авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Выделение и структурно-функциональная характеристика трипсина камчатского краба (paralithodes camtschaticus)

На правах рукописи

КИСЛИЦЫН Юрий Алексеевич ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРИПСИНА КАМЧАТСКОГО КРАБА (PARALITHODES CAMTSCHATICUS) 02.00.10-биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, вед. науч. сотр.

Руденская Галина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович доктор химических наук, ст. н. сотр.

Еремеев Николай Леонидович

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 27 ноября 2007 года в 15.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 26 октября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Трипсины являются наиболее типичными представителями сериновых протеиназ.

В настоящее время трипсины обнаружены в организмах, принадлежащих к различным таксономическим группам. Функции, выполняемые этими ферментами, довольно разнообразны. Основной функцией трипсина в организме человека, млекопитающих и беспозвоночных животных является участие данного фермента в пищеварении и активации других протеолитических ферментов, участвующих в этом процессе. Кроме того, у человека и млекопитающих доказано участие трипсина в процессах клеточной пролиферации, расширении сосудов, развитии воспаления, а также в различных патологических состояниях:

от рака, панкреатита, астмы и до дерматитов и экземы. У беспозвоночных животных физиологические и биохимические процессы, в которых принимают участие трипсины, изучены слабее. На данный момент, у насекомых и ракообразных показано участие трипсина в пищеварении, клеточной дифференцировке и реакциях иммунного ответа.

В настоящее время большой интерес вызывают трипсины, выделенные из психрофильных организмов. Наиболее изучены психрофильные трипсины рыб. Работы по изучению психрофильных трипсинов беспозвоночных малочисленны и содержат сведения либо о физико-химических и энзимологических свойствах, либо о первичной структуре. Для полного понимания эффективности действия психрофильных трипсинов необходимо комплексное изучение структуры и свойств трипсинов беспозвоночных, обитающих при низких температурах. Камчатский краб в этом смысле является подходящим объектом исследования. Данные таких исследований позволяют более полно понять разнообразие биологических функций трипсинов, а также могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.

Трипсин, как и некоторые другие сериновые протеиназы, успешно экспрессируется в культуре клеток млекопитающих, Escherichia coli, дрожжах Pichia pastoris. Несмотря на это, производство трипсина этими системами в силу ряда причин не получило широкого распространения, и в настоящее время большая часть фермента вырабатывается из панкреатической железы крупного рогатого скота и свиней. Производство трипсина из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus (трипсина РС) является более целесообразным в том смысле, что трипсин, полученный таким образом, не будет загрязнен вирусами, прионами и другими инфекционными агентами, свойственными млекопитающим, а также будут частично утилизированы отходы краболовства.

Цель и задачи исследования Настоящая работа посвящена изучению свойств и первичной структуры трипсина камчатского краба. Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработка эффективного метода получения фермента в гомогенном состоянии в количествах, достаточных для проведения научных исследований.

2. Подтверждение чистоты полученного препарата.

3. Изучение физико-химических и энзиматических свойств трипсина.

4. Установление первичной структуры трипсина.

5. Сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными структурами психрофильных и мезофильных трипсинов.

6. Определение филогенетической связи между трипсинами, выделенными из организмов, принадлежащих к различным таксономическим группам.

Научная новизна и практическая значимость работы Трипсин РС выделен из камчатского краба, морского беспозвоночного, приспособленного к обитанию при температуре воды близкой к замерзанию. Актуальность изучения трипсина из такого источника обусловлена тем, что молекулярная организация ферментов психрофильных организмов позволяет им проявлять ферментативную активность, несмотря на замедление метаболических реакций при низких температурах.

По структурно-функциональным особенностям трипсин РС отличается от трипсинов млекопитающих и относится к группе психрофильных ферментов. Результаты, полученные в настоящей работе, вносят вклад в структурно-функциональные исследования трипсинов, выделенных из организмов, принадлежащих к разным таксономическим группам, и могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.



Трипсин камчатского краба является одним из важнейших компонентов мазей, применяемых для лечения ожогов, рубцов, пролежней. Мазь “Морикрол,” созданная на основе суммарного препарата протеиназ камчатского краба, включая трипсин РС, прошла успешные испытания в различных клиниках Москвы.

Публикация и апробация работы По теме диссертации опубликованы 3 статьи. Результаты диссертации были представлены на V международном симпозиуме “Химия протеолитических ферментов” (Москва 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург 2002), Международной конференции по природным соединениям (Алматы, Казахстан, 2003), VI международном симпозиуме “Химия протеолитических ферментов” (Москва 2007).

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 156 страницах и содержит 23 рисунка и 22 таблицы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ В настоящей работе получен гомогенный трипсин РС, определены его физико химические параметры и изучены его энзиматические свойства. Установлена первичная структура препрофермента путем секвенирования полноразмерной кДНК трипсина.

Выполнено сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными структурами трипсинов, полученных из других организмов. Выявленные структурно-функциональные особенности позволяют отнести трипсин РС к группе психрофильных ферментов.

Произведен филогенетический анализ, на основании которого определено эволюционное положение трипсина РС среди протеиназ клана SA.

I. Выделение трипсина РС В качестве исходного материала для выделения трипсина РС нами был использован коммерческий препарат “Морикраза”, полученный осаждением ферментов гепатопанкреаса камчатского краба сульфатом аммония.

Для получения гомогенного препарата была разработана эффективная схема очистки (таблица 1). На первой стадии применялась анионообменная хроматография на DEAE сефадексе (рис. 1). Применение этого сорбента позволило в процессе нанесения препарата избавится от пигментов и белков, не сорбирующиеся при рН 6,4. Элюция градиентом рН и градиентом NaCl привела к отделению белков не обладающих трипсиновой активностью.

Применение DEAE-сефадекса позволило получить фермент с выходом 84%.

Таблица 1. Выделение трипсина камчатского краба.

Активность* Стадия Белок, Выход, Степень очистки ОЕ280 % очистки общая, удельная, ед.акт. ед.акт./ОЕ Раствор 341.0 40.1 0.12 100 “Морикразы” DEAE** 163.8 34.4 0.21 84 1. сефадекс ПТГ 46.0 27.6 0.60 69 агароза*** Mono Q 14.2 25.5 1.80 64 * определена по гидролизу Bz-Arg-pNA (BAPNA) ** DEAE-диэтиламиноэтил.

*** Агароза, содержащая в качестве лиганда пептиды трипсинового гидролизата белка сальмина.

Рис.1. Профиль элюции трипсина РС с DEAE-сефадекса. 1 - градиент концентрации NaCl 0,5-1,0 М. 2- градиент рН 6,4-8,0. Стрелкой показаны фракции, обладающие трипсиновой активностью.

Рис.2. Профиль элюции трипсина РС с ПТГ-агарозы. 1-градиент концентрации изопропанола 0-20 %. 2-градиент концентрации NaCl 0,2-1,5 М. 3-градиент рН 6,4-8,0. Стрелкой показаны фракции, обладающие трипсиновой активностью.

Фракции обладающие трипсиновой активностью хроматографировали на ПТГ-агарозе (рис. 2.). Данный сорбент в качестве лигандов содержит пептиды триптического гидролизата сальмина-протамина осетровых рыб, богатого аргинином и лизином. Использование ПТГ агарозы позволило нам произвести очистку трипсина камчатского краба от карбоксипептидазы РС и коллагенолитической сериновой протеиназы РС. Заключительный этап очистки трипсина РС включал ионообменную хроматографию на колонке Mono Q в режиме FPLC (рис. 3). Применение этой процедуры позволило нам окончательно очистить трипсин РС. Таким образом, с выходом 64%, нами был получен гомогенный препарат трипсина камчатского краба.





II. Критерии чистоты и молекулярные свойства трипсина РС.

Проведение SDS-электрофореа в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях показало наличие единственной белковой полосы, соответствующей молекулярной массе 23 кДа (рис. 4).

Рис. 3. Профиль элюции трипсина РС с колонки Данные масс-спектрометрического Моno Q. Стрелкой показаны фракции, обладающие трипсиновой активностью.

анализа (рис. 5), выявляют одиночный пик, соответствующий молекулярной массе 24,8 кДа, что полностью согласуется с расчетом молекулярной массы по первичной структуре фермента.

N-концевая последовательность трипсина РС характерна для типичных трипсинов животных (табл.6). Из десяти N-концевых аминокислот наибольшее отличие наблюдается с N-концевой последовательностью аминокислот трипсина быка. Полная идентичность первых четырех аминокислотных остатков указывает на то, что трипсин РС, как и Рис. 4. Электрофорез в ПААГ с SDS трипсина РС (2).

трипсины млекопитающих, образуется в 1-белки маркеры (Serva), сверху вниз: фосфорилаза b, БСА, овальбумин, карбонатдегидрогеназа.

результате активации трипсиногена.

Рис.5. MALDI масс-спектрометрический анализ трипсина. Молекулярная масса фермента равна 24863 Да.

В табл. 2 представлены сравнительные характеристики полученного трипсина РС и трипсинов выделенных из организмов принадлежащих к разным таксономическим группам.

Значение молекулярной массы трипсина РС хорошо сопоставимо со значениями молекулярных масс трипсинов ракообразных и насекомых, но несколько выше, чем значения молекулярных масс трипсинов быка Bos taurus и трески Gadus ogac. Трипсин РС имеет самое низкое значение pI (2,5), среди всех представленных трипсинов и одно из самых больших значений температурного оптимума.

Таблица 2. Физико-химические и энзиматические свойства трипсина РС.

Источник трипсина Молекулярная Изоэлектриче- рН-ста- pH оптимум Т-опти масса (Mr,кДа) ская точка (pI) бильность по (BAPNA) мум, °С Бык (Bos taurus) 23 9,3 3-9,5 8,2 Треска (Gadus ogac) 23,5 - 7,5-10 7,5 Краб (Paralithodes 2, 24,8 5,8-9 7,5-8 camtschaticus) Криль (Euphausia 30 2,6 5,9~9,5 8,0 superba) Краб (Uca pugilator) 24 3 6-9 8,0 Саранча (Locusta 24 3,5 7,5-10 9,0 migratoria) Бабочка (Choristoneura 25 10,3 - 9,5 fumiferana) Субстратная специфичность трипсина РС Субстратную специфичность трипсина РС исследовали с помощью хромогенных пептидных субстратов разной длины и состава (табл. 3.).

Трипсин РС, как и другие трипсины, гидролизует связи, образованные карбоксильными группами лизина и аргинина, причем эффективность гидролиза возрастает с удлинением пептидной цепи субстрата. В отношении субстратов эластазы, химотрипсина, сериновой протеиназы РС, содержащих аланин и лейцин в положении Р1, обнаруживалась лишь следовая активность, при инкубации в течении 1 суток. Таким образом, трипсин РС по первичной специфичности не отличается от других трипсинов.

Таблица 3. Субстратная специфичность трипсина РС.

Субстрат Активность фермента, ед.акт./мг H-D-Val-Leu-Lys-pNA 40, Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA 51, Z-Ala-Ala-Phe-Arg-pNA 94, Boc-Ala-Ala-Ala-pNA 0, Z-Gly-Gly-Leu-pNA 0, Z-Ala-Glu-Ala-pNA 0, Glp-Phe-Ala-pNA 0, Glp-Ala-Ala-Leu-pNA 0, Защитные группы: Bz — бензоил-, Z — бензилоксикарбонил-, Glp — пироглутамил-, Boc — трет-бутилоксикарбонил. Хромофорная группа:

-pNA - п-нитроанилид.

Гидролиз Bz-Arg-pNА трипсином РС при различных температурах Для трипсина РС в отличие от трипсина быка наблюдаются значительно более низкие значения Km при гидролизе Bz-Arg-pNА в диапазоне температур 5-35 0С в то время как значения Vmax/E0 различаются не так заметно (табл. 4). Особенно интересно, что трипсин краба гидролизует BAPNA в 19 раз эффективнее при 5 0С, чем трипсин быка. Подобными свойствами обладают психрофильные трипсины рыб.

Таблица 4. Кинетические параметы гидролиза Bz-Arg-pNА трипсином РС и трипсином быка при разных температурах.

Источник Температура 0С Vmax/E0 (s-1) (Vmax/E0) /Km (mM-1s-1) Km (mM) трипсина 5 0,21 0,3 1, бык 21 0,35 0,75 2, 35 0,62 1,75 2, 5 0,029 0,80 27, Камчатский 21 0,041 2,3 56, краб 35 0,053 3,1 58, Ингибирование трипсина РС Ингибирование трипсина показало (табл. 5), что трипсин РС полностью инактивируется ингибиторами сериновых протеиназ DFP (диизопропилфторфосфат) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид). Специфический ингибитор трипсина TLCK (тозиллизинхлорметилкетон) полностью инактивирует фермент. Из белковых ингибиторов наиболее эффективны ингибиторы трипсина из сои-Кунитца (SIT) и Баумана-Бирк (BBI), а также ингибитор из картофеля. Таким образом, по функциональным характеристикам трипсин РС можно отнести к типичным трипсинам.

Таблица 5. Ингибирование трипсина РС.

Остаточная Ингибитор [I] E/I, моль/моль [I], mM активность, % DFP 1:100 0,5 PMSF 1:100 0,5 TLCK 1:50 0,37 Бензамидин 1:50 0,4 Белковые ингибиторы SIT 1:10 0,2 BBI 1:20 0,4 Из картофеля 1:50 0,8 Овомукоид 1:10 0,2 Из морской анемоны 1:20 0,2 III. Первичная структура трипсина РС Определение первичной структуры трипсина Определение первичной структуры трипсина РС было выполнено путем выделения суммарной РНК гепатопанкреаса, на основании которой была создана библиотека кДНК.

Используя вырожденные праймеры, соответствующие N-концевой последовательности трипсина РС, было проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина. В результате была получена нуклеотидная последовательность препрофермента и на основании генетического кода была выведена его соответствующая аминокислотная последовательность. Полученная последовательность зарегистрирована в базе данных GenBank под номером AF461036. Молекулярная масса зрелого трипсина, рассчитанная по аминокислотной последовательности, полностью совпала с молекулярной массой выделенного фермента, также был проведен масс-спектрометрический анализ пептидов полученных при гидролизе трипсина РС трипсином быка (рис. 6), массы пептидов совпали с массами соответствующих пептидов, рассчитанными по первичной структуре.

3882,9 Да IVGGTEVTPGEIPYQLSFQDTSFGGEFHFCGASIYKDTW AICAGHCVQGEDFDSPASLQIVAGDHTLYSAEGNEQKIA VSKIIQHEDYNGFSISNDISLLQFASPLTFNSFVGPIAL 1306,7 Да PAQGQVASGDCTCTGWGTTTEGGYSSDALLKVTMPIVSD 3488,5 Да 2200 Да ADCRASYGESDIDDSMICAGVPQGGKDACQGDSGGPLAC SDTGSPYLAGIVSWGYGCARPNYPGVYCEVAYYVDWVLA NSS Рис. 6. MALDI масс–спектрометрический анализ пептидов, полученных при гидролизе трипсина РС трипсином быка. Выделены пептиды, которые удалось идентифицировать. Над последовательностью пептидов указаны экспериментально определенные массы.

Сигнальные и активационные пептиды трипсина РС Сигнальный пептид трипсина РС состоит из 15 аминокислотных остатков, что вполне сопоставимо с длинами сигнальных пептидов трипсинов других ракообразных (13- аминокислотных остатков) и позвоночных животных (табл. 6), но заметно меньше сигнальных последовательностей трипсинов насекомых и S.griseus. По своей первичной структуре сигнальные последовательности препротрипсинов различных таксономических групп проявляют небольшую степень гомологии и, по-видимому, прохождение зимогена через плазматическую мембрану эндоплазматического ретикулума не требует какой-либо консервативной последовательности аминокислот.

Длина активационных пептидов у представителей различных таксономических групп в большей степени варьирует, нежели длины сигнальных пептидов (табл.6). Длина активационного пептида трипсина РС больше, чем у соответствующих пептидов млекопитающих, рыб и асцидии, но меньше чем длина активационных пептидов насекомых Anopheles gambiae и Lygus hesperus. В последовательности активационного пептида, трипсин РС не имеет отрицательно заряженных аминокислотных остатков, что отличает его от активационных пептидов трипсинов млекопитающих и рыб. Активация зимогена у ракообразных, по-видимому, происходит иным способом, чем у млекопитающих. Как известно, трипсин позвоночных превращается в зрелый белок под действием специфичной энтеропептидазы, имеющей сродство к Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-последовательности активируемого белка, а трипсин РС так же, как и трипсин креветки, имеет иной пропептид Arg-Gly-Leu-Asn-Lys-, не содержащий сайт расщепления энтеропептидазой. Поэтому активация профермента у ракообразных, вероятно, происходит при участии других трипсиноподобных протеиназ, присутствующих в гепатопанкреасе, или путем самоактивации.

Таблица 6. Сигнальные, активационные пептиды и N-концевые последовательности трипсинов.

N-концевая Источник трипсина Сигнальная последовательность Активационная последовательность последовательность MKHFLRALKRCSVAVATVAI Бактерия Streptomyces griseus APNP VVGGTRAAQG AVVGLQPVTASA Асцидия Botrillus schlosseri MKVFAILLLAFCGANA DK IVGG Рак Pacifastacus leniusculus PAMKTLVFCLLLVGALA APSRRLRFPPNNYK IVGGTDASLG Креветка Penaeus vannamei MKTLILCVLLAGA FAAPSRKPTFRRGNK IVGGTDATPG MKYLVFCLLLGAAFA APSRKPTFRRGLNK IVGGTEVTPG Краб Paralithodes camtschaticus Бабочка Helicoverpa armigera MRILALVALCFAAVAA VPSNPQR IVGGSVTTID Жук Rhyzopertha dominica MAVLTGLVLSPVTYVCA APHFVPHLPNGK IVGGHDVSIE MRLFLALLALGFAAVAA VPANPQR IVGGSTTTIQ Manduxa sexta Комар Anopheles gambiae MISNKIAILLAVLVVAVACAQA RVALKHRSVQALPRFLPRPQYDVGHR IVGGFEIDVS Листовертка Choristoneura fumiferana MRVTLALVALCLASVAA LPEKQQR IVGGSVTTIE Муха Drosophila melanogaster MLKIVILLSAVVCALGGTVPEG LLPQLDGR IVGGSATTIS Клоп Lygus hesperus MQLTTVVLLLGAAVAYA QDSSEWGLGGGKVQTNCTCGYTNKNGGR IVGGRQTKVN Треска Gadus ogac RKSLIFVLLLGAVFA EEDK IVGG Лосось Salmo salar MISLVFVLLIGAAFA TEDDK IVGGYECKAY Собака Canis familiaris MNPLLILAFLGAAVA TPTDDDDK IVGGYTCEEN Бык Bos taurus MHPLLILAFVGAAVA FPSDDDDK IVGGYTCAEN Аминокислотная последовательность зрелого трипсина РС Консервативные аминокислотные остатки трипсина РС и других трипсинов В таблице 7. указано соотношение идентичных аминокислотных остатков в последовательностях трипсинов из различных источников. Из таблицы видно, что трипсин РС по первичной структуре наиболее близок к трипсинам ракообразных (65-70% идентичных аминокислот), в меньшей степени к трипсинам позвоночных (37-39 %), еще в меньшей степени к трипсинам насекомых (36%) и наиболее отличается от трипсина микроорганизма (35%).

Таблица 7. Сравнение первичных структур трипсинов из различных источников.

Цифры показывают процентное соотношение идентичных аминокислот в аминокислотных последовательностях трипсинов выделенных из различных источников.

TPC TPV TAF TAA TDM TSA TBT TSG TPC 100 70 65 36 36 37 39 TPV 100 75 38 39 39 43 TAF 100 38 36 39 41 TAA 100 39 39 39 TDM 100 33 36 TSA 100 65 TBT 100 TSG Сокращения: TPC-краба Paralithodes.camtschaticus;

TPV- креветки Penaeus. vannamei;

TAF-речного рака Astacus fluviatilis;

TAA-комара Aedes aegypti;

TDM-мушки Drosophila melanogaster;

TSA-рыбы Squalus acanthias;

TBT-быка Bos. taurus;

TSG- микроорганизма Streptomyces griseus.

При сравнении аминокислотной последовательности трипсина РС с аминокислотными последовательностями трипсинов холодноводных рыб и быка (рис 7), видно, что наиболее протяженные участки идентичных аминокислотных остатков включают в себя N-концевую последовательность, остатки активного центра (His 57, Asp 102, Ser 195), петли 1, 2 и петельную структуру Е. Наличие таких участков объясняет практически одинаковую третичную структуру трипсинов выделенных из различных организмов.

Трипсины холодноводных рыб эффективно гидролизуют ВАPNA при 50С, что сближает их с трипсином РС и отличает от трипсина быка. Тем не менее, трипсин РС и трипсины холодноводных рыб не имеют общих консервативных участков помимо консервативных последовательностей, общих с трипсином быка. Таким образом, структурные элементы, обуславливающие психрофильные свойства трипсина краба, вероятно, отличаются от соответствующих элементов структуры трипсинов рыб.

16 30 40 50 * TPC IVGGTEVTPGEIPYQLSFQDTSFGGEFHFCGASIYKDTWAICAGHCVQGEDFD TSS IVGGYECKAYSQPHQVSLN-----SGYHFCGGSLVNENWVVSAAHCYQS--- TPM IVGGKECSPYSQPHQVSLN-----SGYHFCGGSLVNENWVVSAAHCYKS--- TGO IVGGYECTKHSQAHQVSLN-----SGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKS--- TBT IVGGYTCGANTVPYQVSLN-----SGYHFCGGSLINSQWVVSAAHCYKS--- Петля А Петля Б 70 80 90 100 * TPC SPASLQIVAGDHTLYSAEGNEQKIAVSKIIQHEDYNGFSISNDISLLQFASP TSS ---RVEVRLGEHNIQVTEGSEQFISSSRVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSKP TPM ---RVEVRMGEHHIRVTEGKEQFISSSRVIRHPNYSSYNIDNDIMLIKLSKP TGO ---VLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKP TBT ---GIQVRLGEDNINVVEGNEQFISASKSIVHPSYNSNTLNNDIMLIKLKSA Петля Е Петля С 120 130 140 150 TPC LTFNSFVGPIALPAQGQVASGDCTCTGWGTTTEG-GYSSDALLKVTMPIVSDA TSS ATLNTYVQPVALPTSCAPAGTMCTVSGWGNTMSS-TADKNKLQCLNIPILSYS TPM ATLNQYVQAVALPSSCAPAGTMCTVSGWGSTQSS-SADGNKLQCLNIPILSDR TGO ATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSS-VADGDKLQCLSLPILSHA TBT ASLNSRVASISLPTSCASAGTQCLISGWGNTKSSGTSYPDVLKCLKAPILSDS Петля Д 170 180 190 200 * TPC DCRASYGESDIDDSMICAGVPQGGKDACQGDSGGPLACSDTGSPYLAGIVSWG TSS DCNNSYP-GMITNAMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNG----ELQGVVSWG TPM DCDNSYP-GMITDAMFCAGYLQGGKDSCQGDSGGPVVCNG----ELQGVVSWG TGO DCANSYP-GMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNG----ELQGVVSWG TBT SCKSAYP-GQITSNMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCSG----KLQGIVSWG Петля 3 Петля 220 230 TPC YGCARPNYPGVYCEVAYYVDWVLANSS- TSS YGCAEPGNPGVYAKVCIFNDWLTSTMATY TPM YGCAERDHPGVYAKVCLFNDWLETSMANY TGO YGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY TBT SGCAQKNKPGVYTKVCNYVSWIKQTIASN Петля Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей трипсина РС с трипсинами холодноводных рыб и трипсином быка. Приведены первичные структуры по базе данных SWISS-PROT (идентификационный номер указан после латинского названия животного) для трипсинов: TPC-краба Paralithodes camtschaticus (Q8WR10);

трипсинов холодноводных рыб –TSS-Salmo salar (P35032);

TPM Paranotothenia magellanica (Q92099);

TGO-Gadus ogac (P16049);

трипсина быка –TBT-Bos Taurus (Q29463). Цифры над последовательностью — нумерация по химотрипсиногену быка, звездочками отмечены каталитически важные остатки.

Обозначения: VG —полностью консервативные остатки, VG — консервативные остатки в последовательностях трипсина краба и холодноводных рыб, FQ — остатки трипсина краба, отличные от консервативных остатков трипсина быка и трипсинов рыб.

Структурные особенности трипсина РС Сравнение первичной структуры трипсина РС с первичными структурами трипсинов беспозвоночных и трипсином быка показало различия в областях молекулы существенных для функционирования фермента (табл. 8).

Таблица 8. Отличие трипсина РС от трипсинов ракообразных, трипсинов насекомых и трипсина быка по некоторым аминокислотным остаткам, существенным для связывания субстрата и поддержания третичной структуры фермента.

Камчатский Насекомые Ракообраз Остатки Замечание краб Бык ные Образует S1/ участок Gly44 – – + + (Ala) (Аla) Pro92 Помогает поддержанию определенной – – + + конформации петли С (Ala) (Glu) Leu99 Образует S2 участок + Ile/Leu (Ile) Leu108 Вместе с Lys/Arg107 образует участок – + + + автолиза (Phe) Образует S2/ участок Tyr151 – – – + (Ser) (Pro) (Ser/Ile) Pro152 Способствует поддержанию – + + +/– определенной конформации петли D. делеция Ser190 Входит в состав S1 участка фермента, – определяет вторичную специфичность + + +/– (Ala) трипсина.

Замена остатка Ser190 на Ala в первичной структуре трипсина РС увеличивает размер субстратсвязывающего участка и может влиять на взаимодействие с субстратом или ингибитором. Наличие остатка Ala190 сближает трипсин РС с тромбином, фактором Ха, тканевым активатором плазминогена (tPA) также содержащими в этом положении остаток Ala.

Существенные отличия наблюдаются в петельных структурах трипсина РС и трипсинов позвоночных (рис. 7). Трипсин краба имеет значительно более длинные петельные структуры А и Б, чем соответствующие петли трипсинов рыб и трипсина быка.

Наличие длинных петельных структур, как, правило, увеличивает подвижность молекулы в целом и может способствовать лучшему связыванию субстрата при низких температурах.

Петельные структуры трипсина РС отличаются от петельных структур трипсинов рыб наличием или отсутствием отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Так, например, петля Б и петля 3 трипсина РС имеют в своем составе по три отрицательно заряженных аминокислотных остатка и ни одного положительно заряженного. Трипсины рыб и трипсин быка отличаются от трипсина РС по содержанию отрицательно заряженных аминокислот в петле Б. Например, трипсин лосося S.salar содержит в петле Б один отрицательно заряженный остаток и один положительно, а трипсин быка вообще не имееет отрицательно заряженных остатков. Другие петельные структуры трипсина РС тоже имеют некоторые отличия от соответствующих петельных структур трипсинов рыб и быка. Следует отметить, что петельные структуры трипсинов участвуют во взаимодействии с пептидными и белковыми субстратами, белковыми ингибиторами и во многом определяют динамическое поведение молекулы в целом.

IV. Эволюционное положение трипсина РС Эволюционная связь трипсина РС с ферментами клана SA, выделенными из животных различных таксономических групп, приведена в виде не укорененного филогенетического дерева, размещенного на рисунке 8. Филогенетический анализ показывает, что трипсины ракообразных формируют обособленный кластер, расположенный чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых.

Психрофильный трипсин лосося S. salor имея схожие кинетические параметры гидролиза BAPNA при 50С с трипсином РС, не входит в кластер трипсинов ракообразных, а находится в одной группе с мезофильным трипсином быка. Таким образом, появление психрофильных форм трипсинов произошло задолго до появления рыб.

Интересно отметить тот факт, что трипсины ракообразных и коллагеназы ракообразных образуют две обособленные друг от друга группы, несмотря на тот факт, что последние обладают двойственной субстратной специфичностью. Например, элементы Джонс-Тейлор-Тронтон матрицы между различными трипсинами будут следующие: 1, отделяет трипсин РС от трипсина мухи D. melanogaster, 1,16. различие между трипсином РС и трипсином быка, в то время как, разница между трипсином РС и трипсином креветки P.vannamei, составляет 0,41. Удаленность трипсина РС от коллагеназы РС составит 1,45, а от трипсина из микроорганизма S.griseus 1,57.

Таким образом, можно привести определенный ряд филогенетического родства между трипсином РС и другими ферментами клана SA:

Трипсин РС трипсин креветки P.vannamei трипсин быка трипсин D. melanogaster коллагеназа РС трипсин S. griseus. Можно отметить тот факт, что трипсин РС более близок к трипсину быка, чем к трипсинам из насекомых и микроорганизмов. Кроме того, трипсин РС в эволюционном плане ближе к трипсину быка и трипсинам насекомых, чем к коллагеназе РС;

в то же время трипсин РС более всех удален от трипсина S.griseus. Данный факт может говорить о дивергенции предшественника сериновых коллагеназ и трипсинов по крайней мере до происхождения членистоногих.

Рис. 8 Сравнение аминокислотных последовательностей сериновых протеиназ клана SА позвоночных и беспозвоночных животных с аминокислотной последовательностью трипсина РС. Приведены первичные структуры по базе данных Swiss-Prot (идентификационный номер указан после латинского названия организма).

Сокращения: ChCF, химотрипсин собаки Canus familiaris (P04813);

ChRN, химотрипсин крысы Rattus norvegicus (P07338);

ChBT, химотрипсин быка Bos taurus (P00766);

ChPO химотрипсин рыбы Paralichthys olivaceus (Q9W7Q3);

TBT, трипсин быка B.taurus (Q29463);

TXL, трипсин лягушки Xenopus laevis (P19799);

TSS, трипсин рыбы Salmo salar (P35032);

TPV, трипсин креветки Pen.

vannamei (Q27761);

TPC, трипсин краба P. camtschaticus (Q8WR10), TAF, трипсин рака Astacus fluviatilis (P00765);

PSS, активатор плазминогена из сколопендры Scolopendra supspinipes (O96899);

CUP, коллагеназа краба Uca pugilator (P00771);

ChPV, химотрипсин креветки Pen. vannamei (P36178);

CPC коллагеназа краба P. camtschaticus (Q8WR11), СhPC, химотрипсин насекомого Phaedon cochleariae (O97398);

CHL, коллагеназа насекомого Hypoderma lineatum (P08897);

ChHR, химотрипсин моллюска Haliotis rufescens (P35003);

TCF, трипсин насекомого Choristoneura fumiferana (P35042);

TAA, трипсин насекомого Aedes aegypti (P29786);

TDM, трипсин насекомого Drosophila melanogaster (P04814);

TFO, трипсин гриба Fusarium oxysporum (P35049);

TMA, трипсин гриба Metarhizium anisopliae (Q9Y7A9), TSG, трипсин микроорганизма S.griseus (P00775);

TBS, трипсин из асцидии Botryllus schlosseri (O01309);

TLH, трипсин насекомого Lygus hesperus (Q95P15).

V. Модель третичной структуры трипсина РС На основе первичной структуры нами была смоделирована третичная структура трипсина РС. Для построения модели трипсина РС нами был использован сервис автоматического моделирования SWISS-MODEL. Пространственная структура трипсина РС состоит из двух доменов, расположенных в пространстве не симметрично относительно друг друга, оси симметрии двух барреллей, составляющих основу каждого домена располагаются почти перпендикулярно друг другу. Каждый домен имеет в своем составе шесть антипараллельных -складчатых слоев, которые соединяются между собой петельными стуктурами.

Из наложений видно, что ход основной цепи молекулы трипсина РС совпадает с таковой трипсина быка (рис. 9). Различия наблюдаются только в районах петельных структур.

На рисунке 10. представлено распределение заряженных аминокислотных остатков на поверхности белковых глобул анионного трипсина быка и трипсина РС. На белковой поверхности положительно и отрицательно заряженные аминокислотные остатки образуют определенные участки (кластеры), особая концентрация отрицательно заряженных аминокислотных остатков в трипсине РС сосредоточена в области субстратсвязывающего участка. Возможно, этот факт облегчает связывание положительно заряженного субстрата и способствует более эффективному катализу трипсином РС при низких температурах, в отличие от трипсина быка. В целом поверхность трипсина РС является, более отрицательно заряженной, чем поверхность анионного трипсина быка. Такое свойство поверхностей белковых глобул этих ферментов хорошо согласуется с их аминокислотным составом. В трипсине РС суммарное содержание отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Asp+Glu=28), более чем в два раза превосходит сумму положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg+Lys+His=11), а в анионном трипсине быка наблюдается обратное соотношение (Arg+Lys+His=19) и (Asp+Glu=10).

Рис. 9. Наложение третичных структур смоделированного трипсина РС с трипсином быка Bos taurus (1AQ7). Трипсин РС выделен красным цветом, трипсин быка — желтым. В скобках указан номер кристаллической структуры в банке данных белковых структур (PDB).

Рис.10. Распределение заряженных аминокислотных остатков по поверхности белковой глобулы.

Слева на право: анионный трипсин быка Bos taurus, трипсин краба Paralithodes camtschaticus. Синим цветом показаны положительно заряженные аминокислотные остатки, красным — отрицательно заряженные.

ВЫВОДЫ 1. Разработан трехстадийный метод очистки трипсина РС, включающий комбинацию ионообменной и аффинной хроматографий.

2. Показано, что трипсин РС отличается от трипсинов млекопитающих аномально низкой изоэлектрической точкой, более узким интервалом рН стабильности, более эффективным гидролизом Bz-Arg-pNА в диапазоне 5-350С. На основании полученных результатов трипсин камчатского краба можно отнести к ферментам психрофильного типа.

3. Создана библиотека кДНК, проведено клонирование полноразмерной кДНК трипсина РС, по нуклеотидной последовательности которой была определена последовательность аминокислот препротрипсина РС.

4. Филогенетический анализ, показал, что трипсины ракообразных группируются в обособленный кластер, который располагается чуть ближе к трипсинам позвоночных, чем к трипсинам насекомых и значительно удален от сериновых коллагеназ членистоногих. Дивергенция между трипсинами и сериновыми коллагеназами произошла, вероятно, до происхождения членистоногих.

5. На поверхности белковой глобулы в области субстратсвязывающего участка наблюдается концентрация отрицательно заряженных аминокислотных остатков, которые, вероятно, улучшают связывание субстрата и способствуют эффективному катализу при температуре близкой к 00С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Руденская Г.Н, Исаев В.А, Калебина Т.С, Спепанов В.Н, Мальцев К.В, Швец С.В, Лукьянова Н.А, Кислицын Ю.А, Мирошников А.И. Выделение трипсина РС камчатского краба Paralithodes camtschaticus и его свойства // Биоорганическая химия. – 1998. – Т. 24, N 2. – С. 112–118.

2. Кислицын Ю.А, Ребриков Д.В, Дунаевский Я.Е, Руденская Г.Н. Выделение и первичная структура трипсина камчатского краба Paralithodes camtschaticus // Биоорганическая химия. – 2003. – Т. 29, N 3. – С. 269–276.

3. Rudenskaya G.N, Kislitsin Yu.A, Rebrikov D.V. Collagenolytic serine protease PC and trypsin PC from king crab Paralithodes camtschaticus: cDNA cloning and primary structure of the enzymes // BMC Structural Biology, – 2004. – V. 4, issue 2. – P. 1-9.

www.biomedcentral.com 4. Кислицын Ю.А, Ребриков Д.В, Руденская Г.Н. Выделение и структура трипсина РС камчатского краба Paralithodes camtschaticus // V Международный симпозиум “Химия протеолитических ферментов” (23-25 апреля 2002 г., Москва), сборник тезисов. – Москва: ИБХ РАН, 2002. - C. 49.

5. Ребриков Д.В, Кислицын Ю.А, Руденская Г.И. Первичные структуры коллагенолитической протеиназы и трипсина камчатского краба Paralithodes camtschaticus // III Съезд биохимического общества (26 июня – 1 июля 2002 г., Санкт Петербург), сборник тезисов. – С-Петербург: Мономакс, 2002. – С. 515-516.

6. Isaev V.A, Shmoilov A.M, Kislitsin Yu.A, Rudenskaya G.N. The medical properties of the liniment “Moricrol” // International conference on natural products: Chemistry, technology and medicinal perspectives ( October 8-10 2003, Almaty, Kasakhstan), – P 99.

7. Паписова А.И, Кислицын Ю.А, Семенова С.А, Руденская Г.Н. Кинетические параметры гидролиза пептидных и белковых субстратов протеиназами камчатского краба при различных температурах // VI Международный симпозиум “Химия протеолитических ферментов” (23-25 апреля 2007 г., Москва), сборник тезисов. – Москва: ИБХ РАН, 2007. - C. 102.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.