Определение аминокислот и их оптических изомеров в виде о-фталевых и дансильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
На правах рукописи
Чернобровкин Михаил Геннадьевич ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ В ВИДЕ о-ФТАЛЕВЫХ И ДАНСИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Специальность – 02.00.02 – аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2006
Работа выполнена в лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Научный консультант:
член-корреспондент РАН, профессор Шпигун О.А.
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Варламов В.П.
кандидат химических наук Яшин А.Я.
Ведущая организация:
Защита состоится декабря 2006 года в 16 ч. 15 мин. в аудитории 344 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:
119992, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.
Ломоносова.
Автореферат разослан ноября 2006 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Торочешникова И.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Аминокислотный анализ является хорошо изученным и в то же время развивающимся разделом современной аналитической химии. Определение аминокислот в продуктах питания, напитках и лекарственных препаратах имеет большое значение для контроля технологии производства, оценки качества сырья и готовой продукции, выявления фальсификатов. В последнее время актуально определение D изомеров аминокислот в пищевых продуктах и медицинских препаратах. Это связано с тем, что влияние на здоровье человека D-изомеров аминокислот изучено мало, но их небольшие количества могут появляться в пищевых продуктах при термической обработке, а в медицинских препаратах при использовании синтетических аминокислот. Наиболее успешно поставленные задачи позволяет решать обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с предколоночным переводом аминокислот в гидрофобные производные.
Для предколоночной дериватизации аминокислот предложено несколько десятков реагентов, из них наибольшими преимуществами обладают о-фталевый альдегид (ОФА) и 5 диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид (дансилхлорид).
о-Фталевый альдегид в присутствии серосодержащего нуклеофила быстро и количественно взаимодействует с аминокислотами при комнатной температуре. Актуальным является изучение устойчивости ОФА производных в процессе хроматографического разделения и выбор условий, в которых разложение производных минимально. Хиральные нуклеофилы образуют с аминокислотами диастереомерные производные, что позволяет определять оптические изомеры аминокислот. Известно несколько хиральных модификаторов аминокислот, но каждый из них проявляет энантиоселективность к ограниченной группе аминокислот. В связи с этим необходим поиск и изучение свойств новых, универсальных хиральных нуклеофилов для дериватизации аминокислот.
В отличие от ОФА дансилхлорид легко реагирует с вторичными и первичными аминогруппами, дансильные производные аминокислот устойчивы в условиях ВЭЖХ.
Недостаток дансилхлорида - длительность процесса дериватизации, поэтому важно изучение факторов, влияющих на скорость и выход реакции дериватизации, особый интерес представляет исследование воздействия температуры и микроволнового поля.
о-Фталевые и дансильные производные аминокислот обладают высокой флуоресценцией и светопоглощением. Селективность и чувствительность определения аминокислот в реальных объектах, что особенно важно при определении низких концентраций D-аминокислот, может повысить амперометрическое детектирование. Для его использования нужны дополнительные исследования, так как мало изучена электрохимическая активность аминокислот, модифицированных ОФА и хиральными нуклеофилами. Электрохимическое детектирование дансильных производных аминокислот до сих пор не применялось, между тем наличие электроактивных групп в структуре дансильных производных делает возможным их окисление и последующее амперометрическое детектирование.
Цель работы состояла в изучении условий предколоночной дериватизации аминокислот о-фталевым альдегидом и дансилхлоридом, выборе оптимальных условий разделения и детектирования аминокислот и их энантиомеров в виде производных и определении L- и D- аминокислот в фармацевтических препаратах и пиве. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить устойчивость производных аминокислот с реагентом о-фталевый альдегид/2 меркаптоэтанол (ОФА/2-МЭ) в процессе хроматографирования и провести оптимизацию условий их разделения;
изучить влияние состава подвижной фазы на селективность и эффективность разделения аминокислот и их оптических изомеров, модифицированных о-фталевым альдегидом в присутствии N-ацетил-L-цистеина (НАЦ);
исследовать энантиоселективность двух новых мультихиральных модификаторов аминокислот N-(R)-манделил-(S)-цистеина (НМЦ) и N-фенилацетил-(R)-фенилглицил-(S) цистеина (НФФЦ);
выбрать оптимальные условия для разделения и детектирования двадцати аминокислот в виде ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных;
показать возможность амперометрического детектирования ОФА/НАЦ производных аминокислот;
исследовать влияние температуры и микроволнового поля на дериватизацию аминокислот дансилхлоридом;
оптимизировать условия разделения и электрохимического детектирования дансильных производных аминокислот;
Научная новизна. Исследована устойчивость ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе разделения на колонке с гидрофобизированным силикагелем. Показано, что степень разложения производных не превышает 10% и уменьшается при повышении скорости потока подвижной фазы. Предложены новые мультихиральные модификаторы аминокислот N-(R)-манделил-(S)-цистеин и N-фенилацетил-(R)-фенилглицил-(S)-цистеин.
Проведено систематическое исследование влияния природы нуклеофильного реагента и состава подвижной фазы на разделение аминокислот и их оптических изомеров в виде ОФА производных. Показано, что N-(R)-манделил-(S)-цистеин обладает большей энантиоселективностью по сравнению с ранее изученными аналогами. Использование НМЦ для предколоночной дериватизации позволяет методом обращенно-фазовой ВЭЖХ разделить с высоким разрешением энантиомеры всех аминокислот, входящих в состав белков, кроме аргинина (Rs=0.7). Найдены условия электрохимического детектирования дансильных и ОФА/НАЦ производных аминокислот. Сопоставлены метрологические характеристики определения дансильных и ОФА/НАЦ производных аминокислот с использованием амперометрического, флуориметрического и спектрофотометрического детекторов.
Практическая значимость работы. Выбраны условия разделения о-фталевых производных энантиомеров двадцати аминокислот, содержащихся в пиве и являющихся активными компонентами лекарственных препаратов. После предколоночной дериватизации с ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ реагентами определен энантиомерный аминокислотный состав нескольких образцов пива и лекарственного препарата «Полиамин». Проведенные исследования показали, что D-аланин можно использовать в качестве маркера заражения пива молочнокислыми бактериями. Разработана методика определения аминокислот в виде дансильных производных методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.
Содержание аминокислот определено в препарате «Долголет».
На защиту выносятся следующие положения:
1. Результаты исследования устойчивости ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе хроматографического разделения.
2. Результаты изучения энантиоселективности N-(R)-манделил-(S)-цистеина и ее сравнения с уже известными хиральными модификаторами.
3. Совокупность данных о влиянии состава подвижной фазы на разделение ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных аминокислот.
4. Совокупность данных по определению оптимальных условий дериватизации аминокислот дансилхлоридом.
5. Данные по исследованию условий амперометрического детектирования ОФА/НАЦ и дансильных производных аминокислот.
6. Условия и результаты определения аминокислотного состава пива и некоторых лекарственных препаратов.
Апробация работы. Основное содержание работы
изложено в 10 публикациях.
Результаты исследований доложены на VIII Всероссийском симпозиуме по жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, 2001 г.), Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2003» (Москва, 2003 г.), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографическое оборудование» (Москва, 2004 г.), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), International Congress on Analytical Sciences «ICAS-2006» (Moscow, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей и 5 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста, содержит 51 рисунок и таблиц, в списке цитируемой литературы 117 наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы Систематизированы сведения о реагентах для предколоночной дериватизации аминокислот в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Проведено сравнение основных видов детектирования производных аминокислот.
Обсужден механизм дериватизации аминокислот о-фталевым реагентом, факторы влияющие на получение, устойчивость и разделение о-фталевых производных аминокислот.
Проанализированы свойства и особенности строения хиральных нуклеофилов, используемых совместно с о-фталевым альдегидом для модификации аминокислот. Рассмотрены основные типы взаимодействий в молекуле диастереомеров, влияющие на энантиоселективность разделения.
Обсуждены факторы, влияющие на получение и хроматографическое разделение дансильных производных аминокислот.
Экспериментальная часть Для приготовления исходных растворов аминокислот (5 мг/мл) использовали D и L изомеры из стандартного набора аминокислот (Сигма, США). Сокращенные обозначения аминокислот приведены в табл. 1.
В качестве хиральных модификаторов аминокислот применяли: оптически чистые N ацетил-L-цистеин (НАЦ), N-изобутирил-L-цистеин (ИБЛЦ), N-ацетил-D-пеницилламин (НАП) «ChiraSelect» (Fluka, USA).
Таблица 1. Исследованные аминокислоты Название Обозначение Название Обозначение Аргинин Arg Аланин Ala Валин Val Аспарагин Asn Гистидин His Аспарагиновая кислота Asp Изолейцин Ile Глицин Gly Лейцин Leu Глутаминовая кислота Glu Лизин Lys Глутамин Gln Метионин Met Пролин Pro Треонин Thr Серин Ser Триптофан Trp Тирозин Tyr Фенилаланин Phe Цистин Cys-Cys -аланин -Ala -аминомасляная кислота GABA Новые хиральные реагенты: N-(R)-манделил-(S)-цистеин (НМЦ) и N-фенилацетил (R)-фенилглицил-(S)-цистеин (НФФЦ) были синтезированы и предоставлены к.х.н. Гуранда Д.Т. и проф. Швядасом В.К. (факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова).
В работе использовали жидкостной хроматограф фирмы «Shimadzu» (Япония) SLC 10A со спектрофотометрическим и флуориметрическим детектором RF-10Axl;
хроматограф HP 1050 фирмы «Agilent Technologies» (США) с автоматическим инжектором, диодно матричным детектором;
жидкостной аналитический малогабаритный хроматограф «Цвет Яуза» (Россия) с амперометрическим детектором и насосом для ВЭЖХ «Марафон–2». Объём вводимой пробы составлял 20 мкл.
Для получения дансильных производных аминокислот применяли микроволновую печь «ETHOS touch control» фирмы «Milestone» (Италия) при фиксированной частоте МГц при температуре 40°С. Спектры поглощения снимали в диапазоне 180–500 нм на спектрофотометре фирмы «Shimadzu» UV-2201. В работе использовали центрифугу мощностью 8000 об/мин. и ультразвуковую баню УЗВ-4.0 л («Сапфир», Россия).
рН водных растворов контролировали на рН-метре MP 220 (Mettler Toledo, Щвейцария).
Для разделения производных аминокислот использовали стальную колонку ( мм), заполненную сорбентом «Hypersil BDS-C18» (5 мкм) фирмы «Agilent Technologies» и стальную колонку (150х4.6 мм), заполненную сорбентом «Mightysil RP-18» (5 мкм) фирмы «Kanto Chemical Co. Inc.» (Япония). В качестве подвижных фаз использовали смеси ацетонитрила, метанола с различными буферными растворами.
Для получения производных аминокислот с о-фталевым альдегидом совместно использовали различные нуклеофильные серосодержащие компоненты.
ОФА/2-МЭ реагент получали по стандартной методике, которая была несколько изменена: растворы ОФА и 2-МЭ в метаноле готовили отдельно. Оба раствора хранили при температуре – 20 0С. Реагент готовили непосредственно в день анализа, смешивая растворы ОФА и 2-МЭ (массовое отношение ОФА:2-МЭ=1:1) в 0.1 М Na2B4O7 (pH 9.6).
о-Фталевый реагент для определения оптических изомеров аминокислот получали, растворяя навески ОФА и хирального SH-реагента в метаноле (массовое отношение нуклеофил/ОФА равно 1.4). Для перевода анализируемых соединений в производные к смеси аминокислот или анализируемому образцу последовательно добавляли ОФА реагент и 0.1 М раствор Na2B4O7 (pH 9.6), смесь перемешивали в течение 2-4 минут. Дериватизацию проводили при 3-100 кратном избытке реагента по отношению к суммарному количеству аминокислот.
Для получения дансильных производных аминокислот раствор 5 диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида (0.75 мг/мл) готовили по точной навеске растворением в смеси ацетонитрил: вода (7:3) на ультразвуковой бане, его использовали в день приготовления. Дансильные производные готовили непосредственно перед проведением эксперимента по следующей методике: аликвоты смеси аминокислот или анализируемого образца смешивали с раствором реагента (1:1.5) в среде боратного буферного раствора с pH 9.6. Реакцию проводили при комнатной температуре в затемнённом месте в течение 50 минут.
Исследование устойчивости ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе разделения на колонке с гидрофобизированным силикагелем Использование о-фталевого альдегида совместно с серосодержащими нуклеофильными агентами для предколоночной дериватизации аминокислот дает возможность успешно разделять и определять аминокислоты методом ВЭЖХ. Образование производных происходит по реакции:
O SR' H + + NR H2NR R'SH H O Некоторые о-фталевые производные аминокислот могут разлагаться в ходе анализа, что негативно влияет на метрологические характеристики метода. В работе предложен метод, позволяющий оценить устойчивость ОФА/2-МЭ производных аминокислот на колонке с гидрофобным силикагелем в процессе их хроматографирования. Степень разложения производных аминокислот оценивали по величине пика о-фталевого альдегида на хроматограмме производных, полученных при 3-5 кратном избытке аминокислоты. о Фталевый альдегид, регистрируемый при хроматографировании ОФА/2-МЭ производных, образуется в результате их распада в колонке. Детектирование проводили флуориметрически с переключением длины волны: пик ОФА детектировали при возб.=250 нм, регистр.=285 нм, производных аминокислот – возб.=280 нм, регистр.=440 нм. Предварительно показано, что зависимость площади пика ОФА от его концентрации описывается уравнением S=31.8*С (мМ/л) с коэффициентом корреляции 0.999.
Изучена устойчивость производных Trp, -Ala, Met, Val и Leu, которые по литературным данным разлагаются наиболее заметно. Влияние на степень разложения ОФА/2-МЭ производных четырех аминокислот скорости потока подвижной фазы показано в табл. 2. Данные свидетельствуют, что ОФА/2-МЭ производные триптофана, -аланина, метионина не разлагаются в процессе хроматографического разделения. Производные валина и лейцина частично разлагаются на колонке, причем степень разложения увеличивается при переходе от валина к лейцину. Разложение изучаемых производных увеличивается с уменьшением скорости потока подвижной фазы, следовательно, оптимальной является скорость потока элюента равная или больше 0.5 мл/мин.
Таблица 2. Степень разложения ОФА/2-МЭ производных аминокислот. Концентрация аминокислоты 100 мг/л Производное Степень Степень Степень аминокислоты разложения, % разложения, % разложения, % (скорость потока 0.3 (скорость потока 0.5 (скорость потока 0. мл/мин) мл/мин) мл/мин) 0.1* ОФА/2-МЭ-Trp 0.1* 0.1* * ОФА/2-МЭ-Met 0.1 0.1* 0.1* 0.1* 0.1* 0.1* ОФА/2-МЭ--Ala ОФА/2-МЭ-Val 7.9±0.4 0.1* 0.1* ОФА/2-МЭ-Leu 9.7±0.5 4.3±0.3 0.1* * - минимально детектируемое количество Кроме того, данный вариант предколоночной дериватизации позволяет разделять и определять обращенно-фазовой ВЭЖХ не только смеси аминокислот, но и их оптических изомеров, т.к. при взаимодействия D,L-аминокислоты с ОФА в присутствии оптически активного серосодержащего соединения образуется смесь двух диастереомеров.
Изучено влияние состава и pH элюента на удерживание и селективность разделения диастереомеров ОФА/НАЦ производных аминокислот. На примере разделения диастереомеров Asn, Asp, Ser, и His, показано, что метанол обеспечивает большую селективность разделения диастереомеров аминокислот, чем ацетонитрил. Можно предположить, что метанол, сольватируя ОФА/НАЦ производные аминокислот, образует водородные связи с полярными группами сорбатов и изменяет конформацию диастереомеров, что способствует их разделению. При элюировании подвижной фазой, содержащей метанол, полностью разрешены диастереомеры Asp (RS=1.1) и Ser (RS=1.4), частично His (RS=0.8) и Asn (RS=0.6), в то время как, элюент, содержащий ацетонитрил, позволяет частично разделить только диастереомеры Asp (RS=0.49). pH подвижной фазы варьировали в диапазоне 5.0-7.0, так как в кислой среде ОФА производные аминокислот неустойчивы, а при pH7 возможно негативное влияние элюента на сорбент. На рис. показана зависимость разрешения пиков диастереомеров Asp, Arg, Tyr и Phe от pH подвижной фазы. Для разделения выбранной смеси аминокислот применяли градиентное элюирование. Заметное влияние pH элюента оказывает на разделение ОФА/НАЦ производных Asp, Tyr и Phe. Разделение диастереомеров Phe и Tyr улучшается при увеличении pH элюента с 5.0 до 6.0, максимальная селективность разделения наблюдается для диастереомеров Tyr. Можно предположить, что гидроксильная группа Tyr образует внутримолекулярные водородные связи в молекуле производного с находящейся рядом карбоксильной группой. Подобное взаимодействие вызывает конформационные различия между диастереомерами и повышает селективность хирального разделения. Оптимальным для разделения диастереомеров сложной смеси аминокислот является pH 6.0.
RS Рис. 1. Влияние pH подвижной фазы на разрешение диастереомеров аминокислот.
1-ОФА/НАЦ-D,L-Phe, 2-ОФА/НАЦ-D,L-Arg, 3-ОФА/НАЦ-D,L-Asp, 4-ОФА/НАЦ-D,L-Tyr.
5.0 5.5 6.0 6.5 7. pH Для элюирования ОФА/НАЦ производных аминокислот использовали подвижную фазу, содержащую метанол и 0.01 М Na2HPO4 (pH 6.0), разделение многокомпонентной смеси ОФА/НАЦ производных аминокислот проводили, используя градиентное элюирование. Лучшее разрешение смеси оптических изомеров двадцати аминокислот, входящих в состав пищевых продуктов и медицинских препаратов, возможно в следующем режиме градиентного элюирования: 0 мин, 20%A, 80%B;
10 мин, 20%A, 80%B;
34 мин, 32%A, 68%B;
47 мин, 43%A, 57%B;
51 мин, 48%A, 52%B;
56 мин, 48%A, 52%B;
67 мин, 54%A, 46%B;
75 мин, 65%A, 35%B, 78 мин, 85%A, 15%B, 100 мин, 85%A, 15%B, где A-метанол, B 0.01 М Na2HPO4. Хроматограмма смеси представлена на рис. 2. ОФА/НАЦ реагент перспективен для определения L-изомеров аминокислот, несмотря на неполное разделение дериватизированных Gly и L-Thr, GABA и L-Ala, L-Met и L-Trp.
Рис. 2. Хроматограмма смеси ОФА/НАЦ производных аминокислот. Колонка «Mightysil RP 18» (4.6х150 мм). Подвижная фаза: метанол/Na2HPO4 0.01 М (pH 6.0), градиентное элюирование (см. текст). Скорость потока 0.5 мл/мин. Детектор – диодно-матричный (= нм).
1=D-Asp, 2=L-Asp, 3=D,L-Glu, 4=D,L-Asn, 5=D-Ser, 6=L-Ser, 7=L-Gln, 8=D-Gln, 9=D-His, 10=L-His+D-Thr, 11=L-Thr, 12=Gly, 13=L-Arg, 14=D-Arg, 15=-Val, 16=D-Ala, 17=GABA, 18=L-Ala, 19=L-Tyr, 20=D-Tyr, 21=L-Val, 22=D-Met, 23=L-Met, 24=L-Trp+D-Val, 25=D Phe+D-Trp, 26=L-Phe, 27=L-Ile, 28=Lys+D-Ile, 29=D-Leu, 30=L-Leu.
Изучение свойств нового хирального реагента N-(R)-манделил-(S)-цистеина В работе предложены новые реагенты N-(R)-манделил-(S)-цистеин и N-фенилацетил (R)-фенилглицил-(S)-цистеин, свойства которых изучали в сравнении с наиболее селективными из ранее описанных нуклеофильных агентов: N-ацетил-L-цистеином, N изобутирил-L-цистеином (ИБЛЦ), N-ацетил-D-пеницилламином (НАП) (табл. 3).
Таблица 3. Структурные формулы использованных нуклеофильных реагентов Хиральный Структурная формула Хиральный Структурная формула реагент реагент N-ацетил-L- N-фенилацетил- O O HS HS * * C цистеин (НАЦ) (R)-фенилглицил C OH (S)-цистеин OH N N (НФФЦ) * H3C O O N N-ацетил-D- O O HS * пеницилламин C H3C (НАП) OH CH3 N H3C O N-изобутирил-L- N-(R)-манделил O O HS HS * * цистеин (ИБЛЦ) (S)-цистеин (НМЦ) C C OH N OH N H3 C * HC O O H3 C OH Разрешение и порядок элюирования диастереомеров Asp, Arg, Tyr и Phe приведены в табл. 4.
Как видно из таблицы, полное разделение диастереомеров Tyr достигается при использовании всех четырех SH-реагентов, диастереомеры Phe полностью разделяются после взаимодействия с ОФА/НФФЦ, ОФА/НМЦ и ОФА/ИБЛЦ. Лучшая энантиоселективность получена для ОФА/НФФЦ-D,L-Phe и ОФА/НМЦ-D,L-Phe. Этот факт Таблица 4. Влияние природы нуклеофильного реагента на разрешение и порядок элюирования диастереомеров аминокислот.
Модификатор Asp Arg Tyr Phe RS Порядок RS Порядок RS Порядок RS Порядок элюиро- элюиро- элюиро- элюиро вания вания вания вания ОФА/НАП 0 --- 1.7 L,D 1.2 D,L 0 -- ОФА/НАЦ 0.8 D,L 0.6 L,D 1.8 L,D 0.5 D,L ОФА/ИБЛЦ 0 --- 0.8 L,D 1.6 L,D 1.6 L,D ОФА/НМЦ 0.9 L,D 0.6 D,L 2.1 L,D 2.2 L,D ОФА/НФФЦ 1.1 L,D 0 --- 1.9 L,D 1.9 L,D можно объяснить - взаимодействиями между бензольными кольцами Phe и хирального селектора (НМЦ и НФФЦ), которые придают жесткость молекуле производного и увеличивают разницу в гидрофобности диастереомеров.
Лучшей энантиоселективностью среди всех реагентов обладает НМЦ, этот модификатор и был выбран в работе для дальнейшего исследования. Дериватизация аминокислот ОФА/НФФЦ реагентом приводит к образованию чрезвычайно гидрофобных и сильноудерживаемых производных кроме того, он не позволяет разделить пики D,L-Arg и L Tyr. Самым селективным из уже известных хиральных модификаторов оказался НАЦ.
Сравнивая энантиоселективность НМЦ и НАЦ для всех изучаемых аминокислот, можно отметить, что НМЦ позволяет разделить большее количество оптически активных аминокислот (табл. 5). На рис. 3 показана хроматограмма смеси двадцати аминокислот, модифицированных ОФА/НМЦ реагентом.
Рис. 3. Хроматограмма смеси ОФА/НМЦ производных аминокислот. Условия хроматографирования см. рис. 2. 1=L-Asp, 2=D-Asp, 3=L-Glu, 4=D-Glu, 5=L-Asn, 6=D-Asn, 7=L-Ser, 8=L-Gln, 9=D-Ser, 10=D-Gln, 11=D-His, 12=L-Thr, 13=Gly+L-His, 14=D-Thr, 15=D Arg, 16=L-Arg, 17=-Ala, 18=L-Ala, 19=L-Tyr+GABA, 20=D-Ala, 21=D-Tyr, 22=L-Met+L-Trp, 23=L-Val, 24=L-Phe, 25=D-Met, 26=D-Trp, 27=D-Val, 28=D-Phe, 29=L-Ile, 30=L-Leu, 31=L Lys, 32=D-Ile, 33=D-Lys, 34=D-Leu.
Однако после дериватизации с ОФА/НМЦ совместно элюируются Gly и L-His, L-Trp и L Met, L-Tyr и GABA, тогда как применение ОФА/НАЦ реагента позволяет разделить и между собой все L-аминокислоты. Можно сделать вывод, что НМЦ больше подходит для разделения и определения D-изомеров аминокислот, а НАЦ - для анализа L-аминокислот.
Таблица 5. Хроматографические параметры разделения и порядок элюирования диастереомеров ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных аминокислот ОФА/НАЦ производные ОФА/НМЦ производные Аминокислота Фактор Коэффициент Разрешение Порядок Фактор Коэффициент Разрешение Порядок 1 емкости селективности элюирования емкости селективности элюирования 0.25 1.54 1.31 D,L 3.30 1.16 1.34 L,D Аспарагиновая кислота Глутаминовая 1.01 1 0 ---- 6.27 1.12 1.60 L,D кислота Аспарагин 1.50 1 0 ---- 7.77 1.12 2.43 L,D Серин 1.85 1.15 1.24 D,L 8.95 1.15 3.99 L,D Глутамин 2.57 1.06 0.83 L,D 9.90 1.06 1.65 L,D Гистидин 3.58 1.04 0.65 D,L 11.78 1.12 3.15 D,L Треонин 3.71 1.38 4.38 D,L 12.51 1.08 2.74 L,D Аргинин 6.00 1.04 0.91 L,D 13.78 1.01 0.73 D,L Аланин 9.11 1.09 2.35 D,L 15.17 1.11 4.67 L,D Тирозин 12.60 1.09 3.92 L,D 16.46 1.06 3.65 L,D Триптофан 17.14 1.06 4.84 L,D 19.50 1.13 7.27 L,D Метионин 16.67 1.01 0.98 D,L 19.50 1.09 5.32 L,D Валин 16.30 1.05 3.37 L,D 20.08 1.11 6.07 L,D Фенилаланин 18.27 1.01 0.85 D,L 21.04 1.08 6.04 L,D Изолейцин 18.92 1.05 3.09 L,D 22.81 1.08 7.46 L,D Лейцин 20.90 1.02 1.80 D,L 23.72 1.05 4.00 L,D Лизин 20.21 1 0 ---- 24.24 1.02 2.20 L,D Фактор емкости для первого элюируемого диастереомера В работе оптимальная селективность и эффективность разделения ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных аминокислот достигнуты в одних и тех же хроматографических условиях, что сильно упрощает последовательное использование НАЦ и НМЦ в аминокислотном анализе.
Электрохимическое детектирование ОФА/НАЦ производных аминокислот Обычно для детектирования ОФА производных аминокислот используется чрезвычайно чувствительный флуориметрический детектор, более дешевый электрохимический детектор может быть альтернативным. Нами изучено амперометрическое детектирование аминокислот, модифицированных ОФА/НАЦ реагентом.
Исследование проводили на примере девяти различных по строению аминокислот: Gly, Ala, -Ala, Arg, His, Thr, Asn, Tyr и Ser. Зависимость величины тока окисления от приложенного потенциала (рис. 4) показывает, что ОФА/НАЦ производные аминокислот окисляются на стеклоуглеродном электроде, и оптимальный потенциал для детектирования равен 1000 мВ.
Разделение ОФА/НАЦ производных аминокислот проводили в изократическом режиме с подвижной фазой, содержащей ацетонитрил, что дало возможность максимально увеличить чувствительность детектора (рис. 5). Сравнение пределов обнаружения амперометрического и флуориметрического детекторов показало, что в обоих вариантах достигается примерно одинаковая чувствительность детектирования. Эти детекторы на два порядка чувствительнее спектрофотометрического (табл. 6).
Рис. 4. Зависимость площади Sпика пика производного аминокислоты от потенциала 4 стеклоуглеродного электрода.
1-ОФА/НАЦ-L-Arg, 2 ОФА/НАЦ-L-Ser, 3-ОФА/НАЦ L-Tyr, 4-ОФА/НАЦ-Gly, 5 3000 ОФА/НАЦ--Ala, 6-ОФА/НАЦ L-Ala, 7-ОФА/НАЦ-L-Thr, 8 ОФА/НАЦ-L-His, 9-ОФА/НАЦ L-Asn. Концентрация аминокислоты 9.0*10-5 М.
700 800 900 1000 1100 1200 Е,мВ Рис. 5. Хроматограмма стандартной смеси аминокислот после модификации ОФА/НАЦ реагентом. Колонка «Hypersil BDS-C18» (4.0х125 мм). Подвижная фаза:
ацетонитрил/Na2HPO4 0.01 М, pH 6.0 (8/92). Скорость потока 0.8 мл/мин. Детектор – амперометрический, индикаторный электрод – стеклоуглеродный (Е=1000 мВ). 1=реагент, 2=L-гистидин, 3=L-аргинин,4=L-аланин.
Таблица 6. Пределы обнаружения ОФА/НАЦ производных аминокислот при использовании различных детекторов (n=3, P=0.95) Предел обнаружения (мг/л) Аминокислота Амперометрическое Флуориметрическое Диодно-матричное детектирование детектирование детектирование 2.3 *10-3 2.6 *10- L-Ser 0. 4.5*10-3 3.8*10- L-His 0. 1.7*10-3 1.510- L-Ala 0. 3.2*10-3 2.910- L-Tyr 0. 2.7*10-3 3.610- L-Arg 1. Определение аминокислот в виде дансильных производных Дансилхлорид взаимодействует с первичными и вторичными аминогруппами аминокислот по следующей схеме:
CH CH N CH N CH R O HC C + H2N OH OH HC OSNC O S Cl H O O R O Основным недостатком реагента являются длительность (минимальное время 20- мин) и сложность дериватизации аминокислот, так как количественный выход дансилирования аминокислот уменьшает протекание конкурентных реакций.
В оптимальных для дериватизации аминокислот (см. с.8) условиях изучено влияние нагревания и действие микроволнового излучения (МВ) при 40°С на полноту и скорость образования дансильных производных. Использование МВ излучения или нагревания заметно ускоряет образование дансильных производных аминокислот, но степень образования продукта реакции в этих условиях меньше, чем при нахождении образца при комнатной температуре. Нагревание до 400С уменьшает выход производных на 20%, а МВ излучение в 3 раза (табл. 7). Необходимо отметить, что использование МВ излучения позволяет повысить воспроизводимость выхода реакции дериватизации и аналитического сигнала.
Таблица 7. Сравнительная характеристика условий получения дансильных производных аминокислот при полуторном избытке дансилхлорида Комнатная Водяная баня, Микроволновое температура (40±4)°C поле, 40°C (18±4) °C Соединение Время образования, мин 50 10 Выход, % (n=3, P=0.95) Дансил-Ser 41±3 35±2 14.0±0. Дансил-Val 89±4 71±3 33.2±0. Дансил-Leu 92±5 75±4 33.4±0. Дансильные производные аминокислот обладают высоким светопоглощением и превосходной флуоресценцией, поэтому для их определения обычно используют спектрофотометрический или флуориметрический детектор. Так как дансильные производные аминокислот имеют электроактивные группы (амино-группы и нафтильный фрагмент), исследовано их электрохимическое детектирование. Из производных семнадцати изученных аминокислот (Ser, Val, Leu, Phe, Trp, Ile, Met, Asn, Arg, Gly, -Ala, Tyr, Cys-Cys, His, Thr, Lys, Glu) отклик дали четырнадцать;
производные His, Cys-Cys, Glu детектировать не удалось. Оптимальное значение потенциала детектирования дансилированных аминокислот составляет 1100 мВ (рис. 6).
Показано, что пределы обнаружения амперометрического детектирования на два порядка ниже, чем спектрофотометрического и сравнимы с флуориметрическим. Например, для дансил-Leu предел обнаружения для спектрофотометрического, флуориметрического и электрохимического детектора равен соответственно 2.8*10-2 мг/л, 1.1*10-4 и 1.3*10-4 мг/л.
Амперометрическое детектирование аминокислот предпочтительнее использовать в изократическом режиме элюирования, тогда достигается наилучшая чувствительность определения. В работе использовали изократическое элюирование и в соответствии со Sпика Sпика а б 2 4 5 6 0 700 800 900 1000 1100 1200 1300 700 800 900 1000 1100 1200 E, мВ E, мВ Рис. 6. Зависимость площадей пиков дансильных производных аминокислот от потенциала рабочего электрода. а: 1 – дансил-Trp, 2 – дансил-Phe, 3 – дансил-Leu, 4 – дансил-Val, 5 – дансил-Arg, 6 – дансил-Ser;
б: 1 – дансил-Met, 2 – дансил-Tyr, 3 – дансил-Gly, 4 – дансил-Ile, 5 – дансил-Ala, 6 – дансил-Thr, 7 – дансил-Asn. Концентрация аминокислоты 0.15 мМ.
значениями факторов емкости все аминокислоты разделили на слабоудерживаемые и сильноудерживаемые. К слабоудерживаемым отнесли аминокислоты: Thr, Gly, Lys, Arg, Tyr, к сильноудерживаемым: Val, Met, Ile, Leu, Trp, Phe. Разделение смеси всех аминокислот проводили в два этапа (рис. 7), используя два элюента: (17:83) ацетонитрил-фосфатный буферный раствор для разделения менее удерживаемых и гидрофобных дансильных производных аминокислот и (25:75) ацетонитрил-фосфатный буферный раствор для разделения более гидрофобных производных.
Рис. 7. Хроматограмма стандартной смеси дансильных производных аминокислот. Колонка «Hypersil BDS-C18» (125х4 мм), подвижная фаза: (а) 17/83 и (б) 25/ ацетонитрил/фосфатный буфер (рН=7.0, С=2х10-3М). Скорость потока 0.6 мл/мин. Детектор амперометрический детектор (Е=1100 мВ). а) 1 – дансилхлорид, 2 – дансил-Thr, 3 – дансил Gly, 4 – дансил-Lys, 5 – дансил-Arg, б) 1 – дансилхлорид, 2 – дансил-Val, 3 – дансил-Met, 4 – дансил-Ile, 5 – дансил-Leu, 6 – дансил-Trp, 7 – дансил-Phe.
Определение аминокислот и их энантиомеров в пиве Для получения пива со стабильно хорошими органолептическими показателями, для устранения дефектов вкуса и аромата, связанных с высокими концентрациями высших спиртов и диацетила, в ходе брожения в пиве необходимо определять L-аминокислоты.
Нормы по содержанию L-аминокислот в пиве утверждены Среднеевропейской технической аналитической комиссией по пивоварению (МЕБАК). Данных по определению D-изомеров аминокислот в пиве мало, однако известно, что D-аминокислоты можно использовать для установления подлинности отдельных сортов пива.
Определение в пиве аминокислот и их энантиомеров проводили после дериватизации с ОФА/2-МЭ или ОФА/НАЦ реагентом. Для пробоподготовки образцов применяли метод твердофазной экстракции, полнота извлечения аминокислот составляла 96-100 %.
Идентификацию аминокислот проводили по временам удерживания индивидуальных соединений, достоверность результатов подтверждали методом «введено-найдено».
Определение аминокислот проводили методом внешнего стандарта. Предварительно установлено, что зависимость между площадью хроматографического пика производных и концентрацией аминокислоты в растворе линейна (R0.995).
Десять наиболее важных аминокислот определяли в образцах пива после получения ОФА/2-МЭ производных, разделение аналитов проводили в изократическом режиме, для детектирования использовали амперометрический и флуориметрический детекторы.
Результаты анализа пива «Очаковское специальное» (табл. 8) показывают, что концентрации всех аминокислот, кроме Trp, лежат в пределах норм, установленных комиссией МЕБАК. Для определения аминокислот и их оптических изомеров в пиве разных сортов использовали хиральный модификатор ОФА/НАЦ, свойства которого дают возможность найти в пиве все L-изомеры и некоторые D-изомеры аминокислот. Одна из полученных хроматограмм пива представлена на рис. 8.
Суммарное содержание аминокислот в пиве «Жигулевское» и «Балтика. Светлое №3» близко к нижней нормативной границе (табл. 9). Это может свидетельствовать о глубоком сбраживании основных питательных и вкусообразующих веществ и приводить к «пустоте» во вкусе. Низкое содержание Thr в образцах подтверждает, что все образцы пива получены брожением. Аминокислота Val присутствует в пиве в небольших концентрациях, что указывает на отсутствие больших количеств диацетила и нормальный ход брожения.
Интересно отметить, что концентрация L-Trp в исследуемых образцах, как и в ранее протестированном пиве «Очаковское специальное» выше нормы.
Таблица 8. Результаты определения аминокислот в пиве «Очаковское специальное» (n=3, P=0.95) Аминокислота В исследуемом растворе Концентрация в Нормируемая пиве, мг/л концентрация Добавлено, Найдено, (для стран ЕС), мг/л мг/л мг/л Arg 0 30- 7±1 100± 5 11± Gly 0 20- 3±1 40± 5 8± -Ala 0 _ 6±1 90± 5 10± Tyr 0 40- 8±2 100± 3 10± Val 0 50- 3±1 41± 6 9± Trp 0 1- 2.6±0.5 40± 6 10± Phe 0 10- 3.7±0.9 60± 6 10± Рис. 8. Хроматограмма пива «Очаковское классическое».
Детектор – флуориметрический (возб.=340 нм, регистр.=450 нм), условия разделения производных аминокислот см. рис. 2.
1=D-Asp, 2=L-Asp, 3=L-Glu, 4=L-Asn, 5=D-Ser, 6=L-Ser, 7=L-Gln, 8=L-His, 9=L-Thr, 10=Gly, 11=L-Arg, 12=-Ala, 13=D-Ala, 14=L-Ala+GABA, 15=L-Tyr, 16=L-Val, 17=L-Met, 18=L-Trp, 19= D-Phe+D-Trp, 20=L-Phe, 21=L-Ile, 22=L-Lys, 23=D-Leu, 24=L-Leu.
Таблица 9. Содержание аминокислот в пиве (n=3, P=0.95) Аминокислота Содержание аминокислот в пиве Нормативное содержание «Жигулевское» «Балтика. Светлое №3» «Очаковское классическое» аминокислот, 1 1 L-изомер, D-изомер, % L-изомер, D-изомер, % L-изомер, D-изомер, % мг/л мг/л мг/л мг/л L-Asp 9.0±0.2 14.8±0.7 6.0±0.2 18.2±0.6 22±1 2.2±0.2 20- L-Glu 20±1 12.2±0.7 27±2 30- L-Asn 5.4±0.2 3.4±0.1 9.3±0.6 L-Ser 2.3±0.2 14.7±0.5 5.7±0.3 20.8±0.7 10±1 5.8±0.3 10- L-Gln 8.4±0.5 4.7±0.3 9.5±0.4 L-His 50±2 44±2 38±2 20- L-Thr 0.90±0.05 2.9±0.2 4.4±0.2 5- Gly 23±1 25±1 41±2 20- L-Arg 24±1 37±2 88±4 30- -Ala 2.8±0.1 3.1±0.2 2.8±0.1 --- L-Ala 68±2 2.3±0.2 66±2 1.5±0.1 140±8 1.6±0.1 80- L-Tyr 29±1 64±2 82±4 40- L-Val 35±1 24±1 68±5 50- L-Met 6.7±0.2 5.4±0.2 8.9±0.4 2 2 L-Trp 33±1 1.3±0.1 37±2 3.5±0.2 45±2 2.0±0.1 1- L-Phe 46±2 27±1 78±4 10- L-Ile 5.7±0.4 3.9±0.2 24±1 10- L-Lys 20±1 18±1 51±3 10- L-Leu 11.2±0.5 2.8±0.2 3.6±0.1 12.4±0.4 53±3 0.40±0.02 10- Суммарное 368 366 804 336- содержание аминокислот 1 – содержание D-аминокислоты в процентах по отношению к сумме изомеров, 2 – суммарное содержание D-Trp и D-Phe Видно, что в пиве преобладают L-аминокислоты. Это объясняется тем, что только L изомеры аминокислот участвуют в азотном обмене пивных дрожжей. Источником высокого содержания D-Ser и D-Asp в пиве «Жигулевское» и «Балтика. Светлое №3» предположительно могут быть используемые сырьевые материалы.
Известно, что D-изомеры Ala, Asp, Glu могут выделять некоторые молочнокислые бактерии, попадание которых в пиво приводит к его заражению и потере вкуса. Для поиска среди D-аминокислот маркеров микробиологического заражения пива, уже проанализированный образец «Балтика. Светлое №3» был искусственно заражен молочнокислыми бактериями. Аминокислотный пива анализ проводили через сутки, семь суток и 30 дней после заражения. Относительное содержание D-изомера Ala в пиве через семь и тридцать суток после инфицирования выросло соответственно в 1.7 и 7 раз, в то время как концентрация остальных D-изомеров аминокислот не изменилась. Это означает, что D аланин можно рассматривать в качестве маркера инфицирования пива молочнокислыми бактериями. Разработанный хроматографический метод диагностики инфицирования пива требует меньше времени, чем существующие микробиологические методы.
Определение аминокислот и их энантиомеров в фармацевтических препаратах Растворы для внутривенного питания вводят из расчета 0.05-0.6 г аминокислот на 1 кг массы тела взрослого человека в сутки. В связи с большими дозами вводимых аминокислот важно контролировать их концентрацию и, особенно, оптическую чистоту. Анализ внутривенного препарата «Полиамин» (Россия), в состав которого входят 13 аминокислот и D-сорбит, проводили после дериватизации с N-ацетил-L-цистеином и N-(R)-манделил-(S) цистеином. Определение аминокислот выполняли последовательно с двумя реагентами. Для детектирования производных аминокислот применяли диодно-матричный и флуориметрический детекторы. По разработанной методике в «Полиамине» были определены все аминокислоты, кроме пролина. Найденные концентрации L-изомеров аминокислот и глицина находятся в пределах значений, заявленных в спецификации на данный препарат. Относительное стандартное отклонение не превышает 0.07. Анализ энантиомерного состава аминокислот показал, что концентрация D-Leu и D-Val равна соответственно 0.50±0.04 % и 0.31±0.03 % (рис. 9). Таким образом, в «Полиамине» обнаружено незначительное содержание D-изомеров аминокислот, что может служить подтверждением качества препарата и соблюдения условий хранения.
Рис. 9. Хроматограмма препарата «Полиамин» после дериватизации с ОФА/НМЦ реагентом.
Детектор – флуориметрический (возб.=340 нм, регистр.=450 нм).
Условия разделения производных аминокислот см. рис. 2.
1=L-Thr, 2=Gly+L-His, 3=L-Arg, 4=L-Ala, 5=L-Trp+L-Met, 6=L-Val, 7=L-Phe, 8=D-Val, 9=L-Ile, 10=L Leu, 11=L-Lys, 12=D-Leu.
Результаты наших исследований показали, что сочетание обращенно-фазовой ВЭЖХ и амперометрического детектирования позволяет успешно анализировать смеси аминокислот в виде дансильных производных. Проведено определение аминокислот в БАД «Долголет».
Правильность результатов была подтверждена независимым методом: ВЭЖХ после дериватизации аминокислот препарата органическим реагентом ОФА/НАЦ с последующим разделением в режиме градиентного элюирования с флуориметрическим детектором.
Результаты определения аминокислот в препарате “Долголет” приведены в табл. 10. Из заявленных аминокислот в БАД “Долголет” не найдены His (дансил-His не детектируется амперометрически), Met и Thr. Вероятно, содержание этих аминокислот в препарате ниже предела их обнаружения для использованных методов.
Таблица 10. Содержание аминокислот в лекарственном препарате «Долголет» (n=3, P=0.95) Аминокислота Найдено, мг/табл Содержание, мг/табл (независимый метод) Lys 0.05±0.01 0.04±0. Arg 2.8±0.2 3.0±0. Ile 0.04±0.01 0.06±0. Leu 0.08±0.02 0.10±0. Phe 0.19±0.05 0.23±0. Trp 0.08±0.03 0.13±0. Val 0.05±0.01 0.06±0. ВЫВОДЫ 1. Предложен подход, позволяющий оценить устойчивость о-фталевых/2 меркаптоэтанольных производных аминокислот в процессе хроматографического разделения. Показано, что частично разлагаются при разделении в хроматографической колонке о-фталевые/2-меркаптоэтанольные производные валина и лейцина, и степень их разложения увеличивается с уменьшением скорости потока.
2. Систематически исследовано влияние состава и pH элюента на удерживание и селективность разделения производных аминокислот с о-фталевым альдегидом/N ацетил-L-цистеином. Установлено, что метанол в качестве компонента подвижной фазы обеспечивает большую селективность разделения диастереомеров аминокислот, чем ацетонитрил. Выбран оптимальный состав подвижной фазы и условия градиентного элюирования для разделения смеси двадцати производных аминокислот.
3. Для дериватизации аминокислот предложен новый мультихиральный реагент - N-(R) манделил-(S)-цистеин, позволяющий с высокой селективностью разделять энантиомеры 20 изученных аминокислот.
4. Изучено электрохимическое детектирование аминокислот после дериватизации с о фталевым альдегидом/N-ацетил-L-цистеином, выбран оптимальный потенциал и материал рабочего электрода. Показано, что чувствительность амперометрического детектирования сопоставима с флуориметрическим и выше, чем спектрофотометрического детектирования.
5. Исследовано влияние температуры и микроволнового излучения на образование дансильных производных аминокислот. Установлено, что нагревание реакционной смеси до 40 0С и действие микроволнового поля ускоряет реакцию дансилирования аминокислот, но уменьшает их выход.
6. Показана возможность амперометрического детектирования дансильных производных аминокислот после разделения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Определены условия хроматографического разделения и амперометрического детектирования дансильных производных исследованных аминокислот.
7. Определено содержание аминокислот и их энантиомеров в ряде образцов пива и лекарственных препаратов.
Автор выражает искреннюю благодарность к.x.н., доценту Шаповаловой Е.Н. и к.x.н., н.с. Ананьевой И.А. за постоянное внимание, поддержку, помощь в работе и обсуждении результатов, сотрудникам факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ к.х.н. Гуранда Д.Т. и проф. Швядасу В.К. за предоставленные хиральные реагенты - N-(R)-манделил-(S) цистеин и N-фенилацетил-(R)-фенилглицил-(S)-цистеин.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Чернобровкин М.Г., Шпигун О.А. Использование хроматографических методов анализа для контроля качества пива. // Партнеры и конкуренты. 2002. №12. С. 36-40.
2. Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. Определение аминокислот в пиве с использованием электрохимического и флуориметрического детектирования. // Заводская лаборатория. 2003. Т. 69. №10. С. 7-11.
3. Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. Определение энантиомеров аминокислот в фармацевтических препаратах методом обращенно фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. №1. С. 64-72.
4. Чернобровкин М.Г., Кольцова Н.В., Шепелев Б.Н. Определение аминокислот в препарате «Элтацин». // Фармация. 2004. №5. С. 18-20.
5. Шунина М.В., Чернобровкин М.Г., Башилов А.В., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А.
Влияние температуры и микроволнового излучения на образование производных аминокислот с 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлоридом. // Вестник МГУ.
Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. №4. С. 262-265.
6. Чернобровкин М.Г., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. Изучение устойчивости производных аминокислот с орто-фталевым альдегидом обращенно-фазовой ВЭЖХ / Материалы VIII Всероссийского симпозиума по жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва. 2001. 15-19 октября. С. 49.
7. Шунина М.В., Чернобровкин М.Г. Определение дансильных производных аминокислот высокоэффективной жидкостной хроматографией / Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2003». Москва. 2003. 15-18 апреля. С. 52.
8. Чернобровкин М.Г., Шаповалова Е.Н., Шепелев Б.Н., Гуранда Д.Т., Швядас В.К., Шпигун О.А. Использование N-(R)-манделил-(S)-цистеина для определения оптических изомеров -аминокислот методом ВЭЖХ. / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографическое оборудование». Москва. 2004.
15-19 марта. С. 270.
9. Шунина М.В., Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А.
Амперометрическое детектирование дансил-производных аминокислот в высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Материалы II Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии».
Краснодар. 2005. 25-30 сентября. С. 446.
10. Chernobrovkin M.G., Ananieva I.A., Shapovalova E.N., Shpigun O.A., Guranda D.T., Svedas V.K. Determination of amino acid enantiomers by HPLC using o-phthaldialdehyde and N-(R)-mandelyl-(S)-cysteine as derivatizing agents / International Congress on Analytical Sciences. Moscow. Russia. 2006. June 25-30. P. 218.