авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

БЕЛЯЕВА Анастасия Валерьевна ПРОТЕИНАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА, КАК КАТАЛИЗАТОРЫ ПЕПТИДНОГО СИНТЕЗА В ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ Специальность – 02.00.10 Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н.

Несмеянова РАН Научные руководители: доктор химических наук Филиппова Ирина Юрьевна доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Официальные оппоненты: доктор химических наук Кочетков Константин Александрович кандидат химических наук Воюшина Татьяна Львовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 31 октября 2006 года в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при московском университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 29 сентября 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез пептидов, катализируемый протеиназами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратной оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалентная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе из за опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе.

Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта (криоПВСГ), как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.

В работе решались следующие задачи: (1) получение и характеристика препаратов трипсина, субтилизина, термолизина и химотрипсина, иммобилизованных на криоПВСГ;

(2) выявление оптимальных условий протекания реакции пептидообразования, катализируемого данными биокатализаторами;

(3) изучение биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов в реакциях пептидного синтеза;

(4) синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ – с использованием ферментов, иммобилизованных на криоПВСГ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведена оптимизация условий получения биокатализаторов на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на криоПВСГ.

Показано, что полученные образцы иммобилизованных ферментов катализируют образование пептидной связи в органической среде. Выявлены оптимальные условия проведения ферментативного пептидного синтеза под действием протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ, в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных биокатализаторов получены ди-, три- и тетрапептиды различного строения. Показано, что субстратная специфичность иммобилизованного субтилизина в органических средах «расширяется», в то время как иммобилизованный термолизин практически сохраняет свою специфичность в таких средах. Установлена возможность многократного использования одного и того же препарата иммобилизованной протеиназы для эффективного синтеза пептидов.

Практическая ценность работы заключается в разработке биокаталитической системы, сохраняющей высокую активность и позволяющей, варьируя составляющие ее элементы (иммобилизованный фермент, набор органических растворителей), с высокой эффективностью проводить целенаправленный синтез пептидов различной структуры, включая хромогенные и флуорогенные субстраты протеиназ.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Результаты работы были представлены на Международной конференции “Biocatalysis” (Москва, 2002;

Кижи-Валаам-Санкт-Петербург, 2005), V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002), Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок» (Тверь, 2002), Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов» (Москва, 2003), I и II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003;

Санкт-Петербург, 2005), III Московском международном конгрессе “Biotechnology: state of the art and prospects of development” (Москва, 2005), 28 и Европейском Пептидном Симпозиумах (Прага, Чехия, 2005;

Гданьск, Польша, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного модифицированным протеиназам как катализаторам синтеза пептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (130 ссылок).

Содержит 32 рисунка и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта Для иммобилизации были использованы сериновые протеиназы трипсин, химотрипсин, субтилизин и металлопротеиназа термолизин. Выбор этих отличных по своей природе и каталитическому механизму ферментов был связан с их доступностью, стабильностью и высоким синтетическим потенциалом в реакциях пептидной конденсации. Присутствие в структуре ферментов достаточного количества остатков лизина, экспонированных на поверхность белковой глобулы, позволяло провести ковалентное присоединение протеиназ к носителю.

В качестве матрицы для ковалентной фиксации ферментов был выбран криоПВСГ.

Уникальной особенностью криоПВСГ является его макропористая структура, а также совместимость как с водной, так и с полярной органической средой. Эти свойства носителя обеспечивали возможность иммобилизации на нем крупных молекул ферментов, минимизируя затрудненную диффузию субстрата, а также инактивацию биокатализатора в органической среде.

Для иммобилизации протеиназ использовали криоПВСГ в виде сферических гранул диаметром 1 мм, полученных с помощью специальной криогрануляционной установки в Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН.

В качестве объекта для отработки методики получения иммобилизованных ферментов был использован трипсин, который является доступной и хорошо охарактеризованной протеиназой.

Процесс ковалентной иммобилизации на криоПВСГ включал две основные стадии: введение реакционноспособных группировок в матрицу носителя (активацию криогеля) и присоединение молекул фермента по этим группировкам. Для прививки реакционноспособных группировок к криоПВСГ использовали активацию дивинилсульфоном (ДВС) в щелочной среде и активацию диальдегидами в кислой среде (схемы 1 и 2). Поскольку известно, что подбором длины сшивающего агента можно изменять каталитические характеристики иммобилизованного фермента, для активации матрицы применялись диальдегиды с «ножкой» разной длины: глиоксаль (ГО), янтарный (ЯА), глутаровый (ГА) и терефталевый (ТА) альдегиды.

Непрореагировавшие реакционноспособные группы носителя блокировали трис гидроксиметиламинометаном. Количество присоединенного фермента оценивали по данным аминокислотного анализа навески иммобилизованного биокатализатора после его гидролиза 5.7 н. HCl. Результаты экспериментов по иммобилизации трипсина на гранулах криоПВСГ, приведены в таблице 1.

O C H2 =C H S C H =C H O O Ф ЕРМ ЕН Т H 2N OH O CH2 CH S C H =C H OH O O O NH CH2 CH2 S CH2 CH2 Ф Е РМ Е Н Т O Схема 1. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем винилсульфоновые реакционноспособные группировки OH O O (C H 2 ) OHC CH O H 2N Ф Е Р М ЕН Т C H(C H 2 ) 3 C OH H+ O H O N C H (C H 2 ) 3 CH Ф Е РМ Е Н Т O Схема 2. Схема иммобилизации ферментов на криоПВСГ, содержащем альдегидные реакционноспособные группировки Таблица 1. Характеристика препаратов трипсина, иммобилизованного на криоПВСГ, активированном различными диальдегидами и ДВС Активирующий Содержание трипсина Активность трипсина, иммобилизованного агент на криоПВСГ, мг/г на криоПВСГ ед. акт./г носителя ед. акт./мг белка ГО следы - 0.3 ± 0. ТА 0.013 0. 7.2 ± 0. ЯА 0.147 0. 6.9 ± 0. ГА 1.21 0. ДВС 4.3±0.1 1.35 0. Наилучшие результаты по количеству присоединяемого белка в результате ковалентной иммобилизации трипсина на криоПВСГ наблюдались при активации ДВС и ЯА или ГА с подвижной алифатической спейсерной группировкой. Использование ТА с конформационно-жестким бензольным кольцом не позволило получить иммобилизованный биокатализатор с приемлемым содержанием фермента на носителе. В случае использования криоПВСГ, активированного ГО, полученный образец биокатализатора содержал только следовые количества трипсина, по-видимому, из-за малой стерической доступности для макромолекул белка реакционных групп гелевой матрицы, модифицированной таким «коротким» диальдегидом, как ГО.

Каталитическую активность препаратов трипсина, иммобилизованного на криоПВСГ, оценивали спектрофотометрически по гидролизу специфического хромогенного субстрата Bz-D,L Arg-pNA. Максимальную активность проявлял препарат на основе трипсина, иммобилизованного на носителе, активированном ДВС. Активность биокатализатора, полученного активацией криоПВСГ ГА, была несколько ниже, однако в этом случае матрица криоПВСГ после обработки диальдегидом обладала лучшими механическими свойствами. Исходя из этого, в качестве оптимальных были выбраны условия получения иммобилизованных биокатализаторов путем присоединения ферментов к криоПВСГ после модификации носителя с помощью ГА.

В ходе работы были получены биокатализаторы на основе субтилизинов 72 и Карлсберг, субтилизина Карлсберг в присутствии ингибитора Bz-Tyr-NH2, а также несколько партий препаратов на основе химотрипсина и термолизина (табл. 2). Активность полученных биокатализаторов определяли по гидролизу специфичных для каждого фермента окрашенных пептидных субстратов:

Glp-Ala-Ala-Leu-pNA (в случае субтилизина), Glp-Phe-pNA (в случае химотрипсина), Dnp-Gly-Gly-Ile Arg (в случае термолизина).

Содержание белка на носителе в зависимости от условий проведения иммобилизации варьировало в пределах 1.6 – 15 мг/г носителя. Все полученные препараты проявляли достаточно высокую гидролитическую активность, которая сохранялась в течение длительного времени при хранении в водном буфере при +4°С. На рис. 2 приведены данные по стабильности иммобилизованных на криоПВСГ субтилизина и термолизина. Термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ, сохранял не менее 80% первоначальной активности (кривая 1), и этот эффект наблюдался даже через 8 месяцев хранения в водном буфере. Иммобилизованный субтилизин (кривые 2 и 3) также проявлял достаточно высокую стабильность - даже через 5 месяцев хранения (рис. 2) фермент сохранял более 50% первоначальной активности, в то время как активность нативного субтилизина в этих условиях снижалась до 40% уже через трое суток. Иммобилизованный субтилизин 72 (кривая 2) проявлял более высокую стабильность, чем иммобилизованный субтилизин Карлсберг (кривая 3).

Таблица 2. Характеристики биокатализаторов, полученных в результате иммобилизации препаратов субтилизина, термолизина и химотрипсина на криоПВСГ, активированном ГА Образец Содержание Активность, фермента на мкмоль/мг носителе, мг/г белка *мин Субтилизин 72 5.4 0. Субтилизин Карлсберг – Bz-Tyr-NH2 5.3 0. Субтилизин Карлсберг 1.6 0. Термолизин 2.6 0. 11.6 0. Химотрипсин 5.7 15. 14.6 7. 100 Рис. 2. Изменение удельной активности термолизина(1), Остаточная активность, % иммобилизованного на криоПВСГ, при инкубации в 0.05 М Tris-HCl буфере pH 7.2, 0.05 М CaCl2, субтилизина 72 (2) и субтилизина 40 Карлсберг (3), иммобилизованных на криоПВСГ, при инкубации в 0.05 М Tris-HCl буфере pH 8.2, 2 мМ CaCl 0 1 2 3 4 Время, мес Особый интерес представляло изучение стабильности иммобилизованных биокатализаторов при инкубации в органических смесях диметилформамид (ДМФ)/ацетонитрил (MeCN), соответствующих по своему составу реакционным средам, используемым для проведения ферментативного пептидного синтеза. Ранее при изучении стабильности иммобилизованного субтилизина при хранении в MeCN и смесях MeCN/ДМФ различного состава было показано, что данный биокатализатор сохраняет до 60% гидролитической активности через 2-3 суток. На рис. приведено изменение удельной активности образцов иммобилизованного термолизина, инкубированных в смесях органических растворителей ДМФ/MeCN различного состава, не содержащих воды. За 100% активности принимали удельную активность иммобилизованного фермента, измеренную непосредственно после получения.

Рис. 3. Остаточная активность 100 препарата термолизина, иммобилизованного на остаточная активность, % криоПВСГ, после инкубации в течение 72 ч в смесях ДМФ/MeCN различного состава 25 40 60 80 содержание ДМФ, % Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемый препарат обладает достаточно высокой стабильностью при хранении. В течение 3 и 5 суток в среде, содержащей 25% ДМФ, активность препарата не менялась. Инкубация иммобилизованного термолизина в смесях с 40-80% ДМФ приводила к некоторой инактивации биокатализатора, но даже через 10 дней препарат сохранял не менее 60% своей активности. Более резко потеря активности наблюдалась в среде 95% ДМФ/MeCN, однако и в этом случае биокатализатор сохранял более 40% активности.

Таким образом, иммобилизация ферментов на криоПВСГ приводила к ожидаемому повышению стабильности образцов, предотвращая автолиз при хранении в буфере и денатурацию в смеси полярных органических растворителей.

1.2. Протеиназы, иммобилизованные на криоПВСГ, как катализаторы синтеза пептидов в органической среде с низким содержанием воды 1.2.1. Использование субтилизина, иммобилизованного на криоПВСГ, в пептидном синтезе На примере модельной реакции Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 + Phe-pNA им.субтилизин Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA + CH3OH, (1) катализируемой субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, была изучена синтазная активность биокатализатора в зависимости от состава органических растворителей, концентрации субстратов в реакционной смеси и химической структуры ацилкомпонента. Общая схема реакции представлена ниже:

H2O Phe-pNA [Z-Ala-Ala-Leu-O-E] Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 + E H2O Z-Ala-Ala-Leu-OH Реакции проводили при эквимолярном соотношении парциальной концентрации амино- и карбоксильного компонентов, а соотношение фермент-субстрат варьировалось от 1:6000 до 1: (здесь, и далее моль/моль). За ходом реакции следили с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ.

Зависимость эффективности синтеза от состава смеси органических растворителей была изучена на примере синтеза модельного тетрапептида (реакция 1) в смесях ДМФ/MeCN с концентрацией ДМФ от 60 до 95%. Наибольшая скорость реакции образования Z-Ala-Ala-Leu-Phe pNA наблюдалась в системе, содержащей 60% ДМФ (рис. 4). Уже через 1 час выход целевого продукта составил 96%. Увеличение концентрации ДМФ приводило к снижению скорости накопления продукта, однако даже в 95% ДМФ синтез продукта не прекращался и через трое суток выход Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA составил 70%.

Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что соотношение ДМФ/MeCN, равное 60:40 об.%, является оптимальным и для активности биокатализатора, и для растворимости исходных соединений.

Рис. 4. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA, катализируемый субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, Выход, % в смесях ДМФ/MeCN с различным содержанием ДМФ. (1 – 60% ДМФ;

2 – 80% ДМФ;

3 – 95% ДМФ), [S] = 200 мМ, S:E = 1: 0 10 20 30 40 50 60 70 Время, ч На рис. 5 представлены результаты изучения зависимости эффективности синтеза модельного тетрапептида (1) от начальной концентрации реагентов в среде 60% ДМФ/40% MeCN (об.%). Видно, что чем выше были концентрации исходных реагентов, тем выше была и скорость образования продукта. Таким образом, для наиболее эффективного проведения синтезов желательно использовать максимально высокие концентрации исходных реагентов (подразумевается, что максимально высокие концентрации ограничены растворимостью субстратов).

Рис. 5. Зависимость выхода Z-Ala Ala-Leu-Phe-pNA от времени реакции, катализируемой субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, выход, % в смеси, содержащей 60% ДМФ и 40% MeCN.

0 10 20 30 t, мин 30 мМ 10 мМ 2 мМ 0.5 мМ 100 мM 200 mM На примере синтеза модельного тетрапептида (реакция 1), катализируемого субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, была изучена необходимость активации карбоксильного компонента. Оказалось, что при введении в реакцию компонента со свободной карбоксильной группой Z-Ala-Ala-Phe-OH синтез в целом протекает менее эффективно, чем при использовании его эфирного аналога (рис. 6).

Для проверки стереоспецифичности ферментативного синтеза, катализируемого субтилизином, иммобилизованным на криоПВСГ, были проведены реакции, аналогичные модельной, с использованием амино- и ацилкомпонентов, содержащих в P1 и P1’-положении остатки D-аминокислот вместо соответствующих L-аминокислот. Даже через 3 суток с п-нитроанилидом D аминокислоты не было отмечено появление продукта реакции, что свидетельствовало о сохранении ферментом стереоселективности.

Рис. 6. Влияние структуры ацилкомпонента на эффективность синтеза Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA, Выход, % катализируемого субтилизином, иммобилизованным не 40 Z-Ala-Ala-Leu-OH 30 криоПВСГ, в смеси, содержащей Z-Ala-Ala-Leu-OMe 20 60% ДМФ и 40% MeCN, [S] = 200 мМ 0 20 40 60 80 t, мин В условиях, подобранных для модельной реакции, с помощью иммобилизованного субтилизина с достаточно высокими выходами был синтезирован ряд ди- и трипептидов (табл. 3).

Реакции проводили при начальной концентрации исходных реагентов 100 мМ и в ряде случаев мМ.

На примере синтезов пептидов 1-4 было изучено влияние длины ацилирующего компонента на скорость образования продукта реакции. Показано, что длина ацилкомпонента даже в условиях высоких концентраций субстрата оказывала заметное влияние на эффективность синтеза. Так, аналитический выход защищенного дипептида Z-Leu-Phe-pNA (2) через 19 ч составил 76%, а защищенного трипептида Z-Ala-Leu-Phe-pNA (4) уже через 0.5 ч – 98%. Известно, что в водной среде более длинные пептидные фрагменты легче конденсируются под действием субтилизина, что хорошо согласуется с представлениями о протяженной зоне связывания этих ферментов. В случае использования субтилизина, иммобилизованного на криогеле ПВС, сохраняются те же закономерности.

Одним из преимуществ ферментативного пептидного синтеза является отсутствие необходимости защиты боковых функциональных групп пептидов, содержащих полифункциональные аминокислоты. В этом случае появляется возможность снизить не только количество стадий, но и избежать опасности рацемизации при каждом шаге блокирования или снятия защиты.

Таблица 3. Выходы пептидов, синтезированных с помощью субтилизина, иммобилизованного на криоПВСГ Карбоксильный Амино- Продукт реакции Время, ч Выход, % компонент компонент Z-Leu-OCH3 Phe-pNA 1 Z-Leu-Phe-pNA 19 Boc-Leu-OCam# Phe-pNA 2 Boc-Leu-Phe-pNA 0.5 Z-Ala-Leu-OCH3 Phe-pNA 3 Z-Ala-Leu-Phe-pNA 2 Z-Ala-Ala-OCH3 Leu-pNA 4 Z-Ala-Ala-Leu-pNA 2 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 Phe-pNA 5 Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA 1 Z-Ala-Ala-D-Leu-OCH3 Phe-pNA 6 Z-Ala-Ala-D-Leu-Phe-pNA 72 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 D-Phe-pNA 7 Z-Ala-Ala-Leu-D-Phe-pNA 72 Z-Ala-Ala-Arg-OH Phe-pNA 8 Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 24 Z-Ala-Ala-Arg-OCH3 Phe-pNA 8 Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 24 Z-Ala-Ala-Arg-OCH3 Glu-pNA 9 Z-Ala-Ala-Arg-Glu-pNA 24 Z-Ala-Ala-Arg-OCH3 Asp-pNA 10 Z-Ala-Ala-Arg-Asp-pNA 24 Z-Thr-Ala-Thr-OCH3 Asp-pNA 11 Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 1 Z-Ala-Ala-Gly-OCH3 Phe-pNA 12 Z-Ala-Ala-Gly-Phe-pNA 2 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 Gly-pNA 13 Z-Ala-Ala-Leu-Gly-pNA 24 Z-Ala-Ala-Gly-OCH3 Gly-pNA 14 Z-Ala-Ala-Gly-Gly-pNA 2 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 Phe-OCH3 15 Z-Ala-Ala-Leu-Phe-OCH3 72 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 Phe-NH2 16 Z-Ala-Ala-Leu-Phe-NH2 24 95## Glp-Phe-OMe Ala-pNA 17 Glp-Phe-Ala-pNA 100## Glp-Phe-OMe Gly-pNA 18 Glp-Phe-Gly-pNA Boc-Ala-Glu-Phe-OСam# Phe-DeD### 19 Boc-Ala-Glu-Phe-Phe-DeD 2 Boc-Ala-Glu-Phe-OСam# Phe-pNA 20 Boc-Ala-Glu-Phe-Phe-pNA 2 Phe-Phe-DeD### Z-Ala-Ala-Glu-OCH3 21 Z-Ala-Ala-Glu-Phe-Phe-DeD 24 # - Cam – карбамоилметил, -CH2-CO-NH ## - реакцию проводили при соотношении ДМФ/MeCN 20:80 об.% ### - DeD – N-[2-(2,4-динитрофениламино)-этил]-амид Условия: 200 мМ амино- и карбоксильный компонент, ДМФ/ MeCN 60:40 об.%, E:S =1: Ранее было показано, что при использовании иммобилизованного субтилизина в органической среде с минимальным содержанием воды можно эффективно синтезировать N-ацилированные тетрапептиды, содержащие Lys и остатки Asp и Glu в P1 и P1’-положениях без защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот. Реакции проводили без активации карбоксильного компонента.

Нами был проведен ряд синтезов тетрапептидов 8-10, содержащих Arg в P1-положении (табл.

3). Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA синтезировали, используя в качестве карбоксильного компонента трипептид Z-Ala-Ala-Arg-OH и его эфирный аналог - Z-Ala-Ala-Arg-OMe. Выход продукта реакции через сутки в первом случае составил 26%, в то время как использование Z-Ala-Ala-Arg-OMe позволило повысить выход целевого пептида до 82%.

Под действием иммобилизованного субтилизина удалось осуществить синтез тетрапептидов и 10, содержащих в P1 и P1’-положении разноименно заряженные аминокислотные остатки Arg, Glu и Asp. Выход продуктов 9 и 10 через сутки составил 87% и 34% соответственно. Возможность протекания такого синтеза можно объяснить спецификой биокаталитической системы. При работе в безводной органической среде, вероятно, отсутствуют условия для ионизации и, как следствие этого, электронейтральные гидрофобные аминокислотные остатки хорошо связываются в активном центре субтилизина.

Были проведены синтезы тетрапептидов 12-14, содержащих Gly в P1 и P1’-положении. Реакции с участием пептидов, содержащих Gly в P1’-положении, протекали быстрее, чем реакции синтеза пептидов, содержащих Gly в P1-положении. Например, выход Z-Ala-Ala-Gly-Phe-pNA (12) за 2 часа составил 56%, а Z-Ala-Ala-Leu-Gly-pNA (13) за это же время – 70%. При попытке синтезировать пептид, содержащий Pro в P1’-положении, с помощью иммобилизованного субтилизина даже через суток после начала реакции не наблюдалось образования продукта ферментативного синтеза.

Было показано, что субтилизин, иммобилизованный на криоПВСГ, способен катализировать конденсацию пептида с амидом аминокислоты с образованием пептида 16, в то время как конденсацию аналогичного пептида с эфиром аминокислоты осуществить не удалось (15).

При проведении синтезов пептидов 19-21 оказалось, что при использовании в качестве аминокомпонентов сильно гидрофобных и стерически объемных Phe-DeD и Phe-Phe-DeD реакция протекает менее эффективно, чем при использовании Phe-pNA (табл. 3).

Таким образом, при помощи субтилизина, иммобилизованного на криогеле ПВС, в смеси ДМФ/MeCN проведен синтез ряда п-нитроанилидов ди-, три- и тетрапептидов, в том числе содержащих основные и кислые аминокислотные остатки без защиты боковых ионогенных групп полифункциональных аминокислот. Установлено, что использование активированных карбоксильных компонентов способствует более быстрому образованию продукта конденсации. Проведенные исследования указывают на то, что субтилизин, иммобилизованный на криогеле ПВС, является эффективным катализатором образования пептидной связи между аминокислотными остатками различной природы, причем стереоселективность синтеза в исследованных условиях сохраняется.

1.2.2. Использование термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ, в пептидном синтезе Исходя из данных о субстратной специфичности термолизина, синтазные свойства этого фермента, иммобилизованного на криоПВСГ, были изучены на примере модельной реакции синтеза хромогенного субстрата сериновых протеиназ Z-Ala-Ala-Leu-pNA в средах полярных органических растворителей ДМФ/MeCN и диметилсульфоксид (ДМСО)/MeCN:

иммобилиз. термолизин Z-Ala-Ala-OH + Leu-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA (2).

Зависимость эффективности образования продукта реакции от количества биокатализатора представлена на рис. 7. На основании полученных данных было установлено, что приемлемым содержанием фермента в реакционной смеси для проведения дальнейших экспериментов является 1. нмоль при соотношение фермент-субстрат 1:9000.

Для выбора необходимой оптимальной концентрации субстратов был проведен ряд синтезов с одинаковым количеством препарата иммобилизованного фермента и различным содержанием исходных реагентов в реакционной смеси. На рис. 8 представлены результаты синтеза через 24 ч.

Видно, что при увеличении концентрации исходных компонентов до 30 мМ скорость синтеза резко возрастает, а, начиная с 40 мМ – практически не изменяется.

Для определения условий наиболее эффективного использования препарата в синтезе пептидов была проведена оптимизация соотношения органических растворителей в реакционной смеси. Для этого была изучена синтазная активность препарата иммобилизованного термолизина в двух типах систем органических растворителей, ДМФ/MeCN и ДМСО/MeCN и изучено влияние количеств ДМФ и ДМСО в реакционной смеси на выход образующегося продукта.

Рис. 7. Зависимость выхода Z-Ala 100 Ala-Leu-pNA от количества термолизина, иммобилизованного выход ZAALpNA, % на криоПВСГ, через 1 ч после начала реакции в смеси, содержащей 25% ДМФ и 75% 40 MeCN, [S] = 40 мМ 0 1 2 3 4 5 6 количество фермента, нмоль Рис. 8. Зависимость выхода Z-Ala Ala-Leu-pNA от концентрации исходных компонентов в смеси выход ZAALpNA,% 25%ДМФ/75%MeCN через 24 ч 0 20 40 60 80 [S], мМ В смесях ДМФ/MeCN и ДМСО/ MeCN, содержащих от 10 до 95% ДМФ и ДМСО, были проведены синтезы пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA (реакция 2) (рис. 9а, б). Показано, что увеличение концентрации ДМФ и ДМСО в реакционной смеси, как и ожидалось, приводило к снижению активности биокатализатора, а наиболее приемлемыми для использования являются смеси, содержащие 10-30% ДМФ и 10-40% ДМСО. Вместе с тем, для достаточно надёжного растворения продукта и исходных веществ в объёме реакционной среды количество диметилформамида должно быть не слишком малым. Поэтому для дальнейших экспериментов было решено использовать смесь, содержащую 20 об.% ДМФ.

Термодинамически контролируемый пептидный синтез, катализируемый термолизином, является процессом, обратным гидролитической реакции, а вода непосредственно участвует в механизме катализа реакций гидролиза. Поэтому для выбора условий наиболее эффективного использования препарата было необходимо определить концентрацию воды в реакционной смеси, при которой достигается наибольшая скорость синтеза, а продукт и исходные вещества полностью растворимы в реакционной среде.

выход Z-Ala-Ala-Leu-pNA, % выход Z-Ala-Ala-Leu-pNA, % 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 содержание ДМФ, об. % содерж. ДМСО, об.% а) б) Рис. 9. Зависимость выхода Z-Ala-Ala-Leu-pNA от содержания ДМФ (а) и ДМСО (б) в реакционной смеси через 1ч после начала реакции Для этого в системах 20%ДМФ/MeCN была изучена зависимость выхода продукта реакции (2) от содержания воды в реакционной смеси (рис. 10). Было показано, что количество воды, соответствующее 10-15 об. %, является необходимым для проявления наибольшей каталитической активности препарата иммобилизованного термолизина.

Рис. 10. Зависимость выхода Z-Ala 100 Ala-Leu-pNA от концентрации воды, выходZAALpNA, % добавленной в реакционную смесь, через 2 и 24 часа (системы 20% 60 ДМФ/H2O/MeCN) 40 2 часа 20 24 часа 0 5 10 15 20 25 содерж. H2O, об.% При помощи термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ, в выявленных оптимальных условиях был получен ряд пептидов с общей формулой Z-Ala-Ala-Xaa-pNA, где Xaa = Ile, Phe, Val, Ala (22-25). Специфичность термолизина в реакциях гидролиза такова, что фермент преимущественно расщепляет пептидные связи перед остатками Leu, Ile, Phe или Val. Данные, приведенные в табл. 4, свидетельствуют о том, что иммобилизованный термолизин наиболее эффективно катализирует образование пептидной связи в органической среде именно с теми остатками (Leu, Ile, Phe и Val), которые соответствуют его субстратной специфичности в реакциях гидролиза. Следует отметить, что термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ, практически не катализировал синтез пептидов, содержащих дикарбоновые аминокислоты, а также остатки Gly и Pro в P1- положении.

На основании полученных данных можно выдвинуть предположение, что термолизин, иммобилизованный на криоПВСГ, преимущественно сохраняет первичную субстратную специфичность в реакциях ферментативного синтеза в органической среде.

Ввиду отсутствия у термолизина эстеразной активности, стало возможным осуществить конденсацию N-защищенного дипептида с эфирами и амидом аминокислоты (табл. 4, 26-28), причем в случае использования Leu-NH2 в качестве аминокомпонента, реакция протекала наиболее эффективно.

Таблица 4. Пептиды, синтезированные с помощью термолизина, иммобилизованного на криоПВСГ Карбоксильный Амино- Продукт реакции Время, ч Выход, % компонент компонент Z-Ala-Ala-OH Leu-pNA 4 Z-Ala-Ala-Leu-pNA 24 Z-Ala-Ala-OH Phe-pNA 22 Z-Ala-Ala-Phe-pNA 24 Z-Ala-Ala-OH Val-pNA 23 Z-Ala-Ala-Val-pNA 24 Z-Ala-Ala-OH Ile-pNA 24 Z-Ala-Ala-Ile-pNA 24 Z-Ala-Ala-OH Ala-pNA 25 Z-Ala-Ala-Ala-pNA 24 Z-Ala-Ala-OH Leu-OCH3 26 Z-Ala-Ala-Leu-OCH3 24 Z-Asp-OH Phe-OCH3 27 Z-Asp-Phe-OCH3 48 49* Z-Ala-Ala-OH Leu-NH2 28 Z-Ala-Ala-Leu-NH2 24 Z-Ala-Ala-OH Pro-pNA 29 Z-Ala-Ala-Pro-pNA 72 Z-Ala-Ala-OH Gly-pNA 30 Z-Ala-Ala-Gly-pNA 72 Z-Ala-Ala-OH Asp-pNA 31 Z-Ala-Ala-Asp-pNA 72 Z-Ala-Ala-OH Glu-pNA 32 Z-Ala-Ala-Glu-pNA 72 * - Реакцию проводили в трет-бутаноле, содержащем 5% H2O.

Условия реакций: 20% ДМФ/10%H2O/MeCN (об.%), [S] = 40-90 мМ, +20°С.

1.2.3. Изучение эффективности повторного использования протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ, в пептидном синтезе Синтазная эффективность термолизина, иммобилизованного на крио ПВСГ, была изучена в последовательных циклах синтеза модельного пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA под действием одного и того же образца биокатализатора без его промежуточной реактивации (рис. 11а). Было показано, что наибольшую каталитическую активность, определяемую по выходу Z-Ala-Ala-Leu-pNA, препарат проявлял в течение первых 2 циклов (выходы за 2 часа достигали 87 и 85% соответственно). Затем выходы снижались и в дальнейшем практически не изменялись, оставаясь достаточно высокими даже после шестикратного применения биокатализатора (72% за 2 часа).

Для изучения каталитических свойств иммобилизованного химотрипсина при его повторном применении в среде 20%ДМФ/MeCN были проведены последовательные циклы синтеза хромогенного пептидного субстрата цистеиновых протеиназ - Glp-Phe-Ala-pNA (реакция 3) с одним и тем же образцом иммобилизованного биокатализатора без его промежуточной регидратации (рис.

11б):

Glp-Phe-OMe + Ala-pNA имм. н Glp-Phe-Ala-pNA + MeOH (3), химотрипси где Glp – остаток пироглутаминовой кислоты.

100 80 выход GlpFApNA, % выход ZAALpNA,% 60 40 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 номер цикла номер цикла б) а) Рис. 11. Выход пептидов Z-Ala-Ala-Leu-pNA в смеси 20% ДМФ/10%H2O/MeCN (а) и Glp-Phe Ala-pNA в 20% ДМФ/MeCN (б) в последовательных циклах синтеза, катализируемого одним и тем же образцом иммобилизованного термолизина (а) и химотрипсина (б), без промежуточной регидратации биокатализатора между циклами.

Иммобилизованный химотрипсин, так же как и иммобилизованный термолизин, эффективно катализировал реакцию пептидной конденсации даже после 6-кратного использования.

1.2.4. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов под действием протеиназ, иммобилизованныхна криоПВСГ, в органической среде Возможности изученной биокаталитической системы были продемонстрированы на примере препаративных синтезов ряда хромогенных (п-нитроанилидных, -pNA) пептидных субстратов сериновых и цистеиновых протеиназ (табл. 5). Иммобилизованные ферменты использовали на заключительной стадии синтеза субстратов, согласно общей схеме:

Z-(Glp-)A + B-pNA Z-(Glp-)A-B-pNA, где А – Ala-Ala-OH, Ala-Ala-OMe, Phe-OMe, Thr-Ala-Thr-OMe;

B – Leu, Ala, Asp.

С использованием именно этого подхода впервые в препаративных количествах был получен чувствительный и специфичный флуорогенный субстрат папаина - Glp-Phe-Ala-AMC, в состав которого входит остаток 4-амино-7-метилкумарина (флуорогенная группа).

Таблица 5. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов под действием протеиназ, иммобилизованных на криоПВСГ Субстрат Выход*, Иммобилизованный на Определяемый % криоПВСГ фермент фермент Z-Ala-Ala-Leu-pNA 100(74) Субтилизин Субтилизин 99(71) Термолизин Субтилизин Glp-Phe-Ala-pNA 95 Субтилизин Папаин 88 Химотрипсин Папаин Glp-Phe-Ala-AMC 100(46) Химотрипсин Папаин Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 75 Субтилизин Каспазоподобная протеиназа * - В скобках приведен препаративный выход пептида.

Реакции проводили с эквимолярными количествами исходных реагентов и соотношении фермент-субстрат 1:104. Использование ферментов на стадии конденсации обеспечивало получение продуктов с высокими выходами, гарантировало их оптическую чистоту, облегчало выделение и очистку целевых пептидов. Все продукты охарактеризованы данными ВЭЖХ и аминокислотного анализа, а некоторые субстраты – масс-спектрометрически.

ВЫВОДЫ 1. Получены и охарактеризованы препараты трипсина, термолизина, химотрипсина и субтилизина, иммобилизованных на криогеле ПВС.

2. Показана возможность использования полученных препаратов в качестве эффективных катализаторов синтеза пептидов в органической среде. Изучена каталитическая эффективность иммобилизованных субтилизина и термолизина в пептидном синтезе в зависимости от состава реакционной смеси, концентрации исходных реагентов и количества биокатализатора. С использованием иммобилизованных протеиназ с высокими выходами получены ди-, три- и тетрапептиды разного строения.

3. На основании исследования биокаталитических свойств иммобилизованных ферментов установлено, что в органической среде для иммобилизованного субтилизина наблюдается «расширение» субстратной специфичности, в то время как иммобилизованный термолизин сохраняет свою субстратную специфичность.

4. Показана возможность многократного использования одного и того же образца иммобилизованных термолизина и химотрипсина в синтезах различных пептидов в органической среде без регидратации биокатализаторов в течение, по крайней мере, 6 циклов.

5. Разработана схема синтеза хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ в препаративных количествах под действием иммобилизованных ферментов.

Основное содержание работы

изложено в следующих публикациях:

1. А.В. Бачева, О.В. Байбак, А.В. Беляева, Е.Н. Лысогорская, Е.С. Оксенойт, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Нативный и модифицированный субтилизин 72 как катализатор пептидного синтеза в средах с низким содержанием воды. – Биоорг. химия. Т.29. N 5. 2003. С.551-558.

2. А.В. Бачева, О.В. Байбак, А.В. Беляева, Е.С. Оксенойт, Т.И. Величко, Е.Н. Лысогорская, А.К.

Гладилин, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Активность и стабильность нативного и модифицированного субтилизинов. – Биохимия, Т.68. N 11. 2003. С.1567-1574.

3. A.V. Belyaeva, E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.I. Lozinsky and I.Yu. Filippova Optimization of synthesis of various peptides catalyzed by immobilized subtilisin 72. – Proc. of the 28 European Peptide Symposium (Flegel, Fridkin, Gilon and Slaninova) Kenes International, Tel-Aviv, Israel, 2005, pp. 315-316.

4. A.V. Bacheva, A.V. Belyaeva, E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.I. Lozinsky and I.Yu. Filippova.

Biocatalytic properties of native and immobilized subtilisin 72 in aqueous-organic and low water media. – J. Mol. Cat. B: Enzymatic.V.32. 2005. P.253-260.

5. А.В. Беляева, А.В. Бачева, Е.С. Оксенойт, Е.Н. Лысогорская, В.И. Лозинский, И.Ю.

Филиппова. Синтез пептидов в органической среде при использовании субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС. Биоорг. химия, Т.31, N6, 2005. С.586-592.

6. А.В. Бачева, О.В. Байбак, А.В. Беляева, Е.Н. Лысогорская, Е.С. Оксенойт, В.И. Лозинский, И.Ю. Филиппова. Синтез пептидов в органической среде, катализируемый субтилизином, иммобилизованным на криогеле ПВС. V симпозиум «Химия протеолитических ферментов».

Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, ИБХ РАН. 2002. С.113.

7. A.V. Bacheva, A.V. Belyaeva, S.V. Krylov, O.V. Baibak, E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.I.

Losinsky, I.Yu. Filippova. Subtilisin covalently immobilized on PVA-cryogel: characteristics and biocatalytic properties. Abstracts of International Conference “Biocatalysis-2002: Fundamentals and Application”. Moscow, 2002. P.68.

8. А.В. Беляева, А.В. Бачева. Каталитические свойства субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС. - Международная конференция молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». Тверь, 2002 г. С.8.

9. А.В. Беляева, О.М. Аникина. Кинетические характеристики субтилизина 72, иммобилизованного на криогеле ПВС. - Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов», секция «Химия», Москва, МГУ, 2003 г. С.102.

10. И.Ю. Филиппова, Е.Н. Лысогорская, А.В. Бачева, А.В. Беляева, Е.С. Оксенойт, Т. В.

Рослякова, В.И. Лозинский. Синтез пептидов, катализируемый протеиназами, иммобилизованными на криогеле ПВС. - Тезисы докладов I Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва, 2003. С.5.

11. A.V. Belyaeva, E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, V.I. Lozinsky, and I.Yu. Filippova. Optimization of synthesis of various peptides catalyzed by immobilized subtilisin 72. –Abstracts of 3rd International and 28th European Peptide Symposium. 2004. P.76.

12. А.В. Беляева, Е.С. Оксенойт, Е.Н. Лысогорская, О.М. Аникина, В.И. Лозинский, И.Ю.

Филиппова. Синтез пептидов, содержащих полифункциональные аминокислоты. Тезисы докладов II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 2005.

С.18.

13. A.V. Belyaeva, T.V. Roslyakova, E.S. Oksenoit, E.N. Lysogorskaya, V.I. Lozinsky, and I.Yu.

Filippova. Novel biocatalysts based on proteases immobilized on macroporous poly(vinyl alcohol) cryogel. 3rd Moscow International Congress “Biotechnology: state of the art and prospects of development”. Moscow, 2005. Congress proceedings, part 2. P. 182.

14. O.M. Anikina, A.V. Belyaeva, E.N. Lysogorskaya, and I.Yu. Filippova. Modified subtilisin Carlsberg is effective catalyst for peptide synthesis in organic mixtures. Abstracts of International Conference “Biocatalysis-2005: Fundamentals and Application”, St.Petersburg-Kizhiy-Valaame, 2005. P.62.

15. A.V. Belyaeva, T.A. Semashko, E.N. Lysogorskaya, V.I. Lozinsky, and I.Yu. Filippova. Enzymatic synthesis of high specific substrate for cysteine proteases assay. Abstracts of 29th European Peptide Symposium. Gdansk, 2006. P.163.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.