авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Состояние коллагена в тканях глаза и его целенаправленная модификация

На правах рукописи

ДАНИЛОВ НИКИТА АЛЕКСАНДРОВИЧ

СОСТОЯНИЕ КОЛЛАГЕНА В ТКАНЯХ ГЛАЗА

И ЕГО ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ

02.00.04 – физическая химия

01.02.08 - биомеханика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени

кандидата химических наук

Москва – 2011 г.

Работа выполнена в лаборатории катализа и газовой электрохимии кафедры физической химии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

кандидат химических наук, доцент Игнатьева Наталия Юрьевна доктор биологических наук Иомдина Елена Наумовна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Любимов Григорий Александрович Институт механики МГУ им. М.В. Ломоносова кандидат химических наук Ефимов Александр Валерьевич Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им.Н.И.Пирогова»

Росздрава РФ.

Защита состоится «20» мая 2011 г. на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.90 по химическим наукам при МГУ имени М. В. Ломоносова по адресу:

119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1., строение 3, Химический факультет, аудитория 337, 15:00.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» апреля 2011 г.

Учный секретарь диссертационного совета доктор химических наук М.С. Бобылева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Коллаген является основным структурным белком соединительной ткани, главная функция которой - опорно-механическая. Все структурное и функциональное многообразие соединительных тканей определяется тонкими различиями в аминокислотном составе типов коллагена, его ко- и посттрансляционной модификации, способах укладки макромолекул в фибриллы и организацией фибрилл, взаимодействием фибрилл с другими химическими компонентами тканевого матрикса. Очевидно, что малейшие нарушения этих факторов приводят к изменению морфологии матрикса ткани (патологическому ремоделированию), и, следовательно, к аномальному функционированию органа.

Важная научно-практическая задача исследователей состоит в том, чтобы, с одной стороны, установить наличие и глубину патологических изменений в ткани (в частности, изменение состояния коллагена), выявить связь этих изменений с характером патологического процесса, и, с другой стороны, обозначить подходы к коррекции выявленных нарушений. При этом в ходе выполнения исследований необходимо установить измеряемые параметры, достаточно однозначно характеризующие состояние коллагена.

Объектом исследования данной работы являются коллаген-содержащие ткани глаза, свойства которых нарушаются при наиболее распространенных глазных заболеваниях - прогрессирующей миопии и глаукоме. При миопии имеет место ухудшение механических характеристик склеры глаза, что способствует е необратимому растяжению и прогрессированию заболевания. Есть основания предполагать, что при глаукоме нарушение биомеханических свойств склеры и других структур глаза также является существенным фактором развития патологического процесса.

Определение изменений в структуре и свойствах коллагена при прогрессирующей миопии и глаукоме и разработка научных основ их патогенетического лечения или профилактики дальнейшего развития заболевания является актуальнейшей проблемой научного сообщества офтальмологов, биологов, специалистов в области химии и биомеханики. Кроме того, с точки зрения физической химии интересной является принципиальная возможность использования термодинамических характеристик для определения состояния коллагена в тканях глаза.

Цель работы. Данное исследование предпринято с целью определения особенностей состояния коллагена в тканях глаза при глаукоме и прогрессирующей миопии в рамках физико-химических подходов и создания на базе этих знаний основы для разработки новых методов лечения этих заболеваний.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. На базе данных термического, химического и флуоресцентного анализа выявить особенности состояния коллагена в склере глаз с различными стадиями первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ).

2. С помощью термического, химического, флуоресцентного и морфологического анализа определить отличия в состоянии коллагена в теноновой капсуле глаз в норме и при прогрессирующей миопии.

3. Выявить корреляцию между химическими, термическими и механическими свойствами коллагенсодержащих тканей на примере склеры кролика;

определить изменения в состоянии коллагена склеры кролика под действием перспективных сшивающих агентов – глицеринового альдегида и треозы in vitro.

4. Оценить эффективность воздействия треозы в эксперименте на кроликах in vivo с учетом определенных in vitro характеристик стабильности коллагенового матрикса склеральной ткани.

Научная новизна. Результаты, полученные в настоящей работе, представляют собой новые данные об изменении состояния коллагена I в ткани склеры человека при глаукоме, в ткани теноновой капсулы человека при миопии, а также в ткани склеры кролика при химических склероукрепляющих воздействиях in vitro и in vivo.

Показано, что метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет определить фракции коллагена, отличающиеся типом и количеством сшивок, а также оценить состояние матрикса коллагенсодержащей ткани. Метод ДСК позволяет получить важную информацию о стабильности структурообразующего белка в исследуемой ткани, что, в сочетании с другими методиками (флуоресцентный, биомеханический и химический анализы), создает основу для выявления молекулярных причин патологических изменений матрикса ткани.

Впервые получены зависимости параметров стабильности коллагенсодержащей ткани от времени обработки простыми сахарами – глицериновым альдегидом и треозой. Впервые обнаружено, что на начальных временах воздействия этих агентов характеристики стабильности ткани могут ощутимо ухудшаться в связи со специфическим влиянием продуктов их первичного присоединения.

В рамках данной работы впервые экспериментально разработан инъекционный способ укрепления склеры in vivo с использованием треозы как мягкого сшивающего агента и оценена его эффективность.

Практическая значимость. Полученные в работе данные о состоянии коллагена в склере пациентов с различными стадиями глаукомы расширяют представления о патогенезе глаукомы и могут служить основанием для разработки новых методов терапии, направленных на регуляцию биомеханических характеристик склеры.

Результаты исследования теноновой капсулы обосновывают правомочность ее использования в качестве доступного объекта для изучения патогенеза прогрессирующей миопии и клинической диагностики степени деградации склеры.

Исследование изменения состояния коллагена в склере кролика при обработке простыми сахарами открывает путь к созданию новых методов профилактики и лечения прогрессирующей близорукости.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Биомеханика глаза», Москва, 2007, 2009;

конференции «Федоровские чтения-2007», Москва, 2007;

научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти проф. Э.С. Аветисова «Рефракционные и глазодвигательные нарушения», Москва, 2007;

конференции «12th International Myopia Conference», Australia, 2008;

XVIII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», 2008;

научно-практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум», Москва, 2008, 2009, 2010;

XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2009;

XVII Международной научно-практической конференции по химической термодинамике, Казань, 2009;

конференции «Congress of the European Society of Ophthalmology», Amsterdam, 2009;

конференции «World Glaucoma Congress», Boston, 2009;

Congress of the European Association for Vision and Eye Research, Portoroz, Slovenia, 2009;

конференции «13th International conference on Myopia».

Tuebingen, 2010;

научной конференции с международным участием «Невские горизонты». Санкт-Петербург, 2010.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в реферируемых журналах и 13 статей в сборниках научных работ и тезисов докладов.

Структура и объм диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части (Глава 2), изложения результатов и их обсуждения (Глава 3), выводов и списка цитированной литературы.

Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 137 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор (Глава 1) состоит из трх частей. В первой части описаны компоненты внеклеточного матрикса соединительной ткани: коллаген, эластин, гликозаминогликаны (ГАГ) и протеогликаны (ПГ). Особое внимание уделено морфологии коллагена, его ко- и пост-трансляционным модификациям, в том числе химическим процессам образования стабилизирующих коллагеновую структуру незрелых (альдиминов) и зрелых (включая конечные продукты гликации) кросс поперечных сшивок (Рис. 1).

Рис. 1. Пример поперечных сшивок между макромолекулами коллагена Рассмотрены особенности фибриллярной структуры соединительных тканей, определяющие механические свойства коллагенового волокна. Описаны физико химические основы денатурации коллагена на базе теории плавления полимеров, которая обосновывает описание этого явления в рамках модели фазового перехода I рода;

такой подход объясняет определяющее влияние концентрации меж- и внутримолекулярных поперечных связей в коллагене на измеряемую температуру денатурации (Тд). В качестве характеристик стабильности коллагеновых систем определены механические показатели, Тд и устойчивость к ферментативному расщеплению. Обсуждается влияние патологических особенностей ткани на изменение этих характеристик. Рассмотрены химические и механические изменения склеральной ткани при глаукоме и миопии, а также ключевая в контексте данной работы гипотеза, что при миопии склеральный коллаген характеризуется низкой долей поперечных связей.

Во второй части обзора освещена проблема регулирования свойств коллагенсодержащих биотканей с помощью введения поперечных сшивок при физико-химических воздействиях. Проведен анализ возможностей применения этих методик для укрепления склеры при миопии и рассмотрен химический механизм реакции коллагена с наиболее перспективными сшивающими агентами глицеральдегидом (ГА) и треозой (ТР).

В третьей части проанализированы и выбраны наиболее подходящие методики химического анализа компонентов соединительной ткани. Обсуждаются возможности оценки типового состава коллагена на основе мольных соотношений ключевых и коллагенспецифичных аминокислот: глицина (Gly) к аланину (Ala) и гидроксипролина (Hyp) к лизину (Hyl).

В Главе 2 («Экспериментальная часть») описаны материал и методы исследования. Исследования in vitro выполнены на образцах:

*склеры, взятых у 27 пациентов в возрасте 52-81 года с различными стадиями ПОУГ: начальной (I стадия, n=9), используемой в качестве контроля, развитой (II стадия, n=9), далекозашедшей (III стадия, n=9);

*Теноновых капсул, взятых у 30 пациентов в возрасте 10-22 лет с прогрессирующей миопией от -7.5дптр до -31.0 дптр и у пациентов в возрасте 7 23 лет с эмметропией либо слабой гиперметропией (контрольная группа).

*склеральная ткань 40 глаз 9-12-ти месячных скелетно зрелых кроликов (для исследования гликации in vitro).

Действие сшивающих агентов на ткань склеры кроликов in vitro проводилось при инкубации образцов в растворе ГА от 1 до 48 часов или ТР от 0.5 до 7 суток при 37°С.

Действие треозы на ткань склеры in vivo оценили на 5 кроликах породы «Шиншилла» массой тела ~2.5 кг. Кролики содержались в стандартных условиях вивария, получали стандартный рацион питания и воду ad libitum. После локальной анестезии (инстилляций раствора алкаина) в правые глаза (OD) с помощью инсулинового шприца через загнутую по форме глаза иглу в верхне-наружном квадранте глазного яблока на поверхность склеры вводили 0.15 мл 0.1М раствора треозы. Инъекции повторяли каждые 2-3 дня, всего выполнили от 5 до 7 инъекций.

Левые глаза (OS) служили контролем. Животных выводили из эксперимента через 7 (n=2) и 36 (n=3) суток после окончания курса инъекций.

Физико-химические свойства образцов были исследованы не позднее 24 часов после изъятия. Для характеризации использовали следующие методы:

*химический анализ, включающий определение гликозаминогликанов и гидроксипролина с помощью оригинальных спектрофотометрических реакций, аминокислотного состава с помощью хроматографии гидролизата, характеристик флуоресценции (вид спектра и интенсивность), протеолитической устойчивости к расщеплению смесью «Морикразой»;

*механическое тестирование и анализ кривых «напряжение-деформация», полученных с помощью одноосного растяжения образцов со скоростью 1 мм/мин;

*термический анализ с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) при скорости нагрева 10°/мин;

*морфологический анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Для приготовления срезов изъятые материалы фиксировались в 0.1 М CaCoNa/HCl буфере (pH 7.2-7.4) с добавкой 2% смеси глутарового альдегида и параформальдегида при 4°C, затем производили постфиксацию с 1% OsO4 в течение 1 часа. Ультратонкие срезы окрашивали с помощью уранил-ацетата и цитрата свинца.

Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения Origin Pro 7.5 (“Origin Lab Corp.”, США). Сравнение независимых групп по количественному признаку проводили с помощью t-критериев Стьюдента с уровнем статистической значимости p=0.05. Результаты приведены как «среднее ± доверительный интервал».

Часть исследования, связанная с проведением экспериментов in vivo, проведена в ФГУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздравсоцразвития. Все исследования были разрешены этическим комитетом МНИИ ГБ им.Гельмгольца.

Результаты и их обсуждение (Глава 3) представлены в трех частях, краткое содержание которых изложено ниже.

В первой части приведены результаты сравнительного изучения состояния коллагена в образцах склеры пациентов, страдающих первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) различных стадий (I - начальной, II -развитой и III далекозашедшей), а также в образцах теноновой капсулы пациентов с прогрессирующей близорукостью и из группы контроля.

Выполнены аминокислотный, термический и флуоресцентный анализы образцов склеры, определено также содержание коллагена. Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Изменение биохимических и физико-химических характеристик склеры человека при развитии ПОУГ Параметр I стадия II стадия III стадия Коллаген,% от сухого веса* 47.0±1.5 (n=6) 50.8±0.4 (n=6) 53.2±0.6 (n=6) Мольное отношение Hyp/Hyl** 16.1±2.4 (n=3) 15.4±2.5 (n=3) 16.7±2.0 (n=3) Мольное отношение Gly/Ala** 2.76±0.06 (n=3) 2.73±0.03 (n=3) 2.72±0.04 (n=3) Температура денатурации* 60.7±0.5°С (n=6) 62.9±0.5°С (n=6) 64.2±0.8°С (n=6) Интенсивность флуоресценции** 1.23±0.20 (n=3) 1.46±0.31 (n=3) 1.39±0.24 (n=3) (ex/em=370/441 нм) * Все отличия между группами статистически значимы (p0.05).

** Все отличия между группами статистически незначимы (p0.05) При развитии глаукомы происходит увеличение концентрации коллагена (без изменения его типового состава). Не вполне обычным для естественных процессов в зрелых биотканях является увеличение Тд коллагена без изменения уровня флуоресценции. Причиной такого специфического изменения состояния коллагена в склеральной ткани при ПОУГ является сдвиг тонкого динамического равновесия (турновера) между синтезом и деградацией в сторону синтеза, причем рост числа поперечных сшивок (о чем говорит рост Тд) не связан с повышением содержания конечных продуктов гликации (о чем говорит неизменность уровня флуоресценции). Анализ литературных данных об уровне различных ферментов матрикса и их ингибиторов позволил заключить, что возрастание Тд и накопление коллагена наиболее вероятно связаны с укреплением тканевого матрикса за счет ослабления действия коллагенолитических ферментов и усиления процессов сшивания трансглутаминазой.

Результаты комплексного химического, термического, флуоресцентного и морфологического (ПЭМ) анализа образцов теноновой капсулы суммированы в Таблице 2.

Таблица 2. Изменение физико-химических характеристик теноновой капсулы человека при прогрессирующей миопии Параметр Контроль Миопия Коллаген, % от сухого веса** 56.8±6.4 (n=6) 53.2±5.7 (n=6) Мольное отношение Hyp/Hyl** 25.20±0.99 (n=3) 22.73±2.57 (n=3) Мольное отношение Gly/Ala** 2.61±0.01 (n=3) 2.62±0.20 (n=3) Температура денатурации* 65.6±1.0 °С (n=5) 61.6±1.0 °С (n=5) Интенсивность флуоресценции** 0.614±0.354 (n=6) 0.540±0.250 (n=6) (ex/em=370/438 нм) ГАГ, % от сухого остатка** 0.149±0.035 (n=6) 0.144±0.020 (n=6) * Все отличия между группами статистически значимы (p0.05).

** Все отличия между группами статистически незначимы (p0.05) Повышенное значение Hyp/Hyl без изменения соотношения Gly/Ala, по видимому, связано с высоким содержанием эластина в теноновой капсуле, который содержит Hyp, но совершенно не содержит Hyl. Действительно, исходные образцы демонстрировали высокую эластическую растяжимость (100% по длине) и набухаемость в физиологическом растворе (~600% по массе). Кроме того, 15-20% сухого остатка не растворяется в трипсине после прогрева в ДСК калориметре. Все эти явления характерны для эластина.

На электронных микрофотографиях контрольных образцов теноновой капсулы фибриллы коллагена плотно упакованы в волокна, ориентированные в различных направлениях, и образуют трехмерную сеть (Рис. 2а). Такая структура идеальна для того, чтобы ткань выдерживала разнонаправленные нагрузки. На продольном сечении фибрилл четко визуализируется характерная D-периодичная структура и связанные с поверхностью фибрилл протеогликановые филаменты (Рис. 2б). Распределение фибрилл по диаметру (dср=87.1±2.0 нм) унимодальное (Рис. 2в).

На электронных микрофотографиях образцов миопической группы обнаружены значительные изменения в пространственной организации фибрилл;

волокно дезорганизовано, а фибриллы расположены беспорядочно, отмечен лизис фибрилл (Рис. 2г, д). Ткань содержит области с отсутствием коллагеновых фибрилл, заполненные избытком ПГ. По сравнению с контрольной группой средний диаметр фибрилл dср=75.7±1.0 нм уменьшен (p0.001), причем распределение фибрилл по диаметрам более однородно за счет уменьшения доли фибрилл самых малых диаметров (Рис. 2е).

Кажущееся противоречие результатов аналитического определения ГАГ данным электронной микроскопии, где наблюдался избыток протеогликанов в миопической группе, объясняется деструкцией под действием матриксных металлопротеиназ белкового стержня протеогликанов. Эта часть ПГ контактирует с поверхностью коллагеновых фибрилл, и его деструкция может приводить к наблюдаемому на электронных микрофотографиях отделению гранул ГАГ от поверхности фибрилл. Уменьшение доли фибрилл самого малого диаметра коррелирует с данным механизмом деградации ткани, так как фибриллы малого диаметра подвержены деградации в отсутствие нормального связывания между коллагеном и протеогликанами. В результате происходит ухудшение оптимальных биомеханических характеристик и развитие необратимых деформаций даже в диапазоне физиологических нагрузок.

Разница между средними значениями уровня флуоресценции в контрольных и миопических образцах теноновой капсулы являлась статистически незначимой.

Тем не менее, если рассматривать только сами средние величины, то более низкое значение уровня флуоресценции для миопической группы можно приписать определенной незрелости коллагеновых структур миопического глаза преобладанию молодого коллагена с низкой долей продуктов гликации и более ускоренным его обращением (турновером), что будет препятствовать накоплению флуорофоров.

Г А Д Б В Е Рис. 2. Примеры электронных микрофотографий и гистограмм распределения фибрилл по диаметру в контрольных образцах (слева) и в миопической группе (справа) Дезорганизация ткани отражается на термическом поведении образцов теноновых капсул (Рис. 3). Для контрольной группы эндотерма денатурации коллагена представлена четким эндотермическим пиком с температурой 65.6±1.0°С (n=6) и более или менее выраженным высокотемпературным плечом (Рис. 3С, кривые а и б). Последнее отражает наличие фракции коллагена, сшитой поперечными связями по механизму неферментативной гликации, которые формируются во время старения (плечо не выражено у пациентов моложе 15 лет (Рис. 3С, кривая а)). Кривые ДСК миопических образцов (n=6) можно разделить на две группы: c одним четким эндотермическим переходом в диапазоне 60-62.70°С с высокотемпературным плечом (Рис. 3М, кривая а) и группу термограмм с наличием многокомпонентных эндотерм с ранними максимумами в диапазоне 60 62.70°C, вторыми максимумами при 63.5-65.5°C и высокотемпературным плечом (Рис. 3М, кривая б). Пик, расположенный в области низких температур, обычно связывают с наличием фракции незрелого коллагена с термолабильным типом поперечных связей (альдиминами) [1]. Наличие этой фракции коррелирует с низкой концентрацией зрелых поперечных связей в коллагене миопической группы. Структурная дезорганизация фибриллярной упаковки и отделение гранул ПГ от фибрилл и волокон (Рис. 2г-д) также способны понижать значения Тд. Чем более рыхлая упаковка макромолекул и связывание коллагена и ПГ, тем ниже термостабильность, поскольку при этом больше энтропия случайного клубка (в соответствии с известной теорией «полимер в трубке» [2]), а, следовательно, выше Sд и ниже Тд.

(C) (M) Рис. 3. Типичные ДСК-термограммы образцов теноновой капсулы из контрольной (C) и миопической (M) групп.

Объединенные данные ДСК, ПЭМ и флуоресцентного анализа позволили нам впервые установить отклонения в структуре коллагена теноновой капсулы при прогрессирующей миопии, связанные с понижением уровня кросс-поперечного сшивания и повышением скорости деградации ткани теноновой капсулы при развитии прогрессирующей миопии.

Вторая часть посвящена анализу изменения состояния склерального коллагена кролика при кросс-поперечном сшивании простыми сахарами (гликации) - глицериновым альдегидом (ГА) и треозой (ТР). Проведены флуоресцентный, биомеханический, термический анализы образцов склеральной ткани, а также определена их устойчивость к расщеплению протеолитической смесью «Морикраза», содержащей широкий спектр протеолитических ферментов, включая коллагеназу.

В качестве контроля использовали интактные образцы склеральной ткани. Для них характерна слабая флуоресценция, связанная с наличием продуктов неферментной гликации, образующихся при жизни, и низкая устойчивость к обработке смесью «Морикраза» (за 72 ч при 37°С образец терял 85-87% начального веса). Модуль Юнга этих образцов составлял 36±2 МПа. На ДСК-термограммах наблюдался характерный для денатурации коллагена эндотермический переход (Т=68±1°С, H=57+5 Дж/г), также отмечено высокотемпературное плечо, связанное с прижизненным сшиванием коллагена продуктами деструкции глюкозы (Рис. 4).

Рис. 4. Типичная ДСК-термограмма интактного образца склеры Интенсивность флуоресценции папаинатов препаратов склеры резко возрастает при гликации. Максимумы двух пиков испускания флуоресценции папаинатов образцов, гликированных ГА (Рис. 5а), близки к таковым для известных флуорофоров аргинингидрокситреозидина (АГТ;

ex/em=331/380 нм [3]) и лизингидрокситреозидина (ЛГТ;

ex/em=354/440 нм [3]). Спектры испускания флуоресценции папаинатов образцов, гликированных ТР (Рис. 5б), имеют единственный эмиссионный максимум ~400 нм (ex=328 нм), близкий к максимуму флуорофора треозидина (ex/em=328/402 нм) [4].

Идентификация флуорофоров позволила оценить длину типичных поперечных сшивок, в которые входят сами флуорофоры и их предшественники.

Установлено, что максимальная длина сшивки между соседними полипептидными цепями коллагена может достигать 1.4-1. нм. Это значит, что возможно образование внутримолекулярных (А) и межмолекулярных сшивок, а также сшивок между микрофибриллами. Расстояние между фибриллами 10 нм, и образование сшивок на этом структурном уровне, а тем более между волокнами невозможно.

Образование сшивок приводит к существенному изменению характеристик ткани.

Все определяемые параметры (интенсивность флуоресценции (Б) ФЛ, модуль Юнга - Е, температура денатурации Тд, Рис. Спектры флуоресценции 5.

протеолитическая устойчивость - папаинатов образцов, гликированных ГА ФУ) изменялись в ходе сшивания (А) при возб=331, 354 нм, 370 нм (слева сходным образом: направо);

спектры флуоресценции in vitro образцов, гликированных ТР (Б) при относительно быстрое возрастание возб=328, 370 нм (слева направо) в интервале 0-10 ч для ГА и 0- суток для ТР сменялось выходом графика на плато в интервале 12-18 ч для ГА (Рис. 6) и 5-7 суток для ТР (Рис. 7).

Рис. 6. Изменения характеристик образцов склеры кролика в ходе поперечного сшивания глицериновым альдегидом Это позволяет сделать вывод о почти полном протекании реакции гликации коллагена за указанные временные интервалы. Модуль Юнга склеры в итоге увеличивался в 4-6 раз. Резкое возрастание Тд, E и протеолитической устойчивости однозначно указывает на возрастание структурной стабильности коллагена склеры вследствие поперечного сшивания и обосновывает перспективность дальнейшего изучения возможности клинического использования этих реагентов для укрепления склеры при прогрессирующей миопии.

Рис. 7. Изменения характеристик образцов склеры кролика в ходе поперечного сшивания треозой Кривые «напряжение-деформация», полученные в результате биомеханического тестирования, имеют вид, типичный для коллагенсодержащих тканей (Рис. 8). Условно, кривые разделяются на три участка. На начальном участке с увеличением деформации напряжение изменяется по экспоненциальному закону, что соответствует физиологическому диапазону работы мягких тканей и связано с распрямлением гофрированной структуры фибрилл. На втором участке зависимость почти линейна, на нем определяется модуль Юнга. С увеличением деформации зависимость становится нелинейной (третий участок), и далее наступает разрушение образца.

Отметим, что в случае обработки ТР поведение первого участка кривой сходно с поведением второго: растяжимость закономерно падала с увеличением времени обработки. В случае же ГА наблюдался отчетливый рост относительного удлинения на начальном участке (вплоть до 30%). Это обусловлено большой усадкой ткани в ходе сшивания высокоактивным ГА. Кажущееся повышение растяжимости относится только к восстановлению длины усаженного образца до первоначальной величины. В случае использования треозы усадки ткани не отмечалось, что и объясняет отсутствие повышения начальной растяжимости.

На ранних стадиях гликации (время обработки менее 3 ч для ГА и менее суток для ТР) на ДСК термограммах отмечены интересные особенности (Рис.

9), а на кривой ФУ - локальный минимум протеолитической устойчивости в случае обработки ГА. Эндотермы денатурации состояли из нескольких пиков, в том числе отмечен пик, соответствующий фракции коллагена с (А) пониженной относительно интактных образцов Тд.

Мы полагаем, что ДСК анализ обнаруживает фракции коллагена, которые содержат продукты начального бессшивочного присоединения ГА и ТР к аминогруппам, то есть дополнительные боковые цепи (эффект маскирования);

поперечные сшивки же образуются позднее.

Результатом является частичная временная дезорганизация (Б) фибриллярной структуры. Факт Рис. 8. Примеры кривых «напряжение понижения температуры деформация» для интактных и некоторых плавления после введения в сшитых глицеральдегидом (А) и треозой (Б) углеродный скелет линейного образцов склеры полимера боковых цепей хорошо известен [5].

Эффект маскирования оказывает противоречивое действие на протеолитическую устойчивость. Действительно, в случае гликации ГА зависимость ФУ от времени обработки не является монотонной. После небольшого возрастания (0-1ч), имеет место снижение устойчивости к действию ферментов (2-3ч), и лишь затем вновь резкое возрастание. В это же время исчезает фракция с (G) пониженной Тд;

продукты маскирования переходят в поперечные сшивки.

Эффект оказался менее выражен для случая гликации треозой, вероятно, вследствие значительно меньшей концентрации продуктов маскирования из-за меньшей химической активности треозы.

На основании полученных термодинамических данных о денатурации коллагена в склере (T) можно составить схему изменения энергии Гиббса при Рис. 9. Примеры характерных термограмм для образцов с временем обработки плавлении интактного, глицеральдегидом 1ч40мин-2ч30мин (G) и маскированного и сшитого треозой 12 ч (T) коллагена. Поскольку денатурация коллагена описывается в рамках модели фазового перехода I рода, то в точке перехода между состоянием тройной спирали и конфигурацией случайного клубка верно равенство:

Hд Gперехода G клуб G спир 0, а Tд Sд Мы не отмечали систематического изменения Hд в ходе сшивания, следовательно, изменение температуры денатурации обусловлено главным образом Sд. Рассмотрим это на примерах интактной, маскированной и высокосшитой фракций коллагена (Рис. 10).

1. Интактная (несшитая) фракция коллагена:

При температуре функционирования ткани (37C) устойчива трехспиральная структура, ее энергия Гиббса меньше, чем у случайного клубка. Энтропия несшитого клубка существенно больше, чем у несшитой спирали, поэтому с ростом температуры Gклуб падает быстрее, чем Gспир, и Gперехода будет уменьшаться.

При T TД две фракции могут находиться в равновесии, где TД.- температура 0 денатурации коллагена в интактной ткани.

2. Маскированная фракция.

Эффект маскирования, возможно, способен несколько увеличивать энтропию тройной спирали Sспир, и заметно увеличивает энтропию случайного клубка Sклуб через возникновение новых конформаций за счет вращения алифатических групп новой боковой цепи вокруг одинарных связей. Соответственно, G маскир будет клуб Рис. 10. Изменение энергии Гиббса для различных состояний коллагена. (1) – тройная спираль;

(2) – сшитый клубок;

(3) – необработанный клубок;

(4) – маскированный клубок. Тройная спираль мало изменяет свои характеристики в зависимости от наличия/отсутствия обработки, поэтому отмечена лишь один раз уменьшаться с ростом T быстрее, чем G маскир, и вообще говоря, быстрее Gклуб в спир интактной, необработанной ткани. Таким образом, Gперехода=0 при T TД.

3. Сшитая фракция.

Для сшитой фракции коллагена Sклуб будет гораздо меньше, чем в несшитой фракции, за счет значительного уменьшения числа возможных допустимых конформаций. Это уменьшение с избытком компенсирует незначительное увеличение S сшит, которое происходит за счет некоторого разупорядочивания в спир сшитых образцах, и поэтому температура денатурации коллагена Tд становится значительно больше TД.

Третья часть Главы 3 посвящена важному заключительному этапу работы исследованию возможности стабилизации склеры кролика при гликации треозой in vivo. Через 7 и 36 дней после окончания курса инъекций глаза энуклеировали и проводили комплексный анализ образцов склеры опытных (OD) и контрольных (OS) глаз. Результаты анализа приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Изменение характеристик склеры кролика в ходе гликации треозой in vivo Образец ФЛ, % E, МПа Тд, °С ФУ, % 35.1±2.2* 37.5±2.4* 1.7±0.4* 1.5±0.5** 7ODi (n=2) 94.7±7.3* 72.3±9.0* 12.8±1.6* 3.5±1.1* 7ODoi (n=2) 4.0±1.1* 36.2±2.8** 0.4±0.7** 0.9±0.6** 36ODi (n=3) 60.0±5.2* 73.5±8.4* 11.3±2.4* 2.4±1.3** 36ODoi (n=3) Схема обозначений образцов. Цифра впереди означает количество дней с момента окончания курса инъекций. Индекс-подстрочник характеризует зону склеры: i – зона инъекции;

oi – зона, противоположная зоне инъекции. Знак около параметра означает разностную величину между текущим значением и контрольным (см. ниже).

Для контроля (образцы склеры от неинъецированного глаза), получены следующие величины:

7 дней: ФЛ = 0, E = 33.5±2.5, Тд = 67.9°С±0.5, ФУ = 34.5%±3% 36 дней: ФЛ = 0, E = 34.4±2.0, Тд = 68.7°С±0.6, ФУ = 31.7%±1% *Разница с контрольной группой статистически значима (p0.05) **Разница c контрольной группой статистически незначима (p0.05) Примечание: все отличия между OD-группами в рамках одного и того же интервала времени ( или 36 дней) статистически значимы, за исключением параметра ФУ для образцов 36OD.

Видимых изменений в цвете обработанной склеральной ткани не происходило, однако параметры образцов OD претерпевают резкие изменения характеристик стабильности и характеристик флуоресценции по сравнению с контрольными образцами OS, за исключением слабого изменения протеолитической устойчивости.

В спектре флуоресценции (возб=328 нм) образцов OD наблюдался пик с максимумом ~400 нм, который характерен и для спектров образцов, сшитых треозой in vitro. В контрольных образцах OS этот пик отсутствует. Это позволяет утверждать, что реакция гликации склерального коллагена треозой in vivo и in vitro в общем и целом протекает по сходному механизму и приводит к образованию тех же конечных продуктов.

И для OS, и для OD, наблюдается пик при 411 нм, который смещается до нм при использовании возб=370 нм и приписывается продуктам естественной гликации (Рис. 11).

Рис. 11. Типичный спектр флуоресценции OD и OS образцов (возб=328 нм) Ключевой биомеханический показатель - модуль Юнга возрос почти в 2 раза для образцов 7ODoi и оставался на этом же уровне через месяц после окончания курса инъекций для образцов 36ODoi. Температура денатурации гликированной склеры OD заметно возрастает. В совокупности, эти данные указывают на образование поперечных сшивок между макромолекулами коллагена.

Незначительное изменение протеолитической устойчивости свидетельствует о более слабом уровне сшивания, чем в экспериментах in vitro. На это же указывает несколько меньшее изменение ФЛ, E, а также отсутствие окрашивания обработанной ткани по сравнению с ранее проведенным in vitro экспериментом.

Тем не менее, протеолитическая устойчивость не становится меньше, в отличие от е показателей на ранних этапах сшивания глицеральдегидом in vitro.

Необходимо отметить некоторые особенности полученных результатов. Во первых, наличие наиболее выраженных изменений не в зоне инъекции, а на противоположном участке склеральной оболочки. То же самое отмечалось Воллензаком и Иомдиной [6], которые проводили подобный эксперимент с глицериновым альдегидом и связывали это явление с транспортными эффектами в живом организме. Во-вторых, по сравнению с глицериновым альдегидом треоза является значительно более мягким реагентом. После курса инъекций ГА модуль Юнга и прочность возрастали в пять раз больше, чем это имело место в нашей работе. Большое возрастание E чревато побочными эффектами (риском развития глаукомы) при переходе в перспективе к клинической практике. В случае использования треозы возникновение таких эффектов маловероятно. В то же время, почти двукратное увеличение модуля Юнга, наблюдавшееся в нашей работе, вполне достаточно для остановки прогрессирования миопического процесса, при котором модуль Юнга заднего полюса склеры уменьшается лишь в 1.2-1.3 раза. Таким образом, целевой эффект склероукрепляющего воздействия достигнут, и наблюдается чткая тенденция к его длительному закреплению во времени.

ВЫВОДЫ Показано, что температура денатурации коллагена тканей глаза коррелирует 1.

с изменением состояния матрикса, связанного как с патологическими процессами, так и с воздействием сшивающих агентов.

Впервые получены физико-химические характеристики склеры человека на 2.

различных стадиях прогрессирования первичной открытоугольной глаукомы, включая аминокислотный состав, спектры флуоресценции, термическое поведение. Установлено, что по мере развития глаукомного процесса в склере растет содержание коллагена I и повышается уровень поперечных связей, увеличивающих жесткость склеры.

Впервые получены физико-химические характеристики теноновой капсулы 3.

человека при прогрессирующей миопии, включая данные ультраструктурного морфологического анализа, содержание гликозаминогликанов, аминокислотный состав, термическое поведение и спектры флуоресценции. Показано, что ткань теноновой капсулы миопических глаз характеризуется значительным снижением уровня поперечной связанности коллагена и диаметра коллагеновых фибрилл, что свидетельствует об ослаблении структурной стабильности матрикса этой ткани глаза в процессе развития миопии.

Показано, что использование гликирующих агентов (глицеринового 4.

альдегида и треозы) приводит к значительному росту уровня поперечного сшивания и стабилизации матрикса склеры кролика in vitro. Впервые получены детальные зависимости механической, термической и протеолитической устойчивости ткани склеры как функции времени обработки гликирующими агентами, показана их четкая корреляция с уровнем флуоресценции ткани, осуществлена спектральная идентификация главных флуорофоров. Отмечено, что на ранних стадиях процесса возможна структурная и термодинамическая дестабилизация коллагена, связанная с маскированием аминогрупп боковых цепей.

Впервые получены физико-химические характеристики склеры кролика, 5.

подвергнутой обработке треозой in vivo, включая механическую и протеолитическую устойчивость, термическое поведение и спектры флуоресценции. Подтверждена принципиальная возможность длительной стабилизации склеры in vivo с помощью инъекций треозы под тенонову капсулу на поверхность склеры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Игнатьева Н.Ю., Данилов Н.А., Аверкиев С.В., Обрезкова М.В., Лунин В.В., 1.

Соболь Э.Н. Определение гидроксипролина в тканях и оценка содержания в них коллагена. Журнал аналитической химии, 2007, т. 62, №. 1, с. 51–57.

Игнатьева Н.Ю., Данилов Н.А., Лунин В.В., Обрезкова М.В., Аверкиев С.В., 2.

Чайковский Т.И. Изменение термодинамических характеристик денатурации коллагена тканей глаз в результате неферментативной гликации Вестник Моск.Ун та. Сер.Химия, 2007, т. 62, №. 2, с. 63-66.

3. Danilov N.A., Ignatieva N.Yu., Iomdina E.N., Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Grokhovskaya T.E., Lunin V.V. Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, v. 1780, p. 764–772.

Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич Н.И., 4.

Шехтер А.Б., Данилов Н.А., Кварацхелия Н.Г., Чернышева С.Г. Современные достижения фундаментальных исследований патогенеза прогрессирующей миопии. Российский офтальмологический журнал, 2008, т.1, №3, с. 7-12.

Данилов Н.А., Игнатьева Н.Ю., Иомдина Е.Н., Гроховская Т.Е., Обрезкова 5.

М.В., Руденская Г.Н., Лунин В.В. Увеличение стабильности склерального коллагена в ходе гликации треозой in vitro. Журнал физической химии, 2010, т. 84, №1, с. 131–137.

Данилов Н.А., Игнатьева Н.Ю. Стабилизация склеры при гликации. Вестник 6.

Каз. Гос. Тех. Ун-та, 2010, № 2. с. 11-17.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. R. Zeeman Cross-linking of collagen-based materials. Thesis University of Twente, Enschede, The Netherlands. 1998.

2. Christopher A. Miles and Michael Ghelashvili. Polymer-in-a-Box Mechanism for the Thermal Stabilization of Collagen Molecules in Fibers.// Biophys. J. 1999. V. 76 P.

3243– 3. Kornfield J.A., Tessier F.J., Monnier V.M., Sayre L.M. Triosidines: novel Maillard reaction products and cross-links from the reaction of triose sugars with lysine and arginine residues.//Biochem. J. 2003. V. 369. P. 705- 4. Prabhakaram M., Cheng Q., Feather M., Ortwerth B. Structural elucidation of a novel lysine-lysine cross-link generated in a glycation reaction with L-threose.// Amino Acids.

1997. V. 12. P. 225- 5. Sperling L. H. Introduction to Physical Polymer Science. 2nd ed. New York, Wiley.

1993. P. 363.

6. Wollensak G., Iomdina E. Crosslinking of scleral collagen in the rabbit using glyceraldehyde.// J Cataract Refract Surg 2008. V. 34. N4. P. 651-656.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.