях животных.

5. Полученные в работе FP, PAFP и FT с улучшенными спектральными, биохимическими и фотохимическими свойствами позволяют решать ряд новых биологических задач на живых клетках и тканях млекопитающих.

Научная новизна работы. Созданы двенадцать новых мономерных FP, PAFP и FT, обладающих либо совершенно новыми, либо существенно улучшеными, по сравнению с существующими аналогами, физико-химическими свойствами при экспрессии в качестве белков слияния в клетках. Часть созданных белков не имеет аналогов. Получены кристаллы и определена методом рентгеноструктурного анализа простраственная структура семи белков. На основании этих данных и результатов масс-спектрометрического анализа определены химические структуры хромофоров этих белков, предложены молекулярные механизмы их спектрального, фотохимического и биохимического поведения. Предложена общая схема формирования тирозин-содержащих хромофоров в FP. Показано, что новые FP, PAFP и FT расширяют возможности многоцветового внутриклеточного мечения при использовании методов стандартной флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуорометрии. Вновь созданные варианты FP были применены в качестве маркеров при апробации новых методов оптической микроскопии, таких как регистрация резонансного безызлучательного переноса энергии (Frster resonance energy transfer, FRET), двухфотонное (two-photon, 2P) возбуждение флуоресценции, регистрация изображений сверхвысокого разрешения единичных молекул PALM (photoactivated localization microscopy) и микроскопия сверхвысокого разрешения ансамбля молекул STED (stimulated emission depletion). Созданные FP, PAFP и FT были использованы для решения задач молекулярной клеточной биологии, включая мечение структур в живых клетках, детекцию внутриклеточных взаимодействий и детекцию колокализации белков-мишеней, определение внутриклеточного возраста белков.

Практическое значение полученных результатов. Практическая ценность работы заключается в получении новых мономерных FP, которые можно применять для многоцветового мечения белков, органелл, клеток и организмов различных видов прокариот и эукариот. Разработана стратегия рационального дизайна красных фотоактивируемых FP и FP с большим стоксовым сдвигом, которая может быть использована для получения других подобных маркеров с заданными спектральными характеристиками. Разработано несколько фотоактивируемых красных FP, что открывает новые возможности для прицельного введения и последующего слежения за перемещением одновременно двух флуоресцентно-меченых белков в живых тканях, клетках и органеллах. Становится доступным двухцветовая PALM микроскопия, основанная на использовании двух спектрально различающихся фотоактивируемых FP. Получен мономерный FP, флуоресцирующий в дальне красной области спектра.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в качестве приглашённых докладов на следующих международных симпозиумах и конференциях: "Novel Approaches to Bioimaging II" (Эшберн, США, 2010), 50th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Филаделфия, США, 2010), "Light in Life Sciences" (Мельбурн, Австралия, 2009), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors II" (Эшберн, США, 2009), 238th American Chemical Society National Meeting (Вашингтон, США, 2009), Annual USA-Russian Flow Cytometry Workshop (Москва, 2009), 48th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Сан-Франциско, США, 2008), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors" (Эшберн, США, 2007), The MetroFlow Fall Meeting (Нью-Йорк, США, 2007), 4th Symposium on Biological Imaging "Innovations in Fluorescence Probes for Live-Cell Imaging" (Медисон, США, 2007), NIH Chesapeake Cytometry Consortium meeting (Бетезда, США, 2007), "Frontiers in Microscopy" (Бар Харбор, США, 2006), 57th Pittsburg Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (Орландо, США, 2006), а также на приглашенных семинарах и лекциях в Колумбийском университете (США, 2011), Гарвардском университете (США, 2001, 2007, 2011), Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), Йельском университете (США, 2009), Институте молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2006, 2009), Институте медицинских исследований Бурке (США, 2007), Университете Флориды (США, 2005), Университете Центральной Флориды (США, 2005), Питтсбургском университете (США, 2004), Центре фотомедицины Велмана Массачусетского госпиталя (США, 2004), Институте биоорганической химии РАН (2000, 2003), университете Колорадо (США, 2003), факультете биоинженерии и биоинформатики и факультете химии Московского государственного университета (1999, 2002), Вюрцбургском университете (Германия, 2001), Киотском университете (Япония, 2001), университете Томаса Джефферсона (США, 2001), университете Орегона (США, 2001).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Национальных Институтов Здоровья США (гранты DA019980, GM и GM073913), NATO Collaborative Linkage Grant CBP.NR.NRCLG 981752 (Россия США), федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (контракт 02.740.11.5141) и программы РАН "Молекулярная и клеточная биология".

Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликованы рецензированные печатные работы (44 оригинальные статьи, 6 обзоров и 2 главы в книгах) за период с 1999 по 2010 год.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит _ страницы печатного текста, _ рисунков, таблиц и ссылки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Основным направлением работы стала оптимизация свойств FP и, в частности, получение FP, спектры поглощения (возбуждения флуоресценции) и флуоресценции которых перекрывали бы по возможности больший спектральный диапазон. В задачу работы входило: 1) создание синего FP с улучшенными характеристиками и красных флуоресцентных FP по возможности с большими длинами волн возбуждения флуоресценции и флуоресценции;

2) получение вариантов белков с максимально возможной молекулярной яркостью, т.е. с максимально возможным коэффициентом молекулярной экстинкции и максимально большим квантовым выходом флуоресценции;

3) получение вариантов белков с максимально возможной фотостабильностью;

4) получение мономерных форм FP, не склонных к димеризации и агрегации.

1. Мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP.

К моменту начала работы над диссертацией (1999 г.) уже были получены оптимизированные варианты зеленых и желтых белков, отличающихся высокой молекулярной яркостью (произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции) и высокой фотостабильностью, такие как EGFP и EYFP (Tsien, 1998). Все имеющиеся к этому времени синие FP (BFP) не отвечали этим требованиям. Мы предположили, что создать такие BFP можно путем замены His66 на Tyr66. Однако ранние попытки разработать варианты BFP с Tyr66 в протонированном состоянии на основе GFP путём блокирования переноса протона в возбуждённом состоянии (Ormo et al., 1996) не имели успеха. Мы обратили внимание на то, что образование красного хромофора проходит через стадию образования синего протонированного хромофора (Verkhusha et al., 2004) и что у красных флуоресцентных белков (RFPs) перенос протона в возбужденном состоянии не наблюдается (Hosoi et al., 2006;

Remington, 2006). Поэтому было решено создать BFPs на основе пяти красных белков различного генетического происхождения:

TagRFP (Merzlyak et al., 2007), mCherry (Shaner et al., 2004), mKeima (Kogure et al., 2006), HcRed1 (Fradkov et al., 2002) и M355NA (Bulina et al., 2003). Сайт специфический и случайный мутагенез привёл к тому, что все RFPs были конвертированы в BFP варианты. Эти BFPs содержали ограниченное число Рис. 1. Свойства mTagBFP. (А) Спектры поглощения, возбуждения и эмиссии mTagBFP. (Б) Кинетика созревания mTagBFP и контрольного EBFP2. (В) pH-зависимость для mTagBFP и EBFP2. (Г) Кривые фотовыцветания для mTagBFP (сплошная линия) и контрольных EBFP (коротко-штриховая линия) и Azurite (штриховая линия), полученные при облучении в эпифлуоресцентном режиме. (Д) Кривые фотовыцветания mTagBFP (сплошная линия), EBFP2 (коротко-штриховая линия) и контрольного Azurite (штриховая линия), полученные при сканировании лазером с длиной волны 405 нм. (Е) Спектры флуоресценции очищенной FRET конструкции mTagBFP-mTagGFP до и после протеолитического разрезания. (Ж) FRET mTagBFP-mTagGFP в клетках HeLa, обработанных стауроспорином на панели З. (З) На верхних снимках показаны изображения клеток после обработки стауроспорином. На нижних снимках с помощью псевдоцветов показаны корректированные сигналы FRET.

консервативных мутаций по одним и тем же положениям полипептидной цепи 65L,H, 69K, 84F,W,L, 148F,I, 165A,I,N, 181A,I и 203F,Y (если не указано иное, нумерация здесь и ниже приведена по выравниванию аминокислотной последовательности со стандартным GFP). Дальнейшая селекция мутантов привела к созданию синего мономерного белка mTagBFP, отличающегося от TagRFP восемью аминокислотными заменами: N23D, R69K, P131T, M151T, G175S, C179A, D213N и K214N, спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции которого имеют максимумы соответственно при 399 и 456 нм (Рис. 1А).

1.1. Физико-химические характеристики очищенного mTagBFP.

По сравнению с EBFP2, который являлся наилучшим мономерным BFP (Ai et al., 2007), mTagBFP имеет в 1,6 раза больший молярный коэффициент экстинкции (52000 M1cм1) и в 1,2 раза больший квантовый выход (0,63). Таким образом, молекулярная яркость mTagBFP почти в 2 раза выше, чем у EBFP2, и сравнима с молекулярной яркостью широко используемого EGFP. Более структурированный и узкий спектр флуоресценции mTagBFP по сравнению с EBFP2 (полуширина спектра флуоресценции mTagBFP составляет 59 нм, в то время как у EBFP2 эта величина составляет 70 нм) обеспечивает большее спектральное разделение с другими FPs, что делает mTagBFP весьма перспективным маркером для многоцветового мечения.

При 37C mTagBFP время созревания в два раза короче, а интервал pH стабильности – в два раза шире (pKa ниже 3,0) по сравнению с EBFP2 (Рис. 1Б и 1В).

Фотостабильность mTagBFP при облучении в эпифлуоресцентном режиме сравнима с фотостабильностью Azurite (Mena et al., 2006), но ниже на 40% по сравнению с EBFP2 (Рис. 1Г). При использовании сканирующего конфокального облучения фотостабильность mTagBFP была в 2,1 и 3,3 раза выше, чем фотостабильность EBFP и Azurite, соответственно (Рис. 1Д).

1.2. Использование mTagBFP в качестве донора FRET.

Поскольку спектр флуоресценции mTagBFP и спектры поглощения GFPs имеют значительное перекрывание, mTagBFP может быть хорошим донором в сочетании с GFP (акцептором) при безызлучательном резонансном переносе энергии (FRET). Среди доступных GFP в качестве возможного акцептора был выбран TagGFP из-за его слабого поглощения в спектральной области ниже 400 нм, где возбуждается mTagBFP. Конструкция FRET-маркеров требует, чтобы донор и акцептор были мономерными. После введения известной мономеризующей мутации A206K и дополнительного мутагенеза для сохранения яркости белка был получен яркий мутант TagGFP с заменами L99Q, M153R, V163A и A203K. Эта мутантная форма mTagGFP имеет спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 483 и 506 нм, соответственно.

Расчет показал, что для пары mTagBFP и mTagGFP радиус Фёрстера R0=5, нм, т.е. больше, чем для пары EBFP2-mTagGFP и стандартных пар ECFP-EYFP (Patterson et al., 2000) и mCyPet-mYPet (Nguyen et al., 2005;

Ohashi et al., 2007).

Экспериментальная оценка эффективности переноса энергии была выполнена при помощи протеолитического расщепления сконструированного белка слияния, состоящего из тандема mTagBFP-mTagGFP, соединённого аминокислотной последовательностью -DEVD-, котрая может быть расщеплена каспазой-3 (Рис. 1Е) Эффективность FRET, E, составила соответственно: E=0,57 для mTagBFP-mTagGFP, E=0,38 для EBFP2-mTagGFP, E=0,42 для ECFP-EYFP и E=0,51 для mCyPet-mYPet пар. Это означает, что пара mTagBFP-mTagGFP является лучшей среди имеющихся FRET-пар мономерных флуоресцентных белков.

Эта пара была использована в качестве биосенсора на апоптоз в клетках линии HeLa. Об эффективности переноса судили на основании интенсивности сигнала FRET (Gordon et al., 1998). Начальная эффективность FRET для тандемых пар mTagBFP-mTagGFP и ECFP-EYFP составляла 51,5% и 48%. При инкубации в течение 150 мин с 1 мкМ стауроспорина эффективность FRET снижалась от 51,5% до нуля (Рис. 1Ж, З). Большая эффективность FRET для пары mTagBFP-mTagGFP позволила обнаружить даже слабую протеолитическую активность на начальных стадиях апоптоза. В контрольных экспериментах по соэкспрессии белков в клетках, пара mTagBFP-mTagGFP имела в 6 раз более низкий уровень базового сигнала FRET, по сравнению с парой ECFP-EYFP. Это обусловлено тем, что mTagBFP и mTagGFP, полученные из различных морских организмов, не склонны образовывать гетеродимеры, в отличие от слабо димеризующихся ECFP и EYFP из одного того же природного источника.

1.3. Структура хромофоров mTagBFP и его предшественника TagRFP.

Основываясь на том, что несколько генетически существенно различных RFP удалось превратить в BFP варианты при помощи близких мутаций, а также на наших ранних наблюдениях о том, что хромофор DsRed (Matz et al., 1999) и других RFP при созревании проходит стадию синего протонированного интермедиата (Verkhusha et al., 2004), мы предположили, что механизм образования красного хромофора через синий интермедиат должен быть консервативным. Прямое сравнение хромофоров и их окружения в близко родственных синем и красном флуоресцентных белках должно было пролить свет на этот вопрос. Поэтому мы закристаллизовали и определили пространственную структуру TagRFP и его производного mTagBFP с разрешениями 2,2.

Было установлено, что TagRFP имеет практически планарный анионный DsRed-подобный хромофор (Yabrough et al., 2001) с двойной связью C-C в боковой цепи Tyr64, но в транс-конфигурации. Хромофор mTagBFP содержит N-ацилимин и одинарную связь C-C в боковой цепи Tyr64, что исключает фенольное кольцо Tyr64 mTagBFP из системы сопряженных -связей. При денатурации mTagBFP в щёлочи или кислоте возникают спектры поглощения, которые не характерны для GFP-подобного или DsRed-подобного хромофоров, содержащих двойную связь C C в боковой цепи Tyr хромофора.

Было установлено, что точечные аминокислотные замены в окружении N ацилимина влияют на образование или на фотостабильность синей флуоресценции.

Кроме того, введение алифатических остатков в позицию 64 mTagBFP почти не влияет на спектры поглощения и флуоресценции. Это подтверждает, что двойной связи C-C в боковой цепи Tyr64 не существует. Масс-спектрометрия хромофор содержащего пептида mTagBFP показала, что при формировании хромофора масса фрагмента уменьшается на 20 Да, причём с помощью тандем-масс-спектрометрии мы обнаружили, что связь C-N в Leu63 окислена.

Эти данные указывают на то, что mTagBFP содержит новый тип хромофора – N-[(5-гидрокси-1H-имидазол-2-ил)метилиден]ацетамид, вовлеченный, как и хромофоры TagRFP и mTagBFP, во множество взаимодействий с окружающими их аминокислотами внутри -бочонка.

1.4. Трансформация тирозин содержащих хромофоров.

На основании химических структур хромофоров, данных мутагенеза и имеющихся литературных данных в работе была предложена общая схема химических превращений трипептида, образующего хромофор, согласно которой DsRed-подобный хромофор, такой как в TagRFP, образуется через mTagBFP подобный интермедиат (Рис. 2). После синтеза происходит сворачивание полипептидной цепи FP, которое сопровождается циклизацией трипептида с отщеплением молекулы воды (Рис. 2, АБ). Образующаяся имидазолон содержащая форма имеет спектр поглощения с максимумом около 350 нм.

Рис. 2. Пути образования хромофоров mTagBFP и TagRFP. (А) Нециклизованный хромофорный трипептид. (Б) Циклизованный, но не окисленный предшественник хромофора mTagBFP. (В) Синий mTagBFP хромофор. (Г) Красный TagRFP хромофор DsRed-подобного типа. (Д) Зелёный GFP-подобный хромофор. (Е) Протонированная форма GFP-подобного хромофора. (Ж) Протонированная форма DsRed-подобного хромофора.

Образование этой формы имеет место как для фотоактивируемых PATagRFP (Subach et al., 2010), так и для перманентно флуоресцирующих мутантов GFP (Barondeau et al., 2007). Дальнейшее окисление этой формы кислородом может протекать либо по связи C-C в боковой цепи Tyr трипептида с образованием анионного GFP подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при ~490 нм (Рис. 2, БД), либо по C-N связи первого остатка трипептида с образованием mTagBFP подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при ~400 нм (Рис. 2, БВ), найденного у mTagBFP, синих форм FT белков (Subach et al., 2009) и в «OFF» состоянии PAFP семейства PAmCherry. Образование анионного DsRed-подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при ~580 нм требует окисления mTagBFP-подобного хромофора по связи C-C в боковой цепи Tyr трипептида (Рис. 2, ВГ). Окисление может протекать как автокаталитически (как, например, у TagRFP и mCherry), так и в результате облучения фиолетовым светом, как в случае белков PAmCherry и PATagRFP (Subach et al., 2010). В FT автокаталитический переход ВГ замедлен в различной степени (Subach et al., 2009). В случае PATagRFP в результате облучения фиолетовым светом также может происходить переход БВ.

Практически любая химическая трансформация хромофора на Рис. 2 может быть замедлена или даже заблокирована мутагенезом и может происходить либо автокаталитически, либо быть фотоиндуцированной.

Как GFP- так и DsRed-подобные хромофоры способны к флуоресценции в анионной (депротонированной) форме (Рис. 2Д, Г). Введение дополнительных карбоксильных групп около этих хромофоров приводит к протонированию гидроксильной группы фенольного кольца Tyr хромофора и образованию нефлуоресцентных нейтральных (протонированных) хромофоров с максимумами спектра поглощения при ~400 и ~460 нм (Рис. 2Е, Ж). При облучении этих нейтральных форм светом в максимумах поглощения они переходят в возбужденное состояние, в котором может происходить процесс переноса протона от гидроксильной группы Tyr66 с образованием короткоживущих анионных состояний.

В этих состояниях GFP- или DsRed-подобные хромофоры испускают зеленый или красный фотоны, соответственно, со значительно более низкой энергией, чем энергия поглощенного фотона. Процесс переноса протона в возбужденном состоянии ответствен за так называемый большой стоксов сдвиг, наблюдаемый у некоторых зеленых (Zapata-Hommer et al., 2003;

Ai et al., 2008) и красных (Henderson et al., 2009;

Piatkevich et al., 2010) флуоресцентных белков.

2. Серия мономерных флуоресцентных белков-таймеров.

Для визуализации хронологических и пространственных молекулярных событий на клеточном уровне большой интерес представляет создание флуоресцентных таймеров (FT) – белков, у которых положение спектра флуоресценции изменяется во времени. Единственным доступным к моменту начала работы над диссертацией FT был DsRed-FT, известный также как DsRed-E5 (Terskikh et al., 2000). Однако склонность этого белка к образованию тетрамера препятствовала его использованию в белках слияния. Достигнутое нами понимание механизма формирования хромофоров в FP (Рис. 2) позволило определить путь создания FT, изменяющих флуоресценцию с синей на красную. В качестве исходного материала для направленного мутагенеза был выбран ген красного FP mCherry – мономерного варианта DsRed. Анализ структуры mCherry, а также экспериментальные данные об аминокислотных заменах, влияющих на скорость созревания мутантных вариантов DsRed, позволили выбрать для мутагенеза позиции 42, 44, 65, 69, 106, 148, 203 и 224.

Скрининг бактериальных библиотек мутантов методом проточной цитофлуориметрии и последующий анализ отобранных колоний на чашках Петри выявил два мутанта mCherry/K69R/A224S с быстрым и mCherry/K69R с медленным превращением синего света в красный, которые, однако, имеют низкую яркость флуоресценции. Эти мутанты были подвергнуты случайному мутагенезу. Были выбраны три мутанта mCherry: 1) H17Y, M18V, E34K, K69R, L84W, S112T, S149T, S149T, D178N, N202D, S209T и A224S, 2) M18L, T43S, K69R, L84W, M152I, H176D, Q194L, L205M, Y221C и R227H, и 3) M18V, G24D, E32V, K69R, L84W, D178N, A179V, Q110H и I120V, которые мы назвали соответственно FastFT, MediumFT и SlowFT.

2.1. Основные свойства очищенных рекомбинантных быстрого (FastFT), среднего (MediumFT) и медленного (SlowFT) таймеров.

Синие формы FastFT, MediumFT и SlowFT имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 403/466, 401/464 и 402/465 нм, соответственно (Рис. 3А, Б для FastFT). Соответствующие красные формы имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 583/606, 579/600 и 583/604 нм. Спектры поглощения обеих форм совпадают с соответствующими спектрами возбуждения флуоресценции. Все FT, как и исходный mCherry, не склонны к димеризации.

В процессе созревания FT максимальное накопление синих форм наблюдается через 0,25, 1,2 и 9,8 ч после синтеза FastFT, MediumFT и SlowFT при 37C (Рис. 3В).

После этого доля синих форм FT снижается до нуля, а доля красных форм увеличивается до максимального значения. Скорость этих процессов зависит от температуры (Рис. 3Г, Д, Е). Для каждого FT отношение интенсивностей красной и синей флуоресценции представляет собой параболическую зависимость от времени, которая однозначно связана с возрастом определенного FT.

Молярные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции Рис. 3. Свойства флуоресцентных белков-таймеров. (А) Изменения во времени спектра возбуждения флуоресценции для синей (пик на 403 нм) и красной (пик на 583 нм) форм FastFT при 37C. (Б) Изменения во времени спектра эмиссии флуоресценции для синей (пик на 466 нм) и красной (пик на 606 нм) форм FastFT при 37C. (В) Кинетика созревания синей (чёрным) и красной (серым) форм FastFT (треугольники), MediumFT (квадраты) и SlowFT (круги) при 37C. (Г-Е) Изменение во времени отношения красной к синей флуоресценции для FastFT (Г), MediumFT (Д) и SlowFT (Е) при разных температурах. (Ж-И) рН зависимость интенсивности флуоресценции для синей (Ж) и красной (З) форм и отношение между красной и синей формами (И) для FastFT (треугольники), MediumFT (квадраты), SlowFT (круги) и контрольных EBFP2 (Ж) и mCherry (З) (ромбы).

синих форм FT составляют соответственно 33400-49700 M-1cм-1 и 0,30-0,41.

Флуоресценция синих форм отличается высокой pH стабильностью со значением pKa около 3,0 (Рис. 3Ж). Для сравнения, широко используемый синий белок EBFP характеризуется более низкой pH стабильностью со значением pKa около 4,5.

Коэффициенты экстинкции красных форм FT выше, чем у синих форм, и варьируют от 73100 до 84200 M-1cм-1. Квантовые выходы флуоресценции красных форм FT составляют 0,05-0,09. pH стабильность флуоресценции красных форм близка к исходному mCherry со значениями pKa 4,1-4,7 (Рис. 3З). Для всех FT отношение интенсивности флуоресценции красной и синией форм меняется в пределах физиологических значений pH от 5,4- до 7,4 менее чем на 8%.

2.2. Использование флуоресцентных таймеров для изучения внутриклеточных процессов.

Для того, чтобы охарактеризовать поведение FT в системах, отличных от бактерий, FT были экспрессированы в стабильных клонах клеточной линии S дрозофилы под контролем промотора, индуцируемого металлотионеином. После краткой индукции в течение 0,5, 1 и 2 ч экспрессии FastFT, MediumFT и SlowFT сульфатом меди наблюдали изменение интенсивности синей и красной флуоресценции клеток S2 на протяжении 15 дней, используя метод проточной цитофлуориметрии (Рис. 4А-В). Для изучения свойств FT в клетках млекопитающих была выбрана линия клеток HeLa/Tet-Off. Транскрипцию FT останавливали через несколько часов доксициклином, после чего флуоресценцию клеток анализировали, используя проточный цитофлуориметр (Рис. 4Г-Е).

Следует отметить, что рост флуоресценции синей и красной форм и уменьшение флуоресценции синих форм для всех FT в клетках S2 и HeLa/Tet-Off происходили медленнее, чем изменение сооответствующих параметров для очищенных FT (Рис.

4). Эти данные свидетельствуют о том, что трансляция FT продолжается еще некоторое время после ингибирования экспрессии. Кроме того, FT in vivo подвержены внутриклеточной деградации, о чем свидетельствует медленное уменьшение интенсивности красной флуоресценции после достижения максимума.

Свойства FT были использованы при изучении внутриклеточного транспорта лизосомного рецептора LAMP-2A шаперон-опосредованной аутофагии (chaperone mediated autophagy, CMA) (Eskelinen et al., 2002). По данным проведенных ранее исследований транспорта LAMP биохимическими и иммунофлуоресцентными методами, оставалось не ясным, каким из двух внутриклеточных путей LAMP попадает в лизосомы: прямым – из аппарата Гольджи в поздние эндосомы и лизосомы, или непрямым – из аппарата Гольджи на плазматическую мембрану секреторным путем, а затем в лизосомы посредством эндоцитоза. Поскольку белок слияния LAMP-2A–MediumFT можно было наблюдать в нескольких клеточных компартментах одновременно, именно эту конструкцию слияния применили для изучения транспорта в клетках линии HeLa/Tet-Off.

Исходя из количества синей и красных форм, наблюдаемых для LAMP-2A– MediumFT в разных компартментах, а также из их соотношения, было определено, что LAMP-2A появляется на плазматической мембране не в результате слияния уже существующих лизосомных компартментов, а доставляется из аппарата Гольджи непосредственно после синтеза. Мы определили время нахождения LAMP-2A MediumFT в различных клеточных компартментах при непрямом транспорте: аппарат Гольджи (1,3-1,4 ч) плазматическая мембрана (3,0 ч) ранние и рециклирующие эндосомы (3,0-7,0 ч) поздние эндосомы и лизосомы (после 7,5 ч). Через 12 ч после экспрессии более 90% LAMP-2A находится в поздних эндосомах и лизосомах (Рис.

4Ж).

Рис. 4. Поведение ФТ в клетках S2 дрозофилы и HeLa млекопитающих после импульсного включения экспрессии. (А-В) Изменения во времени флуоресценции синей (чёрные символы) и красной (пустые символы) форм, определенные с помощью проточной цитофлуориметрии в клетках S2 для FastFT (А), MediumFT (Б) и SlowFT (В) при 25C. (Г Д) Изменения во времени флуоресценции синей (синие символы) и красной (красные символы) форм в клетках HeLa/Tet-Off для MediumFT (Г) и SlowFT (Д), экспрессируемых в цитоплазме при 37C. (Е) Точечные гистограммы, полученные на проточной цитофлуориметрии с клетками HeLa/Tet-Off, экспрессирующими SlowFT в цитоплазме при 37C, для выбранных значений времени: 1,5 (зеленый), 7 (светло зеленый), 17 (желтый), (оранжевый) и 56 (красный) часов после добавления доксициклина. (Ж) Внутриклеточная локализация белка слияния LAMP-2A–MediumFT в клетках HeLa/Tet-Off в различные периоды времени после прекращения транскрипции доксициклином. Синяя и красная формы LAMP-2A–MediumFT показаны соответственно зеленым и красным псевдоцветами.

Таким образом, мономерные FT позволяют определять обмен между компартментами, следить за молекулами до и после отдельного клеточного события и определять времена внутриклеточных пост-трансляционных изменений. Наличие трёх FT с различными временами созревания хромофора будет востребовано при исследовании клеточных процессов с существенно отличающимися временными параметрами. Кроме того, синий и красный цвета флуоресценции позволяют использовать FT вместе с GFP вариантами для многоцветного мечения клеточных структур. Мономерное состояние FT позволяет применять их в FRET методах с GFP в качестве FRET партнера. В отличие от тетрамерного таймера DsRed-E мономерные FT могут также использоваться для определения хронологии внутриклеточных белок-белковых взаимодействий.

2.3. Структуры хромофоров FastFT и его синего мутанта Blue102.

Для выяснения молекулярного механизма изменения спектра FT от синего к красному мы определили пространственную структуру белков FastFT (с хромофором M66-Y67-G68) и его мутанта Blue102 (с хромофором L66-Y67-G68), который не изменяет цвет на красный, а всё время остаётся синим. Показано, что переход состояния с синей флуоресценцией в состояние с красной флуоресценцией происходит в соответствии со схемой, представленной на Рис. 2, и связан с замедлением окисления связи C-C в боковой цепи Tyr67 хромофора. Ключевую роль в этом процессе играют остатки Arg70 и Tyr83, так как мутации R70K или W83L существенно ускоряют образование красного, но не оказывают большого влияния на скорость образования синего хромофора. Замены S217A и S217C в FastFT, наоборот, существенно замедляют образование промежуточного синего хромофора, но не влияют на переход из синего в красный, тогда как хромофор FastFT имеет цис конфигурацию, стабилизированую водородной связью между кислородом фенолята Tyr67 и гидроксильной группой боковой цепи Ser146. В Blue102 объемная боковая цепь Ile146 ингибирует цис-конформацию хромофора, тем самым блокируя переход из состояния с синей флуоресценцией в состояние с красной флуоресценцией.

3. Серия фотоактивируемых флуоресцентных белков PAmCherry.

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (PAFP) – исходно не флуоресцирующие, становятся флуоресцентными после краткого облучения фиолетовым светом. PAFP пригодны для практически мгновенного мечения молекулярных субпопуляций и визуализации их последующей динамики внутри клеток. PAFP также являются зондами, необходимыми для новых оптических технологий с высоким разрешением, таких как фотоактивируемая локализационная микроскопия PALM. Особый интерес для развития PALM представляет создание мономерных красных PAFP.

На основании анализа механизма формирования хромофоров (Рис. 2) для создания PAFP мы предложили сделать переход хромофорной структуры из состояния В в состояние Г фотоиндуцированным и при этом модифицировать саму структуру В или её ближайшее окружение таким образом, чтобы в состоянии В структура не флуоресцировала. В качестве исходного материала для направленного мутагенеза был выбран ген mCherry. Насыщенный мутагенез по позициям 148, 165, 167 и 203, расположенным в непосредственной близости к хромофору, и последующий случайный мутагенез позволили выявить три фотоактивируемых Рис. 5. Свойства белков PAmCherry. (А) Спектры поглощения, возбуждения и флуоресценции для PAmCherry1 до и после фотоактивации на длине волны 399 нм. Спектры поглощения и флуоресценции PAmCherry2 и PAmCherry3 сходны. (Б) Кинетика созревания при 37°C для PAmCherry1, PAmCherry2, PAmCherry3 и mCherry. (В) pH-зависимость интенсивности флуоресценции для PAmCherry1, PAmCherry2, PAmCherry3 и tdEosFP. (Г) Относительные скорость и эффективность фотоактивации PAmCherry1 при различных значениях pH.

Значения скорости и эффективности для PAmCherry2 и PAmCherry3 сходны. Кинетика фотоактивации (Д) и фотообесцвечивания (Е) для PAmCherry1, PAmCherry2, PAmCherry3 и tdEosFP. (Ж-И) Цикличное освещение PAmCherry1, rsCherry и rsCherryRev через фильтр 570/30 в течение 12 с и один из следующих фильтров: 390/40 нм в течение 0,6 с (Ж), 436/20 в течение 0,5 с (З), или 480/40 в течение 0,4 с (И). Максимумы сигналов на (Ж-И) нормированы на относительную яркость каждого белка.

варианта с улучшенными характеристиками: PAmCherry1 – E26V, A58T, K69N, L84F, N99K, S148L, I165V, Q167P, L169V и I203R;

PAmCherry2 – M18L, K69N, L84F, A147T, S148L, I165L, Q167A, L169T, A179T, I203R и R226L;

и PAmCherry3 – M18L, A58T, K69N, L84F, M137I, E146D, S148L, I165L, Q167A, D178E и I203R.

3.1. Свойства очищенных белков PAmCherry.

До фотоактивации PAmCherry1, PAmCherry2 и PAmCherry3 имеют спектры поглощения с максимумами при 404-406 нм и не флуоресцируют. В фотоактивированном состоянии белки PAmCherry флуоресцируют в красной области спектра. Они имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами на 564/595, 570/596 и 570/596 нм, квантовые выходы флуоресценции в пределах 0,24-0,53 и молярные коэффициенты экстинкции 18000-24000 M-1см-1 (Рис.

5А). Времена созревания вариантов PAmCherry (18-25 мин при 37C) превышают в 1,2-1,7 раза время созревания исходного mCherry (Рис. 5Б). Все варианты PAmCherry, как и mCherry, являются мономерами.

По сравнению с tdEosFP, PAFP с исходно зеленой флуоресценцией (Wiedenmann et al., 2004), все варианты PAmCherry имеют более высокую рН стабильность со значениями pKa 6,2-6,3 (Рис. 5В). Эффективность и скорость фотоактивации PAmCherry (см. Рис. 5Г для PAmCherry1) уменьшаются при переходе в кислую область рН. Белок PAmCherry1 имеет скорость фотоактивации, более чем в 2 раза превышающую этот параметр для двух других вариантов PAmCherry и в 1,6 раза – для tdEosFP (Рис. 5Д). Скорость обесцвечивания фотоактивированных вариантов PАmCherry в 1,8-3,5 раза ниже, по сравнению с красной формой tdEosFP (Рис. 5Е). При фотоактивации интенсивность красной флуоресценции возрастает для PAmCherry в 3000-5000 раз, тогда как красная флуоресценция очищенного tdEosFP увеличивается не более чем в 200 раз.

На примере PAmCherry1 нами была проверена способность вновь созданных PAFP к обратимому фотопереключению, способность к которому была показана для ранее созданных мутантов mCherry, названных rsCherry и rsCherryRev (Stiel et al., 2008). При периодическом облучении с использованием светофильтров 390/40 (или 436/20) и 570/30 образец PАmCherry1 последовательно фотоактивировали фиолетовым светом, а затем фотообесцвечивали желтым светом (Рис. 5Ж, З). Было показано, что фотоактивация PAmCherry1 необратима. Белок обесцвечивается уже после 15 циклов фотопереключения (Рис. 5И).

3.2. Использование PAmCherry1 в микроскопии сверхвысокого разрешения PALM.

Для оценки возможности применения PAmCherry в PALM приложениях были созданы белки слияния PAmCherry с двумя белками плазматической мембраны:с трансферриновым рецептором (transferrin receptor, TfR) и белком tsO45 вируса G везикулярного стоматита (vesicular stomatitis virus G protein tsO45, VSVG).

Локализацию этих белков можно было выявить с помощью микроскопии полного внутреннего отражения TIRF (total internal reflection fluorescence). Белки слияния TfR PАmCherry и VSVG-PAmCherry при экспрессии в клетках линии COS-7 сохраняли нормальную локализацию.

Сравнение характеристик PAmCherry1 и tdEosFP в конструкциях с VSVG и TfR при использовании их в микроскопии высокого разрешения PALM показало, что эти PAFP дают сравнимое пространственное разрешение (Рис. 6А-Е).

Конструкция PAmCherry1-TfR была использована в двухцветовой PALM микроскопии совместно с химерной конструкцией зелёного PAFP, PAGFP (Patterson et al., 2002), с легкой цепью клатрина (clathrin light chain, CLC). Известно, что TfR интернализуется через клатрин-окаймленные везикулы, размер которых совпадает с размером кластеров TfR. Мы изучили колокализацию кластеров TfR и клатрин окаймленных везикул. Для TfR-PAmCherry1 (Рис. 6Ж-И) и PAGFP-CLC (Рис. 6К-Л) характерны кластеры, расположенные повсюду на плазматической мембране. TfR PAmCherry1 формировал крупные структуры протяженностью несколько мкм (Рис.

Рис. 6. PALM микроскопия PAmCherry1 в фиксированых COS-7 клетках. (А) Гистограммы количества фотонов, собранных от молекул, показаны для TfR PAmCherry1 (красные столбцы;

среднее значение=724) и TfR tdEosFP (черные столбцы;

среднее значение=940). (Б) Гистограммы неопределенностей молекулярной локализации () для TfR PAmCherry1 (красные столбцы;

среднее значение=15,18) и TfR tdEosFP (черные столбцы;

среднее значение=16,75). (В) Гистограммы продолжительности молекулярной флуоресценции (0,1 с кадры) для TfR-PAmCherry1 (красные столбцы) и TfR-tdEosFP (черные столбцы). (Г) Гистограммы количества фотонов, собраных от молекул VSVG-PAmCherry (красные столбцы;

среднее значение=657) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы;

среднее значение=1057). (Д) Гистограммы для VSVG-PAmCherry (красные столбцы;

среднее значение=20,96) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы;

среднее значение=19,91). (Е) Гистограммы продолжительности молекулярной флуоресценции (0,1 с кадры) для VSVG-PAmCherry1 (красные столбцы) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы). (Ж-Т) Изображения клеток, со экспрессирующих (Ж-И) TfR PAmCherry1 и (К-М) PAGFP-CLC, в режиме TIRF (Ж, К, Н) или PALM (З, И, Л, М, О, П) (Н-П) Наложение изображений показывает относительные распределения TfR-PAmCherry1 6Ж, З), которые, возможно, представляют собой (красный) и PAGFP-CLC складки плазматической мембраны. Наблюдалась (зеленый). (Р) Парный частичная колокализация TfR-PAmCherry1 с корелляционный анализ (вверху) и PAGFP-CLC как на TIRF-снимках (Рис. 6Н), так и нормализованные результаты на PALM изображениях с разрешением в 25 нм (внизу) на наличие и размер (Рис. 6О, П). Парный корреляционный анализ молекулярных кластеров.

подтвердил сходные молекулярные распределения Кластерный анализ молекул на и характерный размер кластеров ~200 нм для обоих изображениях на О (С) и П (Т).

типов молекул TfR-PAmCherry1 и PAGFP-CLC, с более высокой степенью кластеризации для CLC (Рис. 6Р). С помощью кластерного анализа мы определили, что молекулы TfR-PAmCherry1 и PAGFP-CLC находятся в трёх различных состояниях: кластеризованы и колокализованы, кластеризованы и не колокализованы и полностью не кластеризованы (Рис. 6С, Т).

Наблюдаемые нами с помощью PALM форма и размер кластеров совпадали с клатрин-окаймленными везикулами, наблюдаемыми ранее с использованием электронной микроскопии (Heuser et al., 1989). Различная колокализация TfR и CLC может представлять разные стадии формирования клатрин-окаймленных везикул (Kirchhausen, 2000). Так, кластеры PAGFP-CLC, в которых отсутствует TfR PAmCherry1, могут соответствовать зрелым клатрин-окаймленным везикулам, кластеры TfR-PAmCherry1 без PAGFP-CLC, возможно, представляют зрелые эндосомы, близкие к плазматической мембране, а колокализованные кластеры являются ранними клатрин-окаймленными везикулами, захватившими TfR PAmCherry1.

Таким образом, отсутствие флуоресценции любого другого цвета в белках PAmCherry, кроме как красного, расширяет диапазон возможностей многоцветовой стандартной микроскопии и многоцветовой микроскопии сверхвысокого разрешения.

Меньший размер мономерной формы PAmCherry, по сравнению с tdEosFP, вносит меньше искажений в функциональные характеристики белков слияния.

3.3. Хромофор PAmCherry1 в тёмном и флуоресцентном состояниях.

Для выяснения молекулярного механизма фотоиндуцированного изменения спектров PAFP мы закристаллизовали белок PAmCherry1 до и после фотоактивации.

Хромофор в темном состоянии имеет неплоскую конформацию и содержит, аналогично хромофору mTagBFP, неокисленную связь C-C в боковой цепи Tyr67.

Белок PAmCherry1 в фотоактивированном состоянии содержит неплоский анионный DsRed-подобный хромофор в транс-конфигурации, при этом наблюдается уменьшение электронной плотности карбоксильной группы Glu215. Данные масс спектрометрии подтвердили, что в OFF состоянии окислена только C-N связь в Met66, а в ON состоянии, кроме того, окислена связь C-C в боковой цепи Tyr67.

Основываясь на этих данных, мы предложили механизм фотоактивации PAmCherry1, согласно которому хромофор PAmCherry1 в возбужденном состоянии выступает в роли акцептора электрона от карбоксильной группы Glu215, в результате чего высвобождается молекула CO2 по механизму радикальной реакции Кольбе (van Thor et al., 2002). Декарбоксилирование Glu215 приводит к окислению связи C-C в боковой цепи Tyr67, в результате чего образуется хромофор, флуоресцирующий в красной области спектра.

4. Фотоактивируемый красный флуоресцентный белок PATagRFP.

Микроскопия сверхвысокого разрешения траекторий единичных частиц (sptPALM) создает перспективу получения информации о пространственной и временной гетерогенности внутриклеточного движения индивидуальных белковых молекул. Особый интерес могут представлять эксперименты по двухцветовой sptPALM для слежения за траекторией перемещения в клетке двух белков. Для реализации возможности sptPALM требуется создание соответствующих PAFP.

Существенным недостатком PAFP PAmCherry (описание свойств которых дано в предыдущем разделе) для реализации микроскопии сверхвысокого разрешения sptPALM является низкая фотостабильность этих белков. Поэтому был разработан вариант мономерного перманентно флуоресцирующего красного белка TagRFP, содержащий 12 аминокислотных замен: R69S, F84W, Q139K, A147P, N148S, M151K, Y153K, S165V, H203R, R207I, V218W и C229S, названный PATagRFP.

4.1. Физико-химические характеристики PATagRFP.

До фотоактивации PATagRFP не флуоресцирует в видимом диапазоне.

Облучение PATagRFP светом с длиной волны 405 нм приводит к необратимой фотоактивации белка в состояние, флуоресцирующее в красной области спектра с максимумом при 595 нм. Спектр возбуждения флуоресценции имеет максимум при 562 нм и совпадает со спектром поглощения (Рис. 7A). Молярный коэффициент поглощения и квантовый выход флуоресценции PATagRFP равен соответственно 66000 M-1см-1 и 0,38, что свидетельствует о большей в 3 раза яркости, по сравнению с PAmCherry1. Фотоактивационный контраст для очищенного PATagRFP составлял ~540. Флуоресценция PATagRFP имела более высокую pH-стабильность, по сравнению с PAmCherry1, со значением pKa равным 5,3 (Рис. 7Б). Высокая pH Рис. 7. Свойства очищенного PATagRFP. (А) Спектр поглощения до фотоактивации (сплошная линия) и спектры поглощения (линия из точек), возбуждения флуоресценции (линия из тире-точек) и эмиссии (штриховая линия) после. (Б) pH-зависимость для флуоресценции PATagRFP (кружки), контрольного PAmCherry1 (треугольники) и TagRFP предшественника (ромбы). (В) Кинетика фотоактивации для PATagRFP (сплошная линия), PAmCherry1 (штриховая линия) и PAGFP (линия из точек). (Г) Полувремена фотоактивации для PATagRFP (сплошные колонки), PAmCherry1 (заштрихованные колонки) и PAGFP (незакрашенные колонки) при различных интенсивностях света. (Д) Кинетика фотовыцветания для PATagRFP (сплошная линия), PAmCherry1 (пунктирная линия) и TagRFP (линия из точек). (Е) Полувремена фотовыцветания для PATagRFP (сплошные колонки), PAmCherry1 (заштрихованные колонки) и TagRFP (незакрашенные колонки) при различных интенсивностях света.

стабильность делает PATagRFP полезным для использования в компартментах клетки с низким рН.

Было показано, что как скорость фотоактивации, так и скорость фотовыцветания флуоресцентной формы PATagRFP зависит от интенсивности облучающего света. При высоких интенсивностях облучения PATagRFP имел более медленную кинетику фотоактивации и фотовыцветания по сравнению с контрольными белками (рис. 7В-Е). При уменьшении интенстивности света эта разница нивелировалась.

Максимальные значения эффективности фотоактивации для PATagRFP, PAmCherry1 и PAGFP наблюдаются при длинах волн соответственно 400-420±10 нм, 400±10 нм и 380-400±10 нм (Рис. 8A), т.е. при длинах волн, отвечающих максимуму спектра поглощения (405 нм) для PAmCherry1 в темном состоянии и максимуму спектра поглощения (412 нм), приписываемому промежуточному соединению, возникающему в процессе фотоактивации PATagRFP (Рис. 8Б). Эффективность Рис. 8. Характеристики фотоактивации PATagRFP при 25°C. (А) Максимальная флуоресценция PATagRFP (сплошные колонки), и контрольных PAmCherry (заштрихованные колонки) и PAGFP (незакрашенные колонки), достигаемая при различных длинах волн света активации. (Б) Изменения поглощения PATagRFP в течение фотоактивации с помощью 405/15 нм. Вставка показывает поглощение образца PATagRFP (27 мг/мл) в начале (сплошная линия) и после 60 мин (пунктирная линия) фотоактивации.

(В) Спектральная зависимость максимальной флуоресценции (сплошные колонки) по сравнению с максимальной скоростью фотоактивации (заштрихованные колонки) для PATagRFP. (Г) Временная зависимость синей (пунктирная линия) и красной (сплошная линия) форм PATagRFP во время фотоактивации с помощью света либо 350/50 нм, либо 390/40 нм. (Д) Временная зависимость синей (пунктирная линия) и красной (сплошная линия) форм PATagRFP, которая была предактивирована в течение 1 мин светом 350/50 нм, в темноте. Вставка показывает временную зависимость форм сходно предактивированного PATagRFP, но во время его облучения с помощью света 390/40 нм. (Е) Зависимость максимальной скорости фотоактивации от мощности света 350/50 нм.

фотоактивации PATagRFP, PAmCherry1 и PAGFP значительно уменьшается с увеличением длины света фотоактивации, превышающей 420 нм (Рис. 8A).

Например, эффективность фотоактивации PATagRFP голубым светом с длиной волны 480±10 нм в 3,5 раза меньше по сравнению с PAmCherry1, что может быть использовано для двухцветовой фотоактивации PATagRFP совместно с PAGFP, флуоресценция которого возбуждается в фотоактивированом состоянии на 488 нм.

Установлено, что PATagRFP имеет сложную кинетику фотоактивации, которая сопровождается образованием на начальных этапах темного состояния с максимумом спектра поглощения при длине волны 351 нм и последующим формированием интермедиата с максимумом спектра поглощения при длине волны 412 нм, который затем переходит в флуоресцентное состояние с максимуом спектров поглощения/флуоресценции при 562/592 нм. Динамика этих процессов зависит от длины волны света, используемого для фотоактивации. Так, образование интермедиата с максимумом спектра поглощения при 412 нм в 5 раз эффективнее при облучении светом с длиной волны 350/50 нм, в то же время образование красной флуоресцентной формы из этого промежуточного состояния происходит быстрее при облучении светом с длиной волны 390/40 нм (рис. 8).

Мы заключили, что фотоактивация PATagRFP является двухстадийным процессом, включающим однофотонное поглощение двумя различными формами хромофора.

4.2. Использование PATagRFP в микроскопии траекторий единичных частиц sptPALM.

Перспективы использования PATagRFP для изучения траекторий движения отдельных белков изучали с использованием химерных конструкций PATagRFP с белком VSVG и эпидермальным фактором роста (EGF). Живые клетки линии COS-7, экспрессирующие химеры, фотографировали в режиме PALM при низких уровнях возбуждения (561 нм) и фотоактивации (405 нм). Молекулы PATagRFP при сравнимом пространственном разрешении с контрольными химерными конструкциями PAmCherry1 имели большую в 1,3 раза фотостабильность, большую длительность флуоресценции и в 1,5 раза больший квантовый выход (Рис. 7Е).

В двухцветных экспериментах sptPALM использовали белки слияния PATagRFP-EGFR (рецептор EGF) и VSVGtsO45-PAGFP. PALM изображения живых клеток показали точечное распределение обеих конструкций на плазматической мембране (Рис. 9A, Г). Совмещение изображений свидетельствует о частичной колокализации молекул VSVG и EGFR в пределах одних и тех же точечных областей (Рис. 9Ж), но основная часть кластеров содержала лишь одну химерную конструкцию. Анализ траекторий белков слияния PATagRFP-EGFR (Рис. 9Д, Е) и VSVGtsO45-PAGFP (Рис. 9Б, В) показал, что даже в областях кажущейся колокализации молекул их траектории не перекрывались во времени (Рис 9З, И). Мы заключили, что EGFR и VSVG локализуются и движутся в пределах разных мембранных доменов.

Белок PATagRFP найдёт широкое применение в таких sptPALM приложениях, как слежение за перемещением двух различных типов молекул в клетке, мониторинг единичных молекул дикого типа и мутантных молекул или слежение за молекулами в различных доменах клетки.

5. Обратимо фотопереключаемый флуоресцентный белок rsTagRFP.

Новым эффективным подходом изучения взаимодействия двух белков в клетке является фотохромный безызлучательно-резонансный перенос энергии pcFRET. В этом методе флуресценция донора модулируется обратимыми изменениями спектра поглощения фотохромного акцептора. Преимущество pcFRET над другими способами измерения FRET заключается в том, что он обеспечивает точное и Рис. 9. Двухцветовая sptPALM микроскопия в живых клетках COS-7 при 37°C. Изображения (А-В) VSVG-PAGFP и (Г-Е) EGFR-PATagRFP в режиме TIRF получены со скоростью 9, кадров/с. PALM изображения (А) VSVG-PAGFP (зеленые) и (Г) EGFR-PATagRFP (красные) наложены друг на друга (Ж). Стрелки показывают области колокализации между молекулами VSVG и EGFR. Масштабный отрезок равен 2 мкм. Изображены траектории молекул (Б) VSVG-PAGFP и (Д) EGFR-PATagRFP с продолжительностью более, чем 0,7 с, причем каждая траектория предсталена различным цветом. Коэффициенты диффузии изображены для молекул VSVG-PAGFP (В) и EGFR-PATagRFP (Е) в начале траекторий и цвет закодирован согласно цветовым картам справа. (З) VSVG-PAGFP (зеленые) и EGFR PATagRFP (красные) траектории наложены друг на друга. (И) Увеличенная область, отмеченная квадратом на З.

повторяемое определение FRET эффективности для одной и той же пары донор акцептор в одной и той же клетке. Из-за отсутствия мономерного обратимо переключаемого FP с разными спектрами поглощения в ON и OFF состояниях, который мог бы выступать в качестве акцептора, pcFRET был реализован только при использовании в качестве акцептора фотопереключаемых химических красителей (Mao et al., 2008). Мы провели один раунд направленного и несколько раундов случайного мутагенеза TagRFP, чтобы создать обратимо переключаемый красный FP, названный rsTagRFP, содержащий следующие мутации в исходной последовательности TagRFP: F84W, I125L, N148A, S165G, F181L, K189N и Y200F.

5.1. Физико-химические свойства очищенного rsTagRFP.

Облучение rsTagRFP светом с длиной волны ~445 нм переключает белок в ON состояние, в котором его спектры поглощения и флуоресценции имеют максимум при длинах волн 567 и 585 нм, интенсивность красной флуоресценции возрастает при этом в 20 раз (Рис. 10A). Молярный коэффициент экстинкции rsTagRFP в ON состоянии в максимуме спектра поглощения (567 нм), измеренный при pH 7,5, равен 36800 M-1см-1, а квантовый выход флуоресценции составляет 0,11. Облучение светом с длиной волны ~570 нм переключает rsTagRFP в OFF состояние со спектром поглощения, имеющим максимум при 440 нм. Большая часть вновь синтезированных Рис. 10. Свойства rsTagRFP. (А) Спектр поглощения после облучения светом 570/30 нм (OFF состояние;

сплошная линия), спектры возбуждения (пунктирная линия) и эмиссии (линия из точек) после облучения светом 445/25 нм (ON состояние). (Б) Начальные скорости переключения в ON и OFF состояния, достигаемые при различных длинах волн. (В) Кинетика релаксации из OFF и ON состояний в темноте. Белок после очистки (в начальном состоянии) был переключен в OFF состояние светом 570/30 нм. После того, как белок достиг основного состояния в темноте, он был переключен в ON состояние светом 445/25 нм.

Поглощение в ON состоянии нормировано на 100%. (Г) Временная зависимость флуоресценции во время переключения в OFF и ON состояния светом 570/5 (4,9 мВт/см2) и 440/5 нм (0,3 мВт/см2). Зависимость начальных скоростей переключения в OFF (Д) и ON (Е) состояния от интенсивности света соответственно 570/30 и 436/20 нм.

молекул rsTagRFP (~97%) находится в ON состоянии (Рис. 10В). После одного OFF ON цикла переключения устанавливается равновесие, в котором около одной трети молекул rsTagRFP находится в ON состоянии при комнатной температуре. Скорость фотопереключения rsTagRFP в OFF и ON состояние зависит от используемой длины волн (Рис. 10Б, Г).

Время созревания rsTagRFP составляло 43 мин при 37°C, что в 1,5 раза меньше времени созревания TagRFP. Форма спектра поглощения rsTagRFP зависит от рН среды: при физиологических pH (7,0-8,0) наблюдается полоса поглощения с максимумом при 567 нм, а при pH 4,0-5,0 доминирует полоса поглощения с максимумом при 440 нм. Вероятно, эти полосы поглощения соответствуют анионной (567 нм) и нейтральной (440 нм) формам фенольной гидроксильной группы красного хромофора (Yampolsky et al., 2008). Флуоресцентный контраст фотопереключения rsTagRFP уменьшался при закислении. Этот эффект может быть использован для измерения внутриклеточного pH.

5.2. Свойства rsTagRFP в фотохромном FRET.

Мы изучили свойства rsTagRFP в качестве акцептора pcFRET в химерной конструкции rsTagRFP-EYFP. EYFP был выбран в качестве донора из-за значительного перекрывания между эмиссией EYFP и поглощением rsTagRFP в ON состоянии и незначительного воздействия света возбуждения EYFP на rsTagRFP. Как и предполагалось, при переключении rsTagRFP в ON и OFF состояние светом с длиной волны 436/20 нм и 570/30 нм создаются и нарушаются условия для FRET между EYFP и rsTagRFP, при этом наблюдаются многократные циклы модуляции флуоресценции EYFP. Обратимое тушение флуоресценции EYFP составляло около 20%. Протеазное расщепление химерного белка EYFP-rsTagRFP сопровождалось исчезновением модуляции флуоресценции EYFP при фотопереключении rsTagRFP, что подтверждает обусловленность эффекта модуляции флуоресценции EYFP существованием pcFRET.

5.3. Применение rsTagRFP в pcFRET в живых клетках.

Мы использовали донорно-акцепторную пару rsTagRFP и EYFP при изучении с использованием pcFRET взаимодействия между EGFR и адапторным белком Grb2, которое индуцируется в клетках млекопитающих EGF и происходит на плазматической мембране и в эндосомах (Sorkin et al., 2000;

Yamazaki et al., 2002).

Мы экспрессировали белки слияния EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в клетках линии HeLa. Внутриклеточное распределение химерных конструкций в покоящихся клетках было различным. Как и ожидалось, молекулы EGFR-EYFP были в основном локализованы на плазматической мембране, тогда как молекулы Grb2-rsTagRFP были равномерно распределены по всей клетке с несколько более высоким уровнем локализации в ядрах (Рис. 11A). Введение в среду EGF (100 нг/мл) приводило к быстрому накоплению Grb2-rsTagRFP на плазматической мембране с последующей аккумуляцией и колокализацией обеих конструкций в эндосомах. Как и ожидалось, фотопереключение Grb2-rsTagRFP не влияло на эмиссию EGFR-EYFP в отсутствие EGF (Рис. 11Б-Г). Это подтверждает предположение об отсутствии взаимодействия между EGFR и Grb2 в нестимулированных EGF клетках. После введения EGF фотопереключение Grb2-rsTagRFP приводило к значительной и обратимой модуляции интенсивности флуоресценции EGFR-EYFP (на ~20%) как на плазматической мембране, так и в эндосомах, что свидетельствует о взаимодействи EGFR и Grb2 в этих компартментах клетки (Рис. 11Б). Существование колокализации EGFR и Grb2 в клетках HeLa после их стимуляции EGF было подтверждено нами с помощью FLIM микроскопии.

Белок rsTagRFP, по сравнению с rsCherryRev, имеет существенно более высокую яркость и более высокий контраст, который не зависит от числа циклов Рис. 11. Взаимодействие между EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в живых клетках HeLa, визуализированное с помощью pcFRET. (А) Изображения клеток в наборе фильтров YFP (слева) и TX2 (справа) в одном и том же поле зрения до и, в различные моменты времени, после добавления EGF. (Б) Модуляция суммарных красных (красная линия) и желтых (оранжевая линия) интенсивностей флуоресценции в клетках во время ON-OFF циклов переключения Grb2-rsTagRFP акцептора. (В, Г) Изменения флуоресценции EGFR-EYFP в ответ на переключение Grb2-rsTagRFP. (В) График показывает относительное увеличение флуоресценции EGFR-EYFP при переключении Grb2-rsTagRFP в OFF состояние в различные моменты времени до и после стимуляции EGF. (Г) Изображения флуоресценции EGFR-EYFP в псевдоцвете (верхний ряд: Grb2-rsTagRFP - ON;

нижний ряд: Grb2-rsTagRFP OFF) в различные моменты времени до и после стимуляции EGF.

переключения. Более того, фотоконверсия rsTagRFP сопровождается резкими и значительными изменениями спектра поглощения, которые позволяют использовать его в pcFRET. Пара rsTagRFP-EYFP имеет большие перспективы использования в pcFRET микроскопии для изучения внутриклеточных белковых взаимодействий.

Красный фотопереключаемый белок rsTagRFP может также применяться для слежения за транспортом меченых белков между различными органеллами в одной клетке при возбуждении светом низкой интенсивности. Более того, совместное использование rsTagRFP и зелёного обратимо переключаемого белка Dronpa (Ando et al., 2004), позволит изучать транспорт одновременно двух белков в одной клетке.

6. Мономерный дальне-красный флуоресцентный белок TagRFP657.

Существует несколько причин, которые определяют необходимость создания дальне-красных FP со спектром возбуждения, имеющим максимум при длине волны больше 600 нм, и спектром флуоресценции с максимумом при длине волны больше 650 нм. Такие белки необходимы для получения изображений живых тканей в спектральной области, где поглощение гемоглобина и меланина незначительно, для использования совместно с ближне-красными или оранжевыми FP в многоцветовой микроскопии, а также в связи с тем, что современные проточные цитофлуориметры и лазерные конфокальные микроскопы укомплектованы стандартными красными Рис. 12. Свойства TagRFP657. (А) Спектры возбуждения (линия из точек) и эмиссии (сплошная линия). (Б) pH зависимость для флуоресценции TagRFP657 (квадраты) и mKate (треугольники). (В) Кинетика фотовыцветания для TagRFP657 (сплошная линия) и mKate (линия из точек). (Г) Полувремена фотовыцветания для TagRFP657 (незакрашенные колонки) и mKate2 (сплошные колонки) при различных интенсивностях света. (Д) Кинетика созревания TagRFP657 (сплошная линия) и mKate2 (линия из точек). (Е) Остаточная зелёная флуоресценция TagRFP657 (сплошная линия), mKate2 (линия из точек) и mNeptune (штриховая линия).

лазерами с длиной волны излучения 633-640 нм. В коммерческом оптическом микроскопе сверхвысокого разрешения ансамбля молекул STED, позволяющем получать изображения с разрешением в 70 нм, используется лазер с длиной волны 635-640 нм.

К моменту начала работы над диссертацией в литературе существовало описание мономерных дальне-красных FP с максимумами спектров возбуждения и флуоресценции при длинах волн, меньших соответственно 600 и 650 нм, и дальне-красных FP со спектрами возбуждения и флуоресценции, с максимумами при длинах волн, несколько больших, чем соответственно 600 и 650 нм, которые являются либо димерами, либо тетрамерами и поэтому непригодны для создания белков слияния. Мы использовали направленный и случайный мутагенез гена мономерного FP mKate (Shcherbo et al., 2007), имеющего максимумы спектров возбуждения и флуоресценции соответственно при 588 и нм, для создания мономерного Рис. 13. TagRFP657 в клетках HeLa. (А) Разделение дальне-красного белка, суспензии клеток, экспрессирующих TagRFP657, названного TagRFP657. Этот mKate или TagRFP, на проточном цитофлуориметре.

белок имеет (Б) Со-экспрессия белков слияния TagRFP657 с аминокислотных замен по гистоном H2B (H2B-TagRFP657) и TurboRFP с сравнению с исходным mKate:

митохондриальным сигналом (TurboRFP-mito). Цвета K9T, M44Q, K69H, F84W, на А и Б являются псевдоцветами. Изображения EB3 S148H, S165T, D166A, M167L, TagRFP657, получены с использованием L181F и R203Y. конфокальной (В) или STED (Г) микроскопии. (Д, Е) Увеличенная область, отмеченная квадратами на В и 6.1. Физико-химические Г. Белыми стрелками указаны детали, разрешимые на характеристики очищенного STED. Профили интенсивностей (Ж, З) получены для участков на Д и Е. Полуширина профилей отмечена TagRFP657.

красными стрелками.

Очищенный TagRFP имеет существенно сдвинутые в дальне-красную область спектры по сравнению с mKate: спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции имеют максимумы при соответственно 611 и 657 нм (Рис. 12А). Молярный коэффициент экстинкции в максимуме спектра поглощения равен 34000 M-1cм-1, квантовый выход – 0,10. Мы сравнили свойства TagRFP657 с улучшенным вариантом mKate2 (Shcherbo et al., 2009), сведения о созданини которого появились во время работы по созданию TagRFP657. Белок TagRFP657 имеет по сравнению с mKate2 более высокую pH стабильность (Рис. 12Б) и примерно в 2 раза большую фотостабильность (Рис. 12В, Г). Созревание хромофора TagRFP657 (125 мин) происходит медленнее по сравнению с mKate2 (Рис. 12Д). При этом, однако, формирование хромофора TagRFP657 было более полным, по сравнению с mKate2 и его мутантой формой, получившей название mNeptune (Lin et al., 2009): в случае TagRFP657 практически отсутствует остаточная зелёная флуоресценция (Рис. 12Е). Показано, что TagRFP в растворе и в составе белков слияния в клетках млекопитающих является мономером.

6.2. TagRFP657 в многоцветовых цитофлуорометрии и микроскопии.

Дальнее-красное положение спектров возбуждения флуоресценции и флуоресценции TagRFP657 не позволяет регистрировать флуоресценцию этого белка с использованием стандартых наборов фильтров для красных FP. Для оценки возможности практического использования FP TagRFP657 мы регистрировали флуоресценцию при длинах волн больше 650 нм и возбуждении при 633 нм с использованием стандартного гелий-неонового лазера. Даже при возбуждении светом с длиной волны 633 нм, при которой оптическая плотность составляет 50% от оптической плотности в максимуме спектра, интенсивность флуоресценции TagRFP657 была в 7 раз больше, чем у mKate, и 2,5 раза больше по сравнению с mKate2.

Нами было показано, что дальне-красный TagRFP можно использовать совместно с красными или ближнее-красными FP как в проточной цитофлуориметрии, так и в флуоресцентной микроскопии с использованием стандартных фильтров (Рис. 13А, Б).

6.3. TagRFP657 в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

Дальне-красный FP TagRFP657 является единственным мономерным FP, который может использоваться при работе с TSC STED микроскопом (Leica), в котором для возбуждения флуоресценции используется лазер с излучением при нм и лазер с излучением при 750 нм для дезактивации возбуждённого состояния.

Возможность получения изображений сверхвысокого разрешения с использованием TagRFP657 была продемонстрирована нами для ряда белков слияния, в частности для белка EB3, связывающегося с микротрубочками. Были получены изображения EB3 TagRFP657 в клетках линии HeLa в стандартном конфокальном (Рис. 13В, Д) и STED (Рис. 13Г, Е) режимах. STED изображения имели в 3 раза лучшее разрешение (Рис.

13З), по сравнению с изображениями, полученными в обычном для конфокального микроскопа режиме (Рис. 13Ж). Размер полученного с использованием TagRFP изображения (full width at half of maximum, FWHM) составил 74 нм, что практически соответствует пределу инструментального разрешения данной модели STED микроскопа.

6.4. Неинвазивная визуализация опухоли с помощью TagRFP657.

Использование дальне-красных FP существенно для получения флуоресцентных изображений тканей и организмов. Мы создали три линии клеток аденокарциномы молочной железы крысы MTLn3, стабильно экспрессирующие один из следующих белков: циановый Cerulean (Rizzo et al., 2004), зелёный EGFP или TagRFP657. Смесь полученных флуоресцентных клеток была трансплантирована в молочную железу SCID (severe combined immunodeficency) мышей. Через четыре недели клетки сформировали раковую опухоль размером в несколько миллиметров. Опухоль четко визулизировалась в дальне-красной области спектра, но совершенно не детектировалась в синем и зелёном каналах. Таким образом, TagRFP657 может успешно применяться для неинвазивной визуализация тканей в живых организмах.

7. Белки с большим стоксовым сдвигом LSSmKate1 и LSSmKate2.

В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов, позволяющих получать высококачественное изображение живых тканей на глубине вплоть до 1 мм, является двухфотонная микроскопия (Zipfel et al., 2003). Суть двухфотонной микроскопии состоит в том, что возбуждение флуоресценции происходит с использованием инфракрасного лазера большой интенсивности, что приводит к поглощению флуорофором двух фотонов с длиной волны, в два раза превышающей длину волны обычного однофотонного возбуждения. Однако красные FP не могут быть эффективно возбуждены коммерчески доступным инфракрасным титан сапфировым лазером, так как спектры их двухфотонного поглощения сдвинуты в более длинноволновую область относительно рабочего диапазона длин волн излучения титан-сапфирового лазера (Drobizhev et al., 2009). Решением данной проблемы могла бы быть разработка красного FP, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим стоксовым сдвигом (large Stokes shift, LSS). Одновременное использование такого красного белка с зеленым и синим FP открывает перспективы для параллельного изучения нескольких клеточных процессов методом многоцветовой двухфотонной микроскопии при возбуждении флуоресценции одной длиной волны. Понимание механизма большого стоксового сдвига в GFP-подобных белках может помочь при рациональном дизайне красных FP с большим стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных FP.

На основе mKate в результате нескольких раундов молекулярной эволюции были созданы мутантные красные FP с большим стоксовым сдвигом, содержащие замены K69Y, P131T, S148G, M167E, T183S, M196V и K69Y, P131T, S148G, M167D, T183S, M196V, которые назвали соответственно LSSmKate1 и LSSmKate2.

7.1. Физико-химические характеристики LSSmKate1 и LSSmKate2.

Основные характеристики белков LSSmKate1, LSSmKate2 и контрольного mKeima – единственного красного FP с большим стоксовым сдвигом (180 нм) приведены на Рис. 14. В отличие от mKeima, белки LSSmKate не имеют дополнительного спектра возбуждения с максимумом в районе 580 нм (Рис. 14А).

Спектры двухфотонного возбуждения для вариантов LSSmKatе, ECFP (Tsien, 1998) и EGFP, измеренные в пределах от 760 до 1000 нм, показали существенное перекрывание. Значение эффективности поглощения в максимуме спектра двухфотонного возбуждения 2PE для LSSmKate1 было в 1,6 раза ниже, а для Рис. 14. Свойства LSSmKate1 (сплошная линия), LSSmKate2 (пунктирная линия) и mKeima (точечная линия). (А) Спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции. (Б) Кривые кинетики созревания. (В) рН зависимость интенсивности флуоресценции. (Г) Кривые фотообесцвечивания для LSS-mKates, mKeima и EGFP (линия точка-тире). (Д) Двухфотонные спектры возбуждения для LSSmKate1, LSSmKate2, mKeima, EGFP и ECFP (линия две точки-тире). (Е) Кривые фотообесцвечивания при 2P-возбуждении на 870 нм.

LSSmKate2 в 1,4 раза выше соответствующего значения для mKeima (Рис. 14Д).

Величина фотостабильности при двухфотонном возбуждении для LSSmKatе1 была такой же, как для mKeima, а значение двухфотонной фотостабильности для LSSmKatе2 было в 1,4 раза выше, чем для mKeima (Рис. 14Е). Белки LSSmKate, в отличие от белков mKeima, не склонны к димеризации.

7.2. Механизм большого стоксового сдвига в белках LSSmKate.

Большой стоксов сдвиг в белках LSSmKate может быть объяснен переносом протона в возбужденном состоянии. Данное явление было ранее исследованно на вариантах GFP, обладающих большим стоксовым сдвигом. Чтобы доказать данное предположение, а также установить аминокислотные остатки, участвующие в переносе протона, была определена пространственная структура белков LSSmKate в кристаллическом состоянии и исследована зависимость спектральных характеристик этих белков от рН, температуры, H/D изотопного состава растворителя, проведен мутагенез ключевых аминокислотных остатков, вовлеченных в перенос протона.

Рентгеноструктурные данные свидетельствуют о том, что трипептид Met63 Tyr64-Gly65 формирует DsRed-подобный хромофор в цис-конфигурации в LSSmKate1 и в транс-конфигурации в LSSmKate2.

Детальный анализ третичных структур белков LSSmKate позволил определить два возможных пути переноса протона. В случае LSSmKate1 гидроксильная группа тирозина цис-хромофора формирует водородную связь с карбоксильной группой боковой цепи Glu167, которая в свою очередь образует водородные связи с Ser165 и молекулой воды (Рис. 15А). В структуре LSSmKate2 фенольная группа транс хромофора образует непосредственную водородную связь с Ser165, который связан водородной связью с карбоксильной группой Asp167 и молекулой воды (Рис. 15Б).

В отличие от других FP с большим стоксовым сдвигом, спектры поглощения белков LSSmKate, измеренные при 25oС при значениях рН от до 11, практически не изменялись. При значении рН 11 появлялся новый пик поглощения, смещенный в красную область спектра с максимумом 579 нм, который был обозначен как пик В. Возбуждение пика В приводило к красной флуоресценции с максимумом при 628 нм, который совпадал для обоих белков LSSmKate. Спектры флуоресценции белков LSSmKate демонстрировали сильную зависимость от температуры и изотопного состава растворителя:

смещение максимумов флуоресценции в коротковолновую область спектра при низких Рис. 15. Структуры хромофоров LSSmKate1 (А) и температурах и увеличение LSSmKate2 (Б) и их микроокружения с наложением на коротковолнового плеча 2Fo–Fc электронную плотность хромофоров. Водородные спектра флуоресценции при связи указаной в ангстремах. Стрелками указаны замещении протонов торсионные углы 1 и 2. Предлагаемые фотоциклы для дейтронами. Похожие LSSmKate1 (В) и LSSmKate2 (Г) при нейтральном рН и эффекты при замене 25оС. Возбужденное состояние нейтрального хромофора водорода на дейтерий были А*, образующееся при облучении светом с длиной волны описаны для mKeima и ~460 нм, превращается после ESPT в возбужденное вариантов GFP, в которых анионное состояние, обозначенное как I*. После эмиссии красной флуоресценции протон переносится от Glu реализуется механизм (LSSmKate1) или Asp167 (LSSmKate2) к хромофору с переноса протона в образованием основного состояния нейтрального А возбужденном состоянии хромофора.

(Shi et al., 2007;

Henderson et al., 2009).

Замена Ser165 на Ala, Thr или Met приводит к существенному сдвигу максимума флуоресценции LSSmKate2, уменьшению рН-стабильности и квантового выхода LSSmKate2, но практически не влияет на спектральные свойства LSSmKate1.

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что остаток Ser165 вовлечен в цепь переноса протонов в LSSmKate2, но не участвует в реализации переноса протона в LSSmKate1. Ключевые стадии фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в LSS-mKate1 и LSSmKate2, приведены на рис (Рис. 15В, Г). В основном состоянии хромофора рКа карбоксила Glu/Asp167 ниже, чем рКа гидроксильной группы тирозина хромофора, и хромофоры находятся в нейтральной форме, стабилизируемой карбоксил-анионом. В возбужденном состоянии происходит возрастание кислотности гидроксильной группы тирозина хромофора (pKa может достигать значений 2-3), что позволяет ей выступать в качестве донора протона и протонировать карбоксильные группы Glu/Asp167 (Wiehler et al., 2003).

7.3. Рациональный дизайн белков с большим стоксовым сдвигом.

Мы полагаем, что формирование путей переноса протона в возбужденном состоянии, аналогичных существующим в белках LSSmKate1, LSSmKate2 и mKeima, можно осуществить и в других оранжевых и красных FP с тирозин-содержащим хромофором путем введения Asp или Glu в микроокружение хромофора. Для проверки данной гипотезы было выбрано пять стандартных FP, таких как mNeptune (Lin et al., 2009), mCherry, mStrawberry, mOrange (Shaner et al., 2004) и mKO (Karasawa et al., 2004).

С использованием сайт-направленного мутагенеза были созданы две серии библиотек кДНК генов для каждого FP. В первом случае в 165 позицию были введены Asp или Glu, а позиция 167 подвергалась случайному мутагенезу. В другом случае замены позиции 165 были случайными, а в 167 позицию были введены Asp или Glu. В результате скрининга были найдены клоны, обладающие оранжевой или красной флуоресценцией при возбуждении в области длин волн 440-460 нм, т. е.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.