Масс-спектрометрическое de novo секвенирование природных дисульфидсодержащих пептидов (
На правах рукописи
Воронцов Егор Анатольевич Масс-спектрометрическое de novo секвенирование природных дисульфидсодержащих пептидов (02.00.03 – органическая химия)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена в лаборатории органического анализа кафедры органической химии химического факультета Московского государственного университета имени М. В.
Ломоносова
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Лебедев Альберт Тарасович
Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич (Институт нефтехимического синтеза им. А.
В. Топчиева РАН, г. Москва) Доктор химических наук, в.н.с., профессор, Еремеев Николай Леонидович (химический факультет МГУ имени М.В.
Ломоносова)
Ведущая организация: Государственное учреждение Российский Онкологический Научный центр им. Н. Н.
Блохина РАМН, г. Москва
Защита состоится 19 октября 2012 г в 1100 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.97 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.
В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 3, МГУ, химический факультет, аудитория 446.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан 19 сентября 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химических наук Кардашева Ю. С.
Общая характеристика работы
Актуальность темы. За последние два десятилетия, благодаря открытию двух новых методов ионизации (электрораспыления ИЭР и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации МАЛДИ), позволивших приступить к изучению строения макромолекул, появилась и стремительно развивается новая отрасль знаний – протеомика. В ее задачу входит изучение строения совокупности всех белков конкретного организма и определения их функций. Неоценимая роль появившихся методов в развитии науки о живом была отмечена присуждением их создателям в 2002 году Нобелевской премии в области химии. В русле протеомики и пептидомики началось развитие масс-спектрометрического секвенирования белков и пептидов (определение их первичных структур), которое в настоящее время практически вытеснило классический метод деградации по Эдману.
Огромное количество экспериментальных сведений о характере фрагментации пептидов подталкивает ученых к изучению закономерностей протекающих в масс-спектрометре процессов фрагментации. Целью этих исследований является создание теорий распада полипептидных цепей при различных способах активации фрагментации. И если для диссоциации, активируемой столкновениями (ДАС), существует теория мобильного протона, удовлетворительно описывающая экспериментальные данные, то для реакций, протекающих при захвате или переносе электрона (ДЗЭ/ДПЭ), общее понимание механизмов процессов ещё складывается. Эти знания необходимы для понимания и предсказания направлений фрагментации пептидов, что позволило бы значительно повысить эффективность автоматического масс-спектрометрического секвенирования при использовании всего многообразия способов активации распада полипептидных цепей. Полная автоматизация процесса секвенирования пептидов и белков при одновременно высокой достоверности и надежности процедуры является актуальной задачей масс-спектрометрии, а с ней пептидомики и протеомики.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей фрагментации природных нетриптических (15-46 аминокислот) дисульфидсодержащих пептидов, протекающей при использовании ряда способов активации распада их цепей, а также влияния на этот процесс цистеин-модифицирующих реагентов. В работе ставились задачи:
1. Изучение возможностей методов диссоциации при захвате электрона (ДЗЭ) и диссоциации, активированной столкновениями (ДАС), для определения последовательности аминокислот внутри С-концевого дисульфидного цикла недериватизованных пептидов.
2. Изучение возможности использования высокоэнергетической активации фрагментации пептидных связей в орбитальной ловушке (диссоциация, активированная столкновениями при повышенных энергиях ДАСПЭ в Орбитрэп) для de novo секвенирования кожных секретов амфибий.
3. Доказательство преимущества суммы двух способов химического разрушения дисульфидной связи (окисления и восстановления/алкилирования) перед традиционным восстановлением/алкилированием для задач de novo секвенирования пептидов с С терминальной внутримолекулярной S—S-связью на примере анализа кожного секрета Rana lessonae в режимах ручного и автоматического секвенирования.
4. Изучение комплексом масс-спектрометрических методов влияния на фрагментацию дисульфидсодержащих пептидов новых цистеинмодифицирующих реагентов: производных N-фенилмалеимида, йодацетамида и йодуксусной кислоты в сравнении с традиционно используемыми йодацетамидом (IAA) и N-фенилмалеимидом (NPM).
Научная новизна и практическая значимость. На пептидах из R. ridibunda, R.
esculenta, R. temporaria, R. arvalis показано, что при захвате электронов (ДЗЭ) в пептидах, содержащих С-концевую S—S-связь, происходит ее разрыв, в результате становится возможным прочтение недоступной ранее части последовательности пептидов.
Эффективность этого процесса зависит от наличия в С-терминальной области остатков лизина.
На пептидах с внутримолекулярной S—S-связью, выделенных из R. ridibunda, R.
esculenta, R. temporaria, R. arvalis, впервые показано, что в условиях ДАС происходит раскрытие С-концевого дисульфидного цикла путем разрыва амидной связи по терминальному остатку цистеина. Образовавшийся в результате линейный молекулярный ион фрагментирует далее по амидным связям, что позволяет установить С-концевую последовательность частично, а иногда и полностью.
Впервые проведено сравнение низкоэнергетической и высокоэнергетической диссоциации, активируемой столкновениями (ДАС и ДАСПЭ) для de novo секвенирования S S содержащих пептидов на примере кожного секрета R. temporaria. Показано, что для пролинсодержащих пептидов низкая энергия активирующих частиц (ДАС) дает более достоверные результаты, поскольку снижается количество ионов вторичной фрагментации, что значительно упрощает секвенирование.
Впервые в ВЭЖХ-МС режиме в одинаковых условиях на кожном секрете прудовой лягушки Rana lessonae показано преимущество для de novo секвенирования суммы процедур модифицирования S—S-связей (окисление + восстановление с последующим алкилированием) в сравнении с традиционным восстановлением/алкилированием. И при ручном, и при автоматическом секвенировании сумма двух модификаций дает существенно более высокие значения доли установленной аминокислотной последовательности, особенно для аргининсодержащих пептидов. Исключительно благодаря дополнительной процедуре окисления дисульфидной связи удалось обнаружить новые подобные пептиды в исходном кожном секрете Rana lessonae.
Впервые проведено изучение влияния на распад бревинина-2Ес и бревинина-1Е природы цистеинмодифицирующих реагентов. Получен большой массив данных по фрагментации дериватизованных пептидов с использованием двух масс-спектрометров ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ФП), а также орбитальной ловушки (Орбитрэп);
проведено изучение особенностей фрагментации ряда дериватизованных природных пептидов при активации столкновениями (ДАС);
при захвате электрона (ДЗЭ);
при переносе электрона (ДПЭ), при активации столкновениями с повышенной энергией (ДАСПЭ).
Полученный обширный материал по фрагментации природных S—S-содержащих пептидов может быть использован для создания теории механизмов реакций, протекающих в пептидах в различных условиях масс-спектрометрического эксперимента.
Публикация и апробация работы. Материалы работы изложены в шести статьях.
Основные результаты исследований были представлены на одиннадцати конференциях: 3-й Всероссийской конференции "Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы" (Москва, 2009), 56, 57, 58 и 60-й конференциях Американского масс-спектрометрического общества (Денвер, 2008;
Филадельфия, 2009;
Солт Лейк Сити, 2010;
Ванкувер, 2012), 4-м Всероссийском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, 2009), 6-м международном симпозиуме по эндокринологии и нейробиологии амфибий (Берлин, 2009), 18-й и 19-й Международных масс-спектрометрических конференциях (Бремен, 2009;
Киото, 2012), 1-м семинаре стран Ближнего Востока и Средиземноморья по масс-спектрометрии (Реховот, 2010), 9-м Европейском семинаре по МСПФ (Лозанна, 2010).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 163 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и приложения. Иллюстративный материал содержит 14 таблиц, 69 схем и рисунков.
Список процитированной литературы состоит из 307 наименований.
Основное содержание работы
Получение и очистка кожных секретов амфибий, выделение пептидов Работа выполнена на лягушках из видов R. arvalis, R. temporaria, R. ridibunda, R.
lessonae, R. esculenta, обитающих в Московской области. Кожный секрет получали электростимуляцией спинных желез при непрерывном смывании выделений деионизованной водой. Протеазы немедленно осаждали и дезактивировали метанолом. Пептидную фракцию отделяли, концентрировали, лиофильно высушивали и хранили при -24С. Нужные для работы пептиды получали при ВЭЖХ-хроматографировании секрета, фракции объединяли, концентрировали, лиофилизовывали и хранили при -24С.
Образцы кожных секретов лягушки R. lessonae модифицировали йодацетамидом (карбоксамидометилирование) или надмуравьиной кислотой (окисление дисульфидных групп в сульфогруппы). Для карбоксамидометилирования кожный секрет в буферном растворе при pH 8 обрабатывали водным раствором дитиотреитола, затем полученную смесь алкилировали водным раствором йодацетамида. Для окисления использовали смесь водного раствора H2O2 и концентрированной муравьиной кислоты.
Синтез цистеинмодифицирующих реагентов и дериватизация пептидов Новые цистеинмодифицирующие реагенты синтезировали по простой двухстадийной схеме: по реакции малеинового ангидрида и соответствующего анилина или бензиламина с последующей циклизацией образующегося производного с образованием N-замещенного малеимида. Окисление и карбоксамидометилирование проводили на природных пептидных смесях с последующим ВЭЖХ-МС/МС анализом. После модификации пептидных смесей лягушки R. ridibunda новыми цистеинмодифицирующими реагентами алкилированные бревинин-1Е и бревинин-2Ес выделяли из реакционных смесей с помощью ВЭЖХ и исследовали их фрагментацию в режиме прямого ввода в масс-спектрометр.
Масс-спектрометрическое секвенирование Секвенирование природных пептидов осуществляли при ионизации электрораспылением (ИЭР) на масс-спектрометрах высокого разрешения: ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (наноВЭЖХ-ИЦР ФП, Thermo LTQ FT Т) и орбитальной ионной ловушке (наноВЭЖХ-Орбитрэп, Thermo Orbitrap Velos). Изучение фрагментации модифицированных пептидов в МАЛДИ проводили на тандемном масс спектрометре с времяпролетным анализатором (МАЛДИ-ВП/ВП, Bruker Ultraflex), при ионизации электрораспылением — на двух приборах ИЦР ФП (Thermo LTQ FT Ultra 7 Т и Bruker Apex 12 Т) и на Орбитрэп. Использовали следующие способы активации фрагментации: в МАЛДИ - распад после источника (РПИ);
при электрораспылении диссоциацию, активированную столкновениями (ДАС);
активированную столкновениями при повышенной энергии (ДАСПЭ);
диссоциации при захвате электрона (ДЗЭ) и при переносе электрона (ДПЭ).
МС секвенирование немодифицированных пептидов с внутримолекулярной S-S связью в условиях диссоциации, активированной соударениями (ДАС) Несмотря на изученность фрагментации полипептидных цепей при низкоэнергетической активации столкновениями (ДАС) в услових электрораспыления, мы обнаружили новое направление разрыва полипептидной цепи внутри C-терминального цикла пептидов с немодифицированной S—S-связью.
На рис. 1 приведен спектр ДАС бревинина-1Та. Помимо серий b- и y-ионов, соответствующих обычному распаду цепи бревинина-1Та, в спектре присутствуют два интенсивных сигнала с m/z 1897.07 и 1667.93, не укладывающихся в общепринятый сценарий распада дисульфидсодержащих пептидов в условиях низкоэнергетической ДАС. Точная масса потери из протонированной молекулы пептида соответствует элиминированию Lys.
Детальное изучение дальнейшего распада выявило ионы, отличающиеся на массы остатков Lys, Thr, Ile, Ser, что соответствует обратной С-концевой последовательности бревинина-1Та.
Это могло осуществиться только при исходном разрыве амидной связи Lys16-Cys17 (см схему на рис. 1) с последующей фрагментацией участка внутри бывшей "Rana box". После потери Ser происходит разрыв С—S-cвязи в Cys с элиминированием S-сульфанилцистеина (152. Да) и образованием dhAla (дегидроаланина, 69.02Да): сигнал с m/z 1314.82. Иногда раскрытие цикла наблюдается при вторичной фрагментации доминирующего y-иона, образовавшегося при разрыве по N-концу остатка пролина (такой разрыв легко реализуется в ДАС) – такой процесс происходит для y15-иона бревинина-1AVb.
Рис. 1. Спектр ДАС двухзарядного иона бревинина-1Та (ИЦР ФП 7 Т) и схема фрагментации внутри "Rana box".
В табл. 1 суммированы данные по прямому секвенированию С-терминальной последовательности дисульфидсодержащих пептидов при активации столкновениями.
Табл. 1. Результаты секвенирования немодифицированных дисульфидсодержащих пептидов в условиях ДАС при электрораспылении.
№ M Пептид Последовательность % 1 2024.1 Бревинин-1Tа FITLLLRKFICSITKKC-OH 100. 2 1963.1 Бревинин-1Tb LVPLFLSKLI(CF)ITKKC-OH 88. 3 2195.3 Бревинин-1T VNPIILGVLPKFV(CLI)TKKC-OH 85. 4 1809.9 Бревинин- 1AVa FLPLLAASFACTVTKKC-OH 100. 5 1873.1 Бревинин- 1AVb FVPLLVSKLVCVVTKKC-OH 100. 6 2607.5 Бревинин- 1LE FFPAFLKVAKVV(PS)IL(CSITKKC)-OH 58. 7 3619.0 Эскуленти 2LE(3-37) (FS)LVK(GV)AKLAGKTLAKEGGKF(GL)DLIACKITNQC-OH 82. 8 3011.6 Бревинин 2Rd (GI)LDSLKNLAKNAAQILLNKAS(CKLSGQC)-OH 69. 9 2989.6 Бревинин- 2Ra (GI)LDSLKNFAKDAAGILLKKASC(KL)(SGQC)-OH 72. 10 1749.0 Ранатуерин- 2а 66. KLLLNPKFRC(KAAFC)-OH 11 1939.0 Ранатуерин- 2R AVNIPKFKVKFRC(KAAFC)-OH 72. % - доля определенной последовательности;
неидентифицированная часть последовательности указана в скобках, идентифицированная выделена серым цветом;
жирным выделены Lys.
Раскрытие цикла при активации столкновениями наблюдается в спектрах девяти пептидов из одиннадцати. С-концевая фрагментация внутри упрощается при наличии двух C терминальных Lys (KKC): так, для недериватизованных бревининов-1Та,-1Тb,-1АV и -1АVb удалось с ее помощью установить последовательности внутри «Rana box» полностью.
Необходимо учитывать возможность протекания новой фрагментации при ИЭР в условиях ДАС для масс-спектрометрического de novo секвенирования пептидов с С-терминальной внутримолекулярной дисульфидной связью.
МС секвенирование немодифицированных пептидов с внутримолекулярной S-S-связью при захвате электрона (ДЗЭ) В литературе показана возможность разрыва при захвате электрона межцепочечных S-S связей и внутримолекулярных S-S-связей триптических пептидов (схема на рис.2).
Рис. 2. Схема разрыва внутримолекулярной S—S-связи в условиях ДЗЭ.
В данной работе впервые изучены возможности фрагментация немодифицированных нетриптических (длинных) дисульфидсодержащих пептидов в условиях ДЗЭ при рутинном ВЭЖХ-ИЭР-МС/МС анализе. На рис. 3 показаны спектры при захвате электрона бревинина 1Т, полученные для ионов-предшественников с зарядами +3 и +4.
Рис. 3. Спектры ДЗЭ бревинина-1T VNPIILGVLPKFVCLITKKC-OH (ИЦР ФП 7 Т): а) трёхзарядный ион-предшественник, б) четырёхзарядный ион-предшественник.
В спектрах немодифицированного бревинина 1Т присутствуют сигналы, соответствующие разрыву S—S-связи с последующей фрагментацией внутри дисульфидного цикла ("Rana box"). При сравнимых интенсивностях фрагментации 3-х и 4-х зарядных ионов предшественников бревинина-1Т более высокое зарядовое состояние не приводит к удлинению серий c-/z-ионов. Однако в спектре MH44+ возрастает количество y-ионов и появляются несколько интенсивных b-ионов. Образование b-ионов нетипично для ДЗЭ:
обычно при элиминировании СО они превращаются в a-ионы. Таким образом, de novo секвенирование нетриптических пептидов с S—S-связью необходимо проводить по сумме спектров всех реализованных зарядовых состояний пептидов.
При детальном изучении фрагментации учитывали совокупность результатов, полученных для каждого пептида от ионов-предшественников разных зарядов. В табл. представлены данные по одиннадцати исследованным в работе пептидам.
В спектрах всех пептидов присутствует ион, соответствующий потере атома S из протонированной молекулы пептида. Поскольку заряды в полипротонированных молекулах пептидов локализованы на наиболее оснвных аминокислотных остатках (Arg, Lys, His), а ДЗЭ инициируется при рекомбинации электрона с положительным зарядом, фрагментация внутри терминального дисульфидного цикла облегчается при наличии внутри него двух остатков лизина. Так, в бревининах-1Та, -1Тb, -1Т и -1AVb, содержащих на конце последовательности участок KKC, удается наблюдать пять из шести разрывов внутри "Rana box". Значения покрытия последовательностей за счет фрагментации при ДЗЭ довольно велики и достигают 80 % для бревинина-1Т и 88.2 % для бревинина-1AVb. Достоинством ДЗЭ-секвенирования является простота разрыва по S—S-связи с образованием радикального центра на Cys и [Cys–H]: такой разрыв не усложняет секвенирование как в ручном, так и автоматическом режиме. Недостатком является невысокая интенсивность сигналов.
Табл. 2. Результаты секвенирования немодифицированных дисульфидсодержащих пептидов в условиях ДЗЭ при электрораспылении.
№ M Пептид Последовательность % 1 2024.1 Бревинин-1Tа FITLL(LR)K(FI)CSITK(KC)-OH 64. 2 1963.1 Бревинин-1Tb LVPLFLSK(LI)CFITK(KC)-OH 76. 3 2195.3 Бревинин-1T VNPIILGV(LP)KFVCLITK(KC)-OH 80. 4 1809.9 Бревинин- 1Avа FL(PL)LAASF(AC)(TV)(TK)(KC)-OH 41. 5 1873.1 Бревинин- 1AVb FVPLLVSKLVCTVVTK(KC)-OH 94. 6 2607.5 Бревинин- 1LE F(FP)(AF)LKVАAKV(VP)S(ILC)(SIT)K(KC)-OH 41. 7 3619.0 Эскулентин-2LE(3-37) (FS)(LV)K(GV)AKLAGKTLAKEGGKFG(LD)(LIACKITNQC)OH 48. 8 3011.6 Бревинин- 2Rd GILDSLKNLAKNAAQI(LL)NKASC(KLSGQC)-OH 72. 9 2989.6 Бревинин- 2Ra (GI)LDSLKNFAKDAAGILLKKA(SCK)L(SG)(QC)-OH 69. 10 1749.0 Ранатуерин- 2Ra KLLL(NP)KFRCKAA(FC)-OH 73. 11 1939.0 Ранатуерин- 2R (AV)N(IP)FKVKF(RC)KAA(FC)-OH 52. % - доля определенной последовательности;
неидентифицированная часть последовательности указана в скобках, идентифицированная выделена серым цветом;
жирным шрифтом выделены остатки лизина (K).
Сравнение ДАС и ДАСПЭ для de novo секвенирования пептидов В работе было проведено сравнение фрагментации пептидов, протекающей при использовании традиционной низкоэнергетической ДАС на масс-спетрометрах с ионной ловушкой-ИЦР ФП, с активацией распада соударениями с повышенной энергией (ДАСПЭ), ставшей доступной в появившихся в последнее время приборах Орбитрэп. На рис. приведены спектры четырёхзарядного иона бревинина-2Т, полученные с использованием двух этих способов фрагментации.
ДАСПЭ характеризуется несколько более длинной и значительно более интенсивной y серией. Интенсивность ионов вторичной фрагментации — производных y18-иона в ДАС (рис.
4, увеличение по интенсивности на врезке в 50 раз) чрезвычайно низка и не затрудняет секвенирования бревинина-2Т. Напротив, ДАСПЭ дает интенсивные сигналы с низкими значениями m/z за счет вторичной фрагментации ионов у18 и у16: вторичные b-ионы фрагмента у18 (211.14, 324.23, 437.31, 593.40) и иона у16 (227.18, 284.20, 383.27) по интенсивности превосходят b-ионы первичной фрагментации самого бревинина-2Т, сопровождающиеся соответствующими a-ионами. Интенсивная вторичная фрагментация в ДАСПЭ особенно выражена у пролинсодержащих пептидов, с облегченным разрывом связи по N-Pro. Как правило, кожные секреты ранидных лягушек содержат большое количество пролинсодержащих пептидов. Наряду с усилением вторичной фрагментации таких пептидов при использовании ДАСПЭ наблюдается образование циклических ионов. В этом случае определить последовательность пептидов по масс-спектрам становится невозможно:
требуется дополнительное модифицирование N-концевой аминокислоты.
Рис. 4. Спектры ДАС (ИЦР ФП) и ДАСПЭ четырёхзарядного иона бревинина-2Т. Во врезках увеличенные области низких масс недеконволюированных спектров. С* — алкилированные остатки цистеина.
Рис. 5. Спектр ДАСПЭ пептида PGRPPGFSPFR-OH. Жирным шрифтом выделены y ионы, образовавшиеся при разрывепо С-Pro;
F - иммониевый ион Phe.
Достоинством ДАСПЭ, в отличие от низкоэнергетической ДАС, являются интенсивные разрывы по С-концу остатка пролина. Например, на рис. 5 приведён ДАСПЭ спектр пептида PGRPPGFSPFR, имеющего в последовательности четыре остатка пролина. Он содержит y2, y6, y7, y10-ионы, соответствующие разрывам по С-концам всех четырёх остатков пролина. В соответствии с существующими представлениями о механизмах фрагментации в ДАС, комплементарные b4, b5, b9-ионы не обнаруживаются, так как не могут образовать устойчивую оксазолоновую структуру, однако присутствует возникший из иона b5 a5-ион.
ДАСПЭ появоляет определить N-концевую аминокислоту: серия y-ионов во многих случаях доходит до конца пептида, что редко наблюдается в низкоэнергетической ДАС.
Таким образом, для эффективного de novo секвенирования пролинсодержащих пептидов метод активации ДАСПЭ целесообразно использовать в дополнение к низкоэнергетической ДАС, доступной наряду с ДАСПЭ на приборах Орбитрэп.
Комплементарность двух процедур модифицирования S—S-связей для de novo секвенирования дисульфидсодержащих пептидов Для надежного масс-спектрометрического секвенирования дисульфидсодержащих пептидов с помощью рутинного ВЭЖХ-МС/МС анализа в работе предложено использование суммы двух параллельных модификаций S—S-связей.
Рис. 6. Реакции окисления и восстановления/карбоксамидометилирования S—S-связи.
На отдельных дисульфидсодержащих пептидах ранее было показано, что, благодаря появлению в структуре пептида двух сульфогрупп, процедура окисления дисульфидных связей надмуравьиной кислотой способна повысить фрагментацию амидных связей пептидов не только в МАЛДИ, но и при ИЭР. В настоящей работе на кожном секрете R. lessonae, содержавшем по предварительным оценкам 10 пептидов с внутримолекулярной S-S-связью, было проведено сравнение двух процедур их модифицирования для целей масс спектрометрического секвенирования, с ручной и автоматической интерпретацией данных. На рис. 6 представлена схема использованных модификаций S—S-связи — восстановления/карбоксамидометилирования и окисления с образованием SO3H-групп.
В табл. 3 суммированы полученные в этом эксперименте данные. Для автоматического de novo секвенирования была использована программа М. Савицкого (Университет Уппсалы, Швеция). В ней, как и при ручном секвенировании, используются данные двух спектров (ДАС и ДЗЭ), полученных на масс-спектрометрах высокого разрешения.
R. lessonae Автоматическим секвенированием в секрете определены дисульфидсодержащих пептидов. Бревинин-2Lb наглядно иллюстрирует комплементарность двух модификаций S—S-связи. Бревинин-1Ra и эскулентин-1 обнаружены в пептидной смеси автосеквенированием только в результате окисления дисульфидных связей. Дополнительная процедура окисления позволила актосеквенатору получить наилучшие результаты для всех трёх Arg-содержащих пептидов, в том числе полностью установить последовательность ранатуерина-2R.
Табл. 3. Доли установленных последовательностей (в %) для автоматического и ручного масс спектрометрического секвенирования пептидов в кожном секрете лягушки R. lessonae.
Автоматическое секвенирование Ручное секвенирование Мм, № Пептид Полн. посл., % "Rana box", % Полн. посл., % "Rana box", % Да Исх Кам Окс Исх Кам Окс Исх Кам Окс Исх Кам Окс 1 Бревинин-1LE 2607.5 41.7 41.7 41.7 0 0 0 41.7 45.8 100 0 14.3 2 Бревинин-1Ra 2636.2 0 0 50.0 0 0 0 41.7 41.7 87.5 0 0 3 Бревинин-2Ra 2989.6 34.5 44.8 58.6 0 0 42.9 41.4 55.2 89.6 0 0 4 Бревинин-2Rd 3011.6 37.9 34.5 72.4 0 0 0 75.9 58.6 100 0 42.8 5 Бревинин-2L 3243.7 69.7 30.3 42.2 0 0 0 60.6 63.6 100 0 28.6 6 Бревинин-2La 3386.8 54.5 0 0 0 0 0 78.8 0 0 0 0 7 Бревинин-2Lb 2995.5 34.5 44.8 31.0 0 0 0 75.9 48.3 89.7 0 14.3 8 Эскулентин-2LE 3789.1 37.8 27.0 45.9 0 0 0 45.9 27.0 100 0 0 9 Ранатуерин-2R 1939.0 0 0 100 0 0 100 29.4 70.6 100 0 14.3 10 Эскулентин-1 4884.0 0 0 17.4 0 0 85.7 0 8.7 17.4 0 0 71. 11 Эскулентин-1R 4770.7 0 0 0 0 0 0 26.1 28.3 32.6 0 28.6 12 Эскулентин-1a/b 4797.7 0 0 0 0 0 0 0 17.4 52.2 0 0 13 Бревинин-2Rb 2918.5 0 0 0 0 0 0 0 10.3 89.6 0 0 Исх-немодифицированные пептиды;
Кам — карбоксамидометилированные;
Окс – окисленные.
Ручное секвенирование в большинстве случаев позволяет определять бльшую часть последовательностей в сравнении с автоматическим (см. гистограмму на рис. 7): так, при окислении и ручной обработке для пяти пептидов удалось определить их последовательность полностью, а для трёх дисульфидсодержащих пептидов, вообще не обнаруженных при автоматическом поиске,— частично.
Рис. 7. Доли установленных последовательностей окисленных пептидов при ручной и автоматической обработке масс-спектрометрических данных.
Ни в одном из пептидов процедура восстановление/карбоксамидометилирования не позволила установить полностью последовательности внутри "Rana box", тогда как окисление дало отличные результаты: в одиннадцати из тринадцати пептидов полные последовательности определены при ручной обработке данных (см. гистограмму на рис. 8).
Для всех пяти аргининсодержащих пептидов окисление повысило доли определенных последовательностей, а для ранатуерина-2R дало 100%-ное прочтение сиквенса.
Рис. 8. Доли установленных последовательностей внутри "Rana box" для карбоксамидометилированных и окисленных пептидов при ручной обработке данных.
Таким образом показано, что окисление надмуравьиной кислотой увеличивает возможности определения последовательности нетриптических дисульфидсодержащих пептидов секрета R. lessonae при электрораспылении и для автоматического, и для ручного секвенирования.
Рис. 9. Доли установленных последовательностей при ручной обработке данных по сумме результатов карбоксамидометилированных (КАМ), окисленных и немодифицированных секретов.
Окисление дает хорошие результаты как самостоятельно, так и в сумме с данными по немодифицированным или карбоксамидометилированным пептидам (см. гистограмму на рис.
9). Трудоемкая и времязатратная ручная обработка данных в настоящее время превосходит по эффективности автоматические алгоритмы. Обобщая использованный подход, мы составили методику эффективного секвенирования дисульфидсодержащих пептидов амфибий, приведенную в Приложении к диссертационной работе.
Фрагментация пептидов, модифицированных новыми реагентами Традиционно используемыми алкилирующими S—S-связи реагентами в протеомике являются йодацетамид (IAA), йодуксусная кислота (IAAC) и N-фенилмалеимид (NPM). Для изучения влияния природы цистеинмодифицирующих реагентов на фрагментацию полипептидной цепи S–S-содержащих пептидов из доступных исходных веществ были синтезированы девять новых алкилирующих реагентов (рис. 10) на основе N-фенилмалеимида (NBM и набор от NPM-1 до NPM-7) и йодацетамида (IAA-1).
Рис. 10. Новые цистеинмодифицирующие реагенты.
NPM и реагенты на его основе алкилируют SH-группы по реакции Михаэля (рис. 11).
Реакция проходит легко, без образования побочных продуктов. Ограничением в использовании малеимидных реагентов служит необходимость проведения реакций в водно ацетонитрильной среде.
Рис. 11. Схема модификации дисульфидных связей производными N-фенилмалеимида Модификации проводились на двух пептидах амфибий: аргининсодержащем 24 звенном бревинине-1E и 34-членном бревинине-2Eс, не содержащем аргинина.
Бревинин-1E: FLPLLAGLAANFLPKIFCKITRKC-OH Бревинин-2Ec: GILLDKLKNFAKTAGKGVLQSLLNTASCKLSGQC-OH Была исследована фрагментация серий модифицированных бревининов-1Е и -2Ес в режимах ДАС и ДЗЭ на приборах ИЦР ФП (Thermo LTQ FT 7 T и Bruker Apex 12 T), а также ДАС, ДАСПЭ и ДПЭ на приборе Thermo Orbitrap Velos.
Диссоциация, активированная соударениями модифицированного бревинина-1Е y-серии характеризуется преобладанием ионов из-за сосредоточения оснвных аминокислотных остатков на С-конце в "Rana box". Наиболее интенсивный сигнал в спектрах соответствует y22-иону, образующемуся при разрыве пептидной связи по N-концу пролина (см. рис. 12).
Рис. 12. Спектры ДАС (Орбитрэп) и ДАСПЭ бревинина-1Е, модифицированного NPM-6. С* — алкилированные остатки цистеина.
ДАСПЭ выгодно отличается от ДАС (как на приборах ИЦР ФП, так и на Орбитрэп) более интенсивной и протяженной y-серией ионов, которая позволяет определить бльшую часть последовательности (см. рис. 13). Лишь в случае IAA и IAA-1 ДАС дает более высокие результаты, чем ДАСПЭ (см. рис. 13). Кроме того, применение IAA-1 и низкоэнергетической ДАС позволяет полностью определить последовательность внутри "Rana box". Длинная y серия характерна для всех производных NPM.
Доля установленной последовательности для модифицированного бревинина-2Ес составила в большинстве случаев 40-60 % и при низкоэнергетической ДАС, и высокоэнергетической ДАСПЭ. Лишь при использовании NPM и NPM-3 в ДАС удалось достичь почти 80 % определения аминокислотной последовательности бревинина-2Ес. Практически во всех случаях наиболее интенсивная фрагментация наблюдается в С-концевой области пептида, что позволяет полностью определить последовательность в "Rana box" (рис. 14).
Рис. 13. Доли установленных последовательностей модифицированного бревинина-1Е при ДАС/ДАСПЭ: а) общее покрытие. б) покрытие в "Rana box", в) по b-серии, г) по y-серии. *- ДАС (ИЦР ФП) спектр не получен, **- ДАСПЭ спектр не получен.
Рис. 14. Интенсивности фрагментных ионов в ДАС (7 Т ИЦР ФП) бревинина-2Ес, модифицированного NPM, NPM-3 и IAA.
Отметим, что боковая COOH группа аспартата, содержащегося в бревинине-2Ес, не вызвала усиления фрагментации по соседним NH-CO-связям в условиях ДАС, что объясняется полипротонированным состоянием молекул пептида при электрораспылении.
Эффективность ДАС для нетриптических пептидов, содержащих несколько оснвных аминокислотных остатков, оказывается сравнительно невысокой. Однако при модифицировании SH-групп производными N-фенилмалеимида и IAA-1 в ДАС удается достичь определения~ 87 % последовательности бревинина-1Е и ~ 80 % бревинина-2Ес.
Использование ДЗЭ/ДПЭ дает возможность установить 82-87 % последовательности модифицированного бревинина-1Е. Наилучший результат в ДЗЭ для бревинина 1Е получен с использванием IAA и IAA-1, а в ДПЭ – при модифицировании с помощью NPM-1 (91 %, см.
рис. 15). Поскольку эта цифра достигнута за счет нескольких дополнительных малоинтенсивных разрывов, можно говорить об идентичности фрагментации бревинина 1Е в ДЗЭ и ДПЭ. Наиболее интенсивные сигналы соответствуют разрывам Asn11-Phe12 и в богатой протонированными остатками лизина и аргинина С-концевой части молекулы. Именно поэтому ДЗЭ/ДПЭ, в отличие от ДАС, позволяет установить сиквенсы в "Rana box" бревинина-1Е для большинства использованных реагентов.
Рис. 15. Спектр ДПЭ бревинина-1Е, модифицированного NPM-1.
С* — алкилированные остатки цистеина.
ДЗЭ дала богатую фрагментацию модифицированного бревинина-2Ес: для NBM и NPM-3-производных удалось определить до 94 % последовательности, при этом спектр содержит очень длинную высокоинтенсивную серию c-ионов, что повышает надежность de novo секвенирования (см. рис. 16). Легче всего происходят разрывы с образованием c8 – с20 ионов, то есть разрывы на участке пептида, богатом остатками лизина. Последовательность внутри "Rana box" также полностью определяется модифицированием с помощью NBM и NPM-3.
ДПЭ для бревинина-2Ес дает более низкий процент определения последовательности, чем ДЗЭ (рис. 17). Из рис. 17в и г видно, что ДЗЭ обеспечивает бльшую длину c-серии, а ДПЭ — z-серии, но поскольку c-ионы для бревинина-2Ес более интенсивны из-за N-концевых оснвных аминокислот, ДЗЭ полнее и надежнее определяет последовательность этого длинного пептида (34 аминокислотных звена).
Рис. 16. Спектр ДЗЭ (ИЦР ФП 12 Т) бревинина-2Ес, модифицированного NPM-3.
С* — алкилированные остатки цистеина.
Рис. 17. Доли установленной последовательности модифицированного бревинина-2Ec при ДЗЭ/ДПЭ:
а) общее покрытие. б) покрытие в "Rana box", в) по c-серии, г) по z-серии.
Суммируя данные фрагментации, полученные для дериватизованных бревининов (см.
табл. 4), можно сказать, что новые реагенты показали хорошую модифицирующую способность и высокий процент определения последовательности пептидов.
Для бревинина-1Е наилучшую фрагментацию обеспечили традиционные NPM и IAA и новые производные NPM, в случае бревинина-2Ес – новые NBM и IAA-1. ДАС и ДАСПЭ дали проценты установленной последовательности на уровне ДЗЭ/ДПЭ для бревинина-1Е, но в случае бревинина-2Ес ДЗЭ/ДПЭ значительно превосходит ДАС. Таким образом, ДЗЭ/ДПЭ является предпочтительным методом de novo секвенирования длинных пептидов, содержащих несколько оснвных аминокислотных остатков, в сравнении с традиционной ДАС.
Табл. 4. Доли установленных последовательностей модифицированных бревининов-1Е и -2Ес при использовании методов ДАС, ДАСПЭ, ДЗЭ и ДПЭ.
Бревинин-1Е, доля установленной последовательности, % NPM NPM-1 NPM-2 NPM-3 NPM-4 NPM-5 NPM-6 NPM-7 NBM IAA IAA-1 IAAC ДЗЭ 7T 45.8 н.о. 66.7 75.0 н.о. н.о. 73.9 н.о. 70.8 83.3 83.3 70. ДЗЭ 12T 87.0 52.2 52.2 73.9 43.5 82.6 82.6 69.6 26.1 87.0 87.0 82. ДПЭ 39.1 91.3 78.3 82.6 34.8 78.3 н.о. 65.2 69.6 69.6 39.1 78. ДАС 7T 83.3 н.о. 45.8 54.2 н.о. 45.8 43.5 34.8 62.5 83.3 87.0 37. ДАС Орб. 52.2 47.8 47.8 43.5 39.1 39.1 47.8 47.8 43.5 43.5 34.8 47. ДАСПЭ 87.0 87.0 82.6 78.3 69.6 78.3 87.0 87.0 н.о. 73.9 34.8 73. Бревинин-2Ес, доля установленной последовательности, % NPM NPM-1 NPM-2 NPM-3 NPM-4 NPM-5 NPM-6 NPM-7 NBM IAA IAA-1 IAAC ДЗЭ 7T 91.2 н.о. н.о. 79.4 н.о. н.о. н.о. н.о. 91.2 85.3 н.о. н.о.
ДЗЭ 12T 72.7 60.6 72.7 93.9 72.7 78.8 78.8 72.7 93.9 75.8 78.7 84. ДПЭ 78.8 66.7 69.7 78.8 57.6 63.6 45.5 69.7 90.9 48.5 93.9 81. ДАС 7T 79.4 20.6 38.2 79.4 н.о. 58.8 55.9 55.9 61.8 64.7 29.4 37. ДАС Орб. 57.6 51.5 63.6 48.5 48.5 54.5 57.6 57.6 57.6 54.5 60.6 66. ДАСПЭ 57.6 57.6 69.7 51.5 54.5 66.7 54.5 54.5 63.6 57.6 33.3 36. н.о. - спектр в данных условиях не получен.
На примере двух бревининов показано, что новые техники инициирования фрагментации, применяемые на Орбитрэп — ДПЭ и ДАСПЭ, позволяют получать величины покрытия их последовательностей не худшие, чем традиционные ДАС и ДЗЭ на приборах ИЦР ФП. Это важно из-за значительно меньшей, в сравнении с ИЦР ФП, стоимости покупки и эксплуатации приборов Орбитрэп, при равенстве аналитических характеристик, что обусловливает рост популярности Орбитрэп в протеомике.
Показано, что для повышения надёжности масс-спектрометрического de novo секвенирования пептидов необходимо использовать сумму методов, дающих комплементарную структурную информацию. В частности, по сумме спектров ДПЭ и ДАСПЭ, регистрируемых на приборе Орбитрэп, можно практически полностью определять последовательности и бревинина-1Е (с IAA, IAAC, NPM-1 – 6), и бревинина-2Ес (с NBM, NPM, IAA-1). Пример комплементарности фрагментации в ДПЭ и ДАСПЭ показан на рис. для бревинина-2Ес, модифицированного NBM: ДАСПЭ (b/y-ионы) позволяет надежно установить последовательность С-концевого фрагмента, ДПЭ (с/z-ионы)— остальную часть последовательности, включая N-конец пептида.
Рис. 18. Фрагментация ДАСПЭ и ДПЭ бревинина-2Ес, модифицированного NBM.
С* – алкилированные остатки цистеина.
Полученные результаты фрагментации модифицированных бревининов-1Е и -2Ес при электрораспылении в настоящей работе были дополнительно сравнены с распадом этих пептидов в условиях МАЛДИ-РПИ.
Было показано, что в МАЛДИ оказалось возможным исследовать исходные пептиды, проводя их восстановление непосредственно на мишени смешиванием растворов пептида с дитиотреитолом в буфере NH4HCO3.
При восстановлении бревинина-1Е в его МАЛДИ спектре появляются сигналы ионов, соответствующих разрывам в "Rana box" (y2-y6 на рис. 19). Интенсивности сигналов этих ионов восстановленного бревинина-1Е невелики, а у бревинина-2Ес они полностью отсутствуют.
Таким образом, для надежного de novo секвенирования обоих бревининов в МАЛДИ также требуется химическая модификация тиольных групп. В табл. 5 суммированы результаты определения последовательностей модифицированных бревининов по интенсивным (S/N10) сигналам. Для повышения надежности определения последовательности было использовано усреднение двух параллельных тандемных спектров каждого модифицированного пептида.
Рис. 19. Спектры МАЛДИ-ВП/ВП нативного и восстановленного на мишени бревинина-1Е Табл. 5. Покрытия последовательностей (по ионам с S/N10) восстановленных и модифицированных бревининов, полученные с помощью МАЛДИ-ВП/ВП.
Бревинин-1Е, доля установленной последовательности, % Восст. NPM NPM-1 NPM-2 NPM-3NPM-4NPM-5 NPM-6 NPM-7 NBM IAA IAA-1 IAAC IAAC б.о.
Общее 87.5 29.2 50.0 87.5 83.3 41.7 16.7 25.0 13.0 87.5 79.2 79.2 41.7 54. "Rana box" 85.7 42.9 85.7 100.0 100.0 57.1 28.6 42.9 0.0 85.7 71.4 100.0 42.9 57. Бревинин-2Ес, доля установленной последовательности, % Восст. NPM NPM-1 NPM-2 NPM-3NPM-4NPM-5 NPM-6 NPM-7 NBM IAA IAA-1 IAAC IAAC б.о.
Общее 64.7 58.8 64.7 55.9 55.9 55.9 50.0 14.7 3.0 58.8 64.7 52.9 14.7 55. "Rana box" 14.3 28.6 14.3 28.6 14.3 28.6 28.6 28.6 0.0 14.3 14.3 0.0 14.3 14. б.о. – спектр получали без очистки от избытка IAAC.
Наилучшие результаты для секвенирования 24-звенного бревинина-1Е в МАЛДИ ВП/ВП получены при использовании реагентов NPM-2 и NBM (до 88% покрытия последовательности), тогда как полностью установить последовательность внутри "Rana box" удалось после модифицирования тиольных групп с помощью NPM-2, -3 и IAA-1. В отличие от диссоциации, активированной соударениями при электрораспылении, в МАЛДИ фрагментация происходит в условиях дефицита протонов, что проявляется в разном характере фрагментации одних и тех же пептидов. В частности, для бревинина-1Е в условиях спектрах наиболее интенсивными являются y15 – y20 -ионы, тогда как в ДАС/ДАСПЭ в МАЛДИ-РПИ доминируют начальные b- и y-ионы.
Наилучший результат секвенирования модифицированного бревинина-2Ес с помощью МАЛДИ-РПИ (до 65% последовательности) был получен при использовании реагентов NPM 1 и IAA. Ни один их протестированных реагентов не усилил фрагментацию С-концевой части бревинина-2Ес: во всех случаях наиболее интенсивная фрагментация наблюдалась в N концевой и средней части полипептидной цепи. Высокую интенсивность имеет y29-ион, образование которого в условиях дефицита протонов облегчается, благодаря СООН-группе аспартата. СООН группы йодуксусной кислоты не дали похожего эффекта в пептидах, модифицированных с помощью IAAC.
Отсутствие очистки от избытка йодуксусной кислоты после дериватизации приводит к увеличению процента покрытия (табл. 5) и повышению интенсивности сигналов в МАЛДИ ВП/ВП.
Выводы 1. Показано, что в условиях ВЭЖХ-МС/МС анализа при захвате электронов в немодифицированных дисульфидсодержащих пептидах происходит разрыв внутримолекулярной S—S-связи с фрагментацией амидных связей внутри цистеинового цикла, что следует учитывать как при ручном, так и при автоматическом секвенировании.
Наличие С-терминальных остатков лизина усиливает фрагментацию внутри дисульфидного цикла таких пептидов в условиях захвата электронов.
2. Обнаружена новая фрагментация немодифицированных дисульфидсодержащих пептидов, протекающая при активации столкновениями в условиях ВЭЖХ-МС/МС анализа.
Образующийся при разрыве С-концевой амидной связи линейный молекулярный ион исходного пептида распадается далее по амидным связям с образованием фрагментных ионов, позволяющих установить С-концевую последовательность пептида. Учет нового направления распада повышает эффективность масс-спектрометрического секвенирования дисульфидсодержащих пептидов.
3. Показано, что применение высокоэнергетической активации столкновениями de novo (ДАСПЭ) усложняет процедуру масс-спекрометрического секвенирования пролинсодержащих пептидов, поскольку провоцирует интенсивную вторичную фрагментацию. Для целей de novo секвенирования пролинсодержащих пептидов ее необходимо использовать в дополнение к низкоэнергетической активации фрагментации (ДАС).
4. Впервые на природной пептидной смеси показана эффективность дополнительного окисления S—S-связей по сравнению с традиционно используемым восстановлением/алкилированием для целей масс-спектрометрического обнаружения и секвенирования дисульфидсодержащих компонентов при ВЭЖХ-МС/МС. Полученные результаты доказывают эффективность процедуры окисления как для ручного, так и автоматического секвенирования, и, в первую очередь, аргининсодержащих дисульфидных пептидов. Использование обеих процедур позволяет определять последовательности нетриптических пептидов полностью. Предложена методика подготовки природных пептидных смесей с дисульфидсодержащими компонентами для их последующего эффективного масс-спектрометрического секвенирования.
5. Протестировано влияние 12 цистеинмодифицирующих, в том числе девяти новых, реагентов на характер фрагментации дисульфидсодержащих бревининов-1Е и -2Ес в различных условиях масс-спектрометрического эксперимента. Показано, что при использовании ДАС/ДАСПЭ и ДЗЭ/ДПЭ цистеинмодифицирующие реагенты на основе производных малеимида (NPM, NPM-3, NBM) и йодацетамида (IAA-1) являются более эффективными, чем традиционные йодацетамид и малеимид и позволяют определять последовательности длинных бревининов-1Е и -2Ес практически полностью.
Основное содержание работы изложено в следующих публикациях 1. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, E.A. Vorontsov, O.V. Klykov, S.V.
Ogourtsov, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. LC–MS/MS with 2D mass mapping of skin secretions’ peptides as a reliable tool for interspecies identification inside Rana esculenta complex // Peptides. 2012. V. 34. № 2. P. 296 – 302.
2. T.Yu. Samgina, E.A. Vorontsov, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, I.E. Nifant'ev, B. Kanawati, Ph. Schmitt-Kopplin, R.A. Zubarev, A.T. Lebedev. Novel cysteine tags for the sequencing of non-tryptic disulfide peptides of anurans: ESI-MS study of fragmentation efficiency // J. Am.
Soc. Mass Spectrom. 2011. V. 22. № 12. P. 2246 – 2255.
3. E.A. Vorontsov, T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, N.B. Poljakov, I.E. Nifant’ev, A.T. Lebedev.
MALDI-PSD fragmentation of the cystine-containing amphibian peptides with novel cysteine tags // Eur. J. Mass Spectrom. 2011. V. 17. № 1. P. 73 – 83.
4. Т.Ю. Самгина, В.А. Горшков, Е.А. Воронцов, К.А. Артеменко, С.В. Огурцов, Р.А.
Зубарев, А.Т. Лебедев. Масс-спектрометрическое изучение кожного пептидома бурой лягушки Rana temporaria из Звенигородской популяции // Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8.
№ 1. С. 7-14.
5. Т.Ю. Самгина, В.А. Горшков, Е.А. Воронцов, К.А. Артеменко, С.В. Огурцов, Р.А.
Зубарев, А.Т. Лебедев. Масс-спектрометрическое изучение пептидома кожного cекрета лягушки Rana lessonae // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 4. С. 261-270.
6. Т.Ю. Самгина, В.А. Горшков, Е.А. Воронцов, В.В. Багров, И.Э. Нифантьев, А.Т. Лебедев.
Новые цистеинмодифицирующие реагенты: эффективность дериватизации и влияние на выход сигналов протонированных молекул дисульфидсодержащих пептидов в масс спектрометрии матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации // Масс спектрометрия. 2009. Т. 6. № 3. С. 178-186.
7. T.Yu. Samgina, Ye.A. Vorontsov, K.V. Karandashev, A. T. Lebedev. Direct ECD and CID sequencing intra disulfide C-terminal loops of non-tryptic natural peptides. Proc of 19th International Mass Spectrometry Conference, Kyoto, Japan, 2012, S32-1040.
8. T.Yu. Samgina, Ye.A. Vorontsov, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, R.A. Zubarev, A.T.
Lebedev. CID or HCD: what is better for de novo sequencing of non-tryptic peptides? Proc. of 60th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Vancouver, BC, Canada, 2012, TP09 178.
9. V.A. Gorshkov, T.Yu.Samgina, Ye.A. Vorontsov, K.A. Artemenko, R.A. Zubarev, A.T.
Lebedev. Mass spectrometry to establish the skin secretory peptidome of ranid and hylid frogs.
Proc. of the 1st "Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countries Mass Spectrometry Workshop", Rehovot, Israel, 2010, p.52.
10. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, S.V. Kovalev, Ye.A. Vorontsov, R.A.
Zubarev, A. T. Lebedev. Amphibian skin peptidome: efficiency of mass spectrometric elucidation. Proc. of 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Salt Lake City, UT, USA, 2010, TP280.
11. A.T. Lebedev, T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, E.A. Vorontsov, R.A. Zubarev, K.A.
Artemenko. FT-ICR MS study of the skin peptidome of ranid and hylid frogs. Proc. 9th European FTMS Workshop, Lausanne, Switzerland, 2010, p. 41.
12. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov, K.A. Artemenko, S.V. Kovalev, Ye.A. Vorontsov, S.V.
Ogurtsov, A. T. Lebedev. Mass spectrometric sequencing of the skin peptides of amphibian inhabiting the territory of Russian Federation. Proc. 6th International Symposium on Amphibian and Reptilian Endocrinology and Neurobiology, Berlin, Germany, 2009, 22.
13. T.Yu. Samgina, Ye.A. Vorontsov, V.A. Gorshkov, N.B. Polyakov, K.A. Artemenko, I.E.
Nifant’ev, B. Kanawati, P. Schmitt-Kopplin, R.A. Zubarev, A. T. Lebedev. Novel cysteine derivatizing agents for the sequencing of nontryptic disulfide peptides of anurans: MS study of fragmentation efficiency. Proc of 18th International Mass Spectrometry Conference, Bremen, Germany, 2009, PWA-442.
14. T.Yu. Samgina, S.V. Kovalev, Ye.A. Vorontsov, V.A. Gorshkov, A.T. Lebedev. Bioactive peptides in the skin secretion of ranid and hylyd frogs: complex approach for the mass spectrometric de novo sequencing. Proc. of 57th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, 2009, ThP 186.
15. Т.Ю. Самгина, В.А. Горшков, Е.А. Воронцов, А.Т. Лебедев. Практические аспекты масс спектрометрического de novo секвенирования биоактивных пептидов ранидных и хилидных лягушек. Тезисы IV всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 2009, c. 135.
16. Е.А. Воронцов, В.А. Горшков, Н.Б. Поляков. Изучение влияния новых цистеинмодифицирующих реагентов на фрагментацию дисульфидсодержащих пептидов в условиях МАЛДИ-ВП/ВП. Тезисы III всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы», Москва, 2009, МБС 5.
17. T.Yu. Samgina, V.A. Gorshkov., K.A. Artemenko., Ye.A. Vorontsov., S.V. Kovalev, A.T.
Lebedev. MS study of the efficiency of derivatizing agents for the sequencing of disulfide peptides of anurans. Proc. of 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Denver, CO, USA, 2008, TPOO 424.
Благодарности Автор выражает благодарность к.х.н. Самгиной Т.Ю. (химический факультет МГУ), к.б.н. Огурцову С.В. (биологический факультет МГУ), д.х.н. Нифантьеву И.Э. (химический факультет МГУ) за ценные консультации в ходе данного исследования, а также Полякову Н.Б.
(ИБХ РАН), проф. Артеменко К.А. (Uppsala University, Sweden), проф. Зубареву Р.А.
(Karolinska Institutet, Sweden) и проф. P. Shmitt-Kopplin (HemholtzZentrum Munich, Germany) за предоставленные приборные возможности.