Фармакогностическое исследование надземной части chamaenerion angustifolium (l.) scop.
На правах рукописи
Валов Роман Игоревич Фармакогностическое исследование надземной части Chamaenerion angustifolium (L.) Scop.
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Улан-Удэ - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор фармацевтических наук, профессор ХАНИНА МИНИСА АБДУЛЛАЕВНА
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор кафедры неорганической и аналитической химии ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» Минобрнауки России АНЦУПОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории химико-фармацевтических исследований ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН ОЛЕННИКОВ ДАНИИЛ НИКОЛАЕВИЧ
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится “22” мая 2012 г. в 1600 час. на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: ул. Сахьяновой, 6, 670047, г. Улан-Удэ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН по адресу: ул. Сахьяновой, 6, 670047, г. Улан-Удэ.
Автореферат разослан “20” апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ХОБРАКОВА В.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Несмотря на значительные успехи, АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.
достигнутые в области изучения опухолевого процесса, разработки методов профилактики, диагностики и лечения, проблема злокачественных новообразований является одной из важнейших в современной медицине.
Применяемые методы хирургического, лучевого и лекарственного лечения опухолевых заболеваний часто не приводят к полному выздоровлению больных, в связи с чем для здравоохранения актуально изыскание новых высокоэффективных и безопасных средств, методов борьбы с онкологическими заболеваниями (Гольдберг и др., 2008;
Горбунова и др., 2003;
Иванова и др., 2009).
Перспективным в настоящее время является поиск новых препаратов для лечения и профилактики онкологических заболеваний, а также создание лекарственных препаратов, усиливающих действие цитостатиков и снижающих их токсическое действие. Наиболее часто в схемы лечения онкологических больных включаются цитостатики природного происхождения (винбластин, винкристин, колхамин, подофиллин и др.), обладающие характерными для всех цитостатических препаратов побочными эффектами. Необходимо отметить, что встречается все больше сведений об использовании растительных средств в качестве имуномодуляторов, повышающих общую резистентность организма и выступающих в качестве средств дополнительной терапии (Бабаскина и др., 1997;
Иванов и др., 2001).
Препараты на основе растительных компонентов выгодно отличаются от синтетических лекарственных средств, прежде всего, низкой токсичностью, высокой биодоступностью и меньшим числом побочных эффектов (Гольдберг и др., 2000). В этом отношении перспективным объектом исследования является иван-чай узколистный (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop., син.
Chamerion angustifolium (L.) Holub, сем. Onagraceae – Кипрейные), который применяется в традиционной и народной медицине как антиоксидантное, общеукрепляющее, противовоспалительное, ранозаживляющее, поливитаминное, противолихорадочное средство, а также применяется при бессоннице, головных болях, неврозах, анемии, нарушениях обмена веществ (Растительные …, 2009). Ранее из соцветий Ch. angustifolium был предложен препарат «Ханерол», обладающий высокой противоопухолевой активностью, обусловленной присутствием суммы фенольных соединений (Постольников, 1977). Согласно сведениям научной литературы химический состав надземной части Ch. angustifolium изучен недостаточно, также отсутствуют данные о фармакогностическом исследовании данного вида. Таким образом, фармакогностическое изучение надземной части Ch. angustifolium является актуальной задачей.
является фармакогностическое исследование надземной ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ части Ch. angustifolium и разработка способа получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие ЗАДАЧИ:
-определить анатомо-диагностические признаки и товароведческие показатели надземной части Ch. angustifolium;
-исследовать химический состав надземной части Ch. angustifolium, произрастающего на территории Сибири;
-разработать методы стандартизации надземной части Ch. angustifolium;
-разработать способ получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии на основе надземной части Ch. angustifolium;
-разработать нормативную документацию на траву иван-чая узколистного и экстракт иван-чая узколистного сухой.
В надземной части Ch. angustifolium впервые НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
установлено присутствие:
-, -каротинов, ликопина, хлорофиллов а и b, лютеина, зеаксантина, виолаксантина, неоксантина, криптоксантина, кампестерола, стигмастерола, урсоловой кислоты, -, -амирина, кумарина, умбеллиферона, скополетина, метилового эфира галловой кислоты, 5-О кофеилхинной кислоты, мирицетин-3-О-галактозида, свободных флавонол агликонов (кверцетин, кемпферол, мирицетин), дилактона валониевой кислоты и трех галлоил-глюкоз (6-О-галлоил-глюкоза, 1,2,6-О-тригаллоилглюкоза и 1,2,3,4,6-О-пентагаллоил-глюкоза). Впервые изучен состав антоцианнов Ch. angustifolium цветков и установлено присутствие пеонидин-3-О галактозида, цианидин-3-О-галактозида, цианидин-3-О-глюкозида, цианидин 3,5-О-диглюкозида и дельфинидин-3-О-глюкозида. Установлено, что Ch.
доминирующим полисахаридным компонентом надземной части angustifolium является -4,6-глюкан. С применением метода масс спектрометрии с индуктивно связанной плазмой определено содержание химического элемента, из них 35 впервые. Определены основные анатомо диагностические признаки надземной части Ch. angustifolium. Разработан и предложен способ получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии.
Разработаны методики ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
количественного определения флавоноидов в пересчете на миквелианин и таннинов в пересчете на энотеин В в надземной части Ch. angustifolium с применением дифференциальной спектрофотометрии и твердофазной экстракции – спектрофотометрии. Разработана методика количественного определения 13 фенольных соединений с применением микроколоночной ВЭЖХ. Разработаны проекты Фармакопейных статей предприятия «Трава иван-чая узколистного» и «Экстракт иван-чая узколистного сухой».
Теоретические положения и результаты СТЕПЕНЬ ВНЕДРЕНИЯ.
экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирского государственного медицинского университета» Минздравсоцразвития РФ.
НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:
Ch.
1) Результаты химического исследования надземной части angustifolium;
2) Данные стандартизации надземной части Ch. angustifolium;
3) Анатомо-диагностические признаки и товароведческие показатели надземной части Ch. angustifolium;
4) Способ получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии на основе надземной части Ch. angustifolium.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на ежегодных конкурсах-конференциях студентов и молодых ученых “Авиценна-2006”, “Авиценна-2007” и “Авиценна-2008” (Новосибирск, 2006, 2007, 2008);
ХI и XII международных экологических студенческих конференциях “Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ” (Новосибирск, 2006, 2007);
66 и 67 всероссийских итоговых студенческих научных конференциях им. Н.И. Пирогова (Томск, 2007, 2008), СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ Работа выполнена в соответствии с планом ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК.
научных исследований кафедры фармакогнозии и ботаники Новосибирского государственного медицинского университета (государственная регистрация № 012000807420) и комплексной целевой программой СО РАМН «Здоровье человека в Сибири» (государственная регистрация № 01.9.2002479).
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертационной работы опубликовано научных работ, в том числе 3 статьи – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ.
Диссертация изложена на СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.
печатных страницах, состоит из введения, основной части (6 глав), заключения, списка цитируемой литературы, состоящего из 152 источников, в том числе на иностранных языках, и включает 49 рисунков, 73 таблиц и 3 приложения.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Трава Ch. angustifolium была собрана в различных МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.
районах НСО, Ярославской области и республике Бурятия в 2006-2011 гг.
ТСХ и ВЭТСХ проводили на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-АФ и ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.), препаративную ТСХ – на пластинах с силикагелем (Имид Ltd.) и целлюлозой (Merck), КХ – на силикагеле 100/400 (Woelm), полиамиде (Sigma), ионообменную хроматографию – на ДЭАЭ-целлюлозе (Whatman), гель-хроматографию – на Sephadex LH-20 (Farmacia), Sephacryl 300 HR (Sigma-Aldrich). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ Спектр). Оптическое вращение определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-механический завод). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре ФТ-801 (Симекс). ГХ-МС анализ проводили на хромато-масс-спектрометре 6890N, соединенным с масс квадрупольным детектором 5973N (Agilent Technologies) с использованием капиллярной колоноки HP-Innowax (Agilent Technologies;
30 м0.25 мм0. мкм;
неподвижная фаза – полиэтиленгликоль). МС-анализ проводили на масс спектрометре высокого разрешения MAT 8200 (Finnigan). Спектры 1Н- и С ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian). ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А- (Эконова). Аминокислотный состав определяли методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза Капель 105 (Люмэкс), элементный состав – на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Elan-DRC II (Perkin-Elmer). Механическую активацию сырья проводили в планетарной мельнице, ультразвуковую обработку – в диспергаторе УЗДН-2Т (Укрросприбор), дезинтеграцию сырья – на установке ДЕЗИ 11МЛ 1Ф. Анатомическое исследование и товароведческий анализ проводили согласно требованиям ГФ XI изд. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statistica MS Excel, OriginPro 7.5.
Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.2 (Alentum Software, Inc.).
1. ХИМИЧЕСКОЕ Chamaenerion ИССЛЕДОВАНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ angustifolium Для химического исследования экстрактивных веществ надземной части Ch. angustifolium было проведено фракционирование и хроматографическое разделение спирторастворимых компонентов с применением жидкофазной экстракции, КХ на силикагеле, полиамиде, Сефадексе LH-20, твердофазной экстракции на полиамиде, препаративной ТСХ на силикагеле и целлюлозе. В результате было выделено 31 соединение, а также определен состав липофильных (жирные кислоты, стерины, фотосинтетические пигменты) и гидрофильных веществ (аминокислоты, свободные углеводы, ди- и трикарбоновые кислоты).
1.1. Липофильные соединения. Для изучения липофильных компонентов травы Ch. angustifolium было проведено исследование гексановой фракции, а также фракции общих липидов, выделенной по методу Фолча, с последующими КХ, препаративной ТСХ, ВЭТСХ на силикагеле и анализом с применением спектрофотометрии, ИК-спектроскопии и ГХ-МС. Установлено присутствие нейтральных липидов, гликолипидов, фосфолипидов, жирных кислот, каротиноидов, хлорофиллов, ксантофиллов, стеролов и тритерпеновых соединений (табл.1). Наличие ряда соединений выявлено в Ch. angustifolium впервые.
Таблица 1. Состав липофильных компонентов травы Ch. angustifolium Группа соединений Индивидуальные компоненты (содержание)б (содержание)а Общие липиды нейтральные (65.2), гликолипиды (10.5), фосфолипиды (8.37%) (24.3) Жирные кислоты 6:0 (сл.), 8:0 (сл.), 10:0 (сл.), 12:0 (сл.), 14:0 (0.5), 16: (общие липиды) (20.7), 16:1 7 (0.1), 16:1 9 (0.2), 18:0 (3.2), 18:1 (7.9), 18:1 9 (0.5), 18:2 6 (18.4), 18:3 3 (27.0), 20: (4.1), 20:1 9 (0.5), 22:0 (1.1), 24:0 (3.9), 26:0 (6.7), 28: (3.1), 30:0 (1.8) -каротин*, -каротин*, ликопин* Каротиноиды хлорофилл а*, хлорофилл b* Хлорофиллы лютеин*, зеаксантин*, виолаксантин*, неоксантин*, Ксантофиллы криптоксантин* -ситостерин, кампестерол*, стигмастерол* Стеролы олеаноловая кислота, урсоловая кислота, -амирин*, Тритерпены амирин* а от массы в.с.с.;
б от массы группы соединений;
* соединения, присутствие которых выявлено впервые.
1.2. Фенольные соединения. Кумарины, выделенные из хлороформной фракции Ch. angustifolium, были идентифицированы как кумарин (4), умбеллиферон (5) и скополетин (6);
из спиртового раствора этилацетатной фракции при охлаждении выпадает соединение с выходом 0.2% м.в.с.с., идентифицированное с эллаговой кислотой (10). Из этилацетатной фракции было выделено два соединения, охарактеризованных как галловая кислота (9) и ее метиловый эфир (метилгаллат, 8), а также два фенилпропаноида – феруловая (11) и кофейная кислоты (12). Присутствие фенилпропаноидов было выявлено в бутанольной фракции;
два выделенных соединения были идентифицированы с 3-О-кофеилхинной (23) и 5-О-кофеилхинной кислотами (24). Компоненты (Hiermann et al., 1998), 10 (Kiss et al., 2004), 11, 12 и 23 (Hiermann et al., 1998) были ранее обнаружены в Ch. angustifolium;
4-6, 8 и 24 выявлены в данном виде впервые.
В составе флавоноидов установлено присутствие 13 соединений группы флавонолов, производных кемпферола (7) – афцелин (кемпферол-3-О рамнозид, 14) и кемпферол-3-О-глюкуронид (22);
кверцетина (13) – кверцитрин (кверцетин-3-О-рамнозид, 15), авикулярин (кверцетин-3-О-арабинозид, 17), гиперозид (кверцетин-3-О-галактозид, 18), изокверцитрин (кверцетин-3-О глюкозид, 19), кверцетин-3-О-(6-галлоил)-галактозид (20) и миквелианин (кверцетин-3-О-глюкуронид, 21);
мирицетина (27) – мирицитрин (мирицетин 3-О-рамнозид, 16) и мирицетин-3-О-галактозид (28) (рис.1).
R H OH H 19 Glc OH H OH Rha H H 20 (6-Gall)Gal OH H HO O R Rha OH H 21 GlcA OH H OR Rha OH OH 22 GlcA H H OH O R1 R2 R3 Ara OH H 27 H OH OH H H H Gal OH H 28 Gal OH OH 7 Рис. 1. Структурные формулы флавоноидов травы Ch. angustifolium.
Присутствие 14-22 в Ch. angustifolium было установлено ранее (Denford, 1980;
Ducrey et al., 1995;
Hiermann et al., 1991;
Kiss et al., 2004;
Tth et al., 2009);
соединение 28, а также свободные агликоны 7, 13 и 27 обнаружены впервые.
В результате хроматографического разделения бутанольной фракции было выделено пять соединений, относящихся к классу таннинов, в т.ч.
эллаготаннины – дилактон валониевой кислоты (25) и энотеин В (26), и галлотаннины – 6-О-галлоил-глюкоза (29), 1,2,6-О-тригаллоилглюкоза (30) и 1,2,3,4,6-О-пентагаллоил-глюкоза (31) (рис. 2).
OH OH O-Gall O-Gall HO HO O O A A HO HO O O OH b-Glc HO HO HO O O OH 7' O HO 1' HO Gall-O O O OH O-Gall O C' B O OH B O 3' OH 29 HO OO HO O O O O D OH 2'' 7'' HO OH HO OH C 1'' O-Gall OH O O HO OH O OH HO O a-Glc O OH O B' Gall-O OH C O Gall-O 25 OH HO O O Gall-O O OH OH O-Gall OH O A' O 31 Gall OH D' HO OH HO OH Рис. 2. Структурные формулы таннинов травы Ch. angustifolium.
Соединения 25, 29-31 выделены из Ch. angustifolium впервые;
ранее присутствие 25, а также 6-О-, 1,6-ди-О-, 2,3-ди-О- и 1,2,6-три-О-галлоилглюкоз было выявлено в Epilobium hirsutum (Bakarat et al., 1997).
Учитывая наличие интенсивной пигментации цветков Ch. angustifolium, было проведено исследование химического состава антоцианов данного вида.
Для их выделения применяли экстракцию 0.1% HCl в этаноле с последующей КХ на Amberlite XAD-7, Сефадексе LH-20, ТСХ на целлюлозе и ВЭТСХ на силикагеле, что привело к выделению 5 соединений, идентифицированных по данным химических превращений, МС-, УФ-, ИК-спектроскопии как пеонидин 3-О-галактозид (32), цианидин-3-О-галактозид (33), цианидин-3-О-глюкозид (34), цианидин-3,5-О-диглюкозид (35) и дельфинидин-3-О-глюкозид (36) (рис.3). Соединения 32-36 выделены из Ch. angustifolium впервые;
ранее исследование антоцианов рода Chamaenerion Hill и близкого к нему рода Epilobium L. не проводилось.
OCH3 OH OH OH OH OH OH OH OH OH HO O HO O HO O HO O HO O OH O-Gal O-Gal O-Glc O-Glc O-Glc OH OH OH O-Glc OH 32 33 34 35 Рис. 3. Структурные формулы антоцианов цветков Ch. angustifolium.
Для определения содержания индивидуальных фенольных соединений была разработана методика количественного определения 13 соединений с применением микроколоночной ВЭЖХ с УФ-детектированием (рис.4).
Разработанная методика была использована для количественного анализа партий сырья Ch. angustifolium, собранного в НСО, Ярославской области и республике Бурятия. Проведенные исследования показали, что для всех исследованных партий сырья доминирующим компонентом является энотеин В, содержание которого составило 51.29-107.79 мг/г. В составе флавоноидов преобладают миквелианин (7.91-26.65 мг/г), афцелин (1.09-18.86 мг/г) и кемпферол-3-О-глюкуронид (2.85-12.34 мг/г) (табл. 3).
Рис. 4. Хроматограмма (ВЭЖХ) спиртового извлечения травы Ch. angustifolium.
Соединения: 1 – галловая кислота, 2 – энотеин В, 3 – 3-О-кофеилхинная кислота, 4 – кверцетин-3-О-(6-галлоил)-галактозид, 5 – мирицитрин, 6 – эллаговая кислота, 7 – миквелианин, 8 – кверцитрин, 9 – кемпферол-3-О глюкуронид, 10 – мирицетин, 11 – афцелин, 12 – кверцетин, 13 – кемпферол.
Условия: колонка ProntoSIL-120-5-C18 (275 мм, 5 мкм);
элюенты А [(4.1 М LiClO4 в 0.1 M HClO4):H2O 5:95], B [MeCN];
градиентный режим 10-40% В (0 12 мин), 100% В (12-15 мин);
Т 40°С;
200 мкл/мин;
детектор 270, 330 и нм.
Таблица 3. Содержание ( x ) фенольных соединений в траве и морфологических группах Ch. angustifolium, мг/г м.в.с.с.
Соединение б Сырье а 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 НСО I 5.55 6.14 55.04 1.37 0.04 1.38 2.85 0.13 1.91 2.30 7.91 0.60 2. II 4.98 5.82 106.07 0.90 0.03 9.83 9.13 0.17 1.53 2.08 18.65 0.26 3. Ярославская область III 6.49 7.58 92.02 1.15 0.07 2.36 4.86 0.16 2.27 3.53 18.72 0.95 2. Республика Бурятия IV 3.41 5.57 54.84 1.43 0.05 1.09 3.40 0.16 3.87 11.65 9.21 0.58 1. V 5.94 8.57 98.66 1.63 0.10 3.67 6.31 0.55 6.19 6.93 26.65 1.17 5. VI 3.24 5.77 64.08 1.06 0.04 2.25 3.12 0.16 3.47 11.05 8.92 0.55 2. VII 5.07 6.22 51.29 1.05 0.06 2.41 5.42 0.16 3.29 1.79 18.49 0.92 4. VIII 8.05 8.39 107.79 1.50 0.04 5.03 4.14 0.20 1.89 3.01 15.52 1.42 2. IX 7.15 8.96 73.18 1.24 0.08 18.86 12.34 0.26 4.05 3.52 17.59 3.95 3. X 5.76 6.62 105.07 1.57 0.04 5.47 5.27 0.18 1.80 1.65 13.55 1.57 1. XI 4.08 5.14 71.77 0.86 0.03 13.28 10.83 0.11 1.43 1.32 10.83 3.16 1. Морфологические группы (сырье II) листья 7.37 8.82 111.61 1.77 0.10 1.53 5.63 0.45 5.43 7.82 31.62 1.53 5. цветки 7.57 9.15 128.61 0.55 0.11 28.85 21.93 0.26 5.84 2.10 11.11 5.18 3. стебли 3.42 3.61 54.80 0.41 0.04 0.37 1.79 0.11 1.05 1.04 6.97 0.34 1. а Сырье (фаза цветения): I – окр. пос. Мочищи (09.07.2006), II – Тогучинский р он, 45 км от г. Новосибирск (10.07.2009), III – окр. п. Карабиха (11.07.2006), IV – мыс Тонкий, ю.-з. склон (03.08.2005), V – мыс Тонкий, сосновый лес (03.08.2005), VI – мыс Тонкий, галечник (03.08.2005), VII – мыс Тыя (25.07.2006), VIII – окр. пос. Даван (28.07.2006), IX – Мухоршибирский р-он, Барской хребет (25.07.2009), X – Мухоршибирский р-он, Барской хребет (28.07.2009), XI – Заиграевский р-он, окр. пос. Нарын-Ацагат (30.07.2011).
б Соединения: указаны на рис. 4.
Исследование характера распределения фенольных соединений по морфологическим группам Ch. angustifolium показало, что для листьев характерно накопление таннинов (203.86 мг/г), для цветков – флавоноидов (82.58 мг/г) и антоцианов (2.07 мг/г);
в стеблях содержание фенольных соединений наименьшее (табл. 4). Следует отметить, что в составе флавоноидов листьев преобладают миквелианин (33.62 мг/г) и кверцетин-3-О-(6-галлоил) галактозид (7.82 мг/г), цветков – афцелин (28.85 мг/г) и кемпферол-3-О глюкуронид (21.93 мг/г);
основными флавоноидами стеблей являются миквелианин (6.97 мг/г) и кемпферол-3-О-глюкуронид (1.79 мг/г) (табл. 3).
Таблица 4.Содержание фенольных соединений в морфологических группах Ch.
angustifolium Общие Морфологическая Флавоноиды, Таннины, Антоцианы, фенолы, мг/г б в мкг/г г группа мг/г мг/г а листья 252.46±9.94 43.52±0.87 203.86±3.66 229.84±6. цветки 237.86±9.75 82.58±1.65 135.97±2.58 2073.21±66. стебли 129.54±5.18 10.74±0.21 64.02±1.15 147.73±4. а в пересчете на галловую кислоту;
в пересчете на миквелианин;
в в пересчете б на энотеин В;
г в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид.
1.3. Углеводы. В составе фракции водорастворимых полисахаридов надземной части Ch. angustifolium (CAWP) выявлено присутствие нейтральных и кислых компонентов (табл. 5). Доминирующими являются нейтральные полимеры группы глюканов. Структурные исследования показали, что преобладающий полисахарид Ch. angustifolium CAWP-1 представляет собой разветвленный -4,6-глюкан с молекулярной массой 95 кДа.
Ch.
Физико-химическая характеристика полисахаридов Таблица 5.
angustifolium I2- Моносахаридный состав, моль% Выход, []D, Фракция р % ° Ara Gal Glc Man Rha Xyl GalA GlcA ция 3.8* CAWP н.о. + 9.7 11.3 61.7 4.2 1.9 1.7 9.4 сл.
** CAWP-1 54.4 +127 + - - 99.9 - - - - * ** от массы возд.-сух. сырья;
от массы CAWP.
1.4. Первичные метаболиты. В составе первичных метаболитов Ch.
angustifolium было выявлено присутствие аминокислот (19 соединений;
доминирует лейцин;
суммарное содержание 3.2-3.4%), органических кислот (винная, яблочная, лимонная кислоты;
суммарное содержание 2.7-2.9%), аскорбиновой кислоты (15-50 мг%), моносахаридов (сахароза, глюкоза, галактоза).
1.5. Элементный состав. С применением метода масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой установлено присутствие 61 элемента, из них 35 впервые. Выявлено, что для листьев характерно накопление Si, Mn, B, Na, Cr, Mo и Co, для стеблей – Br и Al, для цветков – Fe, Zn, Cu, Se и I. Характер распределения элементов по группам близок к таковому травы Ch.
angustifolium.
2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ТРАВЫ Chamaenerion angustifolium.
2.1. Методы определения подлинности и количественного анализа травы Ch. angustifolium. В качестве критериев подлинности травы Ch.
angustifolium были выбраны следующие показатели:
1) положительная реакция на антоцианы при подкислении спиртового извлечения;
2) присутствие миквелианина и группы флавоноидов по данным высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ);
3) присутствие энотеина В по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для проведения количественной оценки действующих веществ травы Ch.
angustifolium предложено определение содержания двух групп соединений – флавоноидов и таннинов, для которых были разработаны методики количественного анализа.
Для определения содержания флавоноидов использована методика дифференциальной спектрофотометрии после реакции комплексообразования с AlCl3 с рабочей длиной волны 410 нм, являющейся общей для спиртового извлечения Ch. angustifolium и доминирующего флавоноида миквелианина (рис.
5а). Учитывая факт отсутствия ГСО миквелианина в России, веществом сравнения был выбран рутин, обладающий сходными спектральными характеристиками, но меньшей интенсивностью экстремума дифференциального спектра. Для устранения данного недостатка при расчетах предложено использование коэффициента пересчета на миквелианин (1.12) в знаменателе формулы. Сравнительные исследования показали, что расхождения в результатах количественного определения флавоноидов в траве Ch. angustifolium при использовании в качестве веществ сравнения миквелианина и рутина не превышали 0.1%.
а б Рис 5. Спектры поглощения спиртового извлечения (СИ) из надземной части Ch. angustifolium и веществ сравнения. а: 1 – спектр СИ, 2 – спектр СИ в присутствии AlCl3, 3 – дифференциальный спектр СИ, 4 – дифференциальный спектр миквелианина (с = 8 мкг/мл). б: 1 – спектр СИ, 2 – спектр СИ после ТФЭ, 3 – дифференциальный спектр СИ, 4 – спектр энотеина В (с = 2 мкг/мл).
Для количественного анализа таннинов в траве Ch. angustifolium была разработана комбинированная методика, включающая этапы экстракции сырья этанолом, твердофазной экстракции (ТФЭ) спиртового извлечения на полиамидном патроне и дифференциальной спектрофотометрии. В процессе ТФЭ происходила необратимая сорбция таннинов на полиамиде, что подтверждалось результатами ВЭЖХ;
в элюате после ТФЭ присутствовали только флавоноиды и ряд простых фенольных соединений, степень элюции которых составляла 98-99%. Спектрофотометрический анализ проводили в дифференциальном варианте с использованием в качестве раствора сравнения элюат после ТФЭ, а рабочим являлся исследуемый раствор без обработки, что позволило устранить влияние нетанниновых соединений при образовании спектра поглощения (рис. 5б). Максимум дифференциального спектра (270 нм) был близок к таковому энотеина В (267 нм), который был выбран в качестве вещества сравнения. Для удобства при расчетах использовалось значение 1% удельного коэффициента погашения энотеина В ( E1см = 345).
В ходе валидационного анализа при определении специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности разработанные методики удовлетворяют критериям приемлемости. Общие метрологические показатели приведены в табл. 8. Суммарное содержание флавоноидов и таннинов в исследованных партиях сырья составило 2.19-5.40 и 5.93-16.82%, соответственно.
Таблица 6. Метрологические характеристики разработанных методик количественного анализа (n = 10, P = 0.95, tP,f = 2.26) x,% x,% E,% Sx S2 S Показатель -2 -1 - флавоноиды 5.03 3.71·10 1.93·10 6.09·10 0.14 2. -1 -1 - таннины 12.33 2.95·10 5.43·10 1.72·10 0.39 3. 2.2. Анатомо-диагностические признаки и товароведческие показатели По данным анатомического исследования травы Ch. angustifolium.
установлены следующие диагностические признаки надземной части Ch.
аngustifolium: лист гипостоматический, устьица аномоцитные, слегка погруженные. Клетки нижней эпидермы сильно извилистостенные, покрыты толстым слоем складчатой кутикулы. Клетки верхней эпидермы почти прямостенные, могут иметь как тонкие, так и толстые боковые стенки.
Паренхима листа выполнена округлыми и лопастными клетками с большими межклетниками. В мезофилле листа, в основном вдоль жилок, встречаются идиобласты с рафидами (рис. 6а) и слизью. Идиобласты намного крупнее паренхимных клеток. Клетки эпидермы лепестков венчика мелкие, с сильно извилистыми стенками, устьица многочисленные. В мезофилле лепестков большое количество клеток – идиобластов с рафидами (рис. 6б) и слизью, которые в несколько раз длиннее клеток идиобластов листа. Наружная эпидерма лепестка покрыта многочисленными одноклеточными выростами.
Фрагменты Рис. 6.
микроскопического строения листа (а) и лепестка венчика Ch. аngustifolium (б).
Стрелками указано положение рафидов.
а б Ch. аngustifolium Товароведческие показатели надземной части представлены в табл. 7.
Таблица 7. Спецификации к ФСП “Иван-чая узколистного трава” и “Экстракт иван-чая узколистного сухой” Нормы Иван-чая Экстракт иван-чая Показатели Методы узколистного узколистного трава сухой Описание, внешние Визуальн., В соответствии с В соответствии с признаки органолепт. ФСП ФСП Подлинность:
При подкислении спиртового раствора должно - антоцианы;
Визуальн. появляться малиновое окрашивание (антоцианы).
После проявления в УФ-свете на хроматограмме - флавоноиды;
ВЭТСХ должны обнаруживаться не менее пяти флуоресцирующих зон, подвижность одной из которых должна совпадать по значению Rf с таковой РСО гиперозида. Между зонами РСО рутина и гиперозида должна присутствовать зона с кирпично-красной флуоресценцией (миквелианин).
На хроматограмме должен присутствовать пик со - энотеин В ВЭЖХ временем выхода 2 мин между пиками галловой и хлорогеновой кислот (энотеин В).
Потеря в массе при Гравиметрич. Не более 8% Не более 5% высушивании Зола общая Гравиметрич. Не более 10% Не более 8% Сульфатная зола Гравиметрич. Не более 0.5% Не более 0.5% Тяжелые металлы ГФ XII Не более 0.01% Не более 0.01% Содержание Гравиметрич. Не более 3% побуревших листьев Содержание Гравиметрич. Не более 1% опушенных частей цветка Количественное определение:
- флавоноиды в Спектро- Не менее 2% Не менее 6% пересчете на фотометрич.
миквелианин;
- таннины в Спектро- Не менее 5% Не менее 15% пересчете на фотометрич.
энотеин В Микробиологичес- ГФ XII Категория 3Б Категория 3Б кая чистота Маркировка В соответствии с ФСП Хранение В защищенном от света месте при температуре 12-15°С Срок годности 3 года 5 лет 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ИВАН-ЧАЯ УЗКОЛИСТНОГО СУХОГО (ЭИУС) 3.1. Способ получения и химический состав ЭИУС. В результате химико-технологических исследований разработан способ получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии, заключающийся в последовательной экстракции сырья (надземной части Ch. аngustifolium), измельченного до размера частиц 0.5-3 мм 70% этанолом в соотношении сырье : экстрагент 1:(68-72) в течение 30 мин при 80-82°С трехкратно, с последующим объединением экстрактов, отгоном этанола, упариванием и сушкой в вакуум-сушильном аппарате. Выход готового продукта – 38-40% от массы воздушно-сухого сырья.
Экстракт иван-чая узколистного сухой представляет собой аморфный порошок от желто-коричневого до светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вяжущим горьковатым вкусом, хорошо растворимый в 50-70% этаноле. Не гигроскопичен, не комкуется. Насыпная масса при свободной засыпке 0.76±0.02 г/см3, при уплотнении 1.06±0.03 г/см3. Угол естественного откоса 48±1°. Сыпучесть 0.91±0.04 г/с. Согласно дериватограмме основное удаление влаги происходит при температуре 60-75°С. При температуре свыше 120°С происходит термическое разложение и карамелизация.
Химический анализ показал, что ЭИУС содержит все основные группы соединений, характерные для исходного сырья (табл. 8).
3.2. Методы контроля качества ЭИУС. Для стандартизации ЭИУС было предложено определение внешнего вида, подлинности (присутствие антоцианов, миквелианина и энотеина В), потери массы при высушивании, золы общей и сульфатной, тяжелых металлов, количественное определение флавоноидов и таннинов и микробиологической чистоты (табл. 7). Суммарное содержание флавоноидов и таннинов в исследованных партиях ЭИУС должно быть не менее 6 и 15%, соответственно.
Таблица 8. Химический состав ЭИУС (серия 150710) Группа Общее Индивидуальные соединения соединений содержание, (содержание, мг/г) мг/г Простые фенолы 52.21±0.63 галловая кислота (19.26), эллаговая кислота (23.78) Фенилпропаноиды - 3-О-кофеилхинная кислота (3.37) Флавоноиды 85.94±1.71 кемпферол (0.31), афцелин (14.85), кемпферол-3-О-глюкуронид (13.35), кверцетин (0.48), кверцитрин (5.83), кверцетин-3-О-(6-галлоил)-галактозид (5.22), миквелианин (31.43), мирицетин (3.81), мирицитрин (6.72) Таннины 351.01±7.02 энотеин В (259.08) ВЫВОДЫ химический состав надземной части Ch. angustifolium.
1. Определен Установлено присутствие:
-, -каротинов, ликопина, хлорофиллов а и b, лютеина, зеаксантина, виолаксантина, неоксантина, криптоксантина, кампестерола, стигмастерола, урсоловой кислоты, -, -амирина, кумарина, умбеллиферона, скополетина, метилового эфира галловой кислоты, 5-О-кофеилхинной кислоты, мирицетин-3-О-галактозида, свободных флавонол-агликонов (кверцетин, кемпферол, мирицетин), дилактона валониевой кислоты и трех галлоил-глюкоз (6-О-галлоил глюкоза, 1,2,6-О-тригаллоилглюкоза и 1,2,3,4,6-О-пентагаллоил-глюкоза).
Изучен состав антоцианов цветков Ch. angustifolium и установлено присутствие пеонидин-3-О-галактозида, цианидин-3-О-галактозида, цианидин-3-О-глюкозида, цианидин-3,5-О-диглюкозида и дельфинидин-3 О-глюкозида. Установлено, что доминирующим полисахаридным компонентом надземной части Ch. angustifolium является -4,6-глюкан. С применением метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой определено содержание 61 химического элемента, из них 35 впервые.
2. Разработаны методики количественного определения флавоноидов в пересчете на миквелианин и таннинов в пересчете на энотеин В в надземной части и экстракте сухом Ch. angustifolium с применением дифференциальной спектрофотометрии и твердофазной экстракции – спектрофотометрии. Разработана методика количественного анализа фенольных соединений с применением микроколоночной ВЭЖХ.
3. Определены анатомо-диагностические признаки и товароведческие показатели надземной части Ch. angustifolium.
4. Разработан способ получения средства для профилактики осложнений полихимиотерапии, заключающийся в последовательной экстракции сырья (надземной части Ch. аngustifolium), измельченного до размера частиц 0.5- мм 70% этанолом в соотношении сырье : экстрагент 1:(68-72) в течение мин при 80-82°С трехкратно, с последующим объединением экстрактов, отгоном этанола, упариванием и сушкой в вакуум-сушильном аппарате.
Выход готового продукта – 38-40% от массы воздушно-сухого сырья.
5. Разработаны проекты Фармакопейных статей предприятия «Трава иван-чая узколистного» и «Экстракт иван-чая узколистного сухой».
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Валов Р.И. Кипрей узколистный – перспективное лекарственное растение / Р.И. Валов // Авиценна-2006: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студентов и молодых ученых.- Новосибирск, 2006.- С. 471-472.
2. Валов Р.И. Некоторые результаты фармакогностического исследования Chamerion angustifolium (L.) Holub, произрастающего на территории Сибири / Р.И. Валов // Экология России и сопредельных территорий.
Экологический катализ: мат-лы ХI международн. экологич. студ. конф. Новосибирск, 2006.- С. 145-146.
3. Валов Р.И. Некоторые результаты фармакогностического исследования Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И. Валов // Мат-лы 66 всерос. итог.
студ. научн. конф. им. Н.И. Пирогова.- Томск, 2007.- С. 221-222.
4. Валов Р.И. Сравнительный анализ основных биологически активных веществ надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И. Валов // Авиценна-2007: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студентов и молодых ученых.- Новосибирск, 2007.- С. 451-452.
5. Валов Р.И. Некоторые результаты фармакогностического исследования надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И. Валов, М.А.
Ханина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научн. тр.- Пятигорск, 2007.- Вып. 62.- С. 77.
6. Ханина М.А. Перспективные лекарственные растения Флоры Сибири / М.А.
Ханина, М.Г. Ханина, Р.И. Валов, М.Ю. Кудряшова // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: мат-лы II международн.
научн. конф.- Алматы, 2007.- С. 214.
7. Валов Р.И. Некоторые результаты фармакогностического анализа надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И. Валов // Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ:
мат-лы ХII международн. экологич. студ. конф.- Новосибирск, 2007.- С.
163-164.
8. Валов Р.И. Исследования фенольного комплекса надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub, произрастающего на территории Сибири / Р.И. Валов // Мат-лы 67 всерос. итог. студ. научн. конф. им.
Н.И. Пирогова.- Томск, 2008.- С. 213-217.
9. Валов Р.И. Товароведческий анализ Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И. Валов // Авиценна-2008: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студентов и молодых ученых.- Новосибирск, 2008.- С. 385-386.
10. Валов Р.И. Некоторые исследования фенольного комплекса надземной Chamerion angustifolium части (L.) Holub, произрастающего на территории Сибири / Р.И Валов, М.А. Ханина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научн. тр. Пятигорск, 2008.- Вып. 63.- С. 267-268.
11. Валов Р.И. Фармакогностическое исследование надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub флоры Сибири / Р.И. Валов, М.А. Ханина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии.- 2008. № 4.- С. 296-298.
12. Валов Р.И. Полисахариды надземной части Chamerion angustifolium (L.) Holub. / Р.И. Валов, М.А. Ханина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии.- 2010.- № 7.- С. 34-37.
13. Валов Р.И. Сорбция природных биологически активных веществ на наноалмазах / Р.И. Валов, И.С. Ларионова, М.Г. Ханина, А.П. Родин, М.А. Ханина // Фармация.- 2010.- № 6.- С. 28-31.
14. Валов Р.И. Элементный состав травы и экстракта хамериона узколистного / Р.И. Валов, М.А. Ханина, А.П. Родин // Фармация.- 2010.- № 8.- С. 6-8.
15. Валов Р.И. Элементный состав Chamerion angustifolium (L.) Holub / Р.И.
Валов, М.А. Ханина, А.П. Родин // Сибирское медицинское обозрение. 2010.- № 5.- С. 44-45.
ВЭЖХ – высокоэффективная ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ АББРЕВИАТУРЫ.
хроматография, ВЭТСХ – высокоэффективная тонкослойная хроматография, ГСО – государственный стандартный образец, ГХ-МС – газовая хроматография – масс-спектрометрия, ИК – инфракрасный, КХ – колоночная хроматография, НСО – Новосибирская область, ТСХ – тонкослойная хроматография, ТФЭ – твердофазная экстракция, УФ – ультрафиолетовый, ЭИУС – экстракт иван-чая узколистного сухой.