авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 |

Химический состав и биологическая активность хиноидных и полифенольных соединений из дальневосточных растений lithospermum erythrorhizon, eritrichium sericeum, maackia amurensis, vitis amurensis, taxu

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Федореев Сергей Александрович Химический состав и биологическая активность хиноидных и полифенольных соединений из дальневосточных растений Lithospermum erythrorhizon, Eritrichium sericeum, Maackia amurensis, Vitis amurensis, Taxus cuspidata и их клеточных культур. Препарат максар из древесины маакии амурской 02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Владивосток - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Официальные оппоненты: доктор химических наук, главный научный сотрудник Макарьева Татьяна Николаевна доктор химических наук, профессор Семенов Аркадий Алексеевич доктор биологических наук, профессор Кушнерова Наталья Федоровна

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится « 2010 г. в часов на заседании » диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail:

science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан « » 2010 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор химических наук, старший научный сотрудник /Монастырная М.М./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение и практическое применение природных соединений имеют большое значение для укрепления здоровья и увеличения продолжительности жизни людей. Действительно, биомолекулы, химические структуры и биологические функции, которых изучает биоорганическая химия, используются в качестве биологически активных субстанций лекарств и ценных пищевых компонентов. На протяжении многих лет и до настоящего времени, основными источниками новых природных соединений были и остаются высшие наземные растения. Многие из них биосинтезируют метаболиты, обладающие выдающейся биологической активностью. Признано, что растения являются основным источником биологического материала при производстве лекарственных препаратов [Стоник В.А., 2004].

В последнее время доказано, что многие патологические состояния животных и человека вызываются нарушением нормального уровня свободных радикалов в их органах и тканях. Это в полной мере относится к естественному процессу старения, сердечно-сосудистым заболеваниям, воспалительным явлениям, ожогам и, прямо или косвенно, к онкологическим заболеваниям. В современной клинической практике коррекция подобных нарушений нередко выполняется применением экзогенных антиоксидантов полифенольной природы, благодаря чему полифенольные и хиноидные соединения природного происхождения стали в настоящее время важными объектами для изучения их структур и биомедицинских исследований. Весьма существенным является и то, что природные полифенольные антиоксиданты не только являются защитой организма от окислительного стресса, путем нейтрализации активных форм кислорода, но и могут регулировать окислительно-восстановительные свойства клеток, или ее компонентов и, таким образом, защищать клетки от старения.

Повсеместное распространение полифенольных соединений в растениях, достаточно хорошая изученность некоторых из них, низкая токсичность и высокая фармакологическая активность привели к созданию ряда лекарственных препаратов на их основе [Rice-Evans C., 2001].

Природные ресурсы Российского Дальнего Востока предоставляют широкие возможности для получения разнообразных антиоксидантов и их композиций, прежде всего из лекарственных растений. Разработка новых лекарственных средств на основе дальневосточных растений, в первую очередь способных усиливать регенеративные процессы в печени, и внедрение их в широкую медицинскую практику приобрели особую социальную значимость. Сегодня большинство зарегистрированных в Российской Федерации препаратов данной группы являются импортными и, вследствие высокой стоимости, малодоступными для населения. В связи с чем, необходимо создание эффективных, малотоксичных отечественных гепатопротективных средств на основе природных антиоксидантов полифенольной природы, устраняющих основное звено патогенеза токсического гепатита – усиление перекисного окисления липидов, и улучшающих антитоксическую и экскреторную функции гепатоцитов печени.

С другой стороны, поскольку вследствие интенсивного и нерегулируемого сбора растительного сырья его запасы в природе истощаются, все большее значение приобретают биотехнологические способы получения ценных природных веществ, в том числе методы клеточной биотехнологии. Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях на питательных средах неограниченно долго, при этом часть полученной биомассы используют для экстракции целевых продуктов, а другую часть пересаживают на свежую питательную среду для возобновления культуры. Независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные условия, вредители), а нередко и более высокий выход и хорошее качество продукта делают эту технологию привлекательной. В настоящее время происходит развитие новых методов биотехнологии клеточных культур растений [Булгаков В.П. и соавт., 2004]. Одним из первых примеров практического применения такого подхода стал биосинтез в промышленном масштабе эфиров шиконина клеточными культурами Lithospermum erythrorhizon, осуществленный в Японии и в нашей стране.

Считается, что биотехнология клеточных культур растений поможет решить проблему сохранения в природе редких видов растений, а также создаст реальную возможность для разработок новейших методов получения наиболее ценных лекарственных веществ и, в конечном счете, новых медицинских препаратов. В условиях, когда постоянно падает доля лекарственных субстанций отечественного производства, представляется особенно важным развивать современные технологии, создающие надежную сырьевую базу для производства отечественных препаратов.

Объектами настоящего исследования явились редкие и ценные растения дальневосточной флоры. Выбор растений был произведен на основе литературных данных и личного опыта с учетом основного критерия возможности их использовать для создания оригинальных отечественных препаратов. В итоге для углубленного исследования отобрано 5 перспективных видов растений – Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. и Eritrichium sericeum (Lehm.) A. DC. сем. Boraginaceae, Maackia amurensis Rupr. et Maxim. сем.

Fabaceae, Vitis amurensis Rupr. сем. Vitaceae, Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. сем.

Taxaceae. Для каждого вида осуществлен тщательный химический анализ его компонентов и вместе с сотрудниками Биолого-почвенного института ДВО РАН предприняты попытки получить активно-растущие клеточные культуры – воспроизводимые биотехнологические источники целевых хиноидных и/или полифенольных соединений. Большое внимание было уделено повышению продуктивности полученных клеточных культур растений и изучению фармакологической активности их метаболитов.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось выделение, установление строения и исследование биологической активности природных полифенольных и хиноидных соединений из экстрактов дальневосточных растений L. erythrorhizon (воробейник краснокорневой), E. sericeum (незабудочник шелковистый), M. amurensis (маакия амурская), V. amurensis (виноград амурский), T. cuspidata (тис остроконечный) и их клеточных культур, а также завершение разработки нового гепатопротективного лекарственного средства "Максар®" на основе полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

На основе полученных суммарных экстрактов из растений и их клеточных 1) культур разработать методы выделения биологически активных соединений, выделить индивидуальные соединения и установить их химическое строение;

провести сравнительное изучение качественного состава и количественного 2) соотношения полифенольных и хиноидных соединений в растениях и их клеточных культурах;

изучить биологическую активность препаратов из клеточных культур 3) L. erythrorhizon, E. sericeum и M. amurensis для определения перспективности их использования в косметике и медицине;

провести сравнительное изучение гепатопротективных, антиоксидантных и 4) противовоспалительных свойств полифенольных комплексов из древесины M. amurensis и ее клеточной культуры;

определить антиоксидантную и антирадикальную активность 5) полифенольных соединений из T. cuspidata;

разработать с применением генно-инженерных методов и новых технологий 6) подходы к увеличению биосинтеза биологически активных соединений культурами клеток;

разработать аналитические методы для установления подлинности и 7) количественного определения активных компонентов в препаратах: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг";

разработать нормативную документацию на сырье, субстанцию и 8) лекарственную форму препарата "Максар";

осуществить регистрацию на территории Российской Федерации и 9) промышленные выпуски препаратов: "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг".

Положения, выносимые на защиту:

Получены высокопродуктивные клеточные культуры из L. erythrorhizon, 1.

способные в течение длительного периода (20 лет) стабильно биосинтезировать изогексенилнафтазарины и (ИГН) изогексенилбензохинонилфураны (ИГБФ). Показано, что препарат “Масло шикониновое”, приготовленный на основе ИГН и ИГБФ из биомассы клеток воробейника краснокорневого, обладает выраженным противовоспалительным действием при лечении рожистых воспалений.

Незабудочник шелковистый и его клеточные культуры Еr-1 и Е-4 содержат (-) 2.

рабдозиин, розмариновую кислоту и новый полифенольный метаболит эритрихин. Воробейник краснокорневой и его клеточная культура ВК- синтезируют (+)-энантиомер рабдозиина и розмариновую кислоту.

Содержание полифенолов в культурах клеток увеличено по сравнению с их содержанием в растениях.

Основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины маакии 3.

амурской, составляющими полифенольный комплекс препарата максар, являются 27 соединений, принадлежащих к разным классам природных полифенолов.

Клеточные культуры, полученные из побегов, черешков, цветковой кисти, 4.

почек и корней M. amurensis, способны синтезировать изофлавоны и птерокарпаны. Клеточная культура А-18 M. amurensis, полученная из проростков семян, продуцирует изофлавоноиды, представляющие собой моно-, ди- и малонилглюкозиды изофлавонов и птерокарпанов, и новый метаболит, структура которого установлена как 6'-O-малонил-3-O--D глюкопиранозил-6,6a-дегидромаакиаин. В отличие от растения, клеточные культуры маакии амурской не биосинтезируют мономерные и димерные стильбены.

Полифенольные комплексы, приготовленные из древесины M. amurensis и 5.

клеточной культуры А-18, обладают выраженным гепатопротективным и антиоксидантным действием.

Препарат максар снижает интенсивность процессов свободно-радикального 6.

окисления липидов, восстанавливает резервы эндогенных антиоксидантов в крови и печени животных, регулирует глутатионзависимые ферментативные антиоксидантные механизмы печени и способствует коррекции нарушений липидного обмена крови и липоидоза печени. Максар обладает противоопухолевым действием, характеризуется малой острой и хронической токсичностью, не имеет мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксического и аллергизирующего эффектов.

7. Максар проявляет гепатопротективную активность у больных хроническим гепатитом вирусной и алкогольной этиологии;

оказывает более выраженный по сравнению с карсилом терапевтический эффект. На основании результатов клинической апробации препарат максар рекомендован в качестве гепатопротективного средства для медицинского применения и промышленного выпуска.

8. Разработаны методы установления подлинности и стандартизации биологически активной субстанции и препарата максар, подготовлены следующие проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП): "Маакии амурской древесина ангро", "Маакии амурской экстракт сухой", "Максар таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг", которые прошли экспертизу ФГУ НЦ ЭСМП Росздравнадзора РФ.

9. Спиртовые экстракты стеблей V. amurensis содержат 6 мономерных и димерных стильбенов. Клеточная культура VB2 винограда амурского, трансформированная геном rolB, способна продуцировать только один транс-стильбен резвератрол с выходом 3.15% на сухой вес клеток.

10. В состав экстракта из древесины T. cuspidata входят четыре лигнана и два катехина, обладающие высокой антирадикальной и антиоксидантной активностью. Клеточная культура T. cuspidata продуцирует три известных таксановых дитерпеноида и один новый, таксюнаннин-7-ол.

Научная новизна работы. Выполнено сравнительное изучение состава природных полифенольных и хиноидных соединений дальневосточных растений L. erythrorhizon, E. sericeum, M. amurensis, V. amurensis, T. cuspidata и их клеточных культур. Совместно с сотрудниками Биолого-почвенного института (БПИ ДВО РАН) получены высокопродуктивные культуры клеток L. erythrorhizon, E. sericeum, M. amurensis, V. amurensis, T. cuspidata и исследованы особенности накопления в них вторичных метаболитов. Из экстрактов 5 видов растений и их клеточных культур выделено и идентифицировано 74 природных метаболита.

Установлено строение 8 новых природных соединений.

Изучена физиологическая активность целого ряда веществ и препаратов из указанных растений и созданных на их основе клеточных культур, в том числе показано, что косметическое средство "Масло шикониновое", полученное из клеточных культур воробейника, эффективно при лечении рожистых воспалений.

Впервые на основе клеточных культур L. erythrorhizon, E. sericeum созданы два новых источника рабдозиина, причем в форме различных диастериомеров, (+)- и (-)-рабдозиина. Выявлено выраженное нефропротективное, диуретическое, противовоспалительное и антиоксидантное действие препаратов ПВ и ПН, приготовленных из клеточных культур L. erythrorhizon и E. sericeum.

Впервые установлено, что основными компонентами спиртовых экстрактов ядровой древесины M. amurensis являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс (ПФКД) препарата максар. В состав препарата входят: изофлавоны, птерокарпаны, мономерные стильбены, изофлаваны, изофлаваноны, халконы, олигомерные полифенолы и димерные транс-стильбены. В процессе выделения в кислых водно-спиртовых средах на сорбентах с обращенной фазой димерные транс-стильбены, при их облучении ультрафиолетовым светом, легко изомеризуются в димерные цис-стильбены.

Доказано, что в процессе производства и хранения субстанции препарата максар такой изомеризации не происходит.

Показано, что, кроме выраженного гепатопротективного действия, препарат максар способствует коррекции нарушений липидного спектра крови и жировой дистрофии печени, повышает активность системы антиоксидантной защиты организма и препятствует развитию алиментарной гиперлипопротеинемии у животных. Он оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном, снижает интенсивность образования в печени продуктов перекисного окисления липидов (ДК, МДА), регулирует систему антиоксидантной защиты организма животных преимущественно через глутатионзависимые ферментативные механизмы, улучшает детоксикацию гидропероксидных радикалов. Максар уменьшает коагуляционные свойства крови и препятствует формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии.

Впервые показано, что максар обладает противоопухолевым действием ингибирует рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29.

Впервые из клеточной культуры А-18 M. amurensis выделено и структурно идентифицировано 20 изофлавоноидов и проведено полное отнесение сигналов протонов и углеродов в ЯМР спектрах гликозидной части этих соединений.

Культура клеток A-18 является стабильным продуцентом и накапливает до 1.9% изофлавоноидов на сухую массу клеток.

Впервые была проведена сравнительная оценка гепатопротективных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств полифенольных комплексов (ПФК), приготовленных из древесины и клеточной культуры M. amurensis.

Показано, что оба фитокомплекса в разной степени обладали выраженным гепатозащитным действием и влиянием на активность свободно-радикального окисления. Выраженное противовоспалительное действие обнаружено только у ПФК из древесины M. amurensis.

Практическая значимость работы. Практическая ценность работы состоит в завершении разработки нового отечественного лекарственного средства препарата "Максар®". В частности, были разработаны аналитические методы определения его качества и подлинности, разработана нормативная документация и осуществлены регистрация на территории Российской Федерации, а также промышленные выпуски этого препарата. Препарат "Маакии амурской экстракт сухой" введен в государственный Реестр лекарственных средств как новая фармацевтическая субстанция, а растение маакия амурская внесено в государственный Реестр лекарственных растений России. Высокая гепатопротективная активность препарата "Максар®" подтверждена результатами клинических испытаний.

Автор участвовал в создании перспективных для углубленного фармакологического изучения и последующего промышленного производства клеточных культур L. erythrorhizon, E. sericeum, M. amurensis, V. amurensis, T. cuspidata, являющихся воспроизводимыми источниками полифенольных и хиноидных соединений. Они могут быть объектами последующего внедрения.

Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены: на 45th Arctic sci. conf. “Bridges of the science between North America and the Russian Far East“, 2527 Aug., 1994, Anchorage, Alaska, 29 Aug. 2 Sept., 1994, Vladivostok, Russia;

VII Междунар. съезд, Санкт-ПетербургПушкин, 35 июля 2003 г.;

The 8th Intern. congr. “Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin” Phytopharm 2004, June 2123, 2004, Mikkeli, Finland;

2nd Intern. conf. on natural products and physiologically active substances (ICNPAS-2004) and 3rd EuroAsian heterocyclic meet. “Heterocycles in organic and combinatorial chemistry” (EAHM-2004), Novosibirsk, Russia, Sept. 12-17, 2004;

IX Междунар. съезд ФИТОФАРМ 2005 и конф. молодых ученых Европейского фитохим. о-ва "Растения и здоровье", Санкт-Петербург, 2225 июня 2005;

Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию проф. Ш.М. Омарова.

Махачкала, 2006;

III Всерос. конф., 23–27 апр. 2007 г.;

Thirteenth intern.

biotechnology symp. and exhibition, Oct. 1217, 2008, Dalian, China;

IV Всерос. конф., Барнаул, 2123 апр. 2009 г.;

Междунар. науч.-практ. конф. "Фармация Казахстана:

интеграция науки, образования и производства" Шымкент, Казахстан, 2009. По материалам диссертации опубликовано 80 работ, из них 38 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК и 6 патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам, функциям и распространению в растениях полифенольных и хиноидных соединений, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты экспериментов, Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, используемый в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитируемой литературы. Работа изложена на 401 страницах, содержит таблиц и 53 рисунка. Список литературы включает 670 цитируемых работ.

Благодарности. Автор благодарит к.х.н. В.А. Денисенко, к.ф.-м.н. В.П.

Глазунова, к.х.н. П.С. Дмитренка за съемку ЯМР, КД, ИК, масс-спектров;

член корр. РАН В.П. Булгакова и к.б.н. К.В. Киселева за предоставленные клеточные культуры растений и помощь в работе с ними. Автор выражает благодарность профессору Я.Ф. Звереву и его сотрудникам (Алтайский государственный медицинский университет), профессору М.Б. Плотникову и его сотрудникам (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН), д.б.н. В.С. Чучалину (Сибирский государственный медицинский университет) и к.б.н. В.И. Яньковой (Владивостокский филиал ДВНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения) – за проведение фармакологических исследований препаратов.

Используемые сокращения: ИГН – изогексенилнафтазарины;

ИГБФ – изогексенилбензохинонилфураны;

ТСХ – тонкослойная хроматография;

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления;

ДФПГ – 1,1 дифенил-2-пикрилгидразил;

КД – спектры кругового дихроизма;

ЯМР 1H и 13C – спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода;

с – синглет;

д – дублет;

м.д. – миллионные доли;

COSY – корреляционная спектроскопия;

HSQC – эксперимент ЯМР гетероядерной корреляции через одну связь;

HMBC – эксперимент ЯМР гетероядерной корреляции через несколько связей;

FABМS – масс-спектр бомбардировки быстрыми атомами с прямым вводом вещества;

ПН – спиртовый экстракт клеточной культуры E. sericeum Еr-1;

ПВ – спиртовый экстракт клеточной культуры L. erythrorhizon ВК-39;

ПФК – полифенольные комплексы;

ПФКД, ПФКК – полифенольные комплексы из древесины и клеточной культуры АСТ M. amurensis;

– аспартатаминотрансфераза;

АЛТ – аланинаминотрансфераза;

ЩФ – щелочная фосфатаза;

ГТФ – глутатионтрансфераза;

ПОЛ – перекисное окисление липидов;

ТБРП – продукты ПОЛ, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой;

ОПА – общая прооксидантная активность;

СОД супероксиддисмутаза;

ГПО – – глутатионпероксидаза;

ОАА – общая антиоксидантная активность;

ГЛП – гиперлипопротеинемия;

ЛПНП липопротеины низкой плотности;

ЛПВП липопротеины высокой плотности;

ХС холестерин;

-ТФ – -токоферол;

ДК – диеновые конъюгаты;

АОС антиоксидантная система организма;

АОЗ антиоксидантная защита в организме животных;

ОВУ – относительные времена удерживания веществ;

ГСО – государственный стандартный образец;

МДА – малоновый диальдегид.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Содержание хиноидных пигментов в корнях и клеточной культуре ВК- Lithospermum erythrorhizon Изучение девяти видов дальневосточных растений сем. Boraginaceae показало, что воробейник краснокорневой, содержащий максимальное количество хиноидных пигментов на сухой вес корней (1.8%), является наиболее перспективным растением для получения клеточной культуры. Клеточную культуру воробейника краснокорневого получили из корней дикорастущего растения в Биолого-почвенном институте ДВО РАН методом селекции окрашенных агрегатов каллусов. Культура депонирована во Всероссийскую коллекцию клеток высших растений (Институт физиологии растений РАН, г.

Москва) под индексом ВСКК-ВР 36 (штамм ВК-39). Суммарные гексановые экстракты хинонов из клеточной культуры ВК-39 были разделены на индивидуальные компоненты колоночной хроматографией на силикагеле с последующей их очисткой методом гельпроникающей хроматографии на сефадексе LH-20 в CHCl3. Преобладающими компонентами в суммарном экстракте были изогексенилнафтазарины (ИГН): шиконин (1), дезоксишиконин (2), ацетилшиконин (3), изобутирилшиконин (4), изовалерилшиконин (5), метилбутирилшиконин и,-диметилакрилшиконин (6), (7) оксиизовалерилшиконин (8).

OH O 9 6 5 OH O R R 1 OH 2 H 3 OCOCH 4 OCOCH(CH3) 5 OCOCH2CH(CH3) 6 OCOCH(CH3)CH2CH 7 OCOCH=C(CH3) 8 OCOCH2(CH3)2OH 9 OCOCH2CH Структуры соединений 18 определены прямым сравнением данных спектров ЯМР 1H и 13С с данными для аналогичных соединений, ранее выделенных из корней L. erythrorhizon. Впервые удалось выделить и установить структуру нового ацильного производного шиконина 9 с молекулярной массой m/z = 344 [М]+, отвечающей составу C19H20O6. Анализ данных спектров ЯМР 1Н и 13С нафтохинона 9 показал совпадение сигналов атомов, принадлежащих протонам и углеродам нафтазаринового фрагмента и изопентенильного участка боковой цепи, с сигналами атомов известных ИГН (38). Сигналы в спектре ЯМР 1H в виде квартета при 2.41 м.д. интенсивностью 2Н и триплета при 1.18 м.д.

интенсивностью 3H, имеющие КССВ J=7.65, свидетельствует о том, что ацильный заместитель при С-11 в соединении 9 состоит из остатка пропионовой кислоты.

Таким образом, соединение 9 является новым производным шиконина пропионилшиконином, а его структура установлена как (R)-1-(5,8-дигидрокси-1,4 нафтохинон-2-ил)-4-метилпент-3-енилпропионат. Из фракции, содержащей ИГБФ, были выделены и идентифицированы: эхинофуран (10), эхинофуран В (11),,диметилакрилизогексенилбензохиноилфуран (12), а также два новых изобутирилизогексенилбензохинонилфуран и изовалерилизогексенил (13) бензохинонилфуран (14).

O 5 R 6 2 1 7 9 O O 10 R 10 OCOCH 11 H 12 OCOCH=C(CH3) 13 OCOCH(CH3) 14 OCOCH2CH(CH3) Структуры соединений 1014 определены на основании анализа их спектров ЯМР 1H и 13С и идентификации продуктов их щелочного гидролиза методами ГЖХ и масс-спектрометрии. Хинон 12 – первый представитель нового класса ИГБФ, впервые был выделен нами из корней L. erythrorhizon. Его структура установлена как (S)-1-[5-(1,4-бензохинонил)-фуран-3-ил]-4-метилпент-3-енил-3 метилбут-2-еноат. Позднее японские авторы назвали это соединение эхинофураном С. Состав и относительное содержание хинонов в экстрактах корней L. erythrorhizon и его клеточной культуре определяли путем сопоставления в спектрах ЯМР 1Н интегральных интенсивностей сигналов метильных и метиленовых групп, принадлежащих ацильным заместителям. Количественное содержание хинонов определяли также методом ВЭЖХ (рис. 1).

Рис. 1. ВЭЖХ суммы ИГН (А, Б) и суммы ИГБФ (В, Г) в корнях (А, В) и клеточной культуре ВК-39 (Б, Г) L. erythrorhizon;

520 (А, Б) и 437 (В, Г) нм.

Для этого были установлены поправочные коэффициенты (К) для каждого индивидуального соединения при 520 и 437 нм относительно внутренних стандартов. В качестве внутреннего стандарта для определения содержания ИГН был выбран шиконин, для ИГБФ шиконин и эхинофуран С.

Состав ИГН в корнях воробейника и клетках ВК-39 одинаков, а количественные соотношения хинонов различны (рис. 1, табл. 1). В культивируемых клетках штамма ВК-39 преимущественно накапливаются эфиры шиконина 36 и 8. Содержание остальных нафтохинонов не превышает 710% от суммы ИГН. В Японской суспензионной культуре L. erythrorhizon преимущественно накапливаются шиконин (1), ацетилшиконин (3) и изобутирилшиконин (4) (табл. 1).

Таблица 1. Состав и относительное содержание ИГН (%) в корнях L. erythrorhizon, клеточном штамме ВК-39 и в японской суспензионной культуре ВК- Корни Корни Суспензионная Вещество культура* (ВЭЖХ) (ЯМР) (ЯМР) 1 3.1 2.3 7.9 2 0.9 1.2 1.2 3 33.8 34.0 27.3 4 18.8 17.8 39.5 5 9.4 12.5 26. 6 17.8 6.3 7 3.4 2.7 1.8 8 12.4 13.3 9.1 9 1.2 1.3 3.7 Примечание. *Yazaki K., Fukui H., Kikuma M., Tabata M. Regulation of shikonin production by glutamine in Lithospermum erythrorhizon cell cultures // Plant Cell Rep.

1987. V. 6, N 2. P. 131-134.

Состав пигментов оранжевого цвета (ИГБФ) в корнях воробейника краснокорневого и клеточной культуре ВК-39 одинаков. Однако корни растения накапливают преимущественно эхинофуран C (12), а клетки штамма ВК- биосинтезируют хиноны 12–14 в одинаковых количествах (рис. 1, табл. 2).

Таблица 2. Состав ИГБФ (%) в корнях L. erythrorhizon и клеточном штамме ВК- Корни ВК-39 ВК- Вещество (ВЭЖХ) (ВЭЖХ) (ЯМР) 10 5.1 6.1 5. 11 3.1 2.9 3. 12 55.1 31.1 32. 13 19.8 28.1 29. 14 16.9 29.8 29. Для оценки суммарного содержания ИГН и ИГБФ в гексановых экстрактах из корней и клеточной культуры ВК-39 использовали L. erythrorhizon спектрофотометрический метод анализа. ИГБФ предварительно отделяли от эфиров шиконина высаживанием последних в виде комплексов с ацетатом меди.

Концентрации нафтохинонов и бензохинонов находили по калибровочным кривым, построенным для очищенной суммы эфиров шиконина и эхинофурана С (12). Оптическую плотность растворов образцов ИГН определяли при 520 нм в интервале концентраций от 10 до 50 мкг/мл, ИГБФ при 437 нм в интервале концентраций от 1 до 6 мкг/мл. Было установлено, что суммарное содержание ИГН и ИГБФ в гексановых экстрактах из клеток воробейника, выращенных в производственных условиях, составляет 80.1 ± 3.6 и 9.5 ± 0.4 % соответственно, что значительно больше, чем в экстрактах из корней растения (67.2 ± 3.4 и 6.2 ± 0.6 % соответственно). Относительное содержание хинонов в клетках штамма ВК 39 выше, а растительных восков и других примесей в более чем 2.5 раза ниже, чем в корнях растения. Низкое содержание растительных восков в клеточной культуре является важной технологической характеристикой, обеспечивающей получение высокоочищенного шиконина и препаратов на его основе. В клеточной культуре воробейника краснокорневого ВК-39 на протяжении 20 лет культивирования сохраняются стабильное соотношение и количественное содержание хинонов. Установлено, что биосинтез хинонов происходит одновременно с ростом каллусов, при этом к концу культурального цикла клетки накапливают в 4 раза больше ИГН и ИГБФ по сравнению с 56-летними корнями растения.

2. Регуляция процессов роста и биосинтеза вторичных метаболитов в клеточной культуре ВК-39 Lithospermum erythrorhizon Изучено влияние компонентов питательной среды на рост и продуктивность клеточной культуры L. erythrorhizon. Оказалось, что наибольшее влияние на изучаемые параметры оказывают сахароза, нитраты, ионы меди, а также фитогормоны. Определен оптимальный состав компонентов и их концентраций в продукционной питательной среде. Эта оптимизированная среда получила индекс МС-32 и была использована в дальнейшем для культивирования каллусов воробейника. Для увеличения продукции эфиров шиконина клетками ВК-39 L.

erythrorhizon предпринято стимулирование фенилпропаноидного пути биосинтеза.

С этой целью была проведена селекция культивируемых клеток L. erythrorhizon, устойчивых к ингибитору роста 4-фторфенилаланину (4-ФФА). Селекцию клеток вели, постепенно увеличивая дозу ингибитора с 220 до 2170 мкМ в питательной среде. При каждом шаге селекции каллусы пассировали трижды и отбирали лучшие по продуктивности ИГН ткани. В результате последовательного отбора получена клеточная линия ВК-39F, обладающая самым высоким ростом в присутствии 4-ФФА в питательных средах. Эта культура росла при концентрациях 4-ФФА 10–30 мг/л, при которых наблюдалось ингибирование роста исходной культуры ВК-39 (рис. 2), и сохраняла жизнеспособность при концентрации 4-ФФА 300 мг/л (2170 мкM).

Рис. 2. Рост клеточных культур ВК-39 и ВК-39F в присутствии 4-ФФА.

Культура клеток ВК-39F, обладающая самым высоким ростом при содержании 4-ФФА в питательных средах, была выбрана для дальнейшего исследования. Анализ содержания нафтохинонов в чувствительных и устойчивых к 4-ФФА линиях был начат только после того, как культуры каллусов были выращены на питательных средах без 4-ФФА (12 пассажей). В результате было установлено, что в линии ВК-39F ИГН накапливалось вдвое больше, чем в исходной культуре ВК-39 и в 7 раз больше чем в корнях воробейника (1.8 % на сухую массу корней) (табл. 3).

По данным спектроскопии ЯМР 1H и ВЭЖХ набор ИГН и пропорции между производными шиконина в культурах ВК-39 и ВК-39F сохранялись. В процессе длительного культивирования было установлено, что культуры клеток ВК-39 и ВК 39F обладают высокой и устойчивой способностью к биосинтезу ИГН и ИГБФ, происходящему параллельно с накоплением биомассы.

Таблица 3. Продукция ИГН и накопление биомассы клеточными культурами L. erythrorhizon Клеточная Свежая Сухая Продукция Содержание линия биомасса, г/л биомасса, г/л ИГН, г/л ИГН, % 282 ± 36 18.9 ± 1.1 1.36 ± 0.30 7.2 ± 0. BK- 295 ± 32 21.0 ± 1.5 2.64 ± 0.45 12.6 ± 0. BK-39F Примечание. Данные представлены как средние из пяти экспериментов.

Таким образом, получены клеточные культуры воробейника краснокорневого, которые являются хорошим сырьевым источником для промышленного получения хинонов в одну стадию культивирования, что имеет существенные экономические преимущества перед двухступенчатым культивированием, применяемым в настоящее время за рубежом.

3. Препарат "Масло шикониновое" Биомасса клеточных культур ВК-39 и ВК-39F была использована для создания нового препарата, названного шикониновое".

"Масло Экспериментальное изучение этого препарата показало, что он обладает выраженным противовоспалительным действием. Основной механизм действия, которого заключается в том, что он нормализует продукцию одного из ключевых медиаторов воспаления – -интерферона.

Также была выявлена высокая противомикробная активность ИГН и ИГБФ, входящих в состав препарата "Масло шикониновое". Сумма хинонов из биомасс клеточных культур ВК-39 и ВК-39F активно ингибирует рост грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, B. anthracoides), грибковую микрофлору (Candida albicans) и не оказывает влияния на грамотрицательные бактерии (Salmonella enteritidis). Антимикробное действие ИГН и ИГБФ в большинстве тестов выше, чем активность шиконина (2). Исследования на животных показали, что препарат "Масло шикониновое" не оказывает иммунотоксического действия и не обладает аллергенностью. При рекомендуемом способе применения – накожных аппликациях, препарат не вызывает изменений внутренних органов и тканей крыс, не оказывает канцерогенного, эмбриотоксического и тератогенного действия, не поступает в системный кровоток вследствие чрезвычайно низкой всасываемости через кожу.

Поэтому его терапевтическое действие ограничено местом нанесения аппликации.

Препарат "Масло шикониновое" зарегистрирован на территории Российской Федерации как средство косметическое для наружного применения: номер регистрации № 035/001921;

ТУ 9158-001-02698186-98. Состав: 0.3% раствор суммы эфиров шиконина в стерильном растительном масле. На основании того, что препарат "Масло шикониновое" обладает высокой противомикробной активностью и противовоспалительным действием, была изучена его эффективность при лечении таких заболеваний, как рожистые воспаления (булезная и булезно-некротическая формы), трофические язвы, микробная экзема, пиодермия, стрептодермия, инфицированные раны, острый наружный отит. При всех показаниях отмечено положительное терапевтическое действие препарата "Масло шикониновое". Терапевтическая эффективность препарата, приготовленного из клеточных культур ВК-39 и ВК-39F L. erythrorhizon, при лечении рожистых воспалений выявлена впервые.

4. Полифенолы из растений Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon и их клеточных культур Из растения и клеточных культур Er-1, E-4 E. sericeum выделены и идентифицированы полифенольные метаболиты: розмариновая кислота (15), (-) рабдозиин (16а) и новый метаболит кофейной кислоты – эритрихин (17).

OH O HOOC H O HO O O OH H HO COOH O OH HO OH O H HOOC OH HO OH OH OH 15 16а 9'' OH OH HOOC HOOC 4'' 6'' 5'' H O H O 1'' HO 3'' HO 2'' 4a 6 7'' O OH 10'' 8'' O OH А Б O OH 7 HO 8a HO O H 1' HOOC OH 6' 2' 5' 3' OH OH 4' OH OH 16б В отличие от E. sericeum, растение L. erythrorhizon и его клеточная культура ВК-39 наряду с розмариновой кислотой синтезируют (+)-рабдозиин (16б), что подтверждено спектрами кругового дихроизма (рис. 3).

Строение нового соединения 17 было установлено спектральными методами. Его молекулярная формула C26H20O10 была рассчитана из масс спектра высокого разрешения (FABМS). В спектре ЯМР 1Н 17 обнаружены сигналы 10 ароматических протонов при 6.75-8.32 м.д. и 6 сигналов протонов, принадлежащих гидроксильным группам при 7.80-8.95 м.д. Анализ спиновых систем показал наличие трех ароматических колец в молекуле 17. Два из них были 1,3,4-тризамещенными, а третье представляло собой тетразамещенный нафталиновый фрагмент. Сигналы трех алифатических протонов при 3.17, 3. и 5.40 м.д. образуют классическую спиновую систему ABX-типа и принадлежат фрагменту кофейной кислоты (2H-7'', H-8'') молекулы 17. Отнесение сигналов ароматических протонов сделано на основании экспериментов COSY-45 и NOE. В углеродном спектре соединения 17 имеются сигналы двадцати шести атомов углерода, двенадцать из них принадлежат протонированным атомам, из них десять имеют ароматический характер.

Рис. 3. Спектры кругового дихроизма соединений 15-17.

Полное отнесение сигналов в спектре ЯМР 13С сделано на основании двумерных спектров ЯМР (HMBC, HSQC). Конфигурация асимметрического центра при С-8'' у эритрихина (17) была определена сравнением его КД спектров со спектрами розмариновой кислоты (15) (рис. 3).

Структура нового тримера кофейной кислоты эритрихина, относящегося к группе арилнафталиновых лигнанов, определена как (2R)-3-(3,4 дигидроксифенил)-2-[4-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-2-нафтоилокси] пропановая кислота.

Следует отметить, что содержание розмариновой кислоты (15) и (+)- и (-) рабдозиина (16а, 16б) в клеточных культурах ВК-39 и Er-1 превышает их содержание в растениях L. erythrorhizon и E. sericeum в 2 и 66 раз соответственно (табл. 4).

Таблица 4. Содержание полифенолов в растениях и (%) E. sericeum L. erythrorhizon и их клеточных культурах Сумма 15 16а, 16б Объект полифенолов E. sericeum 2.04 ± 0.40 0.66 ± 0.22 0.04 ± 0.01 2.74 ± 0. Каллусы* E- 5.30 ± 0.40 2.56 ± 0.40 7.86 ± 0. Каллусы E-4*** следы 4.50 ± 0.79 1.51 ± 0.15 0.10 ± 0.02 6.11 ± 0. Культура корней* Er- 0.07 ± 0.02 0.32 ± 0.12 0.41 ± 0. Корни растения** следы L. erythrorhizon 1.10 ± 0.15 0.82 ± 0.08 1.92 ± 0. Каллусы* ВК-39 – 0.66 ± 0.19 0.07 ± 0.03 0.73 ± 0. Корни растения** – Примечание. * – средние данные восьми определений (в трех повторностях) в течение двухлетнего периода культивирования;

** – средние данные пяти измерений;

*** – продукция каллусов E-4 после селекции и добаления 5 мкМ метилжасмоната;

следы – количество вещества 0.003%;

"–" – соединение не обнаружено.

В результате клеточной селекции линии Е-4 и использования индукторов вторичного метаболизма (метилжасмонат и глицерат меди) удалось увеличить продуктивность культуры клеток E. sericeum и довести выход метаболитов кофейной кислоты до 7.86% на сухой массу ткани (табл. 4).

Попытки использования методов генной инженерии, в частности, интеграция гена rolC из Agrobacterium rhizogenes в клетки растений сем.

Boraginaceae приводили к снижению накопления в них полифенолов в 1.5–2. раза.

5. Фармакологическая активность препаратов из биомассы клеточных культур Eritrichium sericeum и Lithospermum erythrorhizon Установлено влияние препаратов из клеточных культур воробейника (ПВ) и незабудочника (ПН) на функцию почек. Применение ПН в дозе 100 мг/кг/сутки в течение 30 дней облегчает, и в некоторых случаях предотвращает развитие симптомов гломерулонефрита у крыс (табл. 5).

Таблица 5. Влияние ПН на проявление симптомов гломерулонефрита у крыс Группа Тяжесть состояния (выделение белка с мочой, мг/сутки), %* (количество отсутствие маловыраженные средневыраженные тяжелые животных) симптомов симптомы симптомы симптомы (10) (10-30) (31-100) (100) I (n=10) 100 0 0 II (n=14) 0 28.5 28.5 III (n=13) 23 16 38 Примечание. Группа I – интактные животные;

группа II – животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию;

группа III – животные с гломерулонефритом, получавшие крахмальную суспензию с порошком ПН ( мг/кг/сутки в течение 30 дней);

* – результаты представлены в % от общего числа животных в группе.

При длительном (до двух недель) применении препаратов ПВ и ПН обнаружено усиление экскреторной функции почек, сопровождающееся диуретическим, калийуретическим и легким натрийуретическим эффектами (табл. 6). Возрастание диуреза, сопровождающееся уменьшением реабсорбции электролитов, на фоне повышения экскреции креатинина позволяет связать мочегонное действие препаратов воробейника и незабудочника с увеличением скорости клубочковой фильтрации и угнетением канальцевой реабсорбции.

Таблица 6. Влияние препаратов ПВ и ПН на экскреторную функцию почек у крыс Дни введения препарата Показатель Через Контроль в сутки 2 дня** 3 5 7 9 11 ПВ (250 мг/кг/сутки) Диурез 5.9±0.5 5.5±0.7 6.4±0.9 6.9±1.0 9.1±1.3* 9.7±1.6* 9.4±1.5* 9.2±1.3* Натрий 48±4 53±9 55±8 76±13 59±6* 49±6* 56±5* 53±5* Калий 523±38 481±68 634±73 607±83 845±73* 766±102* 921±108* 812±59* Креатинин 27±3 28±4 32±4 33±4 47±6* 37±4* 39±6* 35±5* ПН (100 мг/кг/сутки) Диурез 7.4±0.5 10.1±1.3 12.0±1.3 13.1±1.5* 15.1±1.6* 13.8±1.3* 14.6±1.6* 13.5±1.2* Натрий 56±4 56±11 73±10 77±10* 81±6* 71±6 71±5* 75±5* Калий 640±36 763±67 722±77* 755±77* 898±82* 929±101* 950±86* 900±81* Креатинин 42±4 45±6 51±6 64±6* 65±5* 63±5* 67±7* 60±5* Примечание. Диурез – мл;

натрий, калий, креатинин – мкмоль;

* – достоверное изменение (P0.05) по сравнению с контролем;

** – после окончания эксперимента.

На модели острого воспаления, индуцированного каррагенином, препараты ПВ и ПН при их длительном предварительном введении (14 суток) показали выраженную противовоспалительную активность, проявившуюся в угнетении экссудации на пике воспалительной реакции (табл. 7).

Таблица 7. Влияние длительного (14 суток) предварительного введения препаратов ПВ (250 мг/кг) и ПН (100 мг/кг) на формирование каррагенинового отека конечностей крыс Часы наблюдения Вид 1 2 экспери- Прирост, Угнетение Прирост, Угнетение Прирост, Угнетение мента отека, воспале- отека воспале- отека воспале см3 см3 см ния, % ния, % ния,% Контроль 0.49±0.04 0.55±0.04 0.67±0.05 ПВ 0.38±0.03* 22.4. 0.38±0.04* 30.9. 0.55±0.06 17. ПН 0.35±0.03* 28.6 0.35±0.04* 36.4 0.50±0.05* 25. Примечание. * различия достоверны (Р0.05) по сравнению с контролем;

подчеркнуты цифры, отражающие выраженную противовоспалительную активность;

"–" – изменение не обнаружено.

Антиэкссудативное действие препаратов ПВ и ПН можно связать с наличием в их составах комплекса полифенольных соединений, представленных олигомерами кофейной кислоты, противовоспалительное действие которых реализуется за счет стабилизации мембран клеток.

Таким образом, обнаруженные в эксперименте под действием препаратов ПВ и ПН усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления позволяют считать эти препараты перспективными при лечении воспалительных заболеваний почек.

6. Полифенольные соединения из древесины Maackia amurensis В процессе многолетних детальных химических исследований спиртовых экстрактов, полученных из измельченной ядровой древесины M. amurensis, было установлено, что основными компонентами экстракта являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс древесины (ПФКД) маакии амурской.

В ПФКД обнаружены изофлавоны: генистеин (18), даидзеин (19), каликозин (20), псевдобаптигенин (21), формононетин (22), оробол (23), афромозин (24), текторигенин ретузин и (25), (26), 5-метоксидаидзеин (27) 2' гидроксиформононетин (28).

Своеобразием маакии амурской, произрастающей в Приморье, является присутствие в ее древесине птерокарпанов (6aR,11aR)-маакиаина (29), (6aR,11aR)-медикарпина (30) и высокое содержание в ней мономерных стильбенов – резвератрола (31) и пицеатаннола (32).

В дополнение к изофлавонам, стильбенам и птерокарпанам из ядровой древесины M. amurensis были выделены и идентифицированы еще восемь соединений, относящиеся к разным классам природных полифенолов. К ним относятся изофлаванон – (±)-3-гидроксивеститон (33);

изофлаван – (±)-веститол (34);

флаваноны – нарингенин (35) и ликвиритигенин (36);

минорные полифенолы – редкий,4,2',4'-тетрагидроксидигидрохалкон (37) и восстановленный стильбен дигидрорезвератрол (38).

R R1O O R R R3 O OR R № R R1 R2 R3 R4 R5 R 18 H H H OH H H H 19 H H H H H H H 20 H H H H OH CH3 H 21 H H H H OCH2 H 22 H H H H H CH3 H 23 H H H OH OH H H 24 H H OCH3 H H CH3 H 25 H H OCH3 OH H H H 26 OH H H H H CH3 H ОСН 27 H H H H H H 28 H H H H H CH3 OH HO O OH HO O H H O R H H HO O O O OCH OH 31 R=H 29 32 R=OH OH HO O HO O OH HO O O HO OCH3 HO OCH R O 35 R=H 33 36 R=OH OH OH HO H HO OH OH OH O 37 Структуры выделенных индивидуальных полифенолов 19–39 определены методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, масс-спектрометрии и сравнением спектральных данных с данными, приведенными в литературе для этих соединений.

Наряду с мономерными полифенолами из полярных хроматографических фракций спиртового экстракта древесины маакии амурской выделены олигомерные полифенолы: изофлавоностильбен маакиазин и (39) стильбенолигнан мааколин (40), а также димерные стильбены (Е)-сцирпусин А (41), (Е)-сцирпусин В (42), (Е)-маакин (43) и (Е)-маакин А (44).

OH OH H3CO OH HO OH HO H H O HO 8a H3CO H H 3a O O O OH OH O OCH 39 OH OH OH R OH HO O HO OH O HO HO O OH OH HO 41 R=H 42 R=OH OH OH OH HO HO OH OH OH HO HO O OH O HO HO OH 44 Их структуры также определены методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, масс-спектрометрии. (Е)-маакин А (44) выделен впервые. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 44 было осуществлено методом селективного подавления дальних КССВ с протонами.

В процессе хроматографического разделения экстрактов маакии амурской на сорбентах с обращенной фазой в кислых водно-спиртовых средах при ультрафиолетовой детекции наряду с транс-стильбенами 4144 были получены их цис-изомеры и кассигарол D (45). цис-Конфигурация у этих соединений была установлена из наличия в спектрах ЯМР 1Н характерных дублетов олефиновых протонов H- и H- с КССВ J=12 Гц в более сильном поле по сравнению с транс изомерами, для которых КССВ протонов H- и H- J=16 Гц.

Возможность изомеризации стильбенов в процессе их выделения с использованием хроматографии низкого давления подтверждена облучением ультрафиолетом ртутной лампы спиртовых растворов индивидуальных димерных транс-стильбенов 4144. цис-Изомеры этих соединений были получены с 50% выходом. В этих же условиях, но при нагревании до 50 ° спиртового раствора C с выходом 30% получено соединение 45.

С другой стороны, установлено, что в процессе анализа методом ВЭЖХ при 254 и 280 нм кратковременное пребывание стильбенов в проточной кювете УФ детектора не вызывало заметной изомеризации как мономерных, так и димерных транс-стильбенов. Кроме этого, метод ВЭЖХ позволил четко различить по временам удерживания (ВУ) нативные транс-стильбены и их модельные цис изомеры. Следовательно, этот метод применим для анализа суммарных экстрактов из M. amurensis. Многократный анализ этих экстрактов методом ВЭЖХ не обнаружил в них даже следовых количеств цис-стильбенов и 45. На основании этого следует признать, что димерные цис-стильбены и кассигарол D (45) не являются нативными компонентами данного вида. Они не образуются на стадии экстракции древесины и в процессе концентрирования экстрактов, а также при длительном хранении сухих экстрактов при дневном рассеянном свете.

Для анализа всех полифенолов, составляющих ПФКД, разработана методика хроматографического разделения его на силикагеле на две фракции суммы мономерных (фракция А) и олигомерных (фракция Б) полифенолов (рис. 4).

Рис. 4. ВЭЖХ мономерных (А) и олигомерных (Б) полифенолов из спиртового экстракта м. амурской. Номера пиков на ВЭЖХ соответствует номерам соединений, выделенных из древесины M. amurensis.

Расшифровку хроматограмм и определение состава полифенолов, составляющих эти фракции, осуществляли с помощью заведомых образцов соединений и их смесей, а также использовали "метод добавок". В качестве внутреннего стандарта использовали государственный стандартный образец (ГСО) дигидрокверцетина.

Для уточнения структуры и определения абсолютной стереохимии мааколина (40) методом рентгеноструктурного анализа были определены молекулярная и кристаллическая структура его дибромпентаметильного производного 46. Производное 46 получено метилированием диазометаном 40 с последующим бромированием полученного перметилированного производного раствором брома в диоксане. Общий вид молекулы 46 и упаковка молекул в кристаллической структуре представлены на рис. 5.

Рис. 5. Общий вид молекулы 46 и упаковка молекул в кристаллической структуре.

Нумерация атомов в структуре 46 выбрана программой для обсчета данных рентгеноструктурного анализа.

Каждая из молекул 46, образующих ячейку кристаллической структуры, имеет по 4 асимметрических центра при атомах углерода С7, С8, С10 и С11 с попарно противоположными конфигурациями. Таким образом, кристаллическую структуру соединения 46 можно представить как рацемическую смесь двух энантиомеров, причем оба энантиомера имеют цис-сочленение пятичленных циклов при углеродных атомах С7 и С10. Аналогичное строение имеет исходное соединение – мааколин (40), а его структура установлена как рацемическая смесь двух энантиомеров: (3S,3aR,8S,8aR) и (3R,3aS,8R,8aS)-3 (3,4-дигидроксифенил)-8-(4-гидрокси-3,5-диметоксифенил)-3,3a,8,8a-тетрагидро 1H-индено[1,2-c]фуран-5,7-диолов. Методом спектроскопии КД было определено, что олигомерные полифенолы 3944 маакии амурской не обладают оптическим вращением и, следовательно, являются рацемическими смесями энантиомеров.

7. Изофлавоноиды из клеточной культуры Maackia amurensis С целью разработки новой технологии для получения воспроизводимого источника изофлавоноидов и исследования путей их биосинтеза, в 1999 г. были получены первые клеточные культуры, из побегов, черешков, цветковой кисти, почек и корней маакии амурской. Изучено влияние различных регуляторов роста на накопление биомассы и полифенолов в клеточных культурах, подобраны условия их выращивания, позволяющие получить максимальный выход изофлавонов. Установлено, что все эти клеточные культуры продуцируют одинаковый набор изофлавонов и птерокарпанов: генистеин (18), даидзеин (19), формононетин (22), маакиаин (29) и медикарпин (30). В 2002 г. из проростков семян M. amurensis была получена новая культура клеток – штамм А-18. Анализ экстрактов сухих каллусов 1999 и 2002 гг. методом ВЭЖХ и ТСХ показал существенные различия в составах их компонентов. Клетки А-18 содержали девятнадцать изофлавоноидов, представляющих собой изофлавоны 18–22, 47 и птерокарпаны 29, 30, а также их моно-, ди- и малонилглюкозиды 48–58.

R1O O R2 O OR O O R 48- O O OR OH O OH 8'' O OH 7'' 9'' 47 деррон HO HO OH -D-глюкопиранозил малонил (-D-Glc) (mal) № Название соединений R1 R2 R3 R4 R -D-Glc -D-Glc 4'-O--D-глюкопиранозилдаидзин 48 H H H -D-Glc -D-Glc 4'-O--D-глюкопиранозилгенистин 49 OH H H -D-Glc даидзин 50 H H H H -D-Glc 51 3'-метоксидаидзин H OCH3 H H -D-Glc 7-O--D-глюкопиранозилкаликозин 52 H OH CH3 H -D-Glc генистин 53 OH H H H -D-Glc 6''-O-малонилгенистин 54 OH H H mal -D-Glc ононин 55 H H CH3 H -D-Glc 6''-O-малонилононин 56 H H CH3 mal Структуры соединений 18–22, 47–58 установлены с использованием двумерной спектроскопии ЯМР, масс-спектрометрии и сравнением их спектральных данных с данными, приведенными в литературе для этих соединений. Отнесение сигналов в спектрах выполнено с использованием HMBC и HSQC экспериментов.

OR R1O O 4a 3 6' H O O O 5' 7 4' 6a 1' R 6b 2 HO 11b 11a HO OH 2' 1 8'' H OH 7'' 9'' 3' O 10a -D-глюкопиранозил малонил R (-D-Glc) (mal) 57, R1 R2 R3 R (6aR,11aR)-6'-O-малонил-3-O--D- 3--D-Glc 57 OCH2O 6'-mal глюкопиранозилмаакиаин (6aR,11aR)-6'-O-малонил-3-O--D- 3--D-Glc 58 H OCH3 6'-mal глюкопиранозилмедикарпин Соединение 59 оказалось новым, ранее не известным птерокарпаном. Его молекулярная формула C25H22O13 была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения МАЛДИ. В этом спектре зарегистрирован пик иона [M+Na]+ при m/z 553.3900 (рассчитанное значение 553.4241). Из данных спектров ЯМР следовало, что в 59 присутствует моносахаридный остаток в форме -D-глюкопиранозида (H 4.84 д, J=7.55 Гц;

C 100.4), присоединенный к птерокарпановому фрагменту в положении 3. Сигналы при H 3.41 и C 167.8, 166.7 м.д. указывают на наличие малонильного заместителя в углеводном фрагменте при С-6'.

Анализ данных ЯМР 1H и 13C показал совпадение сигналов, принадлежащих ароматическим и углеводному фрагментам 59 и 57. Молекулярная масса 59 была меньше на 2 единицы, чем у 57, что предполагало наличие в молекуле дополнительной двойной связи. Сигналы при H 8.31(с) и C 153.9 и 125.6 м.д. в спектрах 1H и 13C ЯМР указывают на положение двойной связи между С6-С6а в пирановом цикле молекулы 59. Полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 1H и C соединения 59 проведено на основании данных HSQC и HMBC экспериментов (рис. 6).

HOOC 9' O H2C8' O 7' O H O 6' O 5' 4' O H 2' 1' H 4a 3' HO A OHH HO 11b O 2 6a H 6b 1 11a B H CH 10a H O O H Рис. 6. HMBC-корреляции для 59.

Таким образом, структура соединения 59 установлена как 6'-O-малонил-3 O--D-глюкопиранозил-6,6a-дегидромаакиаин.

8. Биосинтез изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 Maackia amurensis Наши исследования показали, что по химическому составу полифенольные комплексы из ядровой древесины (ПФКД) и клеточной культуры (ПФКК) M.

amurensis существенно различаются. Мономерные (31, 32) и димерные (41–44) стильбены, идентифицированные как главные компоненты ПФКД, не были найдены даже в минорных количествах в ПФКК A-18.

По составу полифенолов ПФКК гораздо беднее: в нем отсутствуют полифенолы 23–28, 33–38, выделенные из древесины M. amurensis. Биосинтез изофлавоноидов в клеточной культуре M. amurensis организован так, что изофлавоноиды 18–22, 29, 30 могут быть быстро метаболизированы в их конъюгированные формы 48–58. Напротив, в древесине M. amurensis заключительная стадия биосинтеза изофлавоноидов – образование глюкозидов и малонилгликозидов изофлавонов, не реализуется, вероятно, из-за отсутствия ферментов гликозил- и малонилтрансфераз, катализирующих эти реакции.

Динамика накопления полифенольных соединений клетками штамма А- M. amurensis представляет собой типичную сигмоидальную кривую с индукционным периодом (0–7 дней) и фазами экспоненциального (8–21 день), линейного (22–35 дней) и стационарного (36–50 дней) роста. Максимальное содержание изофлавоноидов отмечено к 45-му дню культивирования. После дней культура постепенно стареет и погибает из-за исчерпания питательных веществ. Поэтому в дальнейшем период культивирования клеточной культуры А-18 составлял 45 суток (табл. 8).

Таблица 8. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 M. amurensis Содержание изофлавоноидов (%) в сухих клетках Cоединение в зависимости от возраста клеток (дней) 30* 40* 50** 60** Сумма 0.342 1.151 1.690 1. изофлавоноидов Примечание.* результаты измерений, получены на 2 образцах сухих каллусов;

** результаты измерений, получены на 4 образцах сухих каллусов.

Качественный состав и количественное соотношение изофлавоноидов в культуре клеток A-18 анализировали методом ВЭЖХ на протяжении двух лет (2006-2007 гг.) (табл. 9).

Таблица 9. Содержание изофлавоноидов в клеточной культуре А-18 M. amurensis Содержание изофлавоноидов*, % Среднее** Соеди март май декабрь февраль август октябрь содержание, % нение 2006 2006 2006 2007 2007 Изофлавоны и их моно-, ди- и малонилглюкозиды 18 0.008 0.015 0.008 0.009 0.007 0.020 0.011 ± 0. 0.049 следы следы 19 0.004 0.021 0.044 0.020 ± 0. 20 0.029 0.038 0.034 0.037 0.014 0.024 0.029 ± 0. 21 0.016 0.030 0.038 0.043 – 0.041 0.028 ± 0. 0.084 следы 0. 22 0.037 0.066 0.074 0.053 ± 0. 47 0.058 0.064 0.027 0.029 0.013 0.028 0.037 ± 0. следы 48 0.022 0.066 – 0.005 – 0.016 ± 0. 49 0.140 0.100 0.007 0.012 0.052 0.049 0.060 ± 0. 50 0.047 0.083 0.051 0.067 0.076 0.053 0.063 ± 0. 0.011 следы 0. 51 0.013 0.016 0.007 0.009 ± 0. 52 0.035 0.056 0.077 0.089 0.027 0.027 0.052 ± 0. 53 0.132 0.194 0.095 0.129 0.152 0.097 0.133 ± 0. 54 0.051 0.102 0.089 0.098 0.038 0.075 0.076 ± 0. 55 0.035 0.095 0.022 0.028 0.094 0.105 0.063 ± 0. 56 0.258 0.381 0.165 0.192 0.085 0.234 0.219 ± 0. Птерокарпаны и их малонилглюкозиды 0.090 следы следы 29 0.030 0.040 0.072 0.039 ± 0. 0.046 следы 0. 30 0.054 0.056 0.040 0.035 ± 0. 57 0.121 0.231 0.487 0.619 0.101 0.130 0.282 ± 0. 58 0.147 0.125 0.070 0.093 0.073 0.068 0.096 ± 0. 59 0.056 0.174 0.128 0.139 0.041 0.156 0.116 ± 0. Сумма 1.293 1.953 1.535 1.888 0.773 1.233 1.437 ± 0. Примечание. * средняя проба из 10 образцов;

следы – количество вещества 0.003%;

"–" – количество вещества, не определяемое методом ВЭЖХ;

** среднее из трех определений.

Показано, что клетки A-18 синтезируют свободные и глюкозилированные изофлавоны в соотношении 1:7, а свободные и глюкозилированные птерокарпаны в соотношении 1:5.

Соотношение между группами изофлавонов и птерокарпанов, а также свободных изофлавоноидов и их конъюгированных форм в культуре клеток сохранялось на протяжении всего периода наблюдения.

Эти результаты указывают на стабильный биосинтез изофлавоноидов культурой A-18. В течение двухлетнего периода клеточная культура без специального элиситирования постоянно синтезировала изофлавоноиды, среднее содержание которых на сухой вес клеток составляло около 1.44% (табл. 9), что сопоставимо с уровнем их накопления в ядровой древесине маакии амурской (1.57-1.83 % сумма стильбенов и изофлавонов).

Основные биотехнологические параметры клеточной культуры А- представлены в табл. 10.

Таблица 10. Производственные параметры клеточной культуры A- Свежая Сухая биомасса Продукция Содержание биомасса каллусов (г/л*) изофлавоноидов изофлавоноидов каллусов (г/л*) (% на сухую массу) (мг/л*) 234 ± 21 13.5 ± 1.2 194 ± 17 1.44 ± 0. Примечание. Данные представлены как средние (M±m) из 5 независимых экспериментов с 10 повторностями;

* масса на литр питательной среды.

Таким образом, культура клеток А-18 M. amurensis по важнейшему параметру биосинтетической активности" соответствует "стабильность требованиям, предъявляемым для промышленного использования клеточных культур растений.

9. Сравнительная оценка гепатопротективных свойств полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia amurensis Терапевтическую эффективность препаратов, приготовленных из ПФК древесины M. amurensis и биомассы клеток штамма А-18, оценивали по их влиянию на выживаемость животных, морфологические характеристики печени и биохимические показатели сыворотки крови в сравнении с препаратом карсил (табл. 11).

Таблица 11. Влияние ПФКК, ПФКД и препарата карсил на морфологические характеристики печени и биохимические показатели крови крыс при CCl4-гепатите Экспериментальные группы Показатели Интактные ССl4- ССl4-гепатит ССl4-гепатит ССl4-гепатит животные гепатит +ПФКД +ПФКК +карсил Нектротизированные 1.07±0.25 6.80±0.87* 3.52±0.69* 2.31±0.26* 6.60±0. Гепатоциты, % Гепатоциты 0.53±0.19 9.84±0.57* 5.65±0.71* 2.81±0.37* 5.95±0. с дистрофией, % Двуядерные 2.33±0.78 0.71±0.14* 1.58±0.40* 3.51±0.27* 5.50±0. Гепатоциты, % Плотность клеточ ного инфильтрата, 9.4±1.6 80.4±7.8* 41.7±6.0* 25.6±3.9* 36.1±0. на 1 мм АСТ, мккат/л 1.15±0. 0.61±0.04 1.44±0.02* 1.12±0.02* 1.16±0.04* АЛТ, мккат/л 1.16±0. 0.62±0.03 1.38±0.06* 0.89±0.03* 0.87±0.03* ЩФ, Е/л 686 ± 290±38 914±48* 705±37* 623±43* -ГТФ, мккат/л –** 0.09±0.01 0.66±0.06* 0.28±0.04* 0.30±0.03* Холестерин, 5.61±0.33 10.20±0.53* 6.73±0.18* 9.77±0.91 9.10±0. ммоль/л Белок, г/л 60.0±1. 67.5±2.0 48.9±4.4* 65.7±0.8* 65.0±1.4* Общие липиды, г/л 2.06±0. 1.76±0.07 2.77±0.24* 1.93±0.43* 1.99±0.33* Билирубин, мкмоль/л Общий 12.9±2.3* 9.0±0.9 19.2±0.8* 13.4±0.6* 12.6±0.4* непрямой 9.63±1.65* 2.04±0.95 14.90±2.02* 6.76±0.85* 7.70±0.43* Примечание. Данные представлены как средние (M±m) из 8–10 наблюдений;

* различия достоверны (P0.05): для ССl4-гепатита по сравнению с интактными животными, для исследуемых препаратов по сравнению с ССl4 гепатитом;

** через сутки после последнего введения гепатотоксина.

В группе животных, получавших препараты ПФКД и ПФКК в эффективной дозе 100 мг/кг внутрижелудочно за 2 часа до введения гепатотоксина, выживаемость животных составила 100%. Оба препарата препятствовали развитию морфологических и метаболических нарушений печени в сравнении с контрольной группой. Содержание некротизированных клеток снизилось в 1.9 и 2.9 раза, гепатоцитов с дистрофией в 1.7 и 3.5 раза, количество двуядерных гепатоцитов возросло в 2.2 и 4.9 раза, соответственно, что указывает на усиление процессов регенерации печени. Плотность клеточного инфильтрата уменьшилась в 1.9 и 3.1 раза, соответственно, и он локализовался, преимущественно, периваскулярно. Значительно возросло количество гепатоцитов нормального строения и уменьшилось венозное полнокровие. Между гепатоцитами появляется молодая соединительная ткань с большим содержанием клеточных элементов фибробластов и фиброцитов. Более эффективно восстанавливал гистоархитектонику печени ПФКК. Терапия полифенолами сопровождалась регрессом биохимических показателей. Оба препарата статистически равноэффективно уменьшали активность в крови АСТ – в 1.3 и 1.2 раза, АЛТ – в 1.5 и 1.6 раза, ЩФ – в 1.3 и 1.5 раза, ГТФ – в 2.4 и 2.2 раза, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание общего билирубина под влиянием этих препаратов снижалось по сравнению с контролем в 1.4 и 1. раза, непрямого в 2.2 и 1.9 раза, соответственно, общих липидов в 1.4 раза, белка возрастало в 1.3 раза (табл. 11).

Таким образом, установлено, что ПФКК проявляет гепатопротективный эффект, сопоставимый с активностью полифенолов из ядровой древесины M.

amurensis, и представляет интерес для дальнейшего исследования в качестве альтернативного источника новых гепатопротективных лекарственных средств.

Учитывая, что ПФКК, в отличие от ПФКД, не содержит моно- и димерных стильбенов, можно утверждать, что именно изофлавоноиды обуславливают их гепатопротективное действие.

В отличие от ПФКК, ПФКД достоверно препятствовал развитию гиперхолестеринемии при СCl4-гепатите, снижая содержание холестерина в 1. раза по сравнению с контролем. Из этого следует, что гиполипидемический эффект ПФКД обусловлен содержащимися в нем стильбенами.

10. Сравнительная оценка антиоксидантных свойств полифенолов из древесины Maackia amurensis и клеточной культуры А- Оценку антиоксидантных свойств ПФКД и ПФКК проводили на модели окислительного стресса, вызванного субплантарным введением животным 0.2 мл 3% раствора формалина. Типичный окислительный стресс, возникающий на пике воспалительной реакции, характеризуется резким повышением активности прооксидантной системы (показатели ТБРП и ОПА) с последующей активацией ферментов антиоксидантной защиты и интегративного показателя общей антиоксидантной активности (ОАА). Животным III и IV групп на протяжении суток вводили внутрижелудочно ПФК из древесины маакии амурской и клеточной культуры в дозе 100 мг/кг в виде суспензии на 2% крахмальной слизи (табл. 12).

На фоне развития окислительного стресса оба препарата ПФКД и ПФКК в равной степени предотвращали активацию ПОЛ. При этом содержание ТБРП практически не отличалось от величины, характерной для интактных крыс.

Показатель ОПА в случае применения ПФКК снижался до величин, характерных для интактных животных, а в III группе был почти вдвое ниже контроля, значительно уступая показателю интактных животных. Это свидетельствует об уменьшении количества свободных радикалов в плазме крови за счет их "гашения" полифенолами маакии амурской.

Таблица 12. Влияние препаратов ПФКД и ПФКК на оксидантный статус крови крыс и состояние антиоксидантной защиты Группы животных Показатель I II III (ПФКД) IV (ПФКК) ТБРП, мкМ 2.5 ± 0.2 4.2 ± 0.2* 2.3 ± 0.2 2.4 ± 0. ОПА, % 45.1 ± 1.1 60.1 ± 1.2* 31.1 ± 1.2* 47.6 ± 1. Каталаза, % 12.2 ± 1.3 22.4 ± 1.0* 20.5 ± 0.8* 14.3 ± 0. СОД, % 16.9 ± 0.8 28.3 ± 1.0* 30.0 ± 0.8* 19.4 ± 1. ГПО, Ед/мг Hb 233 ± 7 243 ± 11 250 ± 5 209 ± ОАА, % 73.7 ± 0.5 87.8 ± 0.9* 75.9 ± 1.6 54.6 ± 1.7* Примечание. I – интактные животные;

II – группа контрольные животные (окислительный стресс);

* достоверные изменения по отношению к интактным крысам, подчеркнуты достоверные изменения по отношению к контрольным животным.

Применение ПФКД существенно не повлияло на активность антиоксидантных ферментов, показатели которых практически не отличались от таковых в контрольной группе. При использовании препарата ПФКК было зафиксировано достоверное снижение по сравнению с показателями II группы активности каталазы, ГПО и СОД практически до уровня интактных животных.

Учитывая различия в химическом составе ПФК из нативного растения и из клеточной культуры, можно предположить, что стимулирование неферментативных факторов антиоксидантной активности, отмеченное в большей степени для ПФКД, обусловлено присутствием в нем стильбенов.

Присутствие в ПФКК конъюгированных форм изофлавонов, вероятно, определяет снижение активности антиоксидантных ферментов под действием ПФК клеточной культуры. Таким образом, в результате сравнительного изучения антиоксидантных свойств ПФКД и ПФКК, установлено влияние обоих фитокомплексов на свободно-радикальное окисление, M. amurensis сопровождающееся прямым подавлением активности свободных радикалов и активацией механизмов антиоксидантной защиты, особенно выраженное для полифенолов нативного растения (ПФКД).

11. Сравнительная оценка влияния полифенолов из древесины и клеточной культуры Maackia amurensis на развитие экспериментального воспаления Антифлогистический эффект препаратов ПФКД и ПФКК при их длительном введении был изучен на модели острой воспалительной реакции, индуцированной каррагенином. В этих условиях длительного (14 суток) предварительного введения препарата ПФКД приводило к существенному ослаблению формирования воспалительного отека лапы крыс, причем эффект препарата ПФКД приобретал статистическую значимость и достигал максимума (42.3%) уже через 1 час после инъекции каррагенина и несколько ослабевал к окончанию эксперимента. Напротив, предварительное введение препарата ПФКК не приводило к существенному ослаблению формирования воспалительного отека лапы крыс. Эффект препарата ПФКК на протяжении всего эксперимента колебался в пределах 610.5%, что не может быть признано выраженной противовоспалительной активностью (табл. 13).

Существенные различия в антиэкссудативных эффектах у этих антиоксидантных препаратов можно связать с имеющимися различиями в их химических составах полифенолов. Выраженное противовоспалительное действие препарата максар обусловлено присутствием в составе его ПФК мономерных и димерных стильбенов.

Таблица 13. Влияние длительного (14 суток) предварительного введения препаратов ПФКД и ПФКК (100 мг/кг) на формирование каррагенинового отека конечностей крыс Часы наблюдения Вид 1 2 экспери- Прирост, Угнетение Прирост Угнетение Прирост, Угнетение см3 см мента воспале- отека, воспале- воспале см ния, % ния, % ния,% Контроль 0.52±0.05 – 0.84±0.05 – 1.06±0.04 – ПФКД 0.30±0.03* 42.3 0.63±0.03* 25.0 0.73±0.04* 31. Контроль 0.38±0.021 – 0.66±0.040 – 0.91±0.036 – ПФКК 0.34±0.023* 10.5 0.62±0.031* 6.1 0.83±0.029* 8. Примечание. * различия достоверны (Р0.05) по сравнению с контролем;

подчеркнуты цифры, отражающие выраженную противовоспалительную активность;

"–" – угнетение воспаления не обнаружено.

Учитывая выраженность раннего эффекта ПФКД и тот факт, что начальная фаза каррагенинового отека конечности у животных обусловлена влиянием флогистика на высвобождение ряда медиаторов воспаления (гистамин, брадикинин, серотонин), можно предположить, что антиэкссудативный эффект изучаемого препарата связан с подавлением выхода этих биологически активных веществ, возможно, за счет его мембраностабилизирующего действия.

12. Влияние препарата максар на состояние липидного обмена у крыс с алиментарной гиперлипопротеинемией IIа типа Развитие алиментарной гиперлипопротеидемии (ГЛП) сопровождается усилением процессов ПОЛ в гепатоцитах на фоне снижения активности антиоксидантных ферментов в цитозоле этих клеток, вследствие чего происходит окислительная модификация ЛПНП и появление у животных атерогенных свойств.

Очевидно, что блокирование ПОЛ в печени является необходимым условием снижения содержания циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов и коррекции ГЛП. С этой точки зрения актуальным являлось использование природного антиоксиданта препарата максар, усиливающего резервы антиоксидантной системы (АОС) организма для коррекции липидных нарушений.

В опытах использовали крыс-самцов линии Вистар массой 200-250 г.

Животные контрольной группы I находились на обычном рационе питания по содержанию белков, углеводов, жиров и ХС. У крыс опытной группы II в течение недель воспроизводили модель алиментарной ГЛП IIа типа путем кормления их разбалансированным рационом питания, обогащенным сливочным маслом (25% от рациона) и холестерина (ХС) (2.5% от рациона). Крысам III группы с ГЛП интрагастрально, за 30 мин до кормления, вводили измельченный и тщательно суспендированный в воде препарат максар в дозе 240 мг/кг массы тела в течение 35 суток.

У животных находившихся на атерогенном рационе, характер липидных нарушений соответствовал комбинированной ГЛП IIа типа, характеризующейся гиперхолестеринемией при нормальном или мало измененном уровне триглицеридов, увеличением содержания ХС ЛПНП, гипер--липопротеинемией и гипо--холестеринемией (табл.14). Увеличение содержания общих липидов в печени на 13% свидетельствовало о начале развития липоидоза за счет накопления основной фракции нейтральных липидов триглицеридов.

Наблюдаемый дисбаланс между уровнем ПОЛ и состоянием АОС в печени и крови подтверждал положение об усилении процессов пероксидации при развитии ГЛП, характеризующейся значительным увеличением содержания продуктов ПОЛ на всех стадиях этого процесса (табл. 15).

Таблица 14. Липиды крови и печени крыс с алиментарной ГЛП Группы животных Показатель Контроль ГЛП ГЛП+максар Кровь Общий ХС, ммоль/л 1.48 ± 0.07 2.68 ± 0.06* 1.78 ± 0.02* Триглицериды, ммоль/л 0.39 ± 0.03 0.47 ± 0.03 0.44 ± 0. ХС ЛПВП, ммоль/л 0.31 ± 0.07 0.23 ± 0.02 0.25 ± 0. ХС ЛПНП, ммоль/л 0.99 ± 0.11 2.24 ± 0.08* 1.32 ± 0.02* Общие липиды, ммоль/л 2.04 ± 0.22 2.48 ± 0.10 2.27 ± 0. Коэффициент атерогенности 3.77 10.65 6. Печень Общие липиды, мг/г ткани 3.58±0.07 4.05 ± 0.8* 3.52 ± 0.09* Фракции нейтральных липидов, % от суммы ХС 16.80 ± 0.56 13.84 ±0.82** 12.57 ± 0. Свободные жирные кислоты 16.07 ± 0.44 16.52 ± 0.58 16.62 ± 0. Триглицериды 22.28 ± 0.51 26.04 ± 0.82* 22.76 ± 0.91** Эстерифицированные жирные 14.26 ± 0.95 15.20 ± 0.58 14.49 ± 0. кислоты Примечание. Различия достоверны: * Р0.01, ** Р0.05 по сравнению с контролем для ГЛП и по сравнению с ГЛП для ГЛП+максар. Данные представлены как средние значения (M±m) из 7 наблюдений.

В печени интенсификация процессов ПОЛ была более выражена (табл. 15).

Об истощении резервов АОС печени в результате компенсаторных затрат свидетельствовало уменьшение содержания -токоферола (-ТФ), основного антиоксиданта витаминного звена, снижение функциональной активности звена "глутатионпероксидаза – восстановленный глутатион", тормозящего образование липопероксидов, и активности глутатионредуктазы, катализирующей реакцию восстановления окисленного глутатиона. Наблюдалось угнетение линий защиты АОС и системы биорегенерации окисленного глутатиона.

Таблица 15. Показатели системы ПОЛАОЗ (% к контролю) в печени и крови животных с моделью алиментарной ГЛП Печень Кровь Показатель ГЛП ГЛП+максар ГЛП ГЛП+максар Восстановленный глутатион 61.8* 75.7* 72.2* 40.6* Глутатионредуктаза 68.3* 96.3* 48.1* 63.1* Глутатионпероксидаза 82.4 86.8 105.5 71.5* Диеновые конъюгаты 251.7* 212.4* 188.8* 128.5* МДА 225* 151.2* 174.7* 129.8* -ТФ 75.6* 83.4* 64.3* 74.4** Примечание. Различия достоверны: * * Р0.01, ** Р0.05 по сравнению с контролем для ГЛП и по сравнению с ГЛП для ГЛП+максар. Данные представлены как средние значения из 7 наблюдений.

В крови процессы ПОЛ, оцениваемые по уровню продуктов окисления, протекали менее интенсивно, чем в печени, что обусловливало достаточность функционирования второй линии защиты АОС (табл. 15). Происходило более интенсивное расходование -ТФ, чем в печени. Снижение активности глутатионредуктазы и уменьшение содержания восстановленного глутатиона в крови крыс наблюдалось на фоне практически неизмененной активности глутатионпероксидазы. Ответная реакция АОС крови выражалась в активации второй линии ее защиты обезвреживании липидных радикалов -токоферолом.

У крыс с ГЛП, получавших максар, отмечалась нормализация состояния липидного фона крови и печени. Наиболее выраженное действие максара установлено в отношении уровня общего ХС и ХС ЛПНП, содержание которых уменьшалось на 33 и 41% соответственно. Прослеживалась тенденция к уменьшению содержания триглицеридов, общих липидов крови, снижался коэффициент атерогенности. Введение максара оказывало липидкорригирующее действие в отношении липоидоза печени. Содержание общих липидов уменьшилось на 13%, фракции триглицеридов на 12.5%.

Выявлено ослабление интенсивности процессов ПОЛ в печени и крови животных, получавших максар, что проявлялось уменьшением содержания начальных, промежуточных и конечных продуктов окисления липидов (табл. 15).

Как в печени, так и в крови отмечалось возрастание активности глутатионредуктазы на 41 и 37% соответственно. В печени активность глутатионредуктазы приближалась к показателям контрольной группы животных.

При действии максара у животных достоверно повышалось содержание восстановленного глутатиона и -ТФ в печени. Увеличение содержания -ТФ происходило до контрольных значений. Активность фермента глутатионпероксидазы в крови животных с ГЛП при включении в рацион питания животных максара достоверно снижалась при одновременном уменьшении содержания восстановленной формы глутатиона. Это объясняется участием полифенолов, входящих в состав препарата максар, в процессе инактивации свободнорадикальных соединений и частичной заменой функциональной активности звена "глутатионпероксидаза – восстановленный глутатион" антиоксидантным действием препарата максар.

Таким образом, введение животным с алиментарной ГЛП IIа типа препарата максар, содержащего природные полифенольные антиоксиданты, способствует ослаблению процессов ПОЛ в печени и крови, повышению резервов АОС организма, коррекции нарушений липидного обмена крови и липоидоза печени.

13. Противоопухолевая и антимикробная активность полифенолов Maackia amurensis Обнаружено, что ПФКД проявляет более выраженное противоопухолевое действие в отношении опухолевых клеток рака кишечника человека НТ-29 и DLD- в сравнении с изофлавоном генистеином (18) (рис. 7).

Результаты экспериментов показали, что препарат "Маакии амурской экстракт сухой" (ПФКД) ингибирует на 50% по сравнению с контролем рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29 в концентрациях 4.1 и 8. мкг/мл соответственно.

Препарат из древесины M. amurensis в дозе 25 мкг/мл проявил себя как эффективное противомикробное средство в отношении всех изученных штаммов представителей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры и грибов:

Pseudomonadas aeruginosa ГИСК 453;

Escherichia coli, Staphylococсus aureus, Candida albicans.

Рис. 7. Ингибирование роста колоний клеток рака кишечника человека НТ- ПФКД и генистеином.

Наличие антимикробной активности у полифенолов из M. amurensis является весьма полезным свойством при производстве субстанции и лекарственной формы препарата максар.

14. Доклиническое изучение препарата максар На основании экспериментов по доклиническому исследованию и изучению специфической фармакологической активности, ПФКД маакии амурской предложен в качестве нового лекарственного средства, названного препаратом "Максар®" (максар).

Установлено, что препарат максар характеризуется малой острой и хронической токсичностью, не имеет мутагенного, эмбриотоксического, тератогенного, иммунотоксического и аллергизирующего эффектов. Получено разрешение Минздрава РФ от 24.10.1996 г на проведение клинических испытаний препарата максар у взрослых в качестве гепатопротективного средства в лекарственной форме таблетки.

Кроме вышеперечисленных фармакологических эффектов, Максар обладает антитромбогенным и антитромбоцитарным действием. В условиях овариоэктомии у крыс он ослабляет агрегацию тромбоцитов, уменьшает коагуляционные свойства крови и потенцирует антиагрегантную активность сосудистой стенки. Эндотелийпротективный эффект препарата максар осуществляется модуляторами эстрогеновых рецепторов изофлавоноидами и стильбенами, входящими в его состав.

Кроме этого, препарат ограничивает процессы ПОЛ, препятствует снижению содержания общих липидов, способствует нормализации соотношения липидов и белка, а также устраняет рост лизофосфолипидов в мембранах эритроцитов у овариоэктомированных животных. Эти эффекты способствовуют улучшению вязкоэластических свойств эритроцитов и, следовательно, нормализации показателей клеточной реологии крови.

При экспериментальном синдроме Рейе максар нормализует активность ферментов печеночного происхождения, содержание билирубина, глюкозы и МДА в крови, стимулирует образование кетоновых тел и детоксикацию аммиака, восстанавливает нормальную гистологическую структуру печени и коры большого мозга. Максар при хроническом ССl4-гепатите у крыс усиливает ингибирующее влияние преднизолона на пролиферацию фиброзной ткани в печеночных дольках, синтез коллагена, гликозаминогликанов и аккумуляцию липидов в печени.

Он также оказывает антиоксидантное действие при экспериментальном сахарном диабете, индуцированном аллоксаном.

15. Изучение клинической эффективности и безопасности препарата максар Клиническое изучение препарата "Максар® таблетки, покрытые оболочкой 60 мг" проведено в соответствии с программой клинических испытаний, утвержденной Министерством здравоохранения и социального развития.

Препарат назначали 36 больным хроническим гепатитом и циррозом печени вирусной и алкогольной этиологии по 0.12 г 3 раза в день за 30 минут до еды (возраст больных от 18 до 70 лет). 10 пациентов контрольной группы получали препарат сравнения карсил по 0.07 г 3 раза в день. Курс лечения гепатопротекторами продолжался 4 недели. Через 23 дня приема препарата максар наступало значительное улучшение состояния больных повышалась работоспособность, уменьшались боль и диспептические расстройства.

Максимальный клинический эффект препарата наступал через 2 недели курсовой терапии. Он сохранялся в последующие недели наблюдения. Терапия карсилом лишь через 3 недели приводила к умеренному ослаблению клинических симптомов заболеваний печени.

После терапии препаратом максар в течение двух недель активность трансаминаз, ЩФ и содержание билирубина значительно снижались. В течение последующих двух недель возрастало количество альбуминов, продолжала уменьшаться активность АЛТ (дополнительно в 1.8 раза), ЩФ (в 1.3 раза) и содержание непрямой фракции билирубина (в 2 раза) (табл. 16).



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.