авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Володяев илья владимирович сверхслабое излучение и оптическое взаимодействие яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки

На правах рукописи

УДК 577.357, 591.31 Володяев Илья Владимирович СВЕРХСЛАБОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ И ОПТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЯЙЦЕКЛЕТОК И ЗАРОДЫШЕЙ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ 03.00.30-03 — биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Белоусов Лев Владимирович Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор Егоров Владислав Викторович (Московская ветеринарная академия им.

К.И.Скрябина) доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович (каф. биоорганической химии Биологического факультета МГУ) Ведущая организация институт Биохимической физики им.

Эммануэля РАН

Защита состоится 18 декабря 2007 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп.12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан «16» ноября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Е.Н.

1. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ МГЭ — митогенетический эффект Спектральные области электромагнитного излучения:

ИК — инфракрасная (740 нм — 1 мм), УФ — ультрафиолетовая (10 — 380 нм).

2.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2.1. Актуальность проблемы Первые данные по нехимическим дистантным взаимодействиям биологических объектов появились более 80 лет назад в работах А.Г.Гурвича по т.н. митогенетическому эффекту (МГЭ) [Gurwitsch, 1923]. Феномен МГЭ состоит в изменении ритма клеточных делений в культурах микроорганизмов, культурах клеток и тканях многоклеточных организмов при оптическом контакте с рядом биологических или химических систем. Явление МГЭ многократно подтверждено и детально исследовано в этой и других лабораториях в СССР, Италии, Германии, Нидерландах и США (обзор ранних работ см. в: [Залкинд, Франк, 1930;

Гурвич А. и Л., 1934;

Rahn, 1936]).

Несколько появившихся работ с отрицанием МГЭ [Hollaender a. Claus, 1937;

Westenberg, 1937;

1941] были выполнены с серьезными отклонениями от методики и опровергнуты в ответной критике [Залкинд, 1937;

Гурвич А. и Л., 1948].

В дальнейшем феномены, связанные с дистантным нехимическим взаимодействием наблюдали неоднократно:

• ускорение роста клеток и микроорганизмов при оптическом контакте культур [Киркин, 1981;

Grasso et al., 1991;

Wainwright et al., 1997;

Trushin, 2003];

• cтимуляция созревания спор бактерий [Николаев, 1992, Nikolaev et al., 2006];

• пространственная ориентация клеток при оптическом контакте с другой культурой [Albrecht-Buehler, 1991;

1992;

1994;

1997;

2000];

• стимуляция секреции клеток молочной железы при оптическом контакте культур [Молчанов, 1985;

Moltchanov, Golantzev, 1995];

• изменение содержания белка, активация транскрипционного фактора NFkB и изменение морфологии актинового цитоскелета и плотных контактов в культуре клеток при оптическом контакте с культурой, находящейся под действием перекиси водорода [Farhadi et al., 2007];

• появление цитопатического эффекта в культуре клеток при оптическом контакте с культурой, зараженной вирусом [Казначеев с соавт., 1972];

• аномальное развитие зародышей морского ежа при оптическом контакте с культурой бактерий [Magrou I. et M., 1927;

1932];

• изменение скорости развития и процента аномалий зародышей вьюна при оптическом контакте кладок икры разных стадий развития [Бурлаков с соавт., 1999;

2000];

• стимуляция сверхслабой люминесценции образцов крови при их оптическом контакте [Voeikov, Novikov, 1997;

Xun Shen et al., 1994];

• синхронизация ритмов сверхслабой люминесценции динофлагеллят [Popp F.-A. et al, 1992];

• различные биологические эффекты, вызываемые т.н. вторичным биогенным излучением [Кузин с соавт, 1994].

Общее для всех этих эффектов — отсутствие химического носителя.

Явления дистантного взаимодействия наблюдаются при разделении объектов пластинками из кварца [Gurwitsch, 1923;

Будаговский, 2004;

Бурлаков с соавт., 1999];

стекла [Albrecht-Buehler, 1992;

Trushin, 2003;

Farhadi et al., 2007] и исчезают при их замене на матовые пластинки из того же материала [Будаговский А.В., 2004;

Trushin M., 2003]. В ряде случаев доказано участие электромагнитных волн: УФ [Гурвич А. и Л., 1934;

1945], ИК [Albrecht-Buehler, 1991;

2000];

получены спектры дистантного взаимодействия [Frank, Rodionow, 1932]. Показано, что сверхслабое излучение от физических источников того же спектрального диапазона, что и предполагаемое излучение биологических объектов, действует аналогично последнему [Frank, 1929;

Chariton et al., 1930;

Albrecht-Buehler, 1991, 1994].

Авторы [Кузин с соавт., 1987;

Бурлаков с соавт., 1999;

Voeikov and Novikov, 1997;

Молчанов, 1985] также предполагают электромагнитную природу эффекта;

Ю.А.Николаев (1992) допускает участие акустических волн.

Впервые с помощью физических детекторов электромагнитное излучение биологических объектов зарегистрировано от «индукторов» МГЭ [Rajewsky, 1930;

1931;

Frank, Rodionow, 1932] (обзор работ см. в [Гурвич, 1966]). Однако серьезное развитие проблема сверхслабого излучения получила после работ [Colli, Facchini, 1954;

Тарусов с соавт., 1961;

Владимиров, Львова 1964], в основном в исследованиях школы Б.Н.Тарусова. Показано, что во всех биологических объектах и в ряде модельных систем постоянно идут процессы свободно-радикального окисления, являющиеся источниками сверхслабой хемилюминесценции в видимой области спектра [Тарусов и др. (ред.), 1972;

Журавлев, 1972;

Владимиров, Шерстнев, 1989].

В работах школы Б.Н.Тарусова эти процессы рассматривали как чисто деструктивные. Позже показано, что их определенная интенсивность необходима для нормального функционирования клетки (см. обзор [Voeikov, 2001]), открыто ферментативное производство активных форм кислорода [Babior et al., 1973;

Krieger-Brauer, Kather, 1995] и их влияние на важнейшие клеточные процессы [Downs et al., 1998;

Chiarugi et al., 2003;

Gordeeva et al., 2004]. В настоящее время NO и O2• рассматривают, наряду с Ca2+, как основные вторичные мессенджеры в клетке [Khan and Wilson, 1995;

Droge, 2002;

Saran, 2003]. Ряд авторов [Воейков, 2003;

Новиков, 2004] связывает регуляторную роль АФК с излучением при их рекомбинации.

Однако до настоящего времени механизмы дистантного взаимодействия остаются неизвестными. Электромагнитное излучение от большинства биологических объектов имеет очень низкую интенсивность: по данным разных авторов ~102 квант/см2сек [Rajewsky, 1930;

1931], ~103 квант/см2сек [Frank, Rodionow, 1932], ~0,5—5 квант/сек [Журавлев, 1972]. По оценке [Popp, 1992], мощность электромагнитного взаимодействия биологических объектов лежит в диапазоне 10-17—10-15 Вт (эквивалентно ~100—103 квант/сек в диапазоне ближний УФ — ближний ИК).

Наиболее дискуссионный вопрос в этой области: как столь слабый сигнал может оказывать специфическое действие (стимуляцию клеточных делений или физиологических функций, изменение скорости развития и его аномалий) на фоне световых потоков значительно более высокой интенсивности?

В школе А.Г.Гурвича обращали особое внимание на спектр излучения и «режим» взаимодействия объектов: периодическое прерывание, экранирование отдельных частей и др. Авторы [Залкинд и Франк, 1930;

Гурвич А. и Л., 1934] предполагали, что излучение, вызывающее МГЭ, происходит отдельными квантами или группами квантов, а получение максимального эффекта связано с определенной корреляцией их появления.

В работах [Орел и Дзятковская, 2000;

Бурлаков, 1999;

Beloussov, 2002;

2006] использовали Фурье-анализ и автокорреляционный анализ спонтанного излучения зародышей вьюна, клеточных культур и др. (диапазон 200— нм). Авторы подтверждают, что излучение происходит отдельными группами квантов, находят характерные частоты их появления (~10-3—103 Гц) и указывают на корреляции в спектре этих частот. В [Orel et al., 2004] показано, что автокоррелограммы Фурье-спектров механоиндуцированного излучения крови раковых больных более хаотичны, чем у здоровых людей. По утверждению [Загускин, 2007], чувствительность биосистем к внешним сверхслабым воздействиям также связана не с «магическими частотами», а с общей структурой их набора.

В работах [Popp, Ke-hsuch, 1993;

Bajpai, 1999;

Popp et al. 2002] предполагается, что излучение биологических объектов обладает особыми квантовыми свойствами: высокой степенью когеррентности, свойствами т.н.

сжатого света и др., а их оптическое взаимодействие может проявляться в снижения суммарной интенсивности излучения (т.н. субрадиации) [Popp, 2006]. Последнее согласуется с результатами, полученными на зародышах вьюна [Белоусов с соавт., 2003].

Тем не менее, вопрос о механизмах дистантного нехимического взаимодействия остается нерешенным. Не исследованы корреляции различных свойств излучения биологических объектов и их способности индуцировать дистантные биологические эффекты. Практически отсутствуют систематические измерения излучения от основных модельных объектов биологии по ходу их развития. Большинство работ связано с оптическим взаимодействием или излучением клеточных культур или кладок икры. При этом оптический контакт клеток или зародышей внутри культуры или кладки затрудняет выявление эффекта от взаимодействия между ними и может влиять на суммарное излучение.

2.2. Цели и задачи исследования В связи с изложенным были поставлены следующие цели и сформулированы задачи исследования.

Цель: определить, возможно ли и за счет чего оптическое взаимодействие зародышей X.laevis.

Задачи:

• Определить роль оптических контактов для развития отдельных зародышей X.laevis: сравнить развитие зародышей с нормальными и нарушенными оптическими контактами по основным морфологическим критериям.

• Зарегистрировать излучение отдельного зародыша X.laevis в спектральном диапазоне 200—800 нм на разных стадиях развития.

Провести анализ основных свойств этого излучения.

• Зарегистрировать излучение зародышей X.laevis при их оптическом взаимодействии.

2.3. Научная новизна работы Работа впервые проведена на индивидуальных яйцеклетках и зародышах.

Использован эмбриональный материал от одного из модельных объектов современной биологии развития — шпорцевой лягушки Xenopus laevis Daudin.

Впервые показано оптическое взаимодействие зародышей X.laevis в период дробления, влияющее на темп и пространственно-временную скоррелированность развития.

Впервые измерено сверхслабое излучение зародышей X.laevis от оплодотворения (ст. 1) до стадии хвостовой почки (ст. 24). Показано, что несмотря на равенство фону по средней интенсивности, излучение зародышей имеет свои стадио-специфичные спектры Фурье. В период дробления (ст. 1—4) ССИ зародышей выше фона по мощности на группе частот в диапазоне 0,01—50 Гц и ниже фона в диапазоне 0,1—500 Гц;

на ст. (средняя бластула) обнаружены группы частот в ССИ зародышей в диапазонах 0,01—50 Гц и 0,1—500 Гц. Их появление совпадает со временем внезапной активации генома зародыша — mid-blastula transition.

Показано снижение интенсивности суммарного излучения при оптическом взаимодействии зародышей X.laevis.

Разработано и успешно применено программное обеспечение для поточной цифровой обработки сигналов со статистическим анализом.

2.4. Практическое значение работы Показанное оптическое взаимодействие зародышей X.laevis позволяет исследовать явление сверхслабого излучения биологических объектов на этом объекте — стандартном, удобном в использовании и хорошо изученном при нормальном развитии.

Использованный метод наблюдения за индивидуальным развитием зародышей позволяет строго и детально исследовать их оптическое взаимодействие.

Разработанное программное обеспечение позволяет быстро, строго и в автоматическом режиме анализировать сверхслабое излучение разных объектов.

Анализ излучения зародышей потенциально является мощным экспресс методом определения их состояния и взаимодействия.

2.5. Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были изложены на конференциях:

• III Международной конференции «Электромагнитные поля и излучения в биологии» (Калуга, 2005);

• IV Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2006);

• VII Международной крымской конференции «Космос и биосфера» (Судак, Крым, 2007);

• на летних школах по «биофотонике и ее применению» (Международный институт биофизики, Нойсс, Германия, 2006 и 2007);

на заседании кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ.

2.6. Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

2.7. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Приложения». Работа изложена на 120 страницах, включает 5 таблиц, 4 иллюстраци. В списке литературы приведено 150 публикаций.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования проводили на яйцеклетках и зародышах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin.), полученных методом гормональной стимуляции.

Использовали стандартные методы синхронного и индивидуального оплодотворения in vitro, стандартные растворы для инкубации холоднокровных (10%, 100% MMR, pH 7,4). Регистрировали развитие зародышей по таблицам нормального развития [Nieuwkoop, Faber, 1956;

Детлаф, Руднева, 1975].

Задача 1. Исследование оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток X.laevis.

Яйцеклетки X.laevis синхронно оплодотворяли in vitro. Через 30 мин с них снимали третичные оболочки 2% раствором цистеина (pH 8);

отбирали оплодотворенные яйцеклетки и помещали их в кварцевые кюветы с индивидуальными ячейками для каждого зародыша (рис.1). Использовали две кюветы:

• кювета А — с сохранением оптических контактов (с прозрачными перегородками между зародышами);

• кювета Б — с нарушением оптических контактов (с матовыми перегородками между зародышами).

Зародыши в двух кюветах находились в идентичных условиях: химических, температурных, освещенности и др. Эксперимент начинался через 50— мин после оплодотворения и длился от 1,5 до 2 часов. По ходу опыта определяли количество анимальных бластомеров каждого зародыша. Все ячейки каждой кюветы условно делили на три группы:

1. ячейки с четырьмя ближайшими «соседями» (64 шт.) — внутренние 8* ячеек;

2. ячейки с тремя ближайшими «соседями» (32 шт.) — ячейки в рядах по периферии кюветы за вычетом угловых;

3. ячейки с двумя ближайшими «соседями» (4 шт.) — угловые ячейки.

Сравнивали развитие зародышей в группе 1 кювет А и Б;

отдельно сравнивали развитие в группах 1 и 2 каждой из кювет. В качестве контроля сравнивали развитие в левой и правой половинах кювет.

Рис.1. Кювета с индивидуальными ячейками для каждого зародыша.

Материал: кварц КУ1;

изготовлена по технологии спекания. Размер одной ячейки: 2*2*3 мм;

толщина стенки 1,5 мм. Размер кюветы: 10*10 ячеек.

Оценивали различия в следующих характеристиках:

• среднее число анимальных бластомеров (по критерию Вилкоксона Манна-Уитни);

• распределение зародышей по числу анимальных бластомеров (по критерию Колмогорова-Смирнова);

• пространственное распределение зародышей старшей стадии, присутствующей в выборке. Его оценивали по двум показателям:

o % ячеек с зародышами старшей стадии, образующих кластеры (группы ячеек, имеющих общие стенки, т.е. группы, в пределах которых возможен прямой оптический контакт);

o средний размер кластера (число ячеек).

Эксперименты проводили в разные дни, при разной температуре и на разных кладках, поэтому сравнение любых показателей возможно только в пределах одного эксперимента. Тем не менее, по относительной разности показателей (относ. = (X1—X2)/X1, где X1 и X2 — выбранные показатели для двух групп зародышей) допустимо оценить и всю совокупность экспериментов: насколько достоверно относ. в среднем отличается от 0.

Здесь корректно применить критерий знаков по Вилкоксону.

Задача 2. Анализ излучения яйцеклеток и зародышей X.laevis Излучение яйцеклеток и зародышей измеряли с помощью ФЭУ (диапазон чувствительности 200—800 нм, катод охлаждаемый до -25C, режим счета фотонов [Meig et al., 1992]) в Международном институте биофизики (Нойсс, ФРГ). Запись излучения вели во времени, получая т.н. временной ряд, длительностью от 1 до 20 мин в разных сериях. Время отдельного измерения в ходе эксперимента — период накопления сигнала — составляло:

• 1 мсек (длительность эксперимента 1 мин — 60000 измерений);

• 10 мсек (длительность 5 мин — 30000 измерений);

• 100 мсек (длительность 20 мин — 12000 измерений).

Рассчитывали основные свойства излучения, как математического сигнала Ik = I(tk):

• среднюю интенсивность излучения (m), • дисперсию (2 = (Ik — m)2) — флуктуации интенсивности излучения, • эмпирическую функцию плотности вероятности ((I)) — % измерений с различной интенсивностью излучения в зависимости от этой интенсивности (гистограмму излучения), • спектр Фурье (в варианте спектра мощности по Уэлчу с окном Хэмминга шириной в длины сигнала и перекрыванием окон 50%) — показатель периодических компонент в излучении.

Каждый эксперимент выполняли в 7—10 повторах;

для каждого повтора измеряли фон — излучение кюветы со средой с той же длительностью и временем накопления.

Свойства излучения яйцеклеток и зародышей сравнивали со свойствами фона по критерию Стьюдента. Различия в гистограмме и Фурье-спектре рассчитывали отдельно по каждой полосе.

Для расчета свойств излучения и статистического анализа использовали программы STATISTICA и MATLAB;

разработан оригинальный пакет программ в среде MATLAB.

Во всех случаях для отражения достоверности различий приводится уровень значимости P. «Достоверность» считается, как (1—P)*100%.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Оптическое взаимодействие зародышей Xenopus laevis Распределение зародышей по числу анимальных бластомеров не соответствует нормальному, поэтому для статистического сравнения выборок неприменим критерий Стьюдента. Для сравнения средних использовали U критерий Вилкоксона—Манна—Уитни;

для сравнения самих распределений — критерий Колмогорова—Смирнова (он позволяет делать более серьезные выводы, но является менее мощным, т.е. требует большего различия в выборках для того, чтобы отличить их). Применение обоих критериев корректно в условиях данного эксперимента [Ван дер Варден, 1960].

4.1.1. Корректность постановки эксперимента: проверка однородности выборки % аномалий и распределение зародышей по числу анимальных бластомеров (в т.ч. среднее) не имели достоверных различий между правой и левой половинами каждой из кювет ни в одном эксперименте. В ряду экспериментов относительная разность (относ.) по этим показателям также не имела тенденций (табл. 1).

Следовательно, при синхронном оплодотворении и идентичных условиях содержания зародышей X.laevis использованных выборок достаточно, чтобы избежать артефактных различий в отдельном эксперименте и артефактных тенденций в группе опытов по выбранным статистическим критериям.

4.1.2. Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток X.laevis Количество аномалий.

По % аномалий кюветы А и Б не имели устойчивого различия в ряду экспериментов (P = 0,313). При этом в трех опытах оно было более чем двукратно выше в матовой кювете и в шести опытах разница не превышала 2%. Во всех случаях, когда различие наблюдалось, оно появлялось по ходу эксперимента в ранее не отличавшихся выборках зародышей (табл. 2). Т.о., несмотря на отсутствие достоверных различий, делать вывод о том, что количество аномалий не зависит от оптического взаимодействия дробящихся яйцеклеток, неправомочно.

Табл. 1. Проверка однородности скоростей дробления яйцеклеток X.laevis в кюветах с индивидуальными ячейками для каждой яйцеклетки (зародыша).

Сравнение левой и правой половин кювет. Кювета А — с сохранением оптических контактов;

кювета Б — с нарушением оптических контактов.

Относительные различия рассчитаны, как (прав. — лев.) / лев.

P (уровень значимости) различия среднего числа бластомеров рассчитан по критерию Вилкоксона—Манна—Уитни;

P различия распределений по стадиям развития — по критерию Колмогорова—Смирнова.

P совокупного результата рассчитан по критерию знаков по Вилкоксону.

Относительные различия P различия P различия время среднего распределени время среднее от числа й по числу взаимо число дата T,°C оплодо % аномалий анимальных анимальных анимальных действ творен бластомеров бластомеров бластомеров ия, мин ия, мин кюв. А кюв. Б кюв. А кюв. Б кюв. А кюв. Б кюв. А кюв. Б 25.05.07 23 130 70 -100% 0% 1% -6% 0,828 0,289 1,000 0, 29.05.07 26 100 50 -67% 17% -4% -7% 0,689 0,189 0,919 0, 29.05.07 26 140 90 -60% -33% 3% 9% 0,480 0,173 1,000 0, 31.05.07 28 100 50 67% 0% -7% -2% 0,154 0,733 0,520 1, 31.05.07 28 130 80 -100% -40% 8% 10% 0,398 0,153 0,572 0, 05.06.07 23 100 50 67% 0% -1% -2% 0,943 0,965 1,000 1, 05.06.07 23 140 90 53% -100% 0% -10% 0,442 0,284 0,996 0, 05.06.07 23 170 120 100% -57% 8% 9% 0,099 0,219 0,286 0, 19.09.07 22 160 110 0% 67% 2% -11% 0,950 0,108 0,950 0, P совокупного результата 0,836 0,438 0,477 0, Табл. 2. Влияние оптических контактов на дробление яйцеклеток X.laevis.

Кювета А — с сохранением оптических контактов;

кювета Б — с нарушением оптических контактов.

Относительные различия рассчитаны, как (кюв.Б — кюв.А) / кюв.А.

Критерии для расчета P (уровня значимости) те же.

P Относительные различия P различия различия время распред среднее % % время средни среднего елений от число зароды ячеек, взаимо % числа й дата T,°C оплодо по числу анималь шей входя действ анома анималь размер творен анималь ных старше щих в ия, мин лий ных класте ия, мин ных класте бластом й ра бластом бластом еров стадии ры еров еров 25.05.07 23 130 70 0% -15% -67% -46% -36% 0,005 0, 29.05.07 26 100 50 0% -17% -58% -100% -100% 0,000 0, 29.05.07 26 140 90 392% -11% -61% -72% -67% 0,096 0, 31.05.07 28 100 50 -2% 3% -50% 0% 0% 0,293 0, 31.05.07 28 130 80 0% -16% -70% -100% -100% 0,014 0, 05.06.07 23 100 50 0% -9% -11% 1% -32% 0,041 0, 05.06.07 23 140 90 133% -8% -29% 8% -23% 0,065 0, 05.06.07 23 170 120 100% -14% -36% -11% -24% 0,031 0, 19.09.07 22 160 110 0% -11% -17% -8% -69% 0,039 0, P совокупного результата 0,313 0,008 0,004 0,047 0, В среднем по совокупности - -11% -44% -36% -50% Скорость дробления.

Среднее число анимальных бластомеров (во всех опытах кроме одного) в кювете Б было на 8—17% ниже, чем в кювете А;

в шести опытах это различие было достоверным (P 0,05), а в двух из них достоверно отличались и сами распределения (P 0,025).

Достоверность различия в разных опытах не коррелирует с температурой.

В каждом эксперименте, где не наблюдалось достоверной разницы (P 0,05), она появлялась или исчезала по ходу взаимодействия (см. табл. 2). Различие в среднем числе анимальных бластомеров между кюветами А и Б было достоверно при всех испробованных температурах (22—28°С), но не во все время эксперимента.

В ряду опытов среднее число анимальных бластомеров в кювете Б было в среднем на 11% ниже, чем в кювете А (P = 0,008).

Во всех опытах % зародышей старшей (см. табл. 2) стадии в кювете Б был ниже, чем в кювете А. По совокупности отличие составило в среднем 44% (P = 0,004). При этом сама старшая стадия от опыта к опыту колебалась от бластомеров до морулы.

Пространственное распределение зародышей старшей стадии.

Количество (%) зародышей старшей стадии, образующих кластеры, в четырех опытах слабо различалось и в пяти опытах было на 50—100% ниже в кювете Б (табл. 2). В среднем по совокупности экспериментов нарушение оптических контактов вело к снижению % зародышей старшей стадии, образующих кластеры, на 36% (P = 0,047).

Средний размер кластера в кювете Б также был во всех случаях ниже, чем в кювете А (за исключением одного наблюдения, где количество зародышей старшей стадии было недостаточно для образования кластеров) — табл. 2. В среднем эффект составил 50% (P = 0,008).

4.1.3. Дробление с различным числом оптических контактов Нормальные оптические контакты (кювета А) % аномалий в группах 1 (с четырьмя «соседями») и 2 (с тремя «соседями») в среднем не отличался (P = 1). Среднее число анимальных бластомеров в большинстве экспериментов в группе 2 было ниже, чем в группе 1, но достоверно — только в одном наблюдении (P = 0,012). По совокупности наблюдений среднее различие между группами 1 и 2 недостоверно (P = 0,195).

Нарушенные оптические контакты (кювета Б) Различия между группами 1 и 2 случайны и недостоверны. В среднем по % аномалий P = 0,906, по числу анимальных бластомеров P = 1. Достоверных отличий по среднему числу анимальных бластомеров не было ни в одном эксперименте.

4.1.4. Обсуждение Сравнение дробления яйцеклеток X.laevis при нормальных и нарушенных оптических контактах между ними свидетельствует о том, что оптическое взаимодействие дробящихся яйцеклеток с более «передовыми» стимулирует ускорение дробления. При этом увеличивается общее количество «передовых» яйцеклеток, количество и размер их кластеров и скорость дробления в среднем.

При снижении числа нормальных (ненарушенных) оптических контактов каждого зародыша с четырех до трех прослеживается тенденция к снижению среднего числа анимальных бластомеров, но не выходящая на уровень достоверности. Снижение числа нарушенных оптических контактов не влияет на развитие.

Итак, решающим фактором для нарушения дистантного взаимодействия зародышей является установка между ними т.н. фазового оптического экрана (замена прозрачной кварцевой перегородки на матовую).

4.2. Сверхслабое излучение яйцеклеток и зародышей Xenopus laevis 4.2.1. Корректность расчетов. Статистические характеристики фона Характеристики (см. Материалы и методы) темнового тока ФЭУ, излучения кювет со средой, яйцеклеток и зародышей имеют распределение близкое к нормальному. Учитывая объем выборок (7—10 объектов), для их сравнения допустимо применить критерий Стьюдента.

Уровень значимости P, при котором различие между выборками принимали за достоверное, выбрали равным 0,005. При этом спонтанные флуктуации темнового тока ФЭУ и излучения кювет со средой не выходили на уровень достоверности.

В спектре Фурье темнового тока достоверно встречающихся полос не наблюдалось. Излучение кювет со средой отличалось от темнового тока по средней интенсивности, дисперсии и гистограмме и не отличалось по спектру Фурье. Таким образом, при использованном объеме выборок, критерии сравнения и уровне значимости, артефактных флуктуаций фона не обнаружено.

4.2.2. Излучение яйцеклеток X.laevis Излучение неактивированных, активированных и оплодотворенных яйцеклеток измеряли в течение 1 мин (период накопления сигнала 1 мсек).

Спектры Фурье рассчитывали в диапазоне 0,01—50 Гц. Достоверных отличий от фона ни по одной из характеристик не обнаружено.

4.2.3. Излучение зародышей X.laevis по ходу развития По средней интенсивности, диспекрсии и гистограмме излучение зародышей не отличалось от фона (излучения кюветы со средой). По спектрам Фурье наблюдали достоверные (P 0,005) отличия: «+» полосы — более выраженные в излучении зародыша, чем в фоне и «—» полосы — более выраженные в фоне.

В диапазоне частот 0,01—50 Гц (длительность эксперимента 5 мин, период накопления сигнала 10 мсек) наблюдались следующие наборы полос (рис. 2):

~10 «+» полос на стадии 2;

~30 «+» полос на стадии 3;

снижение их числа на стадии 4 с появлением «—» полос на стадии 5 и сохранением лишь одной «+» полосы на стадии 6. На стадии 8 (средняя бластула) количество «+» полос снова увеличивалось и постепенно снижалось до нуля к стадии 14. На стадиях 14, 20, 24 достоверных отличий излучения зародыша от фона не обнаружено.

В диапазоне частот 0,1—500 Гц (длительность эксперимента 1 мин, период накопления сигнала 1 мсек) наблюдались следующие наборы полос (рис. 3):

1 «+» полоса на стадии 2;

набор «—» полос на стадиях 3—6, наименее выраженный на стадии 4;

резкое появление обширной группы «+» полос на стадии 8 (~20), ее дальнейший рост на стадии 9 (до ~40) и полное исчезновение на стадии 11. На стадии 14 повторно возникал набор «+» полос (~20), и снова пропадал на стадии 20. На стадии 24 наблюдалось 3 «+» полосы.

Рис. 2. Излучение отдельного зародыша разных стадий — фон.

Статистический разностный спектр мощности по Уэлчу.

Диапазон 0,01—50 Гц, период накопления сигнала 10 мсек, длительность измерений 5 мин.

Стадия развития 0 - 0 - Спектральная плотность мощности, *10- 0 - 0 - 0 - 0 - 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Частота, Гц Рис. 3. Излучение отдельного зародыша разных стадий — фон.

Статистический разностный спектр мощности по Уэлчу.

Диапазон 0,1—500 Гц, период накопления сигнала 1 мсек, длительность измерений 1 мин.

Стадия развития 0 - 0 - Спектральная плотность мощности, *10- 0 - 0 - 0 - 0 - 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Частота, Гц 4.2.4. Излучение зародышей X.laevis при оптическом контакте Перед катодом ФЭУ располагали две одинаковые прозрачные кварцевые (КУ1) кюветы с 10% MMR. Горизонтальные размеры кювет (2*10 мм) позволяли разместить на дне каждой из них ряд из 5 зародышей.

Стадия 6. Кюветы ставили узкой стороной к катоду и широкими сторонами друг к другу. Измеряли излучение от десяти зародышей стадии 6 (ранняя бластула), расположенных по пять на дне обеих кювет. Кюветы разгораживали экраном из черной бумаги. Измеряли излучение:

1. до взаимодействия;

2. во время взаимодействия (экран удален, но оставлен в камере люминометра);

3. после взаимодействия (экран повторно установлен между кюветами).

Период накопления сигнала — 1 мсек;

длительность всего эксперимента — 1 мин (60000 измерений). 10 повторов.

Излучение (3) не отличалось от (2) и от фона (излучения кювет со средой) ни по одной из характеристик (Фурье-спектр не рассчитывали). Средняя интенсивность излучения (3) была достоверно ниже, чем (2) на ~8% (1,5*10- квант / 1 мсек) (P 0,02).

Стадия 19. Одну из кювет (кювета 1) ставили непосредственно перед катодом, другую (кювета 2) — за ней. Измеряли излучение от:

1. 5 зародышей стадии 19 (стадия хвостовой почки), расположенных в ряд на дне кюветы 1;

2. 10 зародышей той же стадии, расположенных по 5 на дне обеих кювет.

Период накопления сигнала — 100 мсек;

длительность всего эксперимента — 20 мин (12000 измерений). 11 повторов.

Излучение (1) не отличалось от фона ни по одной из характеристик (Фурье-спектр не рассчитывали). Средняя интенсивность излучения (2) была достоверно ниже, чем (1) на ~5% (0,07 квант / 100 мсек) (P 0,02).

4.2.5. Обсуждение Итак, статистические спектры Фурье излучения отдельного зародыша обладают стадие-специфичностью. Состояние проблемы не позволяет перейти к их интерпретации в связи с молекулярно-биологическими или морфогенетическими процессами. К настоящему времени можно отметить лишь следующие совпадения:

• в период максимальной синхронности дробления (стадии 2—4) наблюдаются «+» спектральные полосы в диапазоне 0,01—50 Гц (за время измерения 5 мин);

• на стадиях 8—9 внезапно появляются наборы «+» полос в обоих диапазонах, особенно в диапазоне 0,1—500 Гц (за время измерения мин). По стадии развития это совпадает с активацией генома зародыша (mid-blastula transition).

Во всех случаях в наборах частот нет внутренней кратности. Изменение длительности эксперимента ведет к изменению всего набора спектральных полос, что говорит об апериодичности излучения. Превышение излучения зародыша над фоном (излучением кюветы со средой) или фона над излучением зародыша по спектральной мощности на группах частот не коррелирует с различием по средней интенсивности исходного сигнала и связано исключительно с его временнй структурой. В отношении оптического взаимодействия это соответствует утверждению С.Л.Загускина о чувствительности биосистем (см. Актуальность проблемы).

Оптическое взаимодействие зародышей наблюдается и на стадиях, более поздних, чем дробление (по крайней мере на стадиях 6 и 19) и проявляется в снижении суммарной интенсивности излучения: сразу после взаимодействия длительностью 1 мин (стадия 6) или во время взаимодействия длительностью 20 мин (стадия 19). Описанное явление подпадает под определение субрадиации, однако оснований для утверждения ее квантовой природы недостаточно.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе показано оптическое взаимодействие зародышей шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin.) по крайней мере в период дробления и по крайней мере в отсутствие третичных оболочек. Это взаимодействие «проходит» через прозрачный кварц КУ1 и приграничные слои воды на расстояние не менее 2 мм (толщина водного слоя не менее 0, мм). Взаимодействие проявляется в стимуляции «передовыми» яйцеклетками отстающих «соседей».

Естественно возникает вопрос о механизмах оптического взаимодействия.

Первые шаги к его разрешению состоят в измерении излучения от зародышей и анализе его свойств. Этой проблеме посвящена вторая часть работы. Показано, что хотя по средней интенсивности излучение зародышей не отличается от фона, оно обладает особой стадие-специфичной временнй структурой, связанной с апериодическими процессами, но с характерным для выбранной длительности опыта набором полос в Фурье-спектрах.

Из изложенного следует еще один вопрос: влияет ли оптическое взаимодействие биологических объектов на их сверхслабое излучение? В настоящей работе на новом объекте подтверждены результаты Л.В.Белоусова на зародышах костистых рыб: оптическое взаимодействие зародышей ведет к снижению суммарной интенсивности их излучения. Это нетривиальное явление, названное ранее субрадиацией, может служить дополнительным инструментом для решения проблемы механизмов дистантного взаимодействия.

6. ВЫВОДЫ 1. Показано оптическое взаимодействие дробящихся яйцеклеток Xenopus laevis, проявляющееся в стимуляции «передовыми» яйцеклетками отстающих «соседей»;

2. Показано оптическое взаимодействие групп зародышей на стадиях 6 и 19, проявляющееся в явлении субрадиации (снижения суммарной интенсивности излучения при взаимодействии);

3. Измерено излучение зародышей Xenopus laevis на стадиях 2—24;

приведены его стадие-специфичные разностные (с фоном) спектры Фурье при равенстве фону по средней интенсивности;

4. Показано, что на стадиях 2—4 излучение зародыша выше фона по спектральной мощности на группе частот в диапазоне 0,01—50 Гц на временах 5 мин и ниже в диапазоне 0,1—500 Гц на временах 1 мин;

5. Показано резкое появление в излучении зародыша на стадиях 8— групп спектральных полос, превышающих фон, совпадающее по стадии с активацией собственного генома зародыша, и постепенное их исчезновение на более поздних стадиях (11—24);

6. Предложена и успешно применена конструкция кювет для постановки экспериментов по оптическому взаимодействию индивидуальных зародышей;

7. Разработано и успешно применено программное обеспечение для анализа сверхслабого излучения.

7. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ [1] Volodyaev I. Bridging the gap between physics and biology. Rivista di Biologia / Biology Forum, Vol.98 №2, Pp.237- [2] Володяев И., Браже А., Белоусов Л.В. Мультифрактальный анализ сверхслабого излучения зародышей вьюна. Труды III международной конференции «Электромагнитные поля и излучения в биологии», стр. 277-278. 05-07.10.2005, Калуга. АП «Полиграфия».

[3] Володяев И., Белоусов Л.В. Некоторые закономерности в сверхслабом излучении зародышей Xenopus laevis. Труды IV международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», стр. 88. 03-07.07.2006, СПб.

[4] Белоусов Л.В., Володяев И.В. Некоторые свойства сверхслабых излучений (ССИ) яйцеклеток, зародышей и клеточных культур.

Сборник избранных трудов IV международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», стр.27- [5] Володяев И.В., Белоусов Л.В. Сверхслабые излучения развивающихся яйцеклеток и зародышей шпорцевой лягушки.

Онтогенез, т.38 №5, стр.386-393.

[6] Володяев И.В., Белоусов Л.В. Оптическое взаимодействие и сверхслабое излучение зародышей шпорцевой лягушки. Сборник трудов VII международной крымской конференции «Космос и биосфера», стр.158-159. 01-06.10.2007, Судак, Крым.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.