авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 ||

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии» _ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Рис. 8. Пример зависимости автокорреляционных функций торсионных углов от номера остатка.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР лабораторная работа № 2. молекулярная динамика (мд) пептида (RRWRRWWRRWWRRWRR) в явно заданном растворителе (воде) в при сутствии отрицательно заряженных противоионов (Cl-) цель лабораторной работы – ознакомление с основами современных компьютерных методов расчета молекулярной динамики (МД) биологических молекул и их применение для изучения структурно-динамических свойств (подвижность аминокислотных остатков, стабильность пространственной структуры) модельного пептида в явно заданном растворителе (вода).

Расчеты проводятся в программном пакете MAC, специализирован ном для работы в операционной системе Lux. Для проведения практику ма необходимы персональные компьютеры с установленным программным обеспечением. При необходимости установочные файлы для MAC можно найти в свободном доступе в сети Интернет (www.gcs.g). Пре подаватель должен иметь высшее образование, хорошо владеть методами молекулярного моделирования, а также иметь представление о принципах организации белковых молекул.

программа лабораторной работы 1. Основы метода МД. Классические уравнения движения Нью тона. Использование методов эмпирических силовых полей для рас чета потенциальной энергии молекулярной системы. Численное ин тегрирование уравнений движения. Термодинамические ансамбли, алгоритмы поддержания постоянной температуры (термостаты) и давления (баростаты). Применение периодических граничных усло вий. Ограничения метода МД.

2. Принципы структурной организации белковой молекулы. Ос новные элементы вторичной структуры белков. Конформационные переходы в белковой молекуле. Влияние растворителя на структур но-динамические свойства полипептидной цепи и их исследование с помощью экспериментальных методик. Характер получаемой ин формации, ограничения.

3. Конструирование модельного пептида в -спиральной кон формации. Работа в молекулярном редакторе (например, MLML, HypCh).

4. Отнесение параметров силового поля для молекулы пептида.

5. Помещение пептида в ячейку, заполненную явно заданными молекулами воды. Добавление необходимого числа ионов для ней трализации заряда молекулярной системы.

6. Подготовительный этап МД. Минимизация энергии молеку лярной системы, «нагревание» до заданной температуры.

7. Запуск длительных расчетов МД.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

8. Обработка траектории МД. Получение данных о подвижности аминокислотных остатков, эволюции конформации пептида в ходе МД, оценка взаимодействия с растворителем.

9. Оформление полученных результатов и подготовка отчета о выполненной работе.

теоретическое введение Пространственная структура и механизмы функционирования белков су щественно зависят от влияния среды. Во многих случаях именно эффекты ок ружения определяют нативную конформацию и биологическую активность белков. В то же время современные экспериментальные методы структурно го анализа дают лишь “статическую” (рентгеноструктурный анализ, элект ронная микроскопия) или усредненную по ансамблю (спектроскопия яМР) картину конформационных состояний белков. Это затрудняет исследование деталей структурных изменений, происходящих в процессе осуществления белками их биологических функций.

Решение многих из указанных проблем может быть достигнуто с по мощью методов компьютерного моделирования – молекулярной динами ки (МД), Монте-Карло (МК) и др. В компьютерных экспериментах можно моделировать поведение систем белок-среда на достаточно протяженной временной шкале, причем некоторые из получаемых в расчетах важнейших структурно-функциональных параметров (например, термодинамика кон формационных переходов и ионного транспорта, структура промежуточных состояний в процессе функционирования и т.д.) не могут быть получены эк спериментально. Результаты моделирования эффективно используют как для интерпретации экспериментальных данных, так и для уточнения параметров моделей. Основными трудностями при этом являются корректный учет вза имодействий внутри белковой молекулы и эффектов среды, ограничения в размере молекулярных систем и временной шкалы моделирования (в случае МД), значительные вычислительные затраты.

задачи лабораторной работы 1. Конструирование модельного пептида в -спиральной конформации.

Работа в молекулярном редакторе (например, HypCh).

Необходимо сконструировать модель пространственной структуры ко роткого пептида, имеюшего заданную аминокислотную последовательность (Для нескольких групп, выполняющих данную лабораторную работу, не обходимо выбрать одну из предложенных: QWQMW, RQ QM и впоследствии сравнить результаты моделирования).

Ход работы зависит от молекулярного редактора, установленного на пер сональном компьютере (например, MLML, HypCh и др.). Открыть МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР молекулярный редактор. В меню выбрать инструмент добавления аминокис лотных остатков из базы данных структурных фрагментов. Аминокислотная последовательность: RRWRRWWRRWWRRWRR. Для добавляемых остатков задать конформацию -спирали (значения двугранных углов и :

-57° и -47°, соответственно). Обратить внимание на зарядовое состояние остатков, включая концевые. Поскольку планируется исследовать поведение пептида при рН 7, указанные остатки и концевые группы должны иметь соответс твующее состояние ионизации. Сохранить полученную структуру в файле формата PDB (pp.pdb).



2. Отнесение параметров силового поля для молекулы пептида.

Этот этап, как и все последующие этапы работы, связанные с пакетом MAC, выполняют в терминале Lux. Открыть Lux-терминал. В ра бочую папку поместить B-файл со структурой исследуемого пептида (pp.

pdb), а также файлы параметров расчетов (.dp – параметры минимиза ции, h.dp – параметры «нагревания», d.dp – параметры расчета МД).

Для отнесения параметров силового поля молекуле пептида и для перевода структурного файла в формат пакета MAC (*.g) используется утили та pdb2gmx (для получения справки по любой утилите MAC необхо димо ввести в строке терминала команду: имя утилиты -h). В командной строке терминала необходимо ввести команду:

pdb2gx - pp.pdb -o pp.g -p sys.p –gh -ssg При запуске утилиты пользователю из предложенного списка следу ет выбрать силовое поле, параметры которого будут отнесены молекуле, – M87 («gx cs cfild ( dfid M87, s ul)»).

После выполнения утилиты в рабочей папке появятся файлы sys.p, pp.g, которые будут использованы в дальнейшей работе.

3. Помещение пептида в ячейку, заполненную явно заданными молеку лами воды. Добавление необходимого количества ионов для нейтрализации заряда молекулярной системы.

Для помещения молекулярной системы в ячейку заданного размера (4x4x нм ) используют утилиту editconf. В командной строке необходимо ввести:

dc - pp.g - bx1.g -c –bx 4 4 ячейку с пептидом заполняют молекулами воды (C модель). Для этого используют утилиту genbox:

gbx -cp bx1.g –cs - bx2.g После выполнения команды в окне терминала появится информация о добавленных молекулах воды. Необходимо зафиксировать число добавлен ных молекул (sl). С помощью редактора молекулярной графики – M Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

(бесплатная программа, доступная через сеть Интернет), можно визуализо вать моделируемую ячейку. Для этого необходимо набрать:

vd bx2.g В файл «топологии» системы (*.p), содержащий параметры силового поля для всех моделируемых молекул системы, необходимо внести информа цию о добавленных в ячейку молекулах воды. С помощью текстового редакто ра (v, gd) необходимо открыть файл sys.p. В секцию «[ sys ]» добавить строку «L Nsol» (после строки « 1»), где sl – число молекул воды, добавленных с помощью gbx. Сохранить измененный файл.

Нейтрализация системы (добавление необходимого числа ионов противо положного заряду системы знака) выполняется с помощью утилиты genion.

Предварительно необходимо подготовить файл dds.p, используя утили ту grompp:

gpp – em.dp –p sys.p -c bx2.g –o dds.p Молекулы предложенных пептидов содержат 7 положительно заряжен ных остатков, поэтому для нейтрализации заряда системы необходимо доба вить 7 отрицательных зарядов – 7 ионов Cl-.

g –s dds.p – 7 – bx3.g При запуске утилиты пользователю из предложенного списка необходимо выбрать молекулы, которые будут замещены на ионы Cl- (вода, L). После выполнения процедуры необходимо изменить в файле «топологии» число молекул воды и внести информацию о добавленных ионах («CL- 7»).

4. Подготовительный этап МД. Минимизация энергии молекулярной сис темы, «нагревание» до заданной температуры.

Минимизацию энергии молекул и расчет их МД проводят с помощью утилиты mdrun.

Минимизация энергии (методом наискорейшего спуска). Подготовить файл.p:

gpp – em.dp –p sys.p -c bx3.g –o em.p Запуск минимизации энергии:

mdu -d em.p В результате расчета конфигурация системы с минимизированной энер гией будет записана в файл.g.

Нагрев системы (в течение 60 пс). В основе данной процедуры лежит расчет кратковременной МД с линейно возрастающей температурой в сис теме (скорости атомов): от 5 до заданной температуры (300 ). Этот этап необходим для избежания артефактной дестабилизации структуры белка на начальном этапе МД. Подготовить файл h.p, используя параметры нагре вания (h.dp) и оптимизированную конформацию системы (.g):

gpp – h.dp –p sys.p -c.g – h.p МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Запуск нагревания:

du -d h.p В итоге расчета «нагретая» конформация и скорости всех атомов системы, соответствующие заданной температуре, будут записаны в файл h.g.

5. Запуск длительных расчетов МД.

Расчет МД проводится в изотермическом-изобарическом ансамбле (, =1 атм, =300) c использованием термостата и баростата Берендсена.

Длительность расчета траектории 25 нс. Все параметры расчетов находятся в файле d.dp. Подготовить файл md.p, используя параметры МД (md.

dp) и «нагретую» конформацию системы (h.g):

gpp – d.dp –p sys.p -c h.g –o md.p Запуск МД:

mdrun -d md.p Время, требуемое для выполнения расчетов, зависит от производитель ности используемого компьютера и может составлять несколько суток в слу чае загрузки только одного процессора (ядра).

6. Обработка траектории МД. Получение данных о подвижности амино кислотных остатков, эволюции конформации пептида в течение МД, оценка взаимодействия с растворителем.

В результате расчетов МД будет получен файл траектории – md. (md.

xc) и финальная конформация системы (после 25 нс МД) – d.g. На осно вании полученных МД-данных предлагается выполнить следующий анализ:

оценить подвижность аминокислотных остатков (стандартные квадратичные флуктуации, СКФ);

оценить изменение вторичной структуры пептида в процессе МД;

оценить число водородных связей, образуемых между пептидом и растворителем, а также внутри пептида.

Подвижность аминокислотных остатков пептида. Для получения ин формации о значениях СКФ для каждого остатка, которые можно сопоста вить с их подвижностью, необходимо использовать утилиту g_rmsf:

g_s –s d.p – d. – s.xvg -s После обработки в файл s.xvg будет записан профиль подвижности аминокислотных остатков в текстовом формате.

Изменение вторичной структуры пептида в процессе МД. Для получе ния информации об эволюции вторичной структуры пептида необходимо использовать утилиту do_dssp:

d_dssp –s d.p – d. – pp_sc.xp –d После обработки в файл pp_sc.xp будет записана диаграмма измене ний конформации (показано различными цветами) каждого аминокислотного Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

остатка в течение МД (через каждые 50 пс МД, -d 50). Для конвертации файла *xp в более распространенный формат векторной графики (*.ps, scp) необходимо использовать утилиту xpm2ps:

xp2ps – pp_sc.xp – pp_sc.ps Образование водородных связей внутри молекулы пептида и между пеп тидом и молекулами растворителя. Для получения информации о числе водородных связей разного типа в процессе МД необходимо использовать утилиту g_hbond:

g_hbd –s d.p – d. –u hbds.xvg После запуска утилиты необходимо выбрать, между какими группами оценивать число водородных связей («»+«» – внутри пептида, «»+«L» -между молекулами воды и пептидом). После обработки в файл hbds.xvg будет записана информация о числе водородных связей разных типов в каждый момент времени МД.

7. Оформление полученных результатов и подготовка отчета о выполнен ной работе.

По результатам анализа необходимо построить соответствующие графи ки и диаграммы, сделать вывод о структурно-динамических свойствах ис следуемого пептида и стабильности его -спиральной конформации, а также написать отчет о проделанной работе.

контрольные вопросы:

1. Зависят ли результаты МД от выбора стартовой конформации пептида?

2. Каким образом в расчете МД можно учесть рН среды?

3. С помощью каких экспериментов можно подтвердить или опроверг нуть полученные результаты МД?

УчЕбно-МЕтодичЕсКиЕ МатЕРиалы для оРГанизации сЕМинаРоВ и ПРаКтичЕсКих занятий практикическое занятие № 1. моделирование взаимодействия сиг нальных пептидов с мембранами Цель – обучения основам метода управляемой молекулярной динамики, а также для создания представления об основах молекулярного взаимодейс твия пептидов с мембранами».

Занятие рассчитано на студентов, имеющих навыки работы с такими про граммами, как HypCh, M, jls, Bly u, dM u и u u.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Длительность практикума: 24 академических часа (включая часы само стоятельной работы).

Зачет по практикуму выставляется на основании отчета о проделанной работе.

Для выполнения практикума необходимо (в расчете на одного студента):

• Один терминальный компьютер – для сборки системы и анализа полученных результатов • Четыре компьютера для проведения расчетов по управляемой молекулярной динамике Преподаватель практикума должен владеть программами Hypch, B-Bi ly u, dM u и u u, иметь опыт постановки экспериментов по молекулярной динамике и работы с программами просмотра молекул.

Программа практикума 1. Сборка структур сигнальных пептидов в -спиральной конфор мации на основе их аминокислотной последовательности в програм ме HypCh.

2. Изучение термостабильности сигнальных пептидов 3. Создание системы, содержащей липидный бислой и сигналь ный пептид в водном окружении 4. Перемещение пептида в зону углеводородных цепей липидов с помощью метода управляемой молекулярной динамики 5. Обработка результатов 6. Отчет о проделанной работе.

Задачи практикума Сборка структур пептидов.

Сборка структур пептидов происходит с помощью программы HypCh.

Необходимо запустить программу HypCh и с помощью базы данных ами нокислотных остатков собрать по отдельности в конформации -спирали два сигнальных пептида со следующей аминокислотной последовательностью:

Первый сигнальный пептид:

Ac-l--p-Cys-M-p-p-Lu-l-y-h-Lu-h-Ag-l-lu Al-l-Lu-Hs-l-p-l---Lu-As-l-Ag-ly-ly-Ag-Asp-Al l-l-Lu-Lu-M-Cys-l-l-Hs--h-.

Второй сигнальный пептид:

Ac-l-Al-ly-ly-Hs-y-l-l-M-Al-l-l-Lys-Lu-ly-Al Lu-h-ly-h-y-l-y-As-Hs-Lu-h--Lu-Ag-Asp-p-Al.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Рис. 1. Сигнальный пептид, собранный в программе HypCh.

После сборки сигнальные пептиды сохраняются в виде файлов signal1.ent и signal2.ent Изучение термостабильности сигнальных пептидов.

Для изучения термостабильности сигнальных пептидов проводятся экс перименты по молекулярной динамике пептидов в столкновительной среде при различных температурах.

Сначала с помощью программы dMd U создаются структурные фай лы пумы signal1.str и signal2.str.

Рис. 2. Окно программы PredMU МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР После создания структур следует запустить программу uU. В ней следует подготовить к запуску эксперименты по изучению термостабильнос ти. Для экспериментов следует выставить следующие параметры:





1. Потенциальное поле: Ab99.

2. Длина траектории: 500 пс.

3. Температура: 700 К.

4. Термостаты: Берендсена и столкновительный.

5. Постоянная времени в термостате Берендсена: 0.5 пс.

6. Масса виртуальной частицы в столкновительном термостате: 18 а.е.м.

7. Частота столкновения виртуальных частиц с атомами в расчитывае мой системе в столкновительном термостате: 55 пс–1.

8. Диэлектрическая проницаемость среды: = 1.

9. Радиус обрезания для кулоновского взаимодействия: el = 20.

10. Радиус обрезания для взаимодествия Ван-дер-Ваальса: VdW = 20.

11. Шаг интегрирования: = 1 фс.

12. Шаг записи в траекторный файл: 0.1 пс.

13. Шаг записи в файл статистики: 1 фс.

14. Для численного интегрирования используется алгоритм Верле.

15. Начальные скорости задаются в соответствии с распределением Максвелла с помощью генератора случайных чисел.

Затем программу uU и папки, содержащие подготовленные для запуска файлы следует скопировать на два компьютера для проведения мо лекулярно-динамических расчетов и запустить эксперименты в программе uU.

Рис. 3. Окно программы uU перед запуском эксперимента по молекулярной динамике Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Создание систем, содержащих липидный бислой и сигнальный пептид в водном окружении Для создания систем используется B-файл, содержащий отрелаксиро -файл, ванный мембранный бислой в водном окружении, ориентированный перпен дикулярно оси Y. Для начала пептид ориентируется вдоль оси или Z в про грамме HypCh. Затем, с помощью программы BlyU пептид помеща ется в зону молекул воды. Рекомендуется при вставлении пептида в систему указывать координату Y на 35-40 выше геометрического центра системы.

Cледует сохранить готовые файлы под именами sig1m.ent и sig2m.ent.

Рис.4. Окно программы BlyU, предназначенное для помещения пептида в систему с липидным бислоем.

После создание систем следует проверить их адекватность в любой про грамме, предназначенной для просмотра молекул, например sMl.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Рис.5. Графическое изображение собранной системы в программе sMl.

Перемещение пептида в зону углеводородных цепей липидов с помощью метода управляемой молекулярной динамики Для проведения данного эксперимента используется метод управляемой молекулярной динамики. Для начала необходимо с помощью программы dMU создать структурные файлы sig1m.str и sig2m.str. Затем запус тить эксперимент по молекулярной динамике со следующими параметрами:

1. Потенциальное поле: Ab99.

2. Длина траектории: 100 пс.

3. Температура: 300 К.

4. Термостаты: Столкновительный.

5. Баростат: Берендсена 6. Постоянная в баростате 1 пс- 7. Параметры давления по осям:,Z = –260 атм., Y = 1 атм.

8. Масса виртуальной частицы в столкновительном термостате: 18 а.е.м.

9. Частота столкновения виртуальных частиц с атомами в расчитывае мой системе в столкновительном термостате: 55 пс–1.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

10. Диэлектрическая проницаемость среды: = 1.

11. Радиус обрезания для кулоновского взаимодействия: el = 20.

12. Радиус обрезания для взаимодествия Ван-дер-Ваальса: VdW = 20.

13. Шаг интегрирования: = 1 фс.

14. Шаг записи в траекторный файл: 0.1 пс.

15. Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле.

16. Сила равна 5 ккал/(моль*А*атом), приложена к атомам пептида и направлена вдоль оси Z в сторону мембраны.

Обработка результатов 1. Обработка результатов экспериментов по термостабильности.

Траектории, полученные в результате экспериментов по термоста бильности преобразуются в формат C с помощью программы jls.

При конвертировании следует сохранять каждый 100й шаг траектории Рис.6. Программа jls. Окно конвертирования траектории.

Полученную траекторию открывают в программе M и, поставив тип отображения вторичной структуры C, а тип окрашивания остатков: By s оценивают процент вторичной структуры сохранившейся у пептидов в результате динамики при 300К и 700К. На основании полученных данных следует сделать выводы о степени термостабильности первого и второго пептидов.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Рис.7. Изображение сигнального пептида, полученное с помощью программы M.

2. Обработка результатов экспериментов по проникновению пептида в мембрану.

Для оценки динамики сигнальных пептидов следует построить графи ки смещения С-атомов сигнальных пептидов вдоль оси Z. Для этого, с по мощью любого текстового редактора следует открыть структурные файлы sig1m.ent и sig2m.ent. Затем следует выписать номера С-атомов аминокис лотных остатков сигнальных пептидов.

Затем следует запустить программу jls и с помощью команды j lc из меню Tools. В открывшемся окне следует ввести номера С-атомов и сохранить результаты в отдельных файлах Sig1m_C.txt и Sig2m_C.txt.

Полученные файлы следует открыть в программе Mxcl и построить графики смещения С-атомов вдоль оси Z. На основании полученных гра фиков следует сделать выводы о скорости и характере перемещения сигналь ных пептидов.

Кроме того, следует с помощью программ для просмотра молекул, следу ет сделать серию изображений в формате J: Сигнальные пептиды в стол кновительной среде при 300К и при 700К, сигнальные пептиды в воде око ло мембраны до запуска эксперимента, сигнальные пептиды в мембранном бислое.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Отчет о проделанной работе Отчет о проделанной работе должен содержать план выполнения всех за дач, с указанием всех необходимых параметров, а также все полученные в результате экспериментов изображения, вычисления, таблицы и графики.

Литература 1. К. В. Шайтан, К. Б. Терёшкина. Молекулярная динамики белков и пептидов: Методическое пособие. - М.: Ойкос, 2004. (hp://www.ldy.u/ lby/ul/) 2. А. В. Финкельштейн, О. Б. Птицын. Физика белка. – М.: Книжный дом «Университет», 2002.

3. К.В.Шайтан, К.Б.Терешкина – Молекулярная динамики белков и пеп тидов. Методическое пособие. Москва, 4. А.В. Финкельштейн – Физика Белка. Москва, 5. Hp://www.ldy.g 6. Нобелевская лекция по сигнальным пептидам hp://blpz.g/ nobl_pzs/dc/lus/1999/blbl-lcu.pd 7. hp://.wpd.g/w/gl_ppd 8. Adh. Yg d Jg-hsug u. Mb plgy h Hps C us 2. H JUAL BLCAL CHMY l. 277,. 36, ssu pb 6, pp. 33228–33234, часть 4.

дидактические материалы для работы профессорско преподавательского состава Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

рекомеНдации по использоваНию дидактических материалов Дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава содержат методические материалы по дисциплине «Молекулярное моделирование нано- и биоструктур» и включают слайды, иллюстрирующие лекционный курс, эскизы плакатов и дидактические материалы по курсу.

Материал дисциплины изучается на лекциях, практических занятиях, ла бораторных работах, в ходе самостоятельной работы студентов.

Эскизы плакатов можно рекомендовать к использованию при проведении различных видов практикума (в рамках соответствующих тем), а также при оформлении лабораторных или лекционных аудиторий в качестве постоян ной экспозиции по данной дисциплине. При проведении лекционных заня тий целесообразно включение содержимого плакатов в слайдовый презента ционный материал соответствующей лекции.

Слайды представляют собой иллюстрации к содержанию отдельных тем лекционного курса с комментариями и пояснениями. Изображения могут быть использованы для создания презентаций в программе Power или для подготовки интерактивных плакатов по курсу. Проведение презентаций предполагает оборудование лекционных аудиторий соответствующим обо рудованием.

Дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава содержат задания для организации самостоятельной работы студен тов в форме решения практических задач.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР слайды 1.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

2.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Необходимо отметить, что приведенная классификация методов молеку лярного моделирования является достаточно условной, поскольку, напри мер, в методах докинга широко используют и расчеты энергии и т.д. Тем не менее, в современных исследованиях работы в основном ведутся по этим трем направлениям.

- Биоинформатика: работа с базами данных биологической информации (примеры на слайде-6), поиск гомологичных объектов (последовательнос тей, мотивов, структур и пр.), их выравнивание, выявление возможных фун кциональных сайтов (на основании найденных аннотаций), предсказание некоторых структурно-функциональных свойств по последовательности (например, вторичной структуры белков и РНК, доступность растворителю аминокислотных остатков белка в пространственной структуре и пр.). На картинке показан пример выравнивания аминокислотных последователь ностей фрагмента белка. Цветом выделены абсолютно консервативные и/ или изофункциональные остатки.

- Методы эмпирических силовых полей: показана ячейка, содержащая молекулу белка и молекулы воды. Элементы вторичной структуры белка – альфа-спирали и бета-тяжи -показаны в виде цилиндров (синий) и стрелок (красный), соответственно. Расчеты таких систем проводят обычно с помо щью методов молекулярной динамики или Монте-Карло. При этом необхо димо рассчитывать энергию системы, для чего применяются эмпирические силовые поля.

- Молекулярный докинг: Показана молекула небольшого химического соединения (лиганда), связанная в активном центре белка. Поверхность молекулы лиганда изображена оранжевым цветом, окружающие аминокис лотные остатки белка-мишени даны в проволочном представлении (голу бые линии), элементы вторичной структуры белка – альфа-спирали, бета тяжи и бета-повороты - показаны в виде цилиндров (розовый) и стрелок (зеленый, синий), соответственно.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

3.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 4.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Т.н. «слабые» нейротоксины из яда змей могут взаимодействовать с аце тилхолиновыми рецепторами, блокируя их работу. «Слабыми» они называ ются потому, что их связывание с рецептором не такое эффективное, как в случае большинства других нейротоксинов. Аминокислотные последова тельности ряда «слабых» нейротоксинов были расшифрованы в ИБХ РАН несколько лет назад. Показана схема построения модели пространствен ной структуры белка TXW6 - одного из представителей семейства слабых нейротоксинов – на основании его аминокислотной последовательности.

1 этап – поиск гомологов в базах данных последовательностей (показаны последовательности некоторых из найденных белков, все они – нейроток сины или кардиотоксины, имеющие сходныq тип укладки полипептидной цепи – т.н. «трех-петлевой» мотив). 2 этап – предсказание вторичной струк туры TXW6, результаты предсказания несколькими методами показаны на слайде. Синие стрелки – бета-тяжи, красный прямоугольник – возможный участок альфа-спирали. Пространственная структура некоторых из най денных гомологов известна, что позволяет построить модель пространс твенной структуры TXW6 по гомологии. В отличие от бета-тяжей, спираль предсказывается не всеми методами, поэтому выбраны два шаблона – со спиралью и без нее. В дальнейшем необходимо проводить дополнительный анализ, либо привлекать дополнительные экспериментальные данные, что бы выбрать из двух полученных типов моделей наиболее вероятную.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 5.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

- Наиболее известные базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей: BA, SWISS-PROT, PIR, MBL-Trembl.

- Широко используемые базы данных функциональных мотивов и паттер нов:,,.

- Наиболее известные базы данных пространственных структур биомо лекул: B ( B: белки и их комплексы с фрагментами нукле :

иновых кислот, различными лигандами и пр.), B (Nucleic Acid bs:

нуклеиновые кислоты и их компоненты), LB (Lpd B: молекуляр Lpd :

ные структуры липидов, данные по физико-химическим свойствам липид содержащих систем и пр.), CC (Cplx Cbhyd ucu bs:

молекулы углеводов).

Более подробную информацию о биоинформационных ресурсах и воз можностях их использования посредством Интернет-сервиса можно найти на следующих WB-сайтах:

www.xpsy.g hp://cpb.l.gv/sucu/suc/ hp://www.ch.b.g/pgs/svcs.hl МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 6.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

7.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 8.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

9.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 10.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

11.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 12.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Сравнение методов молекулярной динамики (МД) и Монте-Карло (МК).

Общее: Позволяют генерировать выборки состояний молекулярных сис тем в соответствии с заданной функцией распределения (например, по Бо льцману). Следовательно, позволяют исследовать конформационное фазовое пространство этих молекулярных систем (преодолевать энергетические ба рьеры и т.д.). Эффективность такого исследования зависит от используемой температуры (чем выше Т, тем более эффективно).

Различия. В методе МК нет понятия времени. В отличие от детерминис тического метода МД (каждое состояние системы определяется ее «истори ей», т.е. предыдущими состояниями), метод МК стохастический – в выборе состояний есть элементы случайности (хотя полностью случайным выбор назвать нельзя). Таким образом, с помощью МД можно исследовать зави сящие от времени процессы (сворачивание белка, кинетику молекулярных взаимодействий и пр.). В то же время методы МК, как правило, более эф фективны в генерации выборки состояний (хотя не все специалисты с этим согласны).

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 13.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

14.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 15.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

16.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 17.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

18.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 19.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Пример использования методов моделирования по гомологии для постро ения моделей трехмерной структуры биологически важного класса рецепто ров, чье действие опосредовано -белками (C, -p cupld cp -белками C, -p, p s). -белки – большая группа разнообразных белков, которые связываются с интегральными мембранными рецепторами (C) после их (рецепторов) активации лигандами. Несмотря на огромное разнообразие функций в клетке, все белки суперсемейства C имеют сходную структурную организацию мембранного домена – семь трансмембранных альфа-спиралей, образующих плотно упакованный «пучок». В отличие от этого, внемембранные участки («петли») могут принимать разнообразные конформации. В настоящее время известна пространственная структура двух представителей семейства C - зрительного родопсина и адренергического рецептора бета-2А. Сходство мембранной топологии и структурной организации мембранных доменов позволяет проводить моделирование и других рецепторов C на основа нии гомологии.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 20.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

21.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 22.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

23.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 24.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

25.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 26.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

27.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 28.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

29.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Иллюстрирует применение методов молекулярного моделирования к изу чению поведения в мембрано-подобной среде пептида, соответствующего трансмембранному сегменту 69-97 из гликофорина А человека – гликопро теина, входящего в состав мембран клеток эритроцитов человека. Цель – ис следовать пространственную структуру пептида и характер его взаимодейс твия с мембраной. Метод – поиск низкоэнергетических состояний методом Монте-Карло.

Для решения задачи была применена теоретическая модель биологичес кой мембраны. При этом влияние мембраны учитывается в неявном виде – пу тем введения в функцию потенциальной энергии белка дополнительного(ых) термов. Стартовую структуру пептида задавали случайным образом (ста тистический клубок без какой-либо регулярной структуры - соответствует обозначению «CL» на рисунке), причем пептид помещали вне мембраны (мембрана показана сине-зеленым цветом). Если же структура пептида или белка в воде или в мембране известна, то можно использовать ее в качестве стартовой (соответствует обозначению «L» на рисунке).

Результаты моделирования представлены в виде компьютерной анима ции (СЛАЙД-29). Справа отложены значения полной энергии пептида. В анимации показана лишь небольшая часть конформаций, полученных мето дом Монте-Карло. Видно, что в ходе расчета полипептидная цепь проникает вглубь мембраны, происходит формирование элементов вторичной струк туры – -спирали. Наиболее низкоэнергетические состояния представляют собой трансмембранную -спираль, что согласуется с экспериментальными данными.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

30.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 31.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

32.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 33.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Пример № 2 (слайды 30-33).

Исследование связывания кардиотоксина-1 из яда кобры j x с ми целлой детергента.

Цель – понять, каким образом молекула токсина встраивается в ми целлу, что происходит со структурой белка и мицеллы.

Метод – молекулярная динамика в явно заданной гидратированной мицелле додецилфосфохолина (ДФХ).

Результаты:

- выявлены остатки токсина, взаимодействующие с мицеллой;

- изучены структурные перестройки в мицелле, обеспечивающие эффек тивное связывание токсина.

Пояснения к слайдам 31-32.

слайд-31: Модель мицеллы детергента, использованная в расчетах молекулярной динамики. Удалось показать, что результаты вычислений (гео метрия мицеллы, степень упорядоченности «жирных» хвостов детергента и пр.) хорошо согласуются с экспериментальными наблюдениями. Следова тельно, эту модель можно применять для теоретического изучения связыва ния белков с мицеллами.

слайд-32: Результаты моделирования представлены в виде компьютер ной анимации (для наглядности молекулы воды не показаны). Молекула ток сина представлена в виде «ленты», соответствующей полипептидной цепи.

Синим цветом окрашены ее участки, которые «чувствуют» присутствие ми целлы. Видно, что в процессе динамики все больше участков белка взаимо действуют с мицеллой, происходит встраивание токсина в мицеллу. Сравне ние этих результатов с данными спектроскопии яМР продемонстрировало их хорошее согласие. Таким образом, метод молекулярной динамики позволяет корректно описывать поведение белков в мицеллах, и его можно применять для исследования новых пептидов и белков в мембрано-подобных средах.

Еще один способ задать мембрану в расчетах – это построить ее полно атомную модель из молекул липидов и воды. На слайде-33 показан пример такой модели, состоящей из 128 молекул липида и нескольких тысяч моле кул воды. Расчеты молекулярной динамики таких систем позволяют описать поведение липидного бислоя во времени, оценить его средние равновесные значения (геометрия, упорядоченность и пр.), сравнить эти характеристики с имеющимися экспериментальными данными и (в случае согласия теория-эк сперимент) применить эти модели мембран к изучению их комплексов с пеп тидами, белками, низкомолекулярными соединениями (например, с лекарс твами). Проведенные на кафедре расчеты подобных систем доказали высо кую степень корректности описания различных физико-химических свойств липидных бислоев. Сейчас эти модели широко используются для изучения связывания с мембранами пептидов и белков.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 34.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

35.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 36.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Пример № 3 (слайды 34-36).

Молекулярное моделирование взаимодействий фермент-субстрат (на примере связывания АТФ с кальций-транспортирующей АТФазой). C2+ АТФаза – интегральный мембранный фермент, использующий энергию гид ролиза АТФ для осуществления трансмембранного переноса ионов кальция.

АТФ связывается в цитоплазматическом нуклеотид-связывающем домене, который, в свою очередь, состоит из двух субдоменов – Р (домена фосфо рилирования) и N (в котором связывается нуклеотид). Несмотря на то, что известны кристаллографические структуры комплексов АТФазы с АТФ, мо лекулярные детали процесса связывания неясны, поскольку в данном случае взаимодействие фермент-субстрат сильно зависит от взаимного пространс твенного расположения доменов P и N.

Цели:

- установить сайт связывания АТФ в нуклеотид-связывающем домене АТФазы;

- понять, каким образом динамическая подвижность белка влияет на ха рактеристики связывания АТФ;

- определить, какие аминокислотные остатки АТФазы играют основную роль во взаимодействии с АТФ Метод – молекулярная динамика АТФазы в воде, докинг АТФ в на бор полученных структур белка.

Результаты:

- молекулярная модель взаимодействия АТФ с АТФазой;

- предложены варианты аминокислотных замен в белке, которые могут влиять на параметры связывания АТФ.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 37.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

38.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 39.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

40.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Пример № 4 (слайды 37-40).

Молекулярное моделирование антимикробных пептидов (АМП) (на при мере пептида Lc2 из яда паука) Цели (Слайд-37):

- определить характер взаимодействий и моду связывания АМП с мембранами;

- выявить ключевые остатки пептида, ответственные за связывание с мембранами разного типа;

- предложить мутанты Lc2, обладающие пониженной гемолитичес 2,,, кой активностью, но сохраняющие антибактериальное действие, сходное с пептидами дикого типа.

Метод – молекулярная динамика АМП в явно заданных бислоях, по со ставу имитирующих мембраны эритроцитов и грам- бактерий.

Результаты:

- молекулярная модель взаимодействия АМП с мембранами;

- разработаны мутанты Lc2 с пониженной гемолитической актив ностью.

слайд 38.

Использование смешанных липидных бислоев, приближенных по соста ву к реальным клеточным мембранам, позволяет учитывать молекулярные аспекты взаимодействия АМП с различным гетерогенным окружением, а также установить предпосылки их селективности к бактериальным клеткам.

На рисунке представлены равновесные структуры двух модельных мембран (после 20 нс МД). Поверхность мембраны раскрашена в соответствии с ее липидным составом. Детальный анализ макроскопических физико-химичес ких характеристик подобных мембран (плотность упаковки липидов, геомет рия бислоя, подвижность липидных молекул, сольватация липидных голо вок, распределение электростатического потенциала и пр.) свидетельствует о том, что их свойства сильно отличаются. Это, в свою очередь, определяет микроскопические детали связывания пептидов и, следовательно, их актив ность и селективность.

слайд 39.

В процессе МД пептиды связываются с модельными мембранами в со ответствии с распределением гидрофобных и гидрофильных свойств на по верхности пептидов. Положительно заряженные остатки пептидов (Ag, Lys) взаимодействуют с полярными головками липидов и молекулами воды на интерфейсе мембраны. Гидрофобные остатки стремятся проникнуть внутрь мембраны. Встраивание АМП в мембрану приводит к локальному наруше нию структуры бислоя. При связывании АМП с мембранами, содержащими Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

отрицательно заряженные липиды (мембрана ), важную роль играют электростатические взаимодействия заряженных остатков пептида с поляр ными головками липидов. В цвиттерионных мембранах (мембрана yh) основную роль играют взаимодействия неполярных остатков петпидов с гидрофобным «ядром» мембраны. На рисунке представлена равновесная структура системы Lc2+мембрана yh. Анализ энергий ван-дер-ваальсо 2+мембрана +мембрана +мембрана.

вых взаимодействий пептида с липидным бислоем позволяет выявить остат ки, наиболее эффективно взаимодействующие с мембраной. Видно, что это – гидрофобные остатки изолейцина 7, фенилаланина 3 и 10.

слайд 40.

Анализ пространственного распределения гидрофобных свойств на по верхности -спирали Lc2 показывает, что в N-концевой области пептида гидрофобные остатки формируют выраженный паттерн. При этом данные МД показывают, что ряд N-концевых гидрофобных остатков эффективно взаимодействуют с мембраной yh (слайд 40). Введение гидрофильных мутаций в -концевую область молекулы позволяет изменить характер рас -концевую пределения гидрофобных свойств (приводит к уменьшению размера паттер на и изменению его формы) и понизить эффективность взаимодействия с цвиттерионной мембраной. На рисунке представлены двумерные карты гид рофобных свойств на поверхности идеальных -спиралей Lc2 и двух его точечных мутантов. Подобные карты представляяют собой проекцию гид рофобных свойств в точках поверхности пептида на поверхность цилинд ра. Ось цилиндра совпадает с осью спирали (ось Y). Ось Х обозначает угол вращения вокруг оси спирали. Контурными изолиниями обозначены только наиболее гидрофобные зоны на поверхности пептида. Предложенные мутан ты были затем синтезированы в ИБХ РАН. Биологическое тестирование на живых клетках показало, что они сохраняют антимикробную и утрачивают гемолитическую активности (см. таблицу).

Таким образом, методы моделирования in silico позволяют эффективно решать задачи целенаправленного дизайна новых биологически активных молекул с заранее заданными свойствами.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 41.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

пример фармакофорного скрининга.

Моделирование взаимодействия рецептор-лиганд возможно не только с использованием экспериментально установленной пространственной струк туры белка или его модели. Иногда для поиска in silico активных соединений, предположительно взаимодействующих с мишенью с неизвестной 3 струк турой, используют методику виртуального сканирования баз данных лигандов на предмет взаимодействия с фармакофором (упрощенным представлением активного сайта). Фармакофор представляет из себя определенным образом расположенные в пространстве группы с заданными свойствами (например, гидрофобные центры или положительно заряженные центры). Фармакофор может строиться как на основании структуры мишени («упрощённый сайт связывания»), так и на основании структуры лиганда в предположительно биологически активной конформации («слепок» активного сайта). Докинг, о котором говорилось ранее, – вариант виртуального сканирования, использу ющий атомистическое (а не упрощенное) представление сайта связывания и явно предсказывающий конформацию комплекса лиганд-мишень.

Приведенный на слайде пример показывает, как виртуальное сканирова ние корпоративной БД фирмы Avs с использованием модели фармакофо ра, полученной из яМР-структуры уротензина в воде, позволило иденти фицировать непептидный аналог этого циклического пептида, обладающий несравненно лучшими фармакокинетическими свойствами, чем исходный пептид.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 42.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Использования виртуального сканирования в создании новых лекарствен ных препаратов.

Поскольку методы моделирования взаимодействия лиганд-белок, исполь зующие полноатомное представление мишени (докинг, МД), очень ресурсо емки, итерационное виртуальное сканирование с постепенно увеличиваю щейся реалистичностью представления активного сайта позволяет сканиро вать довольно большие базы данных химических соединений.

В этом примере поиск лиганда начинается с простого «двумерного» выде ления соединений, в принципе способных координировать цинк, с дальней шим уточнением полученного списка с помощью фармакофорного запроса к базе и окончательной селекции небольшого числа предположительно актив ных лигандов с помощью молекулярного докинга в полноатомную трехмер ную модель белка – карбоангидразу II. Некоторые из «лучших» соединений, идентифицированных в докинге, продемонстрировали субмикромолярную активность in v.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 43.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

44.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР эскизы плакатов Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава вопросы для экзамена 1. Развитие идеологии компьютерного эксперимента;

понятие in silico.

Примеры использования компьютерных методов в биологии.

2. Концепция иерархической организации макромолекул. Последова тельность Структура Динамика Функция. Методы ММ, использу емые на каждом из перечисленных этапов (привести примеры).

3. Основные задачи и понятия биоинформатики. Примеры существую щих биоинформационных Интернет-ресурсов.

4. Квантово-механический и «классический» подходы к описанию мо лекулярных систем. Методы, основанные на использовании эмпирических силовых полей (дать краткую характеристику).

5. Понятие конформационного пространства многоатомной молекуляр ной системы. Функция потенциальной энергии молекулы. Методы миними зации потенциальной энергии – привести примеры использования для реше ния задач физико-химической биологии.

6. Основы метода молекулярной динамики (МД). Достоинства и недо статки. Понятие траектории МД. Примеры использования при изучении био молекулярных систем.

7. Использование периодических граничных условий в МД: суть мето да, чем обусловлена необходимость его применения?

8. Метод Монте-Карло. Решение проблемы конформационного поиска с помощью стохастических методов.

9. Основы метода молекулярного докинга. Алгоритмы поиска и оценки конформаций комплекса белок-лиганд. Характер решаемых с помощью до кинга задач.

10. Возможности и ограничения современных экспериментальных и компьютерных методов определения трехмерной структуры макромолекул.

11. Моделирование на основае гомологии. Принцип метода. Выбор структурного шаблона. Оценка качества полученных моделей.

12. Моделирование на основании гомологии. Пример практического ис пользования метода.

13. От теории к практике: комплексное использование методов ММ для поиска новых лигандов белка с неизвестной трехмерной структурой.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР вопросы к лабораторным и практическим занятиям Вопросы по лабораторной работе № 1. Молекулярная динамика нано структур.

1. Метод молекулярной динамики. Классическое приближение уравнений движения молекулярной системы. Численное интегриро вание уравнений движения методом Верле. Молекулярная динамика как численный эксперимент.

2. Приближение межатомных взаимодействий в методе моле кулярной динамики: валентные связи, валентные углы, торсионные углы, ван-дер-ваальсовское и кулоновское взаимодействие.

3. Статистический характер молекулярной подвижности. По нятие об усреднении по времени и по ансамблю. Комбинаторный взрыв при моделировании больших молекул.

4. Статистический характер молекулярной подвижности. Ос новные виды статистик, применяемых в молекулярной динамике.

5. Нанотрубки и другие нанообъекты. Размеры, соотношение с размерами биологических макромолекул. Разновидности нанострук тур, физико-химические свойства, способы синтеза, применение в различных областях народного хозяйства.

6. Применение нанотрубок в биологии: современные исследо вания по взаимодействию нанотрубок и биообъектов, перспективы использования нанотрубок для направленной доставки лекарств.

Роль метода молекулярной динамики на современном этапе развития этой отрасли.

Вопросы по лабораторной работе № 2. Молекулярная динамика (МД) пептида (QQM) в явно заданном растворителе (воде) в присутствии отрицательно заряженных противоионов (Cl-).

1. Как можно проконтролировать, насколько равновесным яв ляется характер поведения изучаемой системы?

2. Какие взаимодействия вносят наибольший вклад в энергию системы пептид-вода? Что может измениться в структуре пептида, если вместо воды использовать в расчетах хлороформ?

3. С помощью каких экспериментов можно подтвердить или опровергнуть полученные результаты МД?

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

Вопросы по практическому занятию №1. «Моделирование взаимодейс твия сигнальных пептидов с мембранами» разработан для обучения основам метода управляемой молекулярной динамики, а также для создания представ ления об основах молекулярного взаимодействия пептидов с мембранами».

1. Для чего при сборке сигнальных пептидов использовались загулшки?

2. Почему пептиды были собраны в конформации -спирали?

3. Как в программе M сменить тип отображения из режима отображения атомов в режим отображения вторичной структуры?

4. Какую информацию можно получить из экспериментов по молекулярной динамике при 300К и 700К?

5. Для чего используется баростат в молекулярной динамике?

6. Зачем в экспериментах по проникновению сигнальных пеп тидов в мембрану к атомам пептида прикладывалась сила?

7. Почему сила прикладывается ко всем атомам пептида, а не к части из них?

8. Почему сила прикладывалась вдоль оси Z?

9. Почему для изучения перемещения пептида достаточно пос троить график движения его С-атомов?

10. Какую информацию можно получить из графика смещения С-атомов пептида вдоль оси Z?

список задач для самостоятельной работы студентов Задачи раздаются группам из 2-3х студентов с написанием общего отчета по итогам практикума.

задача № 1. моделирование на основании гомологии пространс твенной структуры трансмембранного домена потенциал-зависимого калиевого канала (порообразующего участка).

Введение.

Потенциал-зависимый калиевый канал - гомотетрамер, каждая субъеди ница которого содержит сенсор электрического потенциала (S1-S4 трансмем бранные тяжи) и составляющий центральную пору и фильтр участок (S5-S6).

Бактериальный гомолог KcsA состоит только из двух трансмембранных до менов, формирующих центральную пору.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Цель работы.

Трансмембранные участки канала подчеркнуты, потенциал-чувствитель ный сегмент выделен курсивом.

Дана последовательность двух трансмембранных -спиралей и Р-петли рецептора H (см. таблицу). Для фрагмента последовательности кана ла R534- A671 необходимо найти структурные шаблоны, построить модель пространственной структуры белка.

Контрольные вопросы:

1) Как повлияет отсутствие S1-S4 трансмембранных -спиралей на стабильность белка?

2) Какие приближения были сделаны при построении модели, как они могут повлиять на полученные результаты?

3) С помощью каких экспериментов можно подтвердить или опровергнуть итоговую модель?

задача № 2 моделирование на основании гомологии пространс твенной структуры трансмембранного домена рецептора мелатонина мыши (Ml1A_MoUsE).

Введение Мембранные белки – очень важные биологические объекты, но опре деление их пространственной структуры с помощью экспериментальных Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

методов является чрезвычайно сложной задачей. Это связано с тем, что они часто не могут быть выделены в достаточных для изучения количествах и плохо поддаются кристаллизации. Одна из основных функций мембранных белков – рецепторная: они опосредуют трансмембранную передачу сигна ла посредством образования белок-лигандных комплексов.

Большая часть мембранных белков относится к семейству -белок сопря -белок женных рецепторов (C). Они имеют общий тип укладки полипептидной цепи: 7 трансмембранных доменов, образующих «пучок» спиралей, соеди ненных петлевыми участками. При этом N-конец белковой цепи находится во внеклеточной области, а С-конец – внутри клетки. Спектр лигандов для белков этого семейства чрезвычайно широк: это ионы металлов, нуклеоти ды, нуклеозиды, пептиды, низкомолекулярные соединения и даже свет. Для рационального конструирования лигандов, селективно и эффективно дейс твующих на белки семейства C, необходимо наличие моделей их про, странственной структуры.

Несмотря на ценность такой информации, на сегодняшний день извест на структура только двух белков этого семейства: зрительного родопсина и адренергического рецептора В2А. Эти модели широко использует в качестве шаблонов при компьютерном моделировании C-рецепторов на основа -рецепторов нии гомологии. Именно такой подход предлагается использовать для постро ения модели трехмерной структуры мембраносвязанного домена рецептора мелатонина – интегрального мембранного белка из семейства C.

цель работы:

Построение модели пространственной структуры трансмембранного до мена рецептора мелатонина мыши на основании гомологии с бычьим родоп сином. Сравнение полученной модели с существующей моделью рецептора мелатонина человека.

описание:

В процессе выполнения задачи необходимо выполнить следующие этапы:

1. Найти в Интернет-базе данных wss- (hp://www.xpsy.g/ sp/) запись об аминокислотной последовательности моделируемого белка. Извлечь интересную информацию о последовательности (дату секвенирования, таксономию вида, библиографические ссылки на объект, функции, данные о доменной организации). Эта информация должна быть представлена в отчете. Сохранить последовательность моделируемого белка в AA-формате.

2. В базе AA (hp://www.b.c.u/s33/) найти гомологи моделируемого белка. Сохранить последовательности некоторых из них в AA-формате.

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 3. Для всех сохраненных последовательностей построить множественное выравнивание и филогенетическое дерево с помощью инструмента CLUALW (hp://www.b.c.u/cluslw/). На основании этих данных сделать вывод о родственных отношениях в семействе белков.

4. Предсказать положение трансмембранных (ТМ) участков в моделируемом белке различными методами;

сравнить результаты.

Методы (найти в Интернет): HMM, MHMM, M, 2.

5. Построить бинарное (парное) выравнивание последовательности моделируемого белка с последовательностью бычьего родопсина (psd_ bv в Swiss-). Обсудить выравнивание с преподавателем. Уточнить выравнивание. Проверить, совпадают ли на выравнивании предсказан ные ТМ области моделируемого белка и экспериментально определен ные – родопсина.

6. Создание файла с инструкциями для построения модели. Построе ние моделей с помощью программы MLL на основании получен ного ранее выравнивания. Выбор лучшей модели на основании анализа пространственных нарушений.

7. Оптимизация полученной модели в молекулярной оболочке In sgh:

• Добавление атомов водорода для физиологического PH;

• «Ступенчатая» минимизация энергии полученной модели: 1) только атомов водорода;

2) только боковых цепей;

3) всей молекулы, кроме C атомов;

4) полная минимизация энергии;

• Удаление петлевых участков модели и кэпирование полученной структуры.

8. Сравнить полученную модель с построенной ранее моделью ML1A_HUMA.

9. По результатам проделанной работы написать отчет.

Контрольные вопросы:

1. Есть ли какие-нибудь закономерности в расположении консервативных и вариабельных (в семействе рецепторов мелатонина) аминокислотных ос татков трансмембранного домена?

2. Как можно в дальнейшем уточнить и использовать построенную мо дель для рационального конструирования новых лигандов – аналогов мела тонина?

3. Назовите источники возможных ошибок, допущенных при создании модели и способных повлиять на ее качество.

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

задача № 3. молекулярная динамика (мд) пептида (RQIKIFFQN RRMKFKK) в явно заданном растворителе (воде) в присутствии отрица тельно заряженных противоионов (Cl-).

Введение Пространственная структура и механизмы функционирования белков су щественно зависят от влияния среды. Во многих случаях именно эффекты ок ружения определяют нативную конформацию и биологическую активность белков. В то же время современные экспериментальные методы структурно го анализа дают лишь “статическую” (рентгеноструктурный анализ, элект ронная микроскопия) или усредненную по ансамблю (спектроскопия яМР) картину конформационных состояний белков. Это затрудняет исследование деталей структурных изменений, происходящих в процессе осуществления белками их биологических функций.

Решение многих из указанных проблем может быть достигнуто с по мощью методов компьютерного моделирования – молекулярной динамики (МД), Монте-Карло (МК) и др. В компьютерных экспериментах можно мо делировать поведение систем белок-среда на достаточно протяженной вре менной шкале, причем некоторые из получаемых в расчетах важнейших структурно-функциональных параметров (например, термодинамика кон формационных переходов и ионного транспорта, структура промежуточных состояний в процессе функционирования и т.д.) не могут быть получены эк спериментально. Результаты моделирования эффективно используют как для интерпретации экспериментальных данных, так и для уточнения параметров моделей. Основными трудностями при этом являются корректный учет эф фектов среды и огромные вычислительные затраты.

цель работы Изучение структурно-динамических свойств (подвижность аминокислот ных остатков, стабильность пространственной структуры) пептида методом МД в явно заданном растворителе (воде).

описание В процессе выполнения задачи необходимо выполнить следующие этапы:

8. Построить модель пространственной структуры пептида RQ IKIFFQNRRMKFKK в -спиральной конформации (использовать молекуляр ный редактор Maestro). Структуру сохранить в файле B-формата.

9. Используя полученный B-файл, создать входные файлы (, TOP) для МД-пакета MAC 3.14 (утилита dc).

10. Задать необходимые размеры моделируемой ячейки (по 2 нм от пеп тида до границ ячейки).

МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР 11. Добавить необходимое число молекул растворителя – SPC модель воды (утилита gbx).

12. Добавить необходимое число ионов Cl- (утилита g).

13. Провести минимизацию энергии системы (утилита mdrun).

14. Провести уравновешивание системы с фиксированной молекулой пептида (утилита mdrun).

15. Создать файлы параметров МД-расчета (NPT, T=300K, постоянное изотропное давление, учет электростатических взаимодействий методом, время расчета 3 нс).

16. Провести линейный нагрев системы (в течение 60 пс до соответству ющей температуры ).

17. Осуществить запуск МД.

18. Обработать полученную траекторию:

- оценить подвижность аминокислотных остатков (M);

- оценить изменение вторичной структуры пептида в процессе МД;

- оценить число водородных связей, образуемых между пептидом и растворителем, а также внутри пептида.

19. Построить необходимые графики и диаграммы.

20. Написать отчет о проделанной работе.

Контрольные вопросы 1. Зависят ли результаты МД от выбора стартовой конформации пептида?

2. Каким образом в расчете МД можно учесть рН среды?

3. С помощью каких экспериментов можно подтвердить или опроверг нуть полученные результаты МД?

Ефремов Р.Г., Шайтан К.В.

оглавлеНие часть 1: тексты лекций.............................................................................. Введение......................................................................................................... 1. Понятие slc в современной биологии. Общая характеристика методов компьютерного моделирования.

Основные направления. Тип решаемых задач................................... 2. Биоинформатика............................................................................... 3. Методы, основанные на использовании эмпирических силовых полей........................................................... 4. Молекулярный докинг................................................................... 5.Моделирование на основе гомологии........................................... 6. Молекулярное моделирование мембранных и мембрано-активных белков............................................................... часть 2: методические рекомендации по изучению дисциплины................................................................................................. 1. Аннотация....................................................................................... 2. Приобретаемые компетенции....................................................... 3. Виды учебной работы.................................................................... 4. Содержание учебной дисциплины............................................... 4.1. Тематический план учебной дисциплины................................ 4.2. Содержание лекционного курса................................................ 4.3. Темы лабораторных занятий...................................................... 5. Учебно-методическое обеспечение дисциплины........................ 5.1. Рекомендуемая литература......................................................... 5.2. Средства обеспечения освоения дисциплины.......................... 5.3. Материально-техническое обеспечение дисциплины........................................................................................ 6. Методические рекомендации по организации обучения.............................................................................................. 7. Перечень заданий для самостоятельного выполнения............... 8. Примерный перечень тем рефератов............................................ часть 3: Учебно-методические материалы для практических занятий, семинаров, лабораторных работ и деловых игр................................................................................... МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Общий план практикума по «Молекулярному моделированию нано- и биоструктур»............................................. Учебно-методические материалы для лабораторных работ............. Учебно-методические материалы для организации семинаров и практических занятий....................................................... часть 4: дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава.......................................... Рекомендации по использованию дидактических материалов.......................................................................................... Слайды................................................................................................ Эскизы плакатов............................................................................... дидактические материалы для работы профессорско-преподавательского состава........................................ Вопросы для экзамена..................................................................... Вопросы к лабораторным и практическим занятиям................... Список задач для самостоятельной работы студентов................. Учебно-методический комплекс Роман Гербертович Ефремов, Константин Вольдемарович Шайтан МОЛЕКУЛяРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И БИОСТРУКТУР Подписано в печать Формат 60х90 1/16. Тираж Печать офсетная. Бумага офсетная.

Гарнитура s w.

Усл. печ. л. 8,19.



Pages:     | 1 ||
 

Похожие работы:


 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.