авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках

на правах рукописи

ШВЕД Юлия Александровна КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОЖИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ, НА ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЁНКАХ 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН и на кафедре химии высокомолекулярных соединений химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович Институт цитологии РАН доктор химических наук, профессор Билибин Александр Юрьевич Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор Харазова Алла Давидовна Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета доктор химических наук, профессор Власов Геннадий Петрович Институт высокомолекулярных соединений РАН ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Защита состоится “31” октября 2008 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

e-mail:cellbio@mail.cytspb.rssi.ru сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан “_” сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Каминская кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей путём введения в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток является перспективным направлением современной регенеративной медицины.

Восстановление целостности повреждённой ткани требует создания нормального микроокружения для культивируемых и трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и восстановлению с их помощью структуры и функции поврежденной ткани. В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют при культивировании клеток и при создании клеточных продуктов для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе культивируемых клеток на раны возникают, однако, проблемы нарушения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с неизбежным повреждением подготовленных клеток в результате их ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют, что приводит к недостаточной механической прочности клеточных ассоциаций и частичной утере поверхностных рецепторов.

В настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки – тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы, как инженерии, химии, физики, так и клеточной биологии (Langer R at al., 1993). В основе тканевой инженерии лежит введение клеток в биорезорбируемые полимерные матрицы и дальнейшее образование сложных клеточных композиций, подобных ткани или органу, для дальнейшей трансплантации их пациенту взамен поврежденных или утраченных (Lanza R.P. at al, 2004). Использование таких матриц позволяет обеспечить сохранение исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клетки при создании клеточных продуктов и их трансплантации (Amulya K. At al, 1999). В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, а именно, нетоксичность, биосовместимость, простота изготовления полимерных изделий и их достаточная механическая прочность, а также способность полимера резорбироваться в процессе восстановления структуры ткани (Oakes B.W., 2004).

Размножение и рост клеток на полимерных матрицах с разной пространственной организацией может обеспечивать формирование структурной основы дифференцирующихся тканей.

Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности кожных покровов, повреждённых в результате ожогов, трофических язв и воздействий другого рода (Ramos-e-Silva M., at al, 2002). Для этой цели выращенный in vitro клеточный пласт эпителиальных клеток - кератиноцитов должен быть перенесён на поражённый участок кожи. Несмотря на широкий спектр существующих матриц на основе биодеградируемых синтетических полимеров, предназначенных для культивирования различных типов клеток, обладающих повышенной чувствительностью к субстрату, например кератиноцитов, разработанные ранее матрицы по своему составу и свойствам не подходят для этой цели (Morrison G., 1999). В то же время трансплантация клеток кожи уже в настоящее время имеет клиническое применение и поэтому создание подобных матриц является важной задачей не только с точки зрения фундаментальных исследований взаимодействия клеток с полимером, но и для вполне реального практического применения полученных композиций в клинике.

Полимерные матрицы, позволяющие культивировать на них кератиноциты человека с образованием многослойного клеточного пласта, при совместном переносе их в область повреждения позволят исключить процедуру обработки клеток, выращиваемых по известным технологиям, протеолитическими ферментами и ускорить процесс заживления ран.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлся поиск оптимальных условий для культивирования клеток кожи на биодеградируемых полимерных плёнках, сформированных на основе поли(D,L-лактида) для заместительной клеточной терапии.

В процессе исследования были решены следующие задачи:

1. Подобраны оптимальные условия для культивирования клеток кожи на полилактидных плёнках.

2. Разработаны условия нанесения коллагена на поверхность полимерных плёнок и исследовано взаимодействие клеток с различными его структурными формами (молекулярной и фибриллярной).

3. Проведена модификация поверхности полимерных плёнок введением аминогрупп и оценка их влияния на степень распластанности клеток.

4. Отработаны условия формирования пористых плёнок для свободного доступа к клеткам питательных веществ и отвода продуктов метаболизма.

5. Определена скорость деградации плёнок в условиях культивирования клеток и после имплантации их в организм лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальными для культивирования клеток кожи являются плёнки, прикреплённые к поверхности покровного стекла. Сформированные полимерные плёнки после инкубирования их в питательной среде остаются достаточно прочными в течение недель, и на них может быть получен многослойный пласт кератиноцитов для последующей трансплантации.

2. Сформированные полилактидные плёнки толщиной 5 мкм позволяют проводить прижизненное наблюдение за поведением клеток.

3. Предложенные способы модификации полилактидной плёнки разными структурными формами коллагена позволяют улучшить взаимодействие клеток с ее поверхностью. Показано, что поведение кератиноцитов зависит от структуры коллагена и равномерности его распределения на поверхности пленки.

4. Степень адгезии и распластанности клеток на полилактидных плёнках повышается при обработке поверхности плёнок лизином.

5. Путём смешения поли(D,L-лактида) и полиэтиленгликоля с последующим вымыванием последнего могут быть получены гидрофилизованные пленки полилактида с пористой морфологией поверхности.

Научная новизна. Для формирования многослойного пласта кератиноцитов впервые были использованы плёнки на основе аморфного поли(D,L-лактида), прикреплённые к поверхности покровного стекла. Такой способ позволяет отделить плёнку вместе со сформированным на ней многослойным клеточным пластом от подложки и перенести на рану.

Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура белка. Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов. Впервые разработаны условия, при которых образование фибрилл коллагена происходит при нанесении белка, находящегося в молекулярной форме, на поверхность полилактидной плёнки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности.

Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин. Показано, что такая обработка также способствует распластыванию кератиноцитов на ее поверхности.

Теоретическое и практическое значение работы. Сформированный клеточный продукт, состоящий из выращенного на биодеградируемой полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на повреждённый участок кожного покрова.

Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения. В частности, разработанные методы модификации могут быть применены в процессе разработки трёхмерных пористых полимерных матриц. Такие матрицы позволят создать в искусственных условиях для культивирования клеток микроокружение, максимально приближённое к условиям их существования в организме.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 16 тезисов.

Результаты исследования представлены на 3-й научной сессии УНЦХ (Санкт-Петербург, 27, 28 ноября, 2004), международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г.), С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт Петербург, 1-3 февраля 2005 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г.), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005), European Polymer Congress (Moscow, June 27-29, 2005), International conference “New polymer systems for biotechnological and biomedical applications” (Yerevan. Republic Armenia. July 12-14, 2005, October 1-4, 2007), International symposium“Biomaterials” (Hamburg October 1- 4, 2006), Международная конференция “Биология клетки в культуре” (Санкт-Петербург 17- октября, 2006), 3rd World Congress on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany October 17-22, 2007), V конференция молодых учёных с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 19-22 мая, 2008).

Структура и объем работы. Работа изложена на 163 страницах и включает спи сок литературы, который содержит 207 наименований.

Во введении обоснована актуальность проблемы использования биодеградируемых полимеров для культивирования клеток и сформулированы основные цели исследования.

Первая глава содержит обзор современных представлений о различных классах полимеров, используемых для медико-биологических целей. Описаны различные подходы к созданию полимерных матриц, предназначенных для культивирования клеток, а также подробно изложены методы модификации полимерных матриц. Рассмотрено строение кожи и возможные способы её восстановления при повреждениях. Во второй главе описаны основные объекты и методы исследования. Третья глава содержит экспериментальные результаты. В четвёртой главе проведено обсуждение результатов и изложены основные выводы работы. Работа заканчивается списком цитируемой литературы.

Содержание работы 1. Выделение, культивирование и анализ состояния клеток кожи Нормальные кератиноциты и фибробласты человека были получены из кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции. Выделение кератиноцитов проводили путем последовательной ферментативной обработки фрагментов ткани раствором диспазы для отделения эпидермиса от дермы и коллагеназой для выделения базальных кератиноцитов (Hodges et al, 1973). Фибробласты были получены путем спонтанной миграции клеток из целых фрагментов кожи в процессе культивирования.

Фибробластоы культивировали в среде DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), а кератиноциты - в смеси сред DMEM и F12 (3:1) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в СО2–инкубаторе при температуре 37 оС..

Питательную среду меняли через каждые 3 суток Влияние поверхности на процесс взаимодействия клеток с подложкой оценивали по степени адгезии и распластывания клеток на субстрате с помощью инвертированного микроскопа и методом сканирующей электронной микроскопии. Морфологию и поведение распластанных клеток анализировали, наблюдая за характером пространственной организации окрашенных Родамин-фаллоидином структур актинового цитоскелета, методом лазерной конфокальной иммуннофлуоресцентной микроскопии.

2. Синтез поли(D,L-лактида) Поскольку полимерная плёнка, предназначенная для культивирования и трансплантации кератиноцитов, должна резорбироваться в течение 1 мес, для формирования плёнок был использован аморфный поли(D,L-лактид). По предварительно оптимизированной известной методике (Kricheldorf et al, 1999) на основе циклического димера молочной кислоты - лактида в присутствии катализатора - лактата цинка был синтезирован поли(D,L-лактид) с молекулярной массой 150000.

3. Формирование полилактидных плёнок и исследование скорости их деградации в условиях культивирования клеток Полилактидные плёнки были получены методом полива из раствора в хлористом метилене. После испарения растворителя плёнки отделялись от фторопластовой подложки. В зависимости от концентрации полилактида толщина полученных плёнок составила 20, 30, 50 и 100 мкм.

Одним из требований, предъявляемых к полилактидным плёнкам, предназначенным для культивирования кератиноцитов и последующей их трансплантации на рану, является их достаточная прочность после формирования клеточного пласта (3 нед) (Rheinwald, 1980). Поэтому полученные плёнки, толщиной 20 и 100 мкм, выдерживали в течение мес в питательной среде в присутствии и отсутствие сыворотки, а также в чистом фосфатном буфере. Скорость деградации полилактидных плёнок оценивали по убыли массы плёнок после каждых 10 сут инкубирования. В качестве контроля были выбраны плёнки, инкубированные в водной среде.

Наименьшая убыль массы плёнок наблюдается в питательной среде. Вероятно, это связано с частичной сорбцией компонентов питательной среды на поверхность полилактидной плёнки.

В течение 3 нед все плёнки сохраняли необходимую для переноса клеточных пластов прочность, а по истечении 1 мес становились хрупкими и ломкими.

Было отмечено, что даже после 1 сут выдерживания плёнок в любой жидкой среде они становились мутными и рельефными. Так как для проведения прижизненного наблюдения под инвертированным микроскопом за процессами прикрепления, распластывания и размножения клеток на исследуемой поверхности, необходимым свойством плёнок является их прозрачность, использование таких плёнок для этой цели было невозможным. В процессе исследования также было отмечено, что чем толще плёнка, тем быстрее она мутнеет. Поэтому возникла необходимость получения тонких не мутнеющих полилактидных плёнок.

Тонкие плёнки, толщиной 5 мкм, были получены при нанесении раствора на покровное стекло, прикреплённое к подложке, вращающейся со скоростью 3000 об/мин.

Путём подбора концентрации и объёма раствора удалось получить тонкие, не мутнеющие в жидкой среде и не деформирующиеся в течение 3 нед полилактидные плёнки.

Дальнейшие исследования проводили на плёнках полученных таким способом и прикреплённых к покровному стеклу.

4. Оценка скорости деградации пленки и токсичности образуемых продуктов in vivо Для исследования скорости резорбции и возможного токсического влияния продуктов деградации поли(D,L-лактида) на окружающие ткани плёнки толщиной мкм, после предварительной стерилизации, трансплантировали под кожу крысам. По истечении 1, 2 и 3 нед содержания полилактидных плёнок в организме проводили гистологические исследования биоптатов. Присутствие поли(D,L-лактида) в тканях наблюдали после 1 и 2 нед. После 3 нед плёнка полностью резорбировалась в организме, причём патогенного влияния продуктов деградации полилактида на окружающие ткани обнаружено не было.

Плёнка толщиной 5 мкм, трансплантированная под кожу крысам, также полностью резорбировалась уже после 1 нед.

5. Влияние условий получения полимерных плёнок на свойства их поверхности В качестве субстрата, для нанесения раствора поли(D,L-лактида), были использованы покровные стекла с гидрофильной (необработанной) и гидрофобной (силиконизированной) поверхностью. Равномерное распределение полилактида на стеклах обоих типов наблюдали при использовании хлористого метилена в качестве растворителя. При нанесении полилактида, растворенного в более полярном и хорошо удерживающем воду растворителе – ацетоне, на гидрофобную поверхность стекла полимер распределялся неравномерно, а при нанесении на гидрофильную – равномерно (Швед Ю.А. и др., 2006). Гидрофильность поверхности пленок определяли по значениям угла смачивания, измеренного с помощью метода пластинок Вильгельми (Адамсон, 1979). Наименьшим углом смачивания, т.е. наиболее гидрофильной поверхностью, обладали пленки, полученные из ацетона на необработанном стекле. Значения углов смачивания для пленок из хлористого метилена были несколько выше (таблица).

Таблица. Значения углов смачивания пленок, полученных разными способами.

Угол Образцы смачивания 62±4о Покровное стекло 104±4о Гидрофобизированное покровное стекло 78±4о Покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в ацетоне 88±4о Гидрофобизированное покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в ацетоне 84±4о Покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в хлористом метилене 82±4о Гидрофобизированное покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в хлористом метилене Следующий этап работы состоял в исследовании влияния условий формирования плёнок из поли(D,L-лактида) на адгезию и пролиферацию клеток. В качестве контрольной поверхности использовали покровные стекла. Несмотря на то, что разрабатываемая полилактидная плёнка предназначалась для культивирования кератиноцитов, первоначально было проведено исследование поведения на поверхности полилактидной плёнки дермальных фибробластов, менее требовательных к условиям культивирования, в частности, к свойствам субстрата.

При культивировании фибробластов на полимерных матрицах, полученных из разных растворителей, негативного влияния ни полимера, ни растворителей на жизнеспособность клеток обнаружено не было.

Способность фибробластов прикрепляться к исследованным субстратам зависела от степени гидрофильности поверхности полилактидных плёнок, определяемой по углу смачивания. Количество фибробластов, адгезировавших к полилактидной плёнке, полученной из раствора в ацетоне, было выше, но незначительно, по сравнению с количеством клеток, прикрепленных к полимерным плёнкам, полученным из раствора в хлористом метилене (рис.1).

Рис. 1 Зависимость прикрепления фибробластов к полимерной плёнке от способа её получения через 20, 40 или 90 мин после нанесения Доля прикрепившихся клеток, % К – контроль (гидрофильное покровное стекло), А-Фл – плёнка из ПЛ, полученная из К раствора в ацетоне на гидрофильном стекле, А А-Фл 60 А-Фб Фб – плёнка из ПЛ, полученная из раствора в Х-Фл Х-Фб ацетоне на гидрофобном стекле;

Х-Фл – плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофильном стекле;

Х-Фб – плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофобном стекле.

20 40 Время, мин При нанесении на поверхность полилактидных плёнок кератиноцитов – клеток, более требовательных к субстрату, чем фибробласты, оказалось, что они не прикреплялись к пленкам, полученных из раствора, как в хлористом метилене, так и в ацетоне. Таким образом, незначительное повышение гидрофильности пленок за счет использования ацетона в качестве растворителя, явилось недостаточным для адгезии кератиноцитов к поверхности полимерной матрицы. Из этих результатов следовала необходимость проведения дополнительной модификации поверхности полилактидной пленки.

В последующих исследованиях были использованы пленки, полученные из раствора в хлористом метилене. Такой выбор был обусловлен следующими причинами:

трудностью поддерживать на определенном уровне содержание воды в пленках, полученных из растворов полимера в ацетоне, более равномерным распределением полимера в пленках из хлористого метилена и сравнительно низкой температурой кипения хлористого метилена, что позволяет полностью удалить этот растворитель из пленки.

6. Исследование взаимодействия клеток кожи с различными структурными формами коллагена, нанесённого на поверхность полилактидной плёнки Для повышения биосовместимости поверхности полилактидных плёнок их модифицировали коллагеном I типа. Являясь основным белком внеклеточного матрикса, коллаген часто используется в качестве субстрата при культивировании клеток данного типа.

Коллаген получали путём кислой экстракции из сухожилий крысиных хвостов.

Выделенный таким образом коллаген в молекулярной форме наносили общепринятым способом на поверхность полилактидной плёнки из 0.1 М раствора уксусной кислоты.

Количественное содержание коллагена в растворе определяли методом Лоури.

Для того чтобы установить максимальное количество коллагена, способного распределиться на исследуемой поверхности, были проведены теоретические расчёты количественного содержания коллагена на единице площади поверхности при условии ее полного покрытия коллагеном. Молекула коллагена представляет собой жёсткий стержень, поэтому число возможных конформаций молекулы и расположение ее на поверхности матрицы ограничено (рис.2).

Рис. 2 Возможные типы взаимодействия молекулы коллагена с плоской поверхностью.

Исходя из предположения, что молекула взаимодействует с поверхностью по всей своей длине, была рассчитана сорбционная ёмкость, которая составила 0.13 мкг/см2.

Экспериментально полученная первоначально величина сорбционной ёмкости полилактидной плёнки после инкубирования ее в растворе коллагена с концентрацией 0.02 мг/мл составила всего лишь 0.08 мкг/см2 (рис. 3), из чего следовало, что на практике коллаген не покрывает всей поверхности пленки.

(б) (а) 2 Г, мкг/см Г, м кг /с м С коллагена - 0,02 мг/мл С к ол л а ген а - 0,0 5 м г/ м л Рис. 3 Зависимость 1. 0. количества коллагена 1. 0. (мкг/см2) на поверхности интактная ПЛ пленка после гидролиза (С-0,05М) 0. плёнок от времени и условий 0. после гидролиза (С-0,1М) нанесения белка;

при 0. 0.4 интактна я П Л пл енка выдерживании плёнок в п о сл е ги р о л и з а (С -0,0 5 М ) 0.0 п о сл е ги д р о л и з а (С -0,1 М ) растворе коллагена с 0. 1 2 3 4 1 2 3 время, сут в ре м я, су т концентрацией:

а - 0.02 мг/мл;

б - 0.05 мг/мл.

Для увеличения сорбционной ёмкости поверхности полилактидной матрицы были использованы два подхода. Первый заключался в проведении предварительного щелочного гидролиза поверхности пленки, а второй в увеличении концентрации наносимого раствора белка. От первого подхода пришлось отказаться. Несмотря на то, что за счёт электростатических взаимодействий количество сорбированного коллагена на полилактидной поверхности действительно увеличивается, даже кратковременная обработка щелочным раствором низкой концентрации приводила к частичному гидролизу полимера и, соответственно, к ухудшению механических свойств полилактидной матрицы. При увеличении концентрации наносимого раствора коллагена, удалось получить величину сорбционной ёмкости – 0.4 мкг/см2, даже превышающую теоретически рассчитанную. Для того, чтобы в дальнейшем обеспечить максимальное покрытие поверхности, модификацию полилактидной плёнки проводили путём нанесения раствора коллагена с большей концентрацией равной 0,1мг/мл. Для исследования влияния модификации плёнок коллагеновым покрытием на них в течение 1 нед культивировали кератиноциты. Морфология клеток на исследуемых субстратах была охарактеризована методом сканирующей электронной микроскопии (на рис.4 а и б – разные увеличения).

Рис. 4 Сканирующая электронная микроскопия кератиноцитов кожи человека после 1 нед культивирования.

(б) (а) а, б – кератиноциты на полимерной пленке;

в, г – кератиноциты на такой же пленке, покрытой коллагеном.

(в) (г) Действительно, нанесение коллагена способствовало увеличению количества прикрепившихся клеток и степени их распластанности. При этом, однако, клетки располагаются на поверхности пленки неравномерно.

Очевидно, что такое прикрепление кератиноцитов к поверхности может зависеть от равномерности распределения коллагена на поверхности. С целью получения равномерно покрытых коллагеном поверхностей полилактидной пленки было проверено несколько способов нанесения коллагена.

Вместо общепринятого способа нанесения коллагена на поверхность, а именно, выдерживания плёнок в растворе коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл в течение 30 мин с последующей промывкой раствором фосфатного буфера (способ 1), использовали другой способ, при котором на поверхность плёнки равномерно наносился фиксированный объём раствора коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл и плёнки высушивали при комнатной температуре в течение 1 сут – способ 2 (по аналогии со способом 1). В обоих случаях исследуемая поверхности была покрыта коллагеном в молекулярной форме.

Второй способ позволяет получить более равномерным распределением коллагена на поверхности. Трёхкратное нанесение раствора коллагена способом 1, чередующееся с промыванием раствором фосфатного буфера, также способствует равномерному распределению коллагена на поверхности полилактидной плёнки – способ 3 (Швед Ю.А.

и др., 2007) Поскольку в организме коллаген находится в фибриллярной форме, целесообразно было модифицировать поверхность, предназначенную для культивирования клеток, фибриллярным коллагеном. Увеличение концентрации раствора коллагена до 2 мг/мл, а также перевод его в нейтральную среду способствуют формированию фибрилл.

Нейтрализацию кислоты проводили добавлением раствора гидрофосфата натрия и наносили раствор коллагена на поверхность полимера. После этого плёнки с нанесённым коллагеном выдерживали в атмосфере аммиака. В этом случае образование фибрилл коллагена завершается уже непосредственно на поверхности плёнки. Такой способ позволил получить равномерное распределение коллагеновых фибрилл на поверхности – способ 4.

Структуру нанесённого коллагена и его распределение на поверхности полилактидной плёнки оценивали методом иммуннофлуоресцентной микроскопии после окраски препаратов специфическими антителами на коллаген (рис.5) и с помощью метода атомно-силовой микроскопии (рис. 6).

(а) (б) (в) Рис. 5 Различия в распределение коллагена при нанесении его на полилактидную пленку разными способами:

а-коллаген, нанесённый способом 1, б- коллаген, нанесённый способом 2, в, д - коллаген, нанесённый способом 4, г- трёхкратное нанесение способом (г) (д) Об.: х60 (а, б, в, г) или х100 (д).

Рис. 6 Атомно-силовая микроскопия коллагенового покрытия полилактидной пленки..

а –- нанесение фибриллярного коллагена;

(а) (б) б-трёхкратное нанесение молекулярного коллагена.

При культивировании кератиноцитов было показано, что структура коллагена оказывает влияние на распределение клеток на поверхности. При модификации пленки молекулярным коллагеном выявляются только одиночные клетки разной степени распластанности и обладающие хорошо развитым цитоскелетом, характерным для дифференцированных кератиноцитов. На поверхности же, модифицированной фибриллярным коллагеном, вдоль фибрилл располагаются вытянутые цепочки округлых клеток. Цитоскелет в них распределяется циркулярными тяжами на периферии под клеточной мембраной. Такое распределение цитоскелета характерно в большей степени для стволовых и транзиторных клеток. Дифференцированные же кератиноциты прикрепляются к фибриллярному коллагену в значительно меньшей степени. Из полученных данных следует, что покрытие пленки фибриллярным коллагеном в большей мере способствует размножению и росту популяции базальных кератиноцитов.

7. Культивирование кератиноцитов на пористых плёнках, приготовленных на основе смеси поли(D,L-лактида) и полиэтиленгликоля Для свободного доступа питательных веществ, к трансплантированным в рану клеткам и отвода продуктов их метаболизма матрица, предназначенная для культивирования клеток, должна быть пористой. Размер пор для свободной циркуляции жидкой среды должен составлять менее 10 мкм. Для формирования таких плёнок в данной работе был использован метод, основанный на фазовом разделении двух несовместимых полимеров с последующим удалением одного из них селективным растворением.

Образцы синтезированного поли(D,L-лактида) с молекулярной массой 150000, смешивали с полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 и 15000. В качестве растворителя был использован хлористый метилен.

Содержание ПЭГ в смеси составляло 10 и 30 %. Для контроля скорости растворения ПЭГ и выхода его из смеси первоначально был использован метод, основанный на измерении массы плёнки до и после выдерживания в воде. Этот способ является общепринятым при исследовании таких систем, как кристаллический поли(L,L лактид)/ПЭГ. Однако при использовании, синтезированного нами, аморфного поли(D,L лактида) оказалось, что относительная потеря массы плёнок до и после инкубации в воде превышает первоначально введённое количество ПЭГ. Поэтому параллельно измерению относительной потери массы проводили независимое определение количественного содержания вышедшего из смеси и растворённого в воде ПЭГ. Способность ПЭГ образовывать окрашенные комплексы с йодом и хлоридом бария позволила провести фотоколориметрическое определение количества растворённого в воде ПЭГ. Оказалось, что значения относительной потери массы плёнки превышают количество ПЭГ, растворённого в воде (рис. 7).

(б) (а) B B C C D D E E Убыль массы, % Убыль массы, % 4 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Врем я, ч В р ем я, ч Рис. 7. Зависимость изменения массы плёнок от времени выдерживания их в воде.

- убыль массы плёнки после взвешивания (ПЛ/ ПЭГ (6000));

- фотометрическое определение ПЭГ в растворе (ПЛ/ ПЛ (6000));

PBS С убыль массы плёнки после взвешивания (ПЛ/ ПЭГ (15000));

-р д еа - фотометрическое определение ПЭГ в растворе (ПЛ/ ПЭГ (15000)).

Среда +FBS а – 10 % ПЭГ, б -30 % ПЭГ.

Полученные результаты объясняются способностью смеси аморфного поли(D,L лактида) и ПЭГ образовывать двухфазную систему. Причём каждая фаза имеет минорное содержание второго компонента. В процессе растворения ПЭГ в воде вместе с ним в водную среду уходит частично растворённый в нём поли(D,L-лактид). Оставшаяся фаза поли(D,L-лактид) содержит минорное количество ПЭГ, что и было подтверждено данными ПМР-спектроскопии.

В процессе исследования было показано, что с увеличением молекулярной массы ПЭГ, снижается его выход из матрицы. Размер и распределение пор на поверхности исследуемых матриц исследовали с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (рис.8). При использовании ПЭГ с молекулярной массой 6000 были получены плёнки с размером пор, не превышающем 5 мкм.

(а) (д) (б) Рис. 8 Анализ структуры полимерных образцов методом сканирующей электронной микроскопии.

а–Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ(6000)-10 %;

б–Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000)- 30 %;

в–Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ(15000)-10 %;

г–Плёнка на основе смесиПЛ/ПЭГ(15000)- 30 %;

(г) д –Боковой срез образца б.

(в) Для исследования токсического влияния остаточного содержания ПЭГ на клетки на полученных матрицах культивировали кератиноциты. Несмотря на то, что клетки на исследуемых матрицах не погибали, их пролиферативная активность уступала контролю (покровное стекло, покрытое коллагеном). Поэтому была проведена дополнительная обработка поверхности раствором коллагена.

Взаимодействие с подложкой и рост кератиноцитов на пористых пленках, модифицированных коллагеном, были сопоставимы с контролем (рис. 9).

(а) (б) (в) Рис. 9 Характер роста первичных кератиноцтов человека в течение 9 сут на полимерных подложках, покрытых раствором коллагена (наблюдение под световым микроскопом):

а – Контроль – покровное стекло, покрытое коллагеном б – Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000) - 10 %;

(г) (д) в – Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000)-30 %;

г – Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ(15000)-10 % д –Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (15000)-30 %.

8. Влияние аминогрупп, нанесенных на поверхность полилактидной плёнки, на организацию актинового цитоскелета кератиноцитов Внесение чужеродного белка, в частности коллагена, в организм человека может вызывать отрицательную иммунную реакцию. Поэтому в некоторых случаях целесообразно использовать и другие методы модификации поверхности полимерной матрицы.

Для этой цели нами впервые была проведена обработка поверхности полилактидной плёнки раствором лизина. Взаимодействие лизина с поверхностью полилактидной плёнки может происходить за счёт физической сорбции, образования водородных связей аминогрупп лизина со сложноэфирными группами полилактида, реакции аминолиза с разрывом сложноэфирной связи полилактида. Одна из двух аминогрупп лизина связывается с поверхностью, а вторая остаётся свободной, что обеспечивает слабый положительный заряд поверхности плёнки. Поскольку клетка имеет отрицательный заряд, то за счёт электростатического взаимодействия увеличивается количество прикрепившихся к модифицированной поверхности полилактидной плёнки клеток.

Содержание аминогрупп на поверхности полилактидной плёнки контролировали нингидриновым методом. Для этих целей полилактидные плёнки после обработки раствором лизина при нагревании (55 оС) гидролизовали в течение 24 ч при 120 оС в растворе 6М соляной кислоты в запаянных ампулах. Показано, что наибольшее количество лизина связывается с поверхностью полилактидной плёнки в присутствии метанола (рис.10).

H 2O 4. C 3H 7 O H Рис. 10 Количество лизина на поверхности плёнок 3.5 C 2H 5 O H после обработки в различных условиях CH 3O H 3. 2. мкг лизина/cm - вода, 2. 1. -PBS: изопропиловый спирт =1:1, вода 1. 0. -Среда вода : этиловый спирт = 1:1, 0. Среда +FBS спирт = 1:1.

0 2 4 6 8 - вода : метиловый время, мин Степень распластанности кератиноцитов, нанесенных на модифицированную пленку коррелирует с количеством лизина на ее поверхности (рис. 11).

(а) (б) (в) Рис. 11 Организация актинового цитоскелета кератиноцитов на модифицированных и немодифицированном полимерных плёнках.

а – полилактидные плёнки без обработки, (г) (д) обработка плёнок раствором лизина:

б – в воде, в – в смеси вода :

изопропиловый спирт = 1:1, г -в смеси вода : этиловый спирт = 1:1, д -в смеси вода : метиловый спирт=1:1.

Таким образом, поставленные задачи были выполнены. Получена модифицированная полилактидная плёнка, способствующая прикреплению и размножению кератиноцитов, которая в дальнейшем после доказательства её эффективности при заживлении ран на лабораторных животных может быть использована в клинике для лечения повреждения кожного покрова.

ВЫВОДЫ 1. Разработанные нами биодеградируемые полимерные плёнки на основе полилактида позволяют культивировать на них кератиноциты человека и получать многослойные пласты клеток для последующей трансплантации без предварительной ферментативной обработки.

2. Биосовместимость полученных пленок, способствующая прикреплению и росту клеток, достигается путем модификации их поверхности коллагеном I типа или лизином.

3..Структура и распределение коллагена на поверхности пленок зависит от условий его нанесения и влияет на поведение взаимодействующих с ним клеток. Наилучшие распределение кератиноцитов по поверхности пленки, их рост, морфология и пространственная организация цитоскелета достигаются при нанесении коллагена в фибриллярной форме.

4 Путём смешивания полилактида с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ), и удалением последнего из готовой матрицы можно получить пористые плёнки, которые улучшают взаимодействие клеток с окружающей средой при их культивировании и после переноса пласта на рану.

5. Разработанные полилактидные пленки в условиях культуры и при внесении в экспериментальные раны лабораторных животных являются не токсичными и обладают удовлетворительной скоростью резорбции, и, следовательно, могут быть использованы в технологиях клеточной заместительной терапии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Соловьев А.Ю., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. «Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке». Цитология, 2006, т.48, № 2, с.161-168.

2. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П.

Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разными структурными формами коллагена, нанесённого на полилактидную матрицу Цитология, 2007, т.49, № 1, с.32-39.

3. Швед Ю. А., Кухарева Л. В., Зорина Н. А., Зорин И. М., Пинаев Г. П., Билибин А.

Ю., Деградация полилактидных плёнок в условиях кульивирования клеток: оценка влияния компонентов среды.// Труды III научной сессии УНЦХ СПбГУ. Санкт Петербург, 27-28 ноября, 2004, стр. 351.

4. Швед Ю. А., Зорин И. М., Кухарева Л. В.,Блинова М. И., Билибин А. Ю. Пинаев Г.

П. Разработка резорбируемых полилактидных плёнок в качестве субстрата для культивирования клеток человека. // Симпозиум «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», С.-Петербург, 25-27 октября 2004 г., стр. 5. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Соловьев А.Ю., Зорин И.М., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю. Нанесение коллагена на поверхность полилактидных пленок. Материалы С. Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», 1-3 февраля 2005 г., с.110..

6. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю. Сорбция коллагена на поверхности пористых пленок на основе смеси полилактида и полиэтиленгликоля.// Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», Москва, 12-15 апреля 2005 г., с. 493-494.

7. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю.. Влияние коллагенового покрытия на поведение кожных фибробластов и кератиноцитов человека на поверхности полилактида. // Материалы 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», 18-22 апреля 2005 г., Пущино, с.176.

8. Shved Ju.A., Zorin I.M., Makarov V.I., Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblast cultivation on polylactide-polyethylenglycol copolymer and blend films of skin. European Polymer Congress, Moscow, June, 2005, c.4106.

9. Shved Ju.A., Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblasts cultivation on the degradable polylactide films for substitutive cell therapy of skin. // International conference “New polymer systems for biotechnological and biomedical applications” (доклад). Jerevan. Republic Armenia. July 12-14, 2005, p. 17-22.

10. Швед Ю.А. Разработка резорбируемой полимерной подложки для культивирования кератиноцитов человека. // Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина»14-16 апреля 2005, Санкт-Петербург.стр. 11. Shved Yu.A., Kukhareva L.V., Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Yu. Enhance cell affinity to poly(d,l-lactide) films by treatment with fibrillar collagen “Biomaterials” 1- Oct, 2006, Hamburg, p. 12. Bilibin A.Yu., Sved Yu.A., Zorin I.M., Pinaev G.P. Poly-D,L-Lactide Films for cell cultivation – influence of the surface modification on cell adhesion. “Biomaterials” 1- Oct, 2006, Hamburg, p. 13. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Влияние различных форм коллагеновых субстратов, прикрепленных к полимерной подложке, на рост клеток кожи в культуре» (доклад). // Международная конференция “Биология клетки в культуре” Санкт-Петербург, 17-19 октября, 2006.

14. Shved Yu.A., Blinova M. I., Khureva L. V., Pinaev G. P.,Bilibin A. Yu. Development on polymer matrix for cultivation of skin cells British-Russian workshop in association with the European Commission “Stem cells: policy, research, and innovations. European Union – Russian Federation perspectives”. Moscow, March15, 2007, p.13.

15. Швед Ю.А., Пинаев Г. П., Билибин А. Ю. Культивирование клеток кожи на полилактидных матрицах. // IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 12-16 марта, 2007, с.

53-54.

16. Shved Ju.A., Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblasts cultivation on the degradable polylactide films for substitutive cell therapy of skin. // International conference “New polymer systems for biotechnological and biomedical applications” (доклад). Yerevan. Republic Armenia. Осt 1- 4, 2007, p. 17-22.

17. Sved Yu.A., Kukhareva L.V., Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Yu. Enhance cell affinity to poly(d,l-lactide) films by treatment with fibrillar collagen. // “3rd World Congress on Regenerative Medicine” Oct 17- 22, 2007, Leipzig, p. 18. Швед Ю.А., Кухарева Л. В., Блинова М. И., Билибин А. Ю., Пинаев Г. П. Создание биодеградируемой полимерной плёнки, предназначенной для культивирования клеток кожи. // V конференция молодых учёных с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая, 2008, Москва, стр. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Адамсон А. Физическая химия поверхностей, Москва, 1979, 569 стр.

Amulya K. Saxena A. K., Benvenuto M., Marler J., Joseph P. Vacanti J. P. Skeletal Muscle Tissue Engineering Using Isolated Myoblasts on Synthetic Biodegradable Polymers:

Preliminary Studies // Tissue Engineering 1999. V. 5. №6. P.525 – 531.

Hodges G. M., Livingston D. C., Franks L. M. The localization of trypsin in cultured mammalian cells\\J.Cell Sci. 1973. V.12. P.887-902.

Kricheldorf, H. R.;

Kreiser-Saunders, I.;

Damrau, D.-O.;

Resorbable initiators for polymerizations of lactonesMacromol. Sypm. 1999, 144, Langer R., Vacanti J. P. Tissue engineering // Science. 1993. V. 260. P. 920-926.

Lanza R.P., Langer R., Chick W.L. Principles of Tissue Engineering // Academic Press:

San Diero. 2004. p. 1020.

Morrison G. Advances in the skin trade // Mechanical. Eng. 1999 V. 121. P. 40–43.

Oakes B.W. Orthopaedic tissue engineering: from labora tory to the clinic // Med. J. Aust.

2004. V. 180. P. 35-38.

Ramos-e-Silva M., Ribeiro de Castro M. New Dressings, Including Tissue-Engineered Living Skin // Clinics in Dermatology. 2002. V. 20. P. 715–723.

Rheinwald J. G. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes // Meth.Cell Biol.

1980. V.21A. P. 229-254.

Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Соловьев А.Ю., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке // Цитология, 2006, т.48, № 2, с.161-168.

Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П.

Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разными структурными формами коллагена, нанесённого на полилактидную матрицу // Цитология, 2007, т.49, № 1, с.32-39.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.