Интеграза вич-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами

На правах рукописи

Приказчикова Татьяна Александровна ИНТЕГРАЗА ВИЧ-1: ИНГИБИРОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ 02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук Готтих Марина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук Михайлов Сергей Николаевич доктор химических наук Ефимов Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 27 февраля 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им.

М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 27 января 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук /Смирнова И.Г./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения, на начало года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года.

Используемая в настоящее время терапия включает комплексное применение препаратов, направленных на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Она позволяет продлить время жизни больных СПИДом на срок до 8 лет. Необходимость использования комплекса препаратов обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых форм вируса, а также токсичностью этих препаратов и их восприимчивостью организмом инфицированного человека. В связи с этим постоянно ведется активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла и способных дополнить существующую противовирусную терапию.

Большое внимание уделяется созданию эффективных ингибиторов стадии интеграции ДНК-копии вирусного генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграза. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, неспособную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток. Таким образом, интеграция является одной из ключевых стадий вирусного цикла и ее ингибирование, несомненно, должно приводить к подавлению репликации ВИЧ. Однако, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения – ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магния, связанным в активном центре фермента. Уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.

Цель работы состояла в дизайне и синтезе эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов, изучении механизма их взаимодействия с ферментом, а также в поиске эффективного носителя для доставки олигонуклеотидного ингибитора в клетки.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином или олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: 3’ процессинг и перенос цепи. Установлено, что действие этих ингибиторы направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Впервые, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2’-О-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой. Впервые установлен участок фермента, с которым взаимодействуют олигонуклеотидные конъюгаты. Показано, что он локализован в C-концевом домене фермента.

Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ- свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Подобраны носители пептидной природы, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидного ингибитора в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен в Бельгии показано, что конъюгаты 2’-О-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках, причем эффективность ингибирования репликации коррелирует с эффективностью проникновения ингибитора в клетку.

Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях: III съезде Российского Биохимического Общества (С.-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г.), международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: “Биология – наука XXI века” (Пущино, 7-21 мая 2004 г.), международной конференции “Chemical & Biological Problems of Proteomics” (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), международном совещании “Targeting replication and integration of HIV” (Франкфурт, Германия, 20-24 марта 2005 г.), 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference (Будапешт, Венгрия, 2-7 июля 2005 г.), International Symposium “Advances in Science for Drug Discovery” (Москва – С.-Петербург, 11-16 июля 2005 г.), 3-ей международной научно-практической школе-конференции Медбиотек (Москва, 4-5 декабря 2006 г.), международном совещании “Targeting replication and integration of HIV” (Барселона, Испания, 11 12 декабря 2006 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 49 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 161 цитированную работу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Одной из причин отсутствия прогресса в области поиска ингибиторов интегразы ВИЧ- является то, что многие соединения, ингибирующие каталитическую активность изолированного фермента, оказываются неэффективными в ВИЧ-инфицированных клетках и тем более in vivo, где интеграза действует в составе сложного прединтеграционного комплекса, в котором она связана с вирусной ДНК и рядом вирусных и клеточных белков. В этой связи, соединения, способные подавлять каталитическую активность комплекса интегразы с вирусной ДНК, рассматриваются как наиболее перспективные препараты. На момент начала настоящей работы, практически единственными ингибиторами интегразы ВИЧ-1, способными действовать на ее комплекс с ДНК и вызывать его быстрое разрушение, были конъюгаты коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с акридином [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735 8743]. Причем было показано, что способность этих соединений нарушать ДНК-связывающую функцию интегразы обусловлена взаимосвязанным действием обоих составляющих конъюгата.

Немодифицированные 11-звенные олигонуклеотиды и свободный акридин не вызывали диссоциацию комплекса интегразы с ДНК и ингибировали ее каталитическую активность при значительно более высоких концентрациях, чем их конъюгаты [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743]. Было высказано предположение, что отрицательно заряженный олигонуклеотид взаимодействует с интегразой за счет образования электростатических контактов, в то время как акридин формирует гидрофобные контакты, которые способствуют фиксации ингибитора на поверхности фермента и вызывают конформационные изменения в структуре интегразы, которые и приводят к нарушению связывания ДНК и к диссоциации фермент-субстратного комплекса. В настоящей работе мы продолжили изучение механизма действия конъюгатов олигонуклеотидов, а также постарались увеличить их ингибирующую активность. В первую очередь, было необходимо заменить молекулу акридина на другой остаток, который, с одной стороны, был бы существенно менее токсичен, а с другой, увеличивал бы ингибирующее действие конъюгата. Кроме того, следовало повысить устойчивость олигонуклеотидной части конъюгата к нуклеазному гидролизу для того, чтобы иметь возможность исследовать активность конъюгатов в экспериментах на ВИЧ-инфицированных культурах клеток.

1. ОПТИМИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ИНГИБИТОРА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ- 1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ- Прежде всего, мы заменили акридин на остаток другой молекулы, которая была бы менее токсична для клетки, и введение которой в состав конъюгата с олигонуклеотидом сохраняло или усиливало бы его способность разрушать комплекс интегразы с ДНК. Для того чтобы найти подходящую молекулу, были синтезированы конъюгаты 11-звенного олигодезоксинуклеотида с рядом органических молекул. Для синтеза конъюгатов был выбран олигодезоксинуклеотид следующего состава: G G T T T T T G T G T (11-D), т. к. его конъюгат с акридином обладал наибольшей ингибирующей активностью по сравнению с конъюгатами олигонуклеотидов других последовательностей [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743].

Предполагается, что акридин в составе конъюгата образует с интегразой гидрофобные контакты, поэтому для получения конъюгатов мы выбрали такие гидрофобные соединения различной природы, как флуоресцеин (Fl), эозин (E), тетраметилродамин (R), холестерин (Chol), тиохром (Th) и олеиновую кислоту (Ol) (рис. 1). Молекулы флуоресцеина, эозина и тетраметилродамина, как и молекула акридина, содержат в своей структуре конденсированную ароматическую систему. Однако в отличие от молекулы акридина эти молекулы не обладают интеркалирующими свойствами, что снижает их токсичность. Холестерин, тиохром (продукт окисления тиамина – витамина B1) и олеиновая кислота являются участниками клеточных процессов и заведомо нетоксичны при микромолярных концентрациях. Молекула тиохрома представляет собой гетероароматическую систему. В свою очередь, холестерин и олеиновая кислота являются структурно совершенно отличными от молекулы акридина. Использование для синтеза конъюгатов с олигонуклеотидом структурно различных молекул, помимо расширения области поиска подходящей замены для акридина, позволило бы нам получить информацию о важности тех или иных элементов структуры молекулы для эффективного ингибирования интегразы.

S S S HN C HN C HN C HN COOH COOH Br COOH Br OCH H3C CH N+ N O HO O O H3C Cl HO CH N Br Br O O акридин (Acr) флуоресцеин (Fl) эозин (E) тетраметилродамин (R) H3C CH CH CH H3C CH N N O O H3C H3C N N S O O холестерин (Chol) тиохром (Th) олеиновая кислота (Ol) Рис. 1. Структуры радикалов органических молекул, введенных в состав конъюгатов с олигонуклеотидом 11-D.

В процессе встраивания вирусной ДНК в клеточную интеграза катализирует две реакции:

3’-концевого процессинга и переноса цепи. Обе эти реакции можно моделировать in vitro, используя рекомбинантную интегразу и, в качестве ее субстрата, ДНК-дуплексы, последовательности которых имитируют U3 или U5 фрагменты вирусной кДНК. Изучение ингибирующей активности синтезированных конъюгатов проводили на примере реакции 3’ концевого процессинга. В качестве субстрата интегразы использовали дуплекс U5B/A, имитирующий концевой участок U5 последовательности вирусной ДНК. Мерой эффективности ингибирующего действия конъюгата считали значение IC50, соответствующее концентрации ингибитора, при которой эффективность реакции снижалась на 50%, относительно эффективности реакции в отсутствие ингибитора. Значение IC50 для каждого конъюгата было определено по результатам трех экспериментов, ошибка измерения составляла не более 15%.

Изучение ингибирующей активности конъюгатов проводили в двух различных условиях:

конкурентного ингибирования, когда ингибитор и субстрат добавляли к ферменту одновременно, и в условиях пресформированного фермент-субстратного комплекса, когда ингибитор добавляли к комплексу интегразы с ДНК-субстратом.

Результаты исследований представлены в таблице 1. Видно, что присоединение к олигонуклеотиду 11-D любой из выбранных молекул приводит к усилению его ингибирующей активности. Высокую ингибирующую активность, превосходящую активность акридинового, проявляют конъюгаты олигонуклеотида с молекулами, обладающими структурным сходством с молекулой акридина: флуоресцеином (IC50 = 0.3 мкМ), тетраметилродамином (IC50 = 0.31 мкМ) и эозином (IC50 = 0.05 мкМ). Причем, среди этих конъюгатов наиболее активным ингибитором является конъюгат с эозином, наиболее гидрофобной молекулой. Его большая активность вполне согласуется с высказанным предположением о роли гидрофобных контактов, образуемых ненуклеотидной частью, в механизме ингибирования интегразы олигонуклеотидными конъюгатами. Вместе с тем, конъюгат с высоко гидрофобным холестерином проявлял относительно невысокую ингибирующую активность (IC50 = 2.0 мкМ), сравнимую с активностью акридинового конъюгата. Вероятно, объемному и достаточно жесткому по структуре остатку холестерина сложно занять то положение в гидрофобном участке интегразы, которое позволило бы образовать нужные гидрофобные контакты. В то же время, молекула олеиновой кислоты, сильно отличающаяся по структуре от остальных молекул, также Таблица 1. Ингибирование каталитической активности интегразы ВИЧ-1 в реакции 3’-концевого процессинга конъюгатами олигонуклеотида 11-D с различными молекулами (100нМ интеграза, 2.5 нМ U5B/A, буфер: 20 мМ Hepes pH 7.2, 7.5 мМ MgСl2, 1 мМ ДТТ) IC50, мкМ Условия Условия Конъюгат ингибирования конкурентного пресформированного ингибирования комплекса 11-D 25.0* 50.0* 11-D-Acr 2.5* 4.0* 11-D-Fl 0.30 ± 0.03 0.28 ± 0. 11-D-E 0.050 ± 0.006 0.055 ± 0. 11-D-R 0.31 ± 0.03 0.34 ± 0. 11-D-Chol 2.0 ± 0.1 2.2 ± 0. Thr-11-D 3.8 ± 0.3 2.9 ± 0. 11-D-Ol 0.10 ± 0.02 0.09 ± 0. * - данные работы [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743].

достаточно большая по размерам, обеспечивает конъюгату высокую ингибирующую активность (IC50 = 0.1 мкМ). В отличие от холестерина, олеиновая кислота обладает значительной гибкостью, и, вероятно, за счет нее способна образовать необходимые контакты.

Важно отметить, что все конъюгаты были способны подавлять активность интегразы и в составе пресформированного комплекса. Это указывало на то, что они сохраняют способность разрушать фермент-субстратный комплекс.

1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ- 1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата Уменьшение длины олигонуклеотида может повысить специфичность действия его конъюгатов, поскольку снижается вероятность неспецифических взаимодействий олигонуклеотида с различными ДНК-связывающими белками и клеточными нуклеиновыми кислотами. В связи с этим мы проверили, возможно ли уменьшить длину олигонуклеотидной части конъюгата без значительной потери в его активности. С этой целью мы протестировали способность конъюгатов флуоресцеина с 9-, 7- и 5-звенными олигонуклеотидами, представляющими собой укороченную с 3’-конца на соответствующее число 10, 8, 11-D, звеньев последовательность 8, ингибировать интегразу в реакции 3’ 6, IC50, мкМ процессинга.

6, Результаты исследования, 4, представленные на рисунке 2, 2, 2, свидетельствуют о том, что уменьшение 0, олигонуклеотида 11-D всего на два 0, звена приводит к снижению 11 9 7 число нуклеотидных звеньев ингибирующей активности конъюгата в составе олигонуклеотида практически на один порядок.

По этой причине, использование Рис. 2. Влияние длины олигодезоксирибонуклеотидной более коротких олигонуклеотидов, чем части флуоресцеин-содержащих конъюгатов на 11-ти звенный для создания ингибитора ингибирование интегразы ВИЧ-1 в реакции 3’-концевого процессинга (100 нМ интеграза, 2.5 нМ U5B/A, буфер: 20 интегразы ВИЧ-1 мы считаем мМ Hepes pH 7.2, 7.5 мМ MgСl2, 1 мМ ДТТ).

нецелесообразным.

1.2.2. Влияния модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его конъюгатов Для того чтобы иметь возможность исследовать активность конъюгатов в экспериментах на ВИЧ-инфицированных культурах клеток, следовало повысить устойчивость олигонуклеотидной части конъюгата к нуклеазному гидролизу. Известно, что модификация углеводо-фосфатного остова олигонуклеотидов позволяет повысить их стабильность и продлить время их биологической активности в клетке [Stein C. A. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 3209 3231;

Gryaznov S. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 1508-1514;

Iribarren A.M. et al. (1990) Proc.

Natl. Acad. Sci Usa. 87, 7747-7751]. Для того чтобы выбрать модификацию углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида, оптимальную с точки зрения активности создаваемого на его основе конъюгата и доступности его синтеза, мы синтезировали конъюгаты флуоресцеина с аналогами олигонуклеотида 11-D, содержащими тиофосфатные (11-PS), N3’P5’ фосфамидные (11-NP) и N3’P5’ тиофосфамидные (11-NPS) межнуклеотидные группы, 2’-О-метил-нуклеозиды (11 OM) или (1--D-2’-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидин вместо природного тимидина (11-Tx) (рис. 3) и протестировали их ингибирующую активность в реакции 3’-процессинга.

А Б В Г Д O B O O B B O B O O O O O T O O O OCH O NH NH O P O O P O O P S- O P S O P O O O O O O B B B B B O O O O O O O O O O OCH Рис. 3. Модификации углеводо-фосфатного остова, использованные для повышения устойчивости олигонуклеотидного ингибитора к нуклеазному гидролизу. А – тиофосфатная, Б – N3’P5’ фосфамидная, В – N3’P5’ тиофосфамидная межнуклеотидные связи, Г – 2’-O-метил-олигонуклеотид, Д – олигонуклеотид с (1--D-2’-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидином вместо природного тимидина.

Оказалось, что конъюгаты 2’-O-метил-олигонуклеотида 11-OM и олигонуклеотида 11-NP с N3’P5’ фосфамидными межнуклеотидными группами проявляют такую же ингибирующую активность, как и конъюгат немодифицированного олигонуклеотида 11-D (табл. 2). Введение в 11-Tx состав конъюгата с флуоресцеином олигонуклеотида с (1--D-2’-дезокси-трео пентафуранозил)тимидинами снижало его ингибирующую активность, а тиофосфатного 11-PS или тиофосфамидного 11-NPS олигонуклеотидов значительно повышало ее.

Таблица 2. Ингибирование каталитической активности интегразы ВИЧ-1 в реакции 3’-концевого процессинга конъюгатами модифицированных по углеводо-фосфатному остову олигонуклеотидов с флуоресцеином (100нМ интеграза, 2.5 нМ U5B/A, буфер: 20 мМ Hepes pH 7.2, 7.5 мМ MgСl2, 1 мМ ДТТ) Олигонуклеотид 11-D 11-PS 11-NP 11-NPS 11-OM 11-Tx IC50, мкМ 0.30±0.02 0.020±0.001 0.30±0.02 0.030±0.003 0.32±0.03 2.0±0. Следует отметить, что введение в 2’-положение метокси группы или замена атома кислорода в 3’-положении на аминогруппу приводят к изменению конформации углеводного фрагмента. Показано, что в структуре 2’-O-метилированных и N3’P5’ фосфамидных олигонуклеотидов он находится в N конформации, свойственной РНК [Lubini P. et al (1994) Chem. Biol. 1 (1) 39-45;

Venkateswarlu D. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27 (10), 2189-2195;

Ding D. et al. (1998) Biochemistry. 37 (35), 12082-12093]. Однако это не повлияло на взаимодействие конъюгатов олигонуклеотидов 11-OM и 11-NP с интегразой, являющейся ДНК-связывающим ферментом. Ранее было показано, что нуклеотидная последовательность конъюгата также не оказывает значительного эффекта на его ингибирующее действие [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743]. Все эти данные хорошо согласуются с высказанной гипотезой о механизме действия конъюгатов, в соответствии с которой основная роль олигонуклеотида заключается в образование электростатических контактов с интегразой. Именно поэтому его тонкая структура (конформация сахара, нуклеотидная последовательность) существенно не влияет на ингибирующую способность олигонуклеотидного конъюгата. Эта гипотеза подтверждается также и тем, что уменьшение длины олигонуклеотида приводит к значительному уменьшению ингибирующей активности конъюгата, очевидно, в результате сокращения числа образуемых им электростатических контактов. Снижение ингибирующей активности конъюгата, содержащего (1--D-2’-дезокси-трео-пентафуранозил)тимидины, можно объяснить значительным изменением расположения фосфатных групп в этом олигонуклеотиде, вызванным инверсией атома кислорода в 3’-положении пентозы.

Более высокая ингибирующая активность конъюгатов тиофосфатного и тиофосфамидного олигонуклеотидов, вероятно, связана с возможностью образования ими дополнительных гидрофобных контактов за счет атомов серы.

Учитывая высокую склонность тиофосфатных олигонуклеотидов к неспецифическому связыванию со многими клеточными белками [Gao W.Y. et al. (1992) Mol. Pharmacol. 41, 223 229], для дальнейших исследований мы выбрали 2’-O-метил-олигонуклеотид 11-OM, активность флуоресцеинового конъюгата которого была сравнима с активностью конъюгата немодифицированного олигонуклеотида.

1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК связывающих ферментов Одной из основных проблем, с которой часто сталкиваются исследователи при разработке ингибиторов ВИЧ, является низкая специфичность их действия, приводящая к высокой токсичности соединений. Для того чтобы оценить возможное неспецифическое действие олигонуклеотидных конъюгатов, мы проверили, способны ли они влиять на каталитическую активность других ДНК-связывающих ферментов. В качестве таких ферментов мы выбрали:

фрагмент Кленова, как модель ДНК-полимеразы – фермента, чрезвычайно важного для функционирования клетки;

эндонуклеазу рестрикции – фермент, осуществляющий, как и интеграза, сиквенс-специфическое расщепление ДНК, а также обратную транскриптазу ВИЧ-1.

Оказалось, что ни один из выбранных конъюгатов не подавляет каталитической активности фрагмента Кленова и эндонуклеазы рестрикции во всем диапазоне концентраций, в котором проводилось тестирование (табл. 3).

Таблица 3. Ингибирование каталитической активности ДНК-связывающих ферментов олигонуклеотидными конъюгатами IC50, мкМ Обратная Эндонуклеаза Конъюгат Интеграза Фрагмент транскриптаза рестрикции ВИЧ-1 Кленова ВИЧ-1 Msp 9RI 11-D-Fl 0.30 ± 0.02 30.0 10.0 50. 11-D-E 0.050 ± 0.006 2.9 10.0 50. 11-D-Chol 2.0 ± 0.1 24.0 10.0 50. 11-NPS-Fl 0.03±0.003 8.8 10.0 50. 11-OM-Fl 0.32 ± 0.02 25.0 10.0 50. В случае обратной транскриптазы ВИЧ-1 конъюгаты подавляли ее каталитическую активность, но при концентрациях, значительно более высоких, чем в случае интегразы ВИЧ-1.

*** Проведенные исследования позволили выбрать оптимальную структуру олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1: конъюгаты 11-звенного 2’-О-метил олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой. Мы синтезировали данные конъюгаты и протестировали их ингибирующую активность как в реакции 3’-концевого процессинга, так и переноса цепи. Значение IC50 для конъюгата с эозином 11-OM-E составляло 50 нМ в реакции 3’ процессинга и 60 нМ в реакции переноса цепи, с олеиновой кислотой 11-OM-Ol – 90 нМ и нМ, соответственно. Кроме того, мы проверили действие данных конъюгатов на активность интегразы другого ретровируса, пенящего вируса человека (ПВЧ). Оба конъюгата ингибировали интегразу ПВЧ, но их активность по отношению к этой интегразе была в 5-6 раз ниже, чем к интегразе ВИЧ. Этот результат позволяет надеяться, что предлагаемые нами ингибиторы не будут оказывать значительного влияния на активность других представителей семейства полинуклеотидилтрансфераз, к которому относится интеграза, таких как, например, V(D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме.

2. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКА СВЯЗЫВАНИЯ ИНГИБИТОРА 2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на комплекс интегразы ВИЧ- с ДНК Напомним, что конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с акридином ингибировали интегразу ВИЧ-1, разрушая ее комплекс с ДНК. Для того чтобы убедиться в том, что синтезированные нами конъюгаты сохранили эту способность, мы воспользовались методом ”торможения” в геле.

Интегразу инкубировали с радиоактивно-меченным ДНК-субстратом в течение 30 мин при температуре 20 C. Показано, что в данных условиях интеграза формирует фермент-субстратный комплекс, но не осуществляет каталитический акт [Pinskaya M. et al. (2004) Biochemistry. 43, 8735-8743]. Затем к комплексу добавляли различные концентрации олигонуклеотидного ингибитора 11-OM-E, инкубировали смесь 5 мин при 37 C и анализировали ее в полиакриламидном геле, несодержащем денатурирующих агентов. В этих условиях ДНК белковый комплекс и свободная ДНК, в силу своих разных масс и зарядов, мигрируют в геле с различной скоростью, что приводит к их разделению.

В отсутствие олигонуклеотидного Концентрация ингибитора весь радиоактивно конъюгата, мкМ меченный субстрат связан с интегразой 0 0.01 0.05 0.1 1. (рис. 4). Добавление возрастающих Интеграза - + + + + + концентраций конъюгата 11-OM-E (от Комплекс ИН 10 нМ до 1 мкМ) приводит к с субстратом уменьшению количества субстрата, связанного в комплекс, и к возрастанию количества свободной ДНК-субстрат ДНК. При концентрации конъюгата нМ происходит 50%-ое уменьшение Рис. 4. Изучение влияния конъюгата 11-OM-E на устойчивость комплекса интегразы с ДНК-cубстратом количества фермент-субстратного методом “торможения” в геле. Электрофореграмма комплекса, что согласуется со комплекса 32P-меченого ДНК-субстрата и интегразы ВИЧ-1, инкубированного с различными концентрациями значением IC50 данного конъюгата.

ингибитора. (8%-ный ПААГ без мочевины, буфер для Аналогичный эксперимент был электрофореза: 20 мМ Трис-ацетат, pH 7.2, 7.5 мМ MgCl2).

проведен для конъюгата 11-OM-Ol.

Для него 50%-ое уменьшение количества комплекса интегразы с ДНК-субстратом наблюдалось при концентрации 100 нМ, которая соответствует значению IC50 данного конъюгата.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирующая активность конъюгатов 2’ O-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой связана с их способностью вызывать диссоциацию комплекса интегразы с ДНК-субстратом.

2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1. Определение участка связывания ингибитора Для того чтобы понять механизм ингибирующего действия конъюгатов, мы решили, в первую очередь, идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует олигонуклеотидный ингибитор, путем его присоединения к интегразе, последующего протеолитического гидролиза ковалентно связанного комплекса, выделения конъюгата ингибитора с пептидом и определения его массы с помощью масс-спектрометрии.

Отрицательно заряженная олигонуклеотидная часть ингибитора, очевидно, взаимодействует с интегразой за счет образования, главным образом, электростатических контактов с положительно заряженными остатками Lys и Arg. Известно, что первичная структура интегразы содержит большое число остатков лизина – 26 из 288 аминокислот. В связи с этим, вероятность успешного присоединения ингибитора к лизину в составе интегразы была достаточно высока. Для осуществления присоединения олигонуклеотидного ингибитора к остатку лизина в качестве реакционноспособной группировки, вводимой в структуру олигонуклеотида, хорошо подходит альдегидная группа.

Были синтезированы олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие 2,3 дигидроксипропильную группировку, которая окисляется периодатом натрия до альдегидной группы в мягких условиях, не затрагивающих других функциональных групп ДНК. Поскольку мы не обладали какой-либо информацией о том, с каким из нуклеотидов может быть сближен остаток лизина, то мы выбрали два положения в структуре олигонуклеотидного ингибитора, в которые были введены модифицированные звенья. В структуре олигонуклеотида T1 нуклеотид с 2,3-дигидроксипропильной группировкой располагался вблизи 5’-конца, а в случае олигонуклеотида T2 – вблизи его 3’-конца и гидрофобной молекулы, входящей в состав конъюгата. В качестве ненуклеотидной компоненты конъюгата была выбрана молекула флуоресцеина в связи с доступностью реагента, простотой синтеза конъюгата и его достаточно высокой ингибирующей активностью. 5' U O O * G G U T T T T G T G T-Fl T1-Fl U* = OH O O * OH G G T T T T T G U G T-Fl T2-Fl 3' Обработанные периодатом натрия ингибиторы T1-Fl или T2-Fl инкубировали с интегразой, при этом образовавшаяся при окислении ингибитора альдегидная группа способна образовывать основание Шиффа с -аминогруппой пространственно сближенного остатка лизина. Для получения устойчивого в условиях анализа продукта присоединения образующееся основание Шиффа восстанавливали цианборогидридом натрия. Продукты присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли. На рисунке 5 видно, что инкубация интегразы с окисленным ингибитором с последующим восстановлением цианборгидридом натрия приводит к возникновению на геле полосы, мигрирующей чуть выше белкового маркера с массой в 34 кДа. Расчетная масса продукта реакции составляет Mинтегразы + Mингибитора = 32 кДа + 4 кДа = 36 кДа. Следовательно, появление на геле указанной полосы свидетельствует в пользу формирования продукта присоединения ингибитора к интегразе. В дополнительных экспериментах мы показали, что этот продукт образуется лишь в случае соблюдения всех стадий описанной схемы. Были подобраны оптимальные условия присоединения: концентрации интегразы – 300 нМ, ингибитора, содержащего альдегидную группу, - 10 нМ, время инкубации ингибитора с интегразой до восстановления цианборгидридом натрия – 15 мин, время восстановления образовавшегося основания Шиффа цианборгидридом натрия – 15 мин.

Эффективность присоединения в значительной степени зависела от положения реакционноспособной группы в структуре олигонуклеотида. Максимальная эффективность присоединения T1-Fl составляла 20% от исходного количества ингибитора (рис. 5, 1 А), а T2-Fl - 40% (рис. 5, 1 Б). Наличие зависимости эффективности присоединения от положения альдегидной группы может свидетельствовать о существовании некоторого специфического участка связывания ингибитора.

А Б кД ИН - + - + Продукты Продукт триптического гидролиза присоединения ковалентно связанного ингибитора к ИН комплекса ИН/T2-Fl T2-Fl Ингибитор Рис. 5. 1 - Присоединение ингибитора к интегразе: А - T1-Fl, Б - T2-Fl. (3 нМ ингибитор, 300 нМ интеграза, инкубация ингибитора с интегразой до восстановления – 15 мин, восстановление NaBH3CN – 15 мин при 37 C). Радиоавтографы электрофоретического анализа продуктов реакции в ПААГ с додецилсульфатом натрия;

2 - радиоавтограф электрофоретического анализа продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса ингибитора T2-Fl с интегразой в 20% ПААГ/7 М мочевина.

Ковалентно связанный комплекс интегразы с олигонуклеотидным ингибитором T2-Fl мы подвергли триптическому гидролизу. Электрофоретический анализ продуктов трипсинолиза показал образование нескольких олигонуклеотидопептидов (рис. 5, 2). Их смесь была проанализирована методом масс-спектрометрии MALDI-TOF в режиме анализа олигонуклеотидов. В качестве матрицы испльзовали 2,4,6-тригидроксиацетофенон. Массу пептидов, входящих в состав олигонуклеотидопептидов, рассчитывали по следующей формуле:

Мпептида = Мпика – (Мингибитора – МО + МH) + МН = Мпика - Мингибитора + 16, где Мпика – значение массы, соответствующее пику масс-спектра, МО – масса карбонильного атома кислорода, теряемого ингибитором при образовании основания Шиффа, МН – масса атома водорода, получаемого ингибитором при восстановлении основания Шиффа, МН - масса атома водорода, который теряет аминогруппа лизина при образовании конъюгата с ингибитором.

Массы двух пептидов, рассчитанных по формуле, нам удалось соотнести с массами пептидов из теоретически возможного набора продуктов триптического гидролиза интегразы.

Масса первого пептида, рассчитанная из данных MALDI-TOF, составляет 999 г/моль. С этой DPVWKGPAK240. Его теоретически рассчитанная масса составляет массой соотнесен пептид 998 г/моль. Данный пептид содержит единственный внутренний Lys236, аминогруппа которого могла участвовать в образовании ковалентной связи с альдегидной группой ингибитора. Масса второго пептида, полученная на основании данных масс-спектрометрии, составляет 2596 г/моль.

IQNFRVYYRDSRDPVWKGPAK240, которая С этой массой мы соотнесли массу пептида составляет 2597 г/моль. Видно, что второй пептид включает пептид 232-240 и является продуктом неполного трипсинолиза интегразы. Важно отметить, что пептид 220-240 не содержит других внутренних лизинов помимо Lys236. Этот результат позволяет нам считать, что с альдегидной группой ингибитора при его связывании с интегразой взаимодействует аминогруппа этого лизина. Оба идентифицированных пептида принадлежат C-концевому домену интегразы. Это позволяет утверждать, что олигонуклеотидный ингибитор взаимодействует именно с этим доменом фермента, а не с его активным центром.

Показано, что C-концевой домен способен связывать ДНК с эффективностью близкой к полноразмерному ферменту [Puras Lutzke R.A. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22 (20), 4125-4131].

Основную роль в образовании контактов с ДНК играют положительно заряженные аминокислотные остатки домена. Однако -баррельную структуру самого домена формируют контакты гидрофобных аминокислотных остатков, таких как Val225, Tyr227, Ala239, Val249, Ile251, Val260 и Ala265 [Lodi P.J. et al. (1995) Biochemistry. 34 (31), 9826-9833]. Мы полагаем, что связывание нашего ингибитора, конъюгата олигонуклеотида с гидрофобной молекулой, в районе Lys236 приводит к нарушению именно этих гидрофобных контактов и, как следствие, к нарушению структуры всего C-концевого домена и его ДНК-связывающей функции.

3. ДОСТАВКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ИНГИБИТОРА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 В КЛЕТКИ В исследованиях, проводимых в культуре клеток, обычно не удается обнаружить активности олигонуклеотидов, если не обеспечить их эффективную доставку в клетки. Одним из способов, позволяющим улучшить транспорт олигонуклеотидов через клеточную мембрану, является использование носителей, образующих с олигонуклеотидами комплексы за счет электростатических взаимодействий. В нашем распоряжении было два типа носителей:

синтетический полимер, поли-диметиламиноэтил-метакрилат (pDMAEMA), синтезированный в научной группе к.х.н. Н.С. Мелик-Нубарова (кафедра ВМС Химического факультета МГУ) и ряд носителей пептидной природы, любезно предоставленных нам доктором Ж. Дивита (отдел биофизики Центра исследований биохимии макромолекул, Монпелье, Франция) в рамках сотрудничества по проекту 6-ой рамочной программы Европейского Сообщества.

pDMAEMA является водорастворимым катионным полимером. Показано, что его комплексы с ДНК проникают в клетку по механизму эндоцитоза [van de Wetering P. et al. (1998) J. Control Release. 53, 145-153;

Jones R.A. et al. (2004) J. Control Release. 96, 379-391].

Эффективность проникновения зависит от молекулярной массы полимера (степени полимеризации) и соотношения ДНК/полимер в комплексе. В нашем случае степень полимеризации n составляла 100 звеньев.

Одним из пептидных векторов был специально сконструированный 27-звенный пептид MPG (Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-NHCH2CH2SH), включающий фрагмент белка gp41 ВИЧ-1, ответственный за его слияние с клеточной мембраной, и фрагмент T-антигена вируса SV-40, ответственный за ядерную локализацию. Данный вектор ранее использовали для доставки в клетку как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и плазмидных ДНК [Morris M.C.

et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14), 2730-2736;

Morris M.C. et al. (1999) Nucleic Acids Res. (17), 3510-3517]. Показано, что олигонуклеотиды в комплексе с MPG менее чем за 1 час, с эффективностью 90% проникают в клетки различных клеточных линий и локализуются преимущественно в ядре. Предполагают, что их проникновение протекает по механизму, отличному от эндоцитоза.

Структура второго пептидного вектора, называемого далее Пептид 1, включает аминокислотный остаток: KETWFETWFTEWSQPKKKRKV. Данный пептид был разработан для доставки в клетки незаряженных или слабо заряженных ПНК [Morris M.C. et al. (2004) Gene Therapy. 11, 757-764]. Структура третьего вектора, Пептида 2, в настоящее время является объектом готовящегося патента. Пептид 2, как и Пептид 1, амфифилен. Он был разработан для доставки коротких олигонуклеотидов. Как и в случае с MPG, предполагается, что проникновение комплексов олигонуклеотидов с Пептидом 1 и Пептидом 2 через мембрану клетки происходит по механизму, отличному от эндоцитоза.

3.1. Формирование комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями Прежде всего, мы проверили, способны ли имеющиеся у нас носители образовывать с олигонуклеотидным ингибитором комплексы. Для этого мы воспользовались методом электрофореза в агарозном геле. Олигонуклеотидный ингибитор смешивали с различными количествами носителя, смесь инкубировали для формирования комплекса, а затем наносили на агарозный гель. В экспериментах по выбору носителя для доставки ингибитора в клетку мы использовали только конъюгат с эозином 11-OM-E. Присутствие в его составе молекулы флуорофора позволяло следить как за его миграцией в геле, так и за его проникновением в клетки без дополнительного введения какого-либо маркера. Электрофоретический анализ показал, что в случае MPG полного связывания олигонуклеотидного ингибитора в комплекс с носителем не происходит даже при молярном соотношении ингибитор/носитель = 40:1, максимальном соотношении, использованном в данном эксперименте. Возможно, плохое MPG связывание конъюгата с обусловлено недостаточной длиной олигонуклеотида.

Необходимо отметить, что ранее этот носитель использовался для доставки в клетки более длинных ( 18-звеньев) олигонуклеотидов и ДНК. В случае Пептида 1, при молярном соотношении ингибитор/носитель 1:10 и выше образовывался комплекс ингибитора с носителем, однако устойчивость комплекса в условиях электрофореза была низкой. При использовании Пептида 2, уже при соотношении 1:5 весь ингибитор связывался в комплекс. Комплекс олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA формировался при соотношении зарядов полимера и олигонуклеотида 2:1.

3.2. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителям Проникновение комплексов олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями в клетки изучали методом флуоресцентной микроскопии с использованием культуры клеток карциномы человека HeLa.

Трансфекцию клеток осуществляли по двум схемам. Согласно первой из них, клетки инкубировали с комплексом олигонуклеотидного ингибитора с пептидным носителем в среде в отсутствие сыворотки в течение 2 часов при 370С, затем фиксировали их с помощью раствора формальдегида;

по второй схеме, клетки инкубировали с комплексом в течение 1 часа, затем к клеткам с комплексом добавляли сыворотку и инкубировали еще 1 час, после этого их фиксировали. Известно, что в присутствии сыворотки устойчивость комплекса олигонуклеотид носитель снижается, что, в свою очередь, сказывается на эффективности проникновения олигонуклеотида в клетки. С другой стороны, условия трансфекции в присутствии сыворотки являются более благоприятным для клеток и могут снижать токсичность трансфицирующих агентов. По этим причинам, нам было важно сравнить эффективность проникновения олигонуклеотида в клетки при наличии сыворотки и в ее отсутствие.

О проникновении олигонуклеотидного ингибитора внутрь клеток судили по возникновению флуоресцентного свечения (520-530 нм, желто-зеленая флуоресценция) трансфицированных клеток при облучении УФ. Для того чтобы идентифицировать место локализации флуоресценции, ядра фиксированных клеток были окрашены красителем 4,6 диамидино-2-фенилиндолом (Dapi) (461 нм, синяя флуоресценция). Сопоставление картин, полученных с разными фильтрами, позволяло определить место нахождения олигонуклеотидного ингибитора (цитоплазма клетки или ее ядро).

Для трансфекции клеток мы использовали комплексы олигонуклеотидного ингибитора 11 OM-E со всеми тремя пептидными носителями. Комплексы с пептидами формировались из расчета, чтобы конечная концентрация 11-OM-E в растворе, с которым инкубируются клетки, составляла 1 мкМ, при этом количество носителя варьировалось. В случае MPG мы брали 5-ти и 20-ти кратные молярные избытки пептида по отношению к ингибитору, а в случае Пептида 1 и Пептида 2 – 5-ти, 20-ти и 40-кратные избытки. В качестве контроля мы использовали клетки, инкубированные с 1 мкМ раствором 11-OM-E без носителя (рис. 6, А). Отсутствие флуоресценции в этих клетках свидетельствовало о том, что олигонуклеотидный ингибитор без носителя в клетки не проникает. При инкубации клеток с 11-OM-E в комплексе с носителями самый низкий уровень флуоресценции наблюдался в клетках, для трансфекции которых применяли комплекс 11-OM-E с MPG (рис. 6, Б). Этот результат, очевидно, объясняется низким содержанием комплекса, обусловленным слабым связыванием олигонуклеотидного конъюгата с полимером.

II I II I Б А ингибитор/носитель в 1: Соотношение комплексе 1: Рис. 6. Трансфекция клеток Hela: А – ингибитором 11-OM-E без носителя, Б – комплексом ингибитора 11-OM-E с MPG. I – картина, полученная с фильтром для зеленой флуоресценции, II – картина, полученная с фильтром для синей флуоресценции.

При трансфекции клеток комплексом с Пептидом 1 уровень флуоресценции и место ее локализации зависели от соотношения ингибитора и пептида (рис. 7, А). Проникновение конъюгата в клетки детектировалось уже при соотношении 1:5, при соотношении 1: эффективность трансфекции значительно увеличивалась, причем наблюдалась в основном внутриядерная локализация флуоресценции. Дальнейшее повышение количества пептида существенно не влияло на уровень трансфекции. Для Пептида 1 были получены схожие результаты по эффективности проникновения, как в отсутствие сыворотки, так и в ее присутствии.

I Б II II А I Соотношение ингибитор/носитель в комплексе 1: 1: 1: Рис. 7. Трансфекция клеток Hela в отсутствие сыворотки: А - комплексом ингибитора 11-OM-E с Пептидом 1;

Б – комплексом ингибитора 11-OM-E с Пептидом 2. I – картина, полученная с фильтром для зеленой флуоресценции, II – картина, полученная с фильтром для синей флуоресценции.

Напомним, что уже при соотношении ингибитора к Пептиду 2 1:5 весь ингибитор связывался в прочный комплекс. Тем не менее, комплекс такого состава в клетку практически не проникал. Флуоресценция наблюдалась только в районе клеточной мембраны (рис. 7, Б). При увеличении количества пептидного носителя проникновение улучшалось, однако при соотношении ингибитора к пептиду 1:40 комплекс становился токсичным для клетки. На рисунке 7, Б (при соотношении ингибитора к носителю 1:40) можно видеть клетки с нарушенной ядерной мембраной. Однако при трансфекции клеток в присутствии сыворотки токсичность комплекса 1:40 снижалась.

Таким образом, для доставки ингибитора 11-OM-E в ВИЧ-инфицированные клетки целесообразно использовать его комплексы с Пептидом 1 и с Пептидом 2 при соотношении не более 1:20, причем трансфекцию можно проводить в присутствии сыворотки.

3.3 Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA Для изучения проникновения олигонуклеотидного ингибитора в клетку с помощью pDМАЕМА были использованы клетки мышиных фибробластов NIH 3T3. Механизм и эффективность проникновения ДНК с помощью этого носителя отличаются от механизма и эффективности проникновения ДНК в комплексе с пептидными носителями. При инкубации клеток с комплексом ДНК/pDMAEMA в течение 1 часа трансфицированными оказываются лишь 3-6% клеток [van de Wetering P. et al. (1998) J. Control Release. 53, 145-153]. По этой причине схема трансфекции клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора 11-OM-E с pDMAEMA отличалось от таковой при использовании пептидных носителей.

Для трансфекции клеток мы Инкубация 4 часа Инкубация 24 часа использовали две концентрации ингибитора – 1 мкМ и 5 мкМ.

Соотношение зарядов 1мкМ 11-OM-E олигонуклеотидного ингибитора и полимера в обоих случаях составляло 1:10. Одна серия клеток инкубировалась Инкубация 24 часа Инкубация 4 часа с комплексом 11-OM-E/pDMAEMA в течение 4 часов в отсутствие сыворотки 5мкМ 11-OM-E при температуре 37 C, затем фиксировалась раствором формальдегида. Другая серия клеток Рис. 8. Трансфекция клеток NIH 3T3 комплексом также в течение 4 часов инкубировалась ингибитора 11-OM-E с носителем pDMAEMA.

с комплексом в отсутствие сыворотки, затем к клеткам с комплексом добавляли сыворотку и инкубировали еще 20 часов, после этого клетки фиксировали. Трансфицированные клетки наблюдали во флуоресцентный микроскоп (рис. 8). При трансфекции 1мкМ комплексом по истечении 4 часов уровень флуоресценции в клетках был достаточно низким. При увеличении времени инкубации до 24 часов количество ингибитора, прошедшего в клетки увеличивалось. При этом флуоресценция наблюдалась, главным образом, в цитоплазме клеток. В случае использования 5 мкМ комплекса высокий уровень флуоресценции клеток наблюдался уже при 4 часовой инкубации. При этом флуоресценция детектировалась не только в цитоплазме клеток, но и в их ядрах.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что pDMAEMA может быть использована для доставки олигонуклеотидного ингибитора в ВИЧ-инфицированные клетки, однако время трансфекции клеток должно быть больше, чем в случае использования носителей пептидной природы.

ТЕСТИРОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ НА ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов 11-OM-E и 11-OM-Ol на ВИЧ-инфицированных клетках было проведено д-р Мириам Витвру (факультет медицины, Каталический университет г. Левен, Бельгия) в рамках сотрудничества по проекту 6 ой рамочной программы Европейского Сообщества. Тестирование проводилось с использованием линии лимфобластоидных клеток человека MT-4, инфицированных штаммом HTLV-IIIB/LAI ВИЧ. Противовирусная активность характеризовалась значением концентрации ингибитора EC50, при которой цитопатогенное действие вируса подавлялось на 50%.

Параллельно определялась цитотоксичность ингибитора в комплексе с носителем - CC50.

Помимо исследованных нами пептидов, в качестве носителя использовался также укороченный аналог Пептида 1, называемый далее Пептид 3. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4. Противовирусная активность олигонуклеотидных ингибиторов EC50, мкМ CC50, мкМ SI Ингибитор Носитель MPG 2.0 2.0 Пептид 1 (1:10) 0.003 6.0 Пептид 1 (1:20) 31.0 31.0 11-OM-E Пептид 2 (1:20) 5.6 5.6 Пептид 3 (1:20) 0.82 3.0 pDMAEMA 0.105 0.3 MPG 10.0 10.0 Пептид 2 (1:20) 6.9 6.9 11-OM-Ol Пептид 3 (1:20) 0.69 3.5 pDMAEMA 0.116 0.45 3. Высокую противовирусную активность - EC50 = 3 нМ - в сочетании с относительно низкой цитотоксичностью показал олигонуклеотидный конъюгат с эозином 11-OM-E в случае использования в качестве носителя Пептида 1 (соотношение ингибитор/носитель 1:10). При использовании Пептида 3 и pDMAEMA оба ингибитора показали противовирусную активность. Однако индекс селективности SI - соотношение цитотоксичности и активности данных комплексов - имел низкие значения.

ВЫВОДЫ 1. Синтезирована серия конъюгатов олигодезоксинуклеотида с GGTTTTTGTGT различными гидрофобными молекулами, исследована их способность ингибировать каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 и показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты с эозином и олеиновой кислотой. Исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность. Установлено, что конъюгаты 11-звенного 2’-O-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой специфично подавляют активность в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи.

2. Показано, что конъюгаты подавляют активность интегразы, разрушая ее комплекс с субстратной ДНК.

3. Установлено, что конъюгаты взаимодействуют с C-концевым доменом интегразы в районе Lys236. Предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие ингибитора с ферментом в данном участке приводит к нарушению гидрофобных контактов, формирующих баррельную структуру C-концевого домена, что в результате вызывает нарушение его ДНК связывающей функции.

4. Изучено проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки в присутствии носителей различной природы и подобраны оптимальные условия трансфекции. Обнаружено, что конъюгат 2’-O-метилированного олигонуклеотида с эозином 11-OM-E в комплексе с 1) пептидным носителем (Пептид эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А., Приказчикова Т.А., Зубин Е.М., Готтих М.Б.

Взаимодействие интегразы вируса иммунодефицита человека с модифицированными аналогами вирусной ДНК. Материалы III съезда биохимического общества, 26 июня 2002 года, Санкт Петербург, Россия, с. 474;

2. Приказчикова Т.А., Готтих М.Б. Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами. 8-ая международная Пущинская школа конференция молодых ученых, 17-21 мая 2004, Пущино, Россия;

3. Smolov M., Prikazchikova T., Agapkina Y., Pinskaya M., Deprez E., Mouscadet J-F., Gottikh M. HIV-1 integrase: mechanism of action and search for inhibitors. Международная конференция “Chemical & Biological Problems of Proteomics”, 5-9 июля 2004, Новосибирск, Россия;

4. Prikazchikova T., Mouscadet J.-F. and Gottikh M. Integrase HIV-1: inhibition catalytic activity by modified oligonucleotides. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference “The Protein World”, 2-7 July 2005, p. 17;

5. Prikazchikova Tatiana, Agapkina Julie, Gottikh Marina Integrase HIV-1: inhibition catalytic activity in vitro. International Symposium “Advances in Science for Drug Discovery”, 11-16 July 2005, B-41;

6. Ю.Ю. Агапкина, Т.А. Приказчикова, М.А. Смолов, М.Б. Готтих. (2005) Структура и функции интегразы ВИЧ-1. Успехи биологической химии, т. 45, с. 87-122;

7. Д.В. Акимов, Д.А. Филимонов, Т.А. Приказчикова, М.Б. Готтих, В.В. Поройков. (2005) Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Биомедицинская химия, т. 51, вып.

3, с. 335-340;

8. Т.А. Приказчикова, Е.М. Волков, Е.М. Зубин, Е.А. Романова, М. Б. Готтих (2007) Ингибирование интегразы ВИЧ-1 модифицированными олигонуклеотидами. Оптимизация структуры ингибитора. Молекулярная биология, т. 41, № 1, с. 130-138.