Механизмы гемостатических сдвигов при отсутствии, дефиците и избытке витаминов с антиоксидантными свойствами в рационе питания (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Шаповалова Елена Михайловна МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СДВИГОВ ПРИ ОТСУТСТВИИ, ДЕФИЦИТЕ И ИЗБЫТКЕ ВИТАМИНОВ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выс шего профессионального образования «Тюменская государственная медицин ская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному раз витию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Бышевский Анатолий Шулимович

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович доктор биологических наук Лунева Светлана Николаевна доктор биологических наук, профессор Фатеева Надежда Михайловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высше го профессионального образования «Российский государственный медицин ский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Москва

Защита состоится «30» апреля 2010 года в 10:00 часов на заседании диссер тационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, проспект В.И.

Ленина, д. 69.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет», г. Челя бинск.

Автореферат разослан «»2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Ефимова Н.В.

Общая характеристика работы

. Витамины рассматривают не только как соеди нения, дефицит которых ведет к специфическим нарушениям;

важные функции организма, в их числе и свободнорадикальное окисление, зависят от обеспечен ности витаминами (М.И.Смирнов, 1974;

П.Н.Шараев, 2004;

А.Ш.Бышевский и др., 2007;

J.K.Campbell e.a., 2004;

A.Opperhuizen e.a., 2005;

С.Weiss e.a., 2005;

A.K.Shirakawa, 2008). Рано сформировавшиеся представления о связях витамина С с метаболизмом (С.Д.Певзнер, 1940) относят ко всем витаминам (В.В.Ефремов, 1969;

М.И.Смирнов, 1974;

C.Weiss e.a., 2005;

A.K.Shirakawa, 2008). Взгляд на них как на средства профилактики и лечения гиповитаминозов сменился представле нием как о соединениях, определяющих за счет неспецифических свойств харак тер метаболизма и устойчивость организма (Б.А.Лавров 1957), и это расширило область их применения.

К заболеваниям, в лечении которых используют витамины, относят и проте кающие с нарушениями гемостаза, некоторые из них эффективны и при заболе ваниях с явлениями гипероксидации (A.Opperhuizen, 2008), особенно витамины с антиоксидантными свойствами (В.П.Мищенко, 1981, 2005;

А.Ш.Бышевский и др., 2003, 2009;

M.P.Iqbal e.a., 2005;

M.R. BiaginiH e.a., 2006;

Y.Nadir e.a., 2007). В по H следние годы выявлено их влияние не только на отдельные прокоагулянты, но и на уровень маркеров гемостаза, отражающий наклонность к кровоточивости или тромбофилии. Появились и первые оценки интенсивности непрерывного внутри сосудистого свертывания крови (НВСК) в связи с витаминной обеспеченностью, выявлены связи между уровнем маркеров НВСК с липидпероксидацией (ЛПО) (А.Ш.Бышевский и др., 2005;

В.П.Мищенко и др., 2005). Утвердилось представ ление о том, что физиологический процесс НВСК, усиливаясь, может перерасти в диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (Д.М.Зубаиров, 1978, 1989, 2000;

А.Ш.Бышевский и др., 1990). Появились основания выстроить в зави симости от скорости НВСК ряд, который отражает его связь с диссеминирован ным внутрисосудистым свертыванием. Полагают, что сдвиги НВСК, оценивае мые по уровню его маркеров, позволяют выявить наклонность к внутрисосу дистому тромбообразованию, как к следствию усиленного тромбиногенеза (З.С.Баркаган, 1998;

И.Н.Бокарев, 2002;

M.Lomtadze e.a., 2005;

H.W.Park e.a., 2005). Обращает на себя внимание ещё и следующее: в лечении заболеваний с на рушениями гемостаза чаще других используют витамины А, Е, ВB5, ВB12 и С;

при B B изучении связи витамины-гемостаз не оценивался исходный уровень обеспечен ности витаминами организма подопытных животных, и редко использовались ра ционы, сбалансированные по нутриентам;

не всегда учитывается витаминная обеспеченность организма пациентов, что позволяет критически оценивать выво ды о дозазависимости эффекта витаминов на гемостаз, так как эффекты от введе ния витамина, зависят от его исходного уровня в организме (А.Ш.Бышевский и др., 2006;

K.HGroenbaek e.a., 2006);

до 80 гг. эффекты витаминов на гемостаз опи H сывали без учета их антиоксидантных свойств;

влияние витаминов на интеграль ный показатель состояния гемостаза (толерантность к тромбину), отражающий ответ организма на гипертромбинемию, не изучали, единичны и сведения об их влиянии на интенсивность НВСК - величину, обратную толерантности к тромби ну (Р.Г.Алборов и др., 2005;

A.Sh.Byshevsky e.a., 2008);

результаты изучения от дельных про- и антикоагулянтов, компонентов плазминовой системы в силу их противоречивости не позволяют оценить эффекты на гемостаз отсутствия, дефи цита или избытка витаминов;

экспериментаторы крайне редко изучали обес печенность организма витаминами, использовали рационы питания, в которых баланс нутриентов, в их числе и витаминов, не учитывали.

Всё это обосновывает актуальность дальнейших исследований для решения вопроса, возникшего в ХХ столетии - целесообразно ли использовать витамины А, Е, ВB5, ВB12, С и особенно их комбинации для коррекции гемостатических сдви B B гов при заболеваниях, протекающих с гиперкоагуляцией.

Цель исследования – экспериментально установить закономерности изменения интегральных показателей состояния гемостаза (непрерывного внутрисосу дистого свертывания крови и толерантности к тромбину), липидпероксидации и антиоксидантного потенциала тромбоцитов в отсутствии, при дефиците или из бытке витаминов А, Е, ВB5, ВB12 и С, а также при избытке их сочетаний.

B B Предполагалось, что анализ влияния на гемостаз намеченных нами к изу чению и широко используемых в медицинской практике витаминов А, Е, ВB5, ВB12 и B B С углубит представления о связи и механизмах их действия на систему свертыва ние крови, одна из значимых физиологических функций которой - защитная ре акция организма на гипертромбинемию.

Задачи исследования 1. Установить, как изменяется в плазме крови уровень факторов РB3, РB4, фибри B B ногена, продуктов деградации фибрина, растворимых комплексов мономерного фибрина и D-димеров, интенсивность липидпероксидации, антиоксидантный по тенциал тромбоцитов и толерантность к тромбину в отсутствии витамина А, его дефиците и избытке в пищевом рационе, сбалансированном по остальным макро и микронутриентам.

2. Изучить, как изменяются эти величины в отсутствии, при дефиците и из бытке витаминов Е, ВB5, ВB12, С в аналогичных экспериментальных условиях.

B B 3. Изучить активность фибринолиза в эуглобулиновой фракции плазмы, а так же активированное время рекальцификации и активированное частичное тромбо пластиновое время, как показателей общей свертываемости крови.

4. Изучить физиологические эффекты сочетанного введения тех же витаминов при их избыточном поступлении с пищевым рационом.

В экспериментах мы сочли необходимым применять в качестве авитаминного рациона такой, в котором отсутствует только один из изучающихся в отдельном опыте витамин;

как модель дефицита витамина применять пищевой рацион, со держащий исследуемый витамин в количестве, равном 25, 50 или 75% от суточ ной потребности;

как модель избытка - рацион с двух-, четырёх-, восьми- и 16 кратным избытком витамина относительно суточной потребности в нём.

Дизайн экспериментов Оценить фибринолиз, уровни маркеров НВСК, интенсивность ЛПО и АОП при питании крыс рационом, в состав которого не включен витамин А, Е, ВB5, ВB12 B или витамин С:

1. При питании рационом, не содержащим витаминов А, Е, ВB5, ВB12 (крысы) или B B витамина С (морские свинки).

2. На фоне прооксиданта или антиоксиданта.

3. При длительном введении избытка витаминов А, Е, ВB5 и ВB12 (крысы).

B B 4. При внутривенном введении избытка витамина РB5 (однократно и повторно, крысы) B 5. При введении избытка витаминов А, Е, ВB5, ВB12 и С в сочетаниях по 2, 3, 4 и 5.

B B Научная новизна - Экспериментально доказано, что отсутствие витамина А, Е, ВB5 илиB В12 в ра B B B B ционе аскорбатнезависимых (крысы) и витамина С в рационе аскорбатзависи мых животных (морские свинки) активирует липидпероксидацию, снижает ан тиоксидантный потенциал тромбоцитов, ускоряет непрерывное внутрисосудис тое свертывание крови и ослабляет защитную реакцию организма на гипер тромбинемию.

- Впервые определено, что у животных содержащихся на моноавитаминном рационе питания, сдвиги в гемостазе причинно связаны с отсутствием данного витамина - введение в рацион витамина А, Е, ВB5 или ВB12 в дозах, равных 25, B B или 75% суточной потребности, ослабляет сдвиги (от 1,2 до 1,8 раза соответст венно, р 0,05), в дозах, превышающих потребность в 2 раза, предупреждает их появление, а в дозах 4-х, 8-и и 16-кратных - достоверно тормозит липидпе роксидацию, повышает антиоксидантный потенциал, снижает коагулоак тивность тромбоцитовB и уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого B свертывания крови, одновременно увеличивая толерантность к тромбину (р 0,05).

- Найдено, что отсутствие и избыток витамина А, Е, ВB5 или ВB12 сопровож B B дается сдвигами интегральных показателей состояния гемостаза за счет анти оксидантных свойств.

- Обнаружено, что связи между сдвигами непрерывного внутрисосудистого свертывания крови в отсутствии в рационе одного из витаминов ассоци ированы со сдвигами липидпероксидации положительно, с изменениями АОП - отрицательно;

что эти связи более выражены в эффектах витаминов А, Е и ВB12 (rBs = 0,82), и менее выразительны (rBs = 0.48) в эффектах витаминов ВB5 и С, B B B B что избыток витамина А, Е, ВB5, или ВB12 в количествах, эквивалентных лечеб B B ным дозам, замедляет непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, ус коряет фибринолиз в эуглобулиновой фракции плазмы и повышает толерант ность к тромбину.

- Выявлена высокая индивидуальная вариабельность сдвигов в отсутствии и избытке ниацина в рационе и что его внутривенное введение быстро и доза зависимо повышает общую свертываемость крови, сменяющуюся вскоре ги покоагуляцией, и что при повторных внутривенных введениях этот ответ ос лабляется.

- Впервые показано, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзави симых животных активирует липидпероксидацию и снижает антиоксидантный потенциал в тромбоцитах уже через 2 недели, усиливая высвобождение факто ров РB3 и РB4, и что при длительном (свыше шести недель) С-авитаминном пита B B нии уровень этих факторов в плазме снижается на 12,5 и 16,6% соответственно относительно контроля (р 0.05).

- Впервые установлена фазность влияния С-авитаминного питания и введе ния витамина С в избытке на липидпероксидацию в тромбоцитах и на сдвиги в гемостазе аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных.

Теоретическая и практическая значимость. На основании анализа измене ния показателей, характеризующих коагулоактивность тромбоцитов, непре рывное внутрисосудистое свертывание крови, ф.XIIа-зависимый фибринолиз и толерантность к тромбину у животных, содержавшихся на сбалансированном рационе питания, из которого исключали один из витаминов - А, Е, ВB5, ВB12, С B B (последний у аскорбатзависимых и аскорбатнезависимых животных) или по лучавших эти витамины в избытке, эквивалентном лечебным дозам, установ лено следующее.

Отсутствие витамина А, Е, ВB5 или ВB12 в рационе, сбалансированном по ос B B тальным нутриентам, ускоряет ЛПО и снижает АОП в тромбоцитах - клетках, участвующих в поддержании ЛПО на физиологическом уровне. Показано, что синхронно с этим ускоряется НВСК, снижается фибринолиз и защитная реак ция организма на гипертромбинемию, следовательно, и на появление в крово токе микромицелл - фрагментов клеточных мембран. Доказано, что сдвиги в гемостазе, возникающие при содержании животных на рационе питания, из которого исключен витамин А, Е, ВB6 или ВB12, реализуются за счет ускорения B B ЛПО и снижения АОП тромбоцитов, так как при введении в моноавитамин ный рацион отсутствующего витамина в дозах ниже потребности, сдвиги ЛПО и гемостаза ослабляются, а при дозе, в 2 раза превышающей суточную по требность, не возникают.

Новыми являются данные, указывающие, что избыток одного из этих ви таминов в рационе угнетает пропорционально дозе и длительности введения ЛПО в тромбоцитах и повышает их АОП, активирует ф.ХIIа-зависимый фиб ринолиз, замедляет высвобождение факторов РB3, РB4 и непрерывно протекаю B B щее с малой интенсивностью внутрисосудистое свертывание и, как следствие, увеличивает способность организма реагировать на гипертромбинемию. По лучено и дополнительное свидетельство того, что эффект этих витаминов на гемостаз реализуется через их антиоксидантные свойства - эффект каждого из витаминов на ЛПО, АОП и гемостаз поддерживается введением антиоксидан та невитаминной природы и подавляется введением прооксиданта.

Данные, полученные при изучении эффекта избытка одного из четырёх витаминов (А, Е, ВB5 или ВB12) в дозах, эквивалентных лечебным, замедляют B B НВСК, ускоряют фибринолиз и увеличивают ТкТР, что указывает на перспек тивность их применения для коррекции тромбофилических сдвигов при забо леваниях, которые сопровождаются оксидативным стрессом.

Важным является и установление того факта, что эффекты ниацина на НВСК и ТкТР вариабельнее, чем эффекты остальных исследованных витами нов, и что при его внутривенном введении влияние на гемостаз двухфазно: рост общей свертываемости сменяется снижением из-за компенсаторной активации фибринолиза.

Найдено, что отсутствие витамина С в рационе аскорбатзависимых жи вотных ускоряет ЛПО и снижает АОП тромбоцитов, но усиливает (в отличие от других витаминов высвобождение фф. РB3 и РB4, а при длительном С-авита B B минном питании (8 недель) уровень фф. РB3 и РB4 снижается, замедляется фиб B B ринолиз и падает ТкТР. Эти сдвиги ослабляются при наличии в рационе ас корбата в дозе, равной 25, 50 или 75% потребности, и не возникают при введе нии в рацион удвоенной против потребности дозы. Особенно важно, что при потреблении с рационом аскорбата в дозах, эквивалентных лечебным, сдвиги, вызываемые его дефицитом или отсутствием в питании, не выявляются до 6-й недели, но при дозах, превышающих потребность в 4, 8 и 16 раз, после шести недель ускоряется ЛПО и снижается АОП тромбоцитов, ускоряется НВСК и растет толерантность к тромбину, обусловленная активацией фибринолиза.

Существенное значение имеют данные о том, что введение аскорбата аскор батнезависимым животным в дозе, превышающей потребность в 8 раз, антиок сидантный эффект проявляется в первые две недели, а позднее ЛПО ускоряет ся, а рост АОП сменяется снижением при одновременном ускорении НВСК.

При введении шестнадцатикратной дозы аскорбата кратковременно длящийся антиоксидантный эффект сменяется прооксидантным, сопровождаясь ускоре нием НВСК. Это доказательно свидетельствует о связи эффекта аскорбата на гемостаз с его влиянием на скорость липидпероксидации.

Экспериментально обнаружено, что сдвиги НВСК при исключении из ра циона одного из витаминов (А, Е, С, ВB5 или ВB12) положительно ассоциирова B B ны с изменениями ЛПО, и отрицательно - с изменениями АОП, что связи эти тесны (rBs 0.9) в эффектах, вызываемых витаминами А, Е и ВB12, и менее тесны B B B B в эффектах витаминов ВB5 и С (rBs 0.7). Установлено, что по степени сдвигов B B при авитаминозе интегрального показателя (ТкТР) витамины практически равноценны (лишь менее, чем у остальных выражен эффект отсутствия в пи тании витамина ВB12), а по степени влияния избытка витаминов на толерант B ность к тромбину и по скорости развития эффекта они располагаются в после довательности А Е ВB12 С ВB5.

B B Математический анализ выявил, что сдвиги НВСК при всех исследован ных нами авитаминных рационах питания отрицательно ассоциированы с из менениями толерантности к тромбину - тесная связь эффекта витаминов А, Е (rBs 0.9) и менее тесная - витаминов ВB12, ВB5 и С (rBs 0.7);

изменения толерант B B B B ности к тромбину положительно ассоциированы с фибринолизом.

Доказано экспериментально, что введение всех возможных сочетаний витаминов по два (А-Е, А-ВB5, А-ВB12, Е-ВB5, Е-ВB12, ВB5-ВB12) повышает степень B B B B B B B B прироста ТкТР, при всех сочетаниях по три это заметнее, и ещё заметнее при сочетаниях по четыре, показано что наибольший эффект свойственен сочета нию, включающему все пять витаминов (если доза аскорбата не проявляет прооксидантных свойств, т.е ниже четырёхкратной относительно суточной по требности).

Внедрение в практику. Совместно с Тюменским отделением Всероссийского физиологического Общества им. И.П.Павлова, с сотрудниками кафедр биоло гической химии, акушерства и гинекологии ТГМА разработаны и внедрены для использования в лечебных учреждениях г. Тюмени (ГЛПУ ТО ОКБ № 2, ГЛПУ ТО ОКБ № 1) и области (МУЗ «ЦРБ» г. Надым, ГУЗ «СОКБ» г. Сале хард) методические рекомендации, оформленные актами: «Эффекторы свер тывания крови из сапропеля: влияние на плазмокоагуляцию, тромбоцитарный гемостаз и некоторые жизненные функции лабораторных животных», «Внут рисосудистое свертывание крови, толерантность к тромбину, активность тромбоцитов и интенсивность ЛПО при гипер- и гипотиреозе» и «Непрерыв ное внутрисосудистое свертывание крови при отсутствии и избытке в рационе витамина ВB12».

B Основные материалы работы обсуждены на российских и международных конференциях: конференции «Теория и методология современного научного исследования Тюменского региона» – Тюмень. - 2003 (2 сообщения), на 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образова ние и здоровый образ жизни». - Сургут. - 2006, 3-й научной международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования». - Варадеро, Куба.

- 2008, IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиниче ская гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». - Мо сква. - 2009, Материалы Российской конф. «Актуальные проблемы теоретиче ской и прикладной биохимии». - Челябинск: ЧГМА, Объединение биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, Южно-Уральский научный центр РАМН. - 2009 (3 сообщения).

Результаты, полученные при выполнении работы, используются в обучении студентов и клинических ординаторов по курсам «Нормальная физиология», «Биохимия» и «Клиническая фармакология».

Положения, выносимые на защиту 1. Исключение из сбалансированного рациона питания витамина А, Е, ВB5, B ВB12 или С (последний у аскорбатзависимых животных) сопровождается уско B рением липидпероксидации, снижением антиоксидантного потенциала тром боцитов, ростом их коагулоактивности, ускорением НВСК и снижением толе рантности к тромбину.

2. Избыточное введение с рационом питания витаминов А, Е, или ВB12 в до B зах, эквивалентных лечебным, угнетает липидпероксидацию, повышает анти оксидантный потенциал тромбоцитов, снижает их коагулоактивность, замед ляя НВСК и повышая толерантность к тромбину.

3. При внутривенном введении витамина ВB5 (500, 1000, 2000 или B мкг/кг) через 5, 15 и 30 мин наблюдается значительная активация фибриноли за, исчезающая к 60-й мин, которая является реакцией на повышение общей свертывающей активности крови, развивающейся через 5-й мин после инъек ции.

4. При введении значительного избытка витамина С (44,0 и 88,0 мг/кг мас сы тела) или длительном (6-8 недель) введении небольших, но превышающих потребность доз (4,125, 11,0 и 22,0 мг/кг массы тела) наблюдается угнетение (первые две недели), а затем ускорение липидпероксидации. Эти сдвиги со провождаются фазными изменениями НВСК и толерантности к тромбину (вначале увеличение и затем снижение).

5. Липидпероксидация (ЛПО) и антиоксидантный потенциал (АОП) отри цательно ассоциированы (rBs, = -0,92), ЛПО и НВСК с одной стороны, толе B рантность к тромбину с другой - ассоциированы отрицательно в опытах с ви таминами А, Е и ВB12 (rBs, = -0.95) и менее тесно (rBs, = -0.75) - в опытах с витами B B B нами ВB5 и С.

B 6. Эффекты изучавшихся витаминов на толерантность к тромбину при со четанном введении характеризуются неполной суммацией, особенно, если в сочетании содержится аскорбиновая кислота, ведущая себя в дозах восьми- и шестнадцатикратно превышающих потребность (44,0 и 88,0 мг/кг) как проок сидант.

Апробация. Основные положения диссертации доложены на 5-й Всероссий ской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром.» (М., 2000);

6-й на циональной конференции «Атеротромбоз, артериальная гипертензия» (М., 2001);

III Российской конференции с международным участием в НЦ ССХ им.

Бакулева (М., 2001), Всероссийской конф. “Тромбозы, геморрагии, ДВС синдром. Проблемы лечения». М., 2001, на сессии (с международным участи ем) Всероссийской ассоциации тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова (М., 2003);

конференции «Актуальные во просы экспресс-диагностики в хирургии» (М., РНЦХ РАМН, 2003);

конферен ции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Гре ция, 2003);

2-й конф. РАЕ «Гомеостаз и эндоэкология» (Египет, 2004);

конфе ренции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003);

на 14 конгрессе Дунайской ассоциации гемостазиологов (С.-Петербург, 2004), на международном симпозиуме «Фундаментальные и прикладные проблемы ме дицины и биологии» (Дубай, 2006), 2-й региональной научно-практической конференции «Экологическое образование и здоровый образ жизни» (Сургут, 2006), Международной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (ОАЭ, Лутраки, 2006), на III научной международ ной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, Вара деро, 2008), на IV Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирур гии» (М.: РНЦХ РАМН, 2009), на заочных электронных конференциях «Эко логические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». 2007. 6., «Экологические проблемы внутренних болезней, перинатологии и педиатрии». - 2007. 6, «Химический анализ». - 2007. 2., «Фундаментальные ис следования». - 2008. 2. (3 работы);

на ежегодных заседаниях регионального отделения РАЕ (Тюмень, 2005-2009), на ежегодных заседаниях Тюменского отделения ВБО (2006-2009), на совместном заседании профессорско преподавательского состава кафедр нормальной физиологии, биохимии и ги гиены с основами экологии, общей фармакологии ТГМА (2006, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 62 статьи, из них 12 в жур налах рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских дис сертаций, 28 - в других медико-биологических журналах, опубликованы 1 мо нография (Москва: Медицинская книга - 2009. - 112 с) и 4 главы в монографиях (М.: Медицина - 2006;

Х-Мансийск: Издат. центр Х-МГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН - 2007).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 238 страницах, содержит 26 таблиц и 21 рисунок, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов иссле дований, результаты исследований, их обсуждение, выводы, и список исполь зованной литературы (273 отечественных и 345 зарубежных источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Выбор животных. Опыты с витаминами А, Е, ВB5 и ВB12 провели на нели B B нейных белых крысах-самцах (864 особи, 175±15 г). Для них разработан пи щевой рацион, содержащий белок, липиды, углеводы, витамины и минералы согласно суточной потребности. В связи с зависимостью гемостаза от метео факторов и сезонных ритмов (В.П.Балуда и др., 1978;

А.Ш.Бышевский и др., 1986) во все опыты включали контрольную группу. Опыты с витамином С проведены на аскорбатзависимых морских свинках-самцах (294, 272±27 г) корректном объекте для моделирования С-гипо - и С-авитаминоза (Б.А.Лавров, 1963).

Крысы получали сбалансированный рацион, разработанный институтом питания АМН СССР, включающий маисовый крахмал, казеин, подсолнечное масло, солевую смесь и витамины по прописи (О.Я.Курцинь, 1952), а также витамины ВB12, ВBс, инозит и викасол (Б.А.Лавров и др., 1963). Рацион в готовом B B виде - вязкая кашица, в которой равномерно распределяются добавки. Суточ ная порция содержала витамины в соответствие с суточной потребностью, а также солевую смесь (Б.А.Лавров и др., 1963). Готовую смесь (100 г/кг массы тела) помещали в кормушки. Рацион этот эффективнее стандартов Дональд сона для «идеальных» крыс, получающих обычный смешанный корм (P.W.Hawk, B.L.Ozer, 1954), что подтверждено работами института питания АМН СССР и УССР, НИИ витаминологии и ряда кафедр биохимии мединсти тутов страны СССР. Е-авитаминный рацион содержал растительное масло без токоферола (ТФ) (А.И.Штенберг, 1960).

Морских свинок содержали на рационе, обеспечивающем нормальный при рост массы и приплод - сено, свёкла, овес, морковь, печеный хлеб, молоко, дрожжи и вода (К.Л.Ковалевский, 1949). Содержание аскорбата в суточной порции - 5.5 мг/кг массы тела. С-авитаминный рацион содержит те же продук ты после обработки, устраняющей витамин С (рекомендации Всесоюзной конференции по витаминам, М.). С-гиповитаминный рацион – это С-авита минный с добавкой аскорбиновой кислоты (АК) в дозах, составляющих 25, или 75% от потребности (т.е. от 5.5 мг/кг/сут). Морковь, молоко и сено - ис точники ретинола и каротина, не разрушающегося при использованной обра ботке (Б.Г.Савинов, 1948).

Суточную потребность в витаминах группы В обеспечивали высушенные на свету дрожжи (0.4 г/кг). Источник витамина Е - овес (П.Х. Попандопуло, 1949). Сходные рационы использованы ранее и при изучении гемостаза (Б.А.Кудряшов, 1975;

Б.А.Лавров и др., 1963;

С.В. Шидин, 2006). Аскорбино вую кислоту (АК) -5.5 мг/кг/сут - получали контрольные группы.

Приемы и методы. Пробы крови брали по правилам гемостазиологии (З.С.Баркаган, 1998) из v. jugularis у наркотизированных животных. Рану за крывали 2-3 швами. В плазме определяли уровень маркеров НВСК (З.С.Бар каган и др., 1998;

Д.М.Зубаиров, 2000;

M.Levi и др., 2004): 1. Продукты дегра дации фибрина (ПДФ) - маркеры НВСК и фибринолиза (H.Wada e.a., 2003) по описанию (А.Ш.Бышевский и др., 1991);

2. Растворимые комплексы моно мерного фибрина (РКМФ) - их прирост сопровождает гиперкоагуляцию - фе нантролиновым тестом (А.П.Момот и др., 1999);

3. D-димеры - маркеры фиб ринации и фибринолиза (Е.Г.Соболева и др. 2003;

P.de Moerloose e.a., 2003) – с помощью моноклональных антител, используя «D-dimer test”, Roche;

4. Уро вень фф. РB3 и РB4 в плазме определяли по описанию (В.П.Балуда и др., 1980).

B B Эти факторы - косвенные маркеры НВСК - их уровень в плазме пропор ционален тромбинемии, а тромбин ускоряет реакцию высвобождения (А.С.Шитикова, 2000);

5. Концентрацию в плазме ф. I - её снижение признак активации НВСК (I.Wada e.a., 2003) - определяли спектрофотометрически (А.Ш.Бышевский и др., 1969);

6. Ф.XIIа-зависимый фибринолиз оценивали по З.С.Баркагану и др. [1998];

7. Активированное время рекальцификации (АВР) и активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - по описанию (Г.Н.Детинкина и др. 1984);

8. Толерантность к тромбину - запатентованным (А.Ш.Бышевский и др., 2003) и апробированным приемом (М.К.Умутбаева, 2005;

Р.Г.Алборов, 2006;

С.В.Шидин, 2007). Специфичность результатов при использовании способа обусловлена тем, что ф. I - субстрат тромбина, сниже ние уровня которого зависит от состояния физиологических систем, обеспечи вающих выживание (Д.М.Зубаиров, 2000).

ЛПО и АОП в тромбоцитах оценивали, определяя уровень диеновых конъюгат (ДК), уровень ТБК-продуктов, период индукции (ПИ), скорость ин дуцированного окисления (СО). Тромбоциты изолировали по описанию (А.Б.Самаль и др., 1990). Величины ЛПО и АОП in vivo изменяли, вводя с ра ционом прооксидант (ацетат свинца, 50 мг/кг массы) или антиоксидант (ди мефосфон, 1 г/кг/сут). Свинец ускоряет ЛПО и снижает АОП, не нарушая об мена порфиринов (А.А.Мкртумян, 1994), так как всасывается в кишечнике лишь около 5% свинца (Материалы ВОЗ: Свинец, 1980). Димефосфон (1,1 диметил-3-оксибутирилфосфоновая кислота) – синтетический антиоксидант, усиливающий эффект физиологических антиоксидантов, не изменяя гемостаза (А.А.Мкртумян, 1994). В использованной дозе димефосфон умеренно повы шает АОП, что позволяет выявлять эффекты других антиоксидантов (М.К.Умутбаева, 2003).

Статистическую обработку числовых данных проводили с помощью меди ко-биологической программы Biostat 4.03 (С.А.Гланц, 1998) методом вариаци онной статистики для малых рядов наблюдений, вычисляя среднюю арифме тическую (М), её среднюю ошибку (m) и среднеквадратическое отклонение (). Оценивали достоверность отличий по доверительному коэффициенту Стьюдента (t) и степени вероятности (р). Интенсивные показатели сравнивали приемом альтернативного варьирования, вычисляя те же величины. Связи пе ременных анализировали методом ранговой корреляции Спирмена. Различия считали достоверными при величине р 0.05. Графический анализ проводили в Microsoft Graf (приложение MS Word 2000), корректность трендов оценивали по коэффициентам аппроксимации (RP2 Сопоставляя результаты действия P).

двух и более факторов, дифференцировали суммацию, синергизм или антаго низм (М.Диксон и Э.Уэббу, 1966).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Эффекты рациона питания без витамина А и с его возрастающим коли чеством. Крысы получали стандартный рацион: 1-я группа (контроль) – рети нол 200 МЕ/кг (суточная потребность);

2-я - А-авитаминный рацион;

3-я, 4-я и 5-я – ретинол 50, 100 и 150 МЕ/кг;

6-я, 7-я и 8-я - в 2, 4 и 6 раза выше по требности (400, 800, 1600, 3200 МЕ/кг);

9-я - 2 400 МЕ/кг ретинола (в 2 раза выше эквивалента высокой лечебной дозы). Пробы брали через 2, 4, 6, 8 и недель.

Оказалось (табл. 1), что при содержании крыс на рационе без ретинола (А авитаминный рацион питания) нарастают уровни ДК, ТБК и снижается АОП.

Прирост уровня липидпероксидов ДК и ТБК и соответственно снижение АОП менее значительны при дозе ретинола в 25, 50% и особенно 75% от суточной потребности. При дозах, превышающих потребность, замедлялась ЛПО, и увеличивался АОП пропорционально дозе и длительности введения ретинола.

Таблица 1.

Изменения ЛПО и АОП в тромбоцитах крыс, не получавших витамин А, получавших его в дозе, равной суточной потребности, в дозах, ниже потребности и в превышающих потребность в 2, 4, 6 и 12 раз Контроль, Животные (n – 5 на каждом этапе) получали ретинол (МЕ/кг массы тела) в дозах:

n= Показатели 200 0.0 50 100 150 400 800 1600 0.057±0.004 0.050±0.003 0.047±0.004 0.052±0.003 0.046±0.003* 0.042±0.004* 0.024±0.002* 0.014±0.001* ДК, 0.051±0.003 0.055±0. 0.063±0.002* 0.061±0.002* 0.057±0.002* 0.044±0.002* 0.035±0.007* 0.014±0.004* 0.010±0.002* А/мг ЛП 0.072±0.002* 0.067±0.002* 0.062±0.002* 0.059±0.002* 0.038±0.003* 0.032±0.003* 0.011±0.003* 0.009±0.003* 0.081±0.002* 0.071±0.002* 0.057±0.002* 0.058±0.002* 0.038±0.003* 0.031±0.004* 0.012±0.002* 0.008±0.004* 0.81±0.03 0.80±0.02 0.77±0.02 0.76±0.03 0.69±0.03* 0.65±0.03* 0.44±0.04* 0.40±0.04* ТБК, 0.76±0.05 0.74±0. 0.91±0.04* 0.87±0.03* 0.84±0.02* 0.64±0.05* 0.60±0.04* 0.35±0.03* 0.35±0.02* ед./мг ЛП 0.99±0.05* 0.95±0.04* 0.91±0.03* 0.81±0.04* 0.55±0.03* 0.51±0.02* 0.24±0.04* 0.18±0.03* 1.22±0.005* 1.10±0.005* 1.01±0.006* 0.09±0.004* 0.57±0.03* 0.044±0.01* 0.22±0.03* 0.17±0.05* 46.0±1.6 46.3±1.7 46.7±1.6 45.7±1.4 46.1±1.7 50.4±1.1* 63.7±1.2* 63.9±1.2* ПИ, 45.7±1.4 43.8±1.2 44.9±1.3 44.0±1.1 45.0±1.2 56.0±1.3* 60.9±1.7* 68.9±1.6* 69.9±1.6* мин/мл 35.7±1.4* 36.8±1.3* 38.6±1.3* 39.2±1.2* 62.6±1.9* 67.6±1.5* 78.2±1.7* 83.2±197* 28.1±1.1* 31.0±1.0* 34.0±1.2* 40.1±1.4* 64.8±1.9* 69.7±1.9* 79.9±1.7* 91.6±1.8* 0.77±0.05 0.73±0.05 0.71±0.06 0.71±0.06 0.77±0.03 0.63±0.04* 0.42±0.02* 0.40±0.03* СО, 0.75±0.03 0.81±0.04 0.80±0.043 0.77±0.04 0.77±0.04 0.67±0.02* 0.54±0.03* 0.31±0.02* 0.27±0.03* ммP 0.92±0.04* 0.84±0.03* 0.72±0.03* 0.72±0.03* 0.59±0.04* 0.48±0.04* 0.23±0.04* 0.20±0.04* P/мл/мин 0.99±0.003* 0.92±0.003* 0.83±0.003* 0.83±0.003* 0.55±0.04* 0.47±0.02* 0.21±0.03* 0.17±0.03* Обозначения (здесь и в следующих таблицах): ДК - диеновые конъюгаты, ЛП - липид, ТБК - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, ПИ - период индукции, СО - скорость окисления;

знак * - достоверное отличие от контроля (жирным выде лены все достоверно отличающиеся от контроля величины);

строки 1,2, 3 и 4 - соответственно после 2, 4, 6 и 8 недель от начала опыта Таблица 2.

Содержание маркеров НВСК в плазме и ТкТР у крыс, не получавших витамин А, получавших его в дозе, равной суточной потребности, дозах ниже потребности и выше неё в 2, 4, 6 и 12 раз Контроль, Показатели n=12 Животные (n = 6 на каждом этапе) получали ретинол (МЕ/кг массы тела) в дозах:

200 0.0 50 100 150 400 800 1200 82.3±1.6* 78.3±1.4* 74.0±13* 87.5±1.2 87.0±1.3 87.4±1.3 87.9±1.2 85.1±1. Ф. РB3,% 89.0±1.3 78.2±1.4* 64.2±1.3* 61.2±1.4* 91.4±1.3 91.1±1.2 89.4±1.5 90.7±1.6 82.4±1.2* B 97.2±1.1* 95.1±1.0* 68.9±1.6* 60.1±1.6* 60.0±1.2* 95.7±1.2 92.2±1.4 76.0±132* 99.5±1.6* 96.9±1.6* 93.2±1.0* 92.9±1.0* 75.1±1.3* 64.1±1.7* 57.4±1.6* 57.4±1.6* 2.9±0.04* 2.1±0.02* 2.0±0.02* 3.5±0.03 3.4±0.05 3.5±0.03 3.5±0.04 3.2±0. Ф. РB4, с 3.4±0.02 3.0±0.02* 2.5±0.05* 1.9±0.02* 1.6±0.02* 3.6±0.05 3.6±0.07 3.4±0.03 3.7±0. B 3.8±0.02* 3.7±0.02* 3.7±0.02* 3.8±0.02* 2.7±0.02* 2.1±0.03* 1.7±0.01* 1.5±0.02* 4.3±0.03* 4.1±0.03* 4.0±0.05* 4.0±0.03* 2.7±0.02* 1.7±0.02* 1.4±0.01* 1.2±0.01* 2.2±0.09 2.2±0.11 2.2±0.09 2.1±0.08 2.1±0.08 2.4±0.06 2.1±0.04 2.1±0. ФГ, г/л 2.3±0.04 2.1±0.11 2.2±0.17 2.1±0.11 2.2±0.10 2.1±0.09 2.2±0.07 2.1±0.14 2.2±0. 2.5±0.08* 2.6±0.04* 2.2±0.08 2.1±0.06 2.2±0.08 2.2±0.08 2.2±0.07 2.2±0. 1.5±0.05* 1.7±0.02* 1.9±0.05* 2.6±0.08* 2.5±0.05* 2.2±0.04 2.1±0.08 2.5±0. 12.1±1.0* 15.5±1.1 15.0±1.1 15.3±1.0 15.3±1.0 14.6±1.5 11.0±1.9 11.0±1. ПДФ, мг% 15.1±1.0 11.0±0.7* 10.1±0.9* 10.2±0.8* 16.0±1.3 16.2±1.2 16.1±1.4 16.1±1.4 14.8±0. 19.3±1.0* 18.0±1.0* 17.0±1.* 18.4±1.0* 9.7±0.5* 8.8±0.9* 8.7±0.5* 8.5±0.4* 22.3±1.1* 20.1±1.0* 18.9±1.1* 17.7±1.1* 8.1±0.3* 7.6±0.02* 6.4±0.01* 6.2±0.01* 23.5 ±1.1 17.4±1.0* 15.3±0.7* 15.0±0.7* 22.6±1.2 22.9±1.2 22.9±1.2 21.8±0. РКМФ, мкг/мл 24.1±0.7 18.1±0.9* 14.2±0.6* 12.4±1.1* 11.3±1.0* 25.0±0.9 25.1±0.8 25.0±0.8 24.0±0. 28.1±0.9* 26.8±0.9* 15.9±0.7* 13.1±0.5* 11.9±0.4* 10.5±0.5* 27.9±1.2 25.1±0. 32.9±0.9* 30.1±0.9* 25.4±0.8* 14.0±0.01* 11.3±0.02* 10.0±0.01* 9.1±0.02* 24.5±0. 0.17±0.011* 0.16±0.010* 0.15±0.010* 0.18±0.012 0.19±0.013 0.19±0.012 0.19±0.012 0.18±0. 0.20±0.009 0.13±0.010* 0.15±0.009* 0.13±0.008* 0.18±0.011 0.18±0.014 0.19±0.011 0.20±0.011 0.15±0.013* D-Д, мкг/мл 0.22±0.008* 0.20±0.008* 0.13±0.009* 0.09±0.009* 0.07±0.004* 0.06±0.005* 0.22±0.009 0.21±0. 0.25±0.009* 0.23±0.006* 0.19±0.011* 0.20±0.009* 012.0±0.03* 0.08±0.01* 0.06±0.01* 0.05±0.02* 114±1.7* 123±2.1* 129±2.1* 90.1±1.4 87.3±1.4 86.3±1.5 97. ±1.6 107±2. 85.1±1.3* 89.4±1.5* 91.9±1.2* 125±2.2* 135±2.1* 139±2.1* 95.1±1.3 113±2. 100±1. ТкТР, % 78.6±1.2* 87.6±1.1* 93.1±1.1* 98.6±1.2 127±2.1* 130±2.3* 138±2.5* 141±2.5* 65.0±1.4* 78.9±1.3* 91.8±1.3* 87.9±1.4* 131±1.5* 148±2.0* 154±2.3* 156±2.0* Обозначения здесь и далее: Ф. - фактор, ФГ - фибриноген, ПДФ - продукты деградации фибрина, РКМФ - растворимые комплексы мономерного фиб рина, D-Д - D-димеры;

ТкТР - толерантность к тромбину;

* - достоверное отличие от контроля (полужирным шрифтом для удобства восприятия выделе ны достоверно отличающиеся от контроля величины);

строки в ячейках 1,2, 3 и 4 - соответственно после 2, 4, 6 и 8 недель от начала опыта Из данных табл. 2 следует, что уровень маркеров непрерывного внутрисосуди стого свертывания крови (НВСК) в отсутствии ретинола становился выше с уве личением длительности опыта, а толерантность к тромбину (ТкТР) снижалась.

При введении ретинола в долях потребности показатели уровня маркеров НВСК приближались к контрольным величинам.

При дозах ретинола, превышающих потребность в 2, 4, 8 и 16 раз, уровень маркеров НВСК, напротив, опускался ниже контрольных значений, а толерант ность к тромбину увеличивались – т.е. А-авитаминное питание ускорило липид пероксидацию и снизило антиоксидантный потенциал. Непрерывное внутрисосу дистое свертывание крови при этом ускорилось, чему сопутствовало снижение ТкТР.

Так как ретинол в дозах, превышающих потребность в 8 и 16 раз (1600 и МЕ/кг), снижал, а при продолжительном введении увеличивал уровень ПДФ, D димеров (А.В Пустынников, 2007) и активировал фибринолиз, провели опыты с бльшей из этих доз (2400 МЕ/кг) и с удвоенной дозой (4800 МЕ/кг), увеличив длительность опыта до 12 недель, контролируя ещё и фибринолиз.

В табл. 3 видно, что при содержании крыс на А-авитаминном рационе пита ния уровень фф. РB3 и РB4 снизился значительнее, чем за 8 недель (сравнить с табл.

B B 2), а уровень фибриногена не менялся. Уровень РКМФ, снизившись за 10 недель, таким же остался и через 12 недель. Уровень ПДФ при дозе 3200 МЕ/кг вырос за 10, и заметнее - за 12 недель, особенно при дозе 4800 МЕ/кг. Уровень D-димеров при обеих дозах уже за 10 и 12 недель стал выше, чем на 8-й неделе. Фибринолиз замедлялся при А-авитаминном питании с 8-й недели. При избытке ретинола ак тивность фибринолиза росла при всех дозах.

Эффекты А-авитаминного питания на фоне про- или антиоксиданта. Воз можно ретинол влияет на гемостаз не как антиоксидант, а иным путем и его эф фект может не зависеть от исходного состояния ЛПО. Чтобы выяснить это, крысы ежедневно получали ретинол одновременно со свинцом или димефосфоном (про или антиоксидантом соответственно). В отсутствии ретинола (табл. 4) воспроиз велись сдвиги, найденные ранее: ускорение ЛПО, НВСК и снижение АОП. Сви нец при А-авитаминном питании усилил сдвиги в том же направлении (группа 3), и при введении свинца и ретинола (группа 4) сдвиги ослаблены. Димефосфон без ретинола (группа 5) ограничил эти сдвиги.

Таблица 3. НВСК, коагулоактивность тромбоцитов, ф.XIIа-зависимый фибринолиз и ТкТР у крыс, неполучавших ретинола, получавших его в суточной потребности, или в дозах, выше потребности в 6, 12 и 24 раза (верхняя строка - 10, нижняя - 12 недель) Показатели Крысы получали ретинол Крысы (n на этапе = 5) получали ретинол (МЕ/кг) (200 МЕ/кг), в дозах:

n на этапе = 10 (контроль) 0.0 1200 2400 89.8±1.9* 61.9±1.3* 52.4±1.3* 55.6±1.3* Ф. РB3,% 80.6±1.4 92.5±1.3* 63.2±1.2* 48.9±1.5* 51.9±1.5* B 3.9±0.04* 2.1±0.04* 1.5±0.03* 1.4±0.03* Ф. РB4, с 3.4±0.02 1.8.03* 4.1±0.04* 1.1±0.04* 1.0±0.04* B 2.0±0.05 2.1±0.03 2.1±0.04 2.3±0. ФГ, г/л 2.2±0.02 2.4±0.06 2.0±0.06 1.8±0.06 1.9±0.04* ПДФ, 18.9±1.1* 18.3±1.4* 22.7±1.7* 23.9±0.07* мг% 15.7±0.4 19.6±0.4* 21.9±1.2* 27.4±1.9* 29.1±0.04* РКМФ, мкг/мл 30.5±1.1* 14.6±0.5* 12.7±0.9* 12.9±0.03* 25.2±0.8 29.9±1.2* 13.9±1.1* 10.9±1.1* 11.4±0.04* D-Д, 0.24±0.008* 0.31±0.013* 0.37±0.014* 0.40±0.03* мкг/мл 0.20±0.001 0.25±0.003* 0.34±0.013* 0.39±0.015* 0.43±0.04* Ф.XIIа- 8.4±0.03 8.4±0.05 6.1±0.07* 5.8±0.03* зависимый 9.5±0.07* 7.9±0.06 5.9±0.06* 6.1±0.04* фибринолиз, 8.1±0.03 11.0±0.04* 6.4±0.05* 5.5±0.04* 4.9±0.03* мин 13.1±0.06* 6.0±0.04* 5.0±0.05* 4.6±0.04* 90.3±1.4 125±2.1* 129±2.1* 129±2.1* 100±4. ТкТР,% 85.4±1.3* 134±2.3* 139±2.1* 139±2.1* 79.1±1.2* 139±2.6* 141±2.5* 141±2.5* 66.1±1.4* 153±2.1* 156±2.2* 156±3. Знак * - достоверные отличия от контроля;

фибринолиз и ТкТР - за 6, 8, 10 12 недель Таблица 4. Изменения ЛПО, АОП и НВСК при введении свинца или димефосфона с А авитаминным рационом и рационом с ретинолом в количестве, равном суточной потребно сти;

1-я строка - через 6, 2-я - через 8 недель от начала опыта, Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа (без ретинола (200 МЕ/кг (без ретинола (200 МЕ/кг (без ретинола (200 МЕ/кг Показатели ретинола) + свинец) ретинола+ +димефосфон) ретинола+ ди свинец) мефосфон) » ДК, 0.088±0.004P 0.061±0.002^ 0.071±0.003 0.051±0.002* 0.057±0.002+ 0.050±0.004# P 0.093±0.006P» А/мг ЛП 0.072±0.005^ 0.081±0.004 0.054±0.005* 0.060±0.005+ 0.047±0.003# P » ТБК, 1.34±0.07P 0.88±0.06^ 0.99±0.05 0.76±0.07* 0.80±0.06+ 0.70±0.04# P 1.51±0.009P» ед./мг ЛП 0.97±0.005^ 1.23±0.004 0.74±0.04* 0.85±0.08+ 0.65±0.04# P » ПИ, 28.4±1.6P 37.1±0.7^ 35.4±1.3 45.6±1.3* 35.9±1.4+ 41.4±1.3# P 24.4±1.9P» мин/мл 34.2±1.0^ 28.3±1.2 45.3±1.1* 41.3±1.1+ 53.6±1.2# P » СО, 1.20±0.07P 0.81±0.05^ 0.90±0.04 0.75±0.03* 0.86±0.06+ 0.70±0.02# P 1.38±0.009P» ммP 0.88±0.004^ 0.98±0.002 0.75±0.03* 0.94±0.03+ 0.68±0.02# P/мл/мин P 107±1.6P» Ф. РB3,% 94.0±1.1^ 97.4±1.1 89.1±1.2* 96.1±1.2+ 85.0±1.0# B P 120±2.0P» 96.1±1.3^ 99.7±1.5 89.4±1.1* 99.8±1.1+ 83.3±1.2# P » 4.1±0.06P 3.7±0.03 3.5±0.03* 3.8±0.04+ 3.6±0.01 3.1±0.02# P 4.9±0.08P» Ф. РB4, с 4.0±0.02^ 4.4±0.03 3.3±0.04* 4.3±0.03+ 3.0±0.03# B P » 2.2 ±0.04* 2.0 ±0.03 2.2 ±0. 1.7±0.04P 2.3±0.06 2.2±0. P 1.4±0.03P» ФГ, г/л 1.6±0.04 2.1±0.03* 2.1±0.01 1.7±0.06 2.2±0. P » ПДФ, 23.0±1.2P 18.0±0.5^ 19.2±1.1 15.3±0.9* 20.0±0.8+ 14.1±0.6# P 27.4±1.6P» мг% 20.1±0.2^ 22.2±1.3 15.0±1.2* 23.0±1.1+ 13.6±0.5# P » РКМФ, мкг/мл 32.9±0.8P 26.5±0.7^ 28.4±0.7 23.1±0.9* 27.2±0.7+ 20.1±0.7# P 37.3±0.9P» 30.3±0.6^ 33.0±0.8 22.8±0.7* 28.9±0.7+ 19.9±0.5# P » D-Д, 0.25±0.008P 0.22±0.006 0.19±0.009* 0.24±0.003+ 0.21±0.004 0.18±0. P 0.29±0.006P» мкг/мл 0.23±0.006^ 0.25±0.007 0.19±0.007* 0.27±0.002+ 0.17±0.003# P » 67.2±1.4P 86.1±1.0^ ТкТР, % 78.1±1.1 100±1.6* 80.3±1.4+ 111±1.4# P 60.7±1.0P» 76.4±0.9^ 65.3±1.1 100±1.6* 71.8±1.7+ 118±1.7# P Обозначения: * - достоверные отличия от величин, найденных в те же сроки в группе 2-й от 1-й, » группеP от 1-й, + - в группе 4-й от 2-й, ^ - в группе 5-й от 1-й, # - в группе 6-й от P-P Pв P3-й P 2-й.

Димефосфон на фоне ретинола (группа 6) замедлил НВСК, ЛПО и повысил АОП.

Видимо, эффекты ретинола на гемостаз реализуются за счет его антиокси дантных свойств - прооксидант усиливает, а антиоксидант ограничивает эффекты ретинола на ЛПО, АОП и соответственно на гемостаз.

Оценим связи между маркерами НВСК (по величие РКМФ), ЛПО (по величи не ДК), АОП (по величине СО) и толерантности к тромбину в условиях моноави таминного рациона. На рис. 1 видно следующее:

- при продолжительном А-авитаминном питании ускоряется ЛПО и НВСК, снижается АОП и ТкТР;

- достоверность аппроксимации трендов близка к единице, что говорит о ли нейности изменения этих величин во времени;

- коэффициенты ранговой корреляции (rBs) пары ДК и ПИ (rBs = - 0.9) указывают B B на их тесную отрицательную связь, для пары ДК и РКМФ – на тесную положи тельную связь (rBs = 0.8), для пар ДК и ТкТР, РКМФ и ТкТР – на тесную отрица B тельную связь (rBs = -1.0 и - 0.9 соответственно).

B ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R = 0, 35 R = 0, - -25 R = 0, R = 0, - 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Рисунок 1. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии ретинола в рационе (тонкие линии – графики;

жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Следовательно, при содержании крыс на А-авитаминном рационе питания ТкТР отрицательно и тесно ассоциирована с интенсивностью ЛПО и НВСК, тесно положительно - с АОП. Это подтверждается ещё и тем, что ретинол в долях су точной потребности, уменьшает степень сдвигов каждого показателя.

Анализ эффектов разных доз ретинола (рис. 2) позволяет констатировать что:

1. Двукратный избыток витамина А замедляет ЛПО и повышает АОП, чему сопутствует замедление НВСК и рост ТкТР;

2. Четырёхкратный избыток вызывает более сильные сдвиги, усугубляющиеся при восьмикратном избытке (при шестнадцатикратном избытке сдвиги ЛПО, АОП и НВСК равны найденным при восьмикратном избытке);

3. Зависимости между сдвигами ЛПО, АОП, НВСК и ТкТР одинаковы при разных дозах ретинола (в пределах суточной потребности);

4. Характер связей в парах ДК-ПИ, ДК-РКМФ, ДК-ТкТР, РКМФ-ТкТР сохра няется прежним - тесная отрицательная, тесная положительная, тесная отри цательная и тесная отрицательная связь соответственно. Поэтому можно считать, что отсутствие ретинола в рационе, сбалансированном по другим нутриентам, ус коряет ЛПО и НВСК, снижает АОП, сопровождаясь снижением ТкТР. Это согла суется с наличием прямой связи между скоростью ЛПО и гиперкоагуляционны ми сдвигами, возникающими при воздействиях, ускоряющих ЛПО [С.Л.Галян и др., 1998;

С.В.Шидин, 2007;

K.M.HColleranH e.a., 2003;

I.Haszon e.a., 2003].

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) 90 R2 = 0, R2 = 0, - - - -70 R2 = 0, - R2 = 0, 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Дозы, МЕ/кг: 400 800 1200 Рисунок 2. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке ретинола;

тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Сравнивая сдвиги ПДФ и D-димеров при высоких дозах ретинола, нашли, что рост их концентрации пропорционален длительности введения, тогда как при введении меньших доз и в более короткие сроки их уровень падал, что служит признаком замедления НВСК, подтверждаемого снижением уровня РКМФ, фф. РB3 B и РB4. Так как уровень фф. РB3 и РB4 продолжает падать и при больших дозах ретино B B B ла, нет оснований отрицать его способности замедлять НВСК.

Рост уровня ПДФ и D-димеров объясняется активацией фибринолиза, ускорив шегося за 10 и 12 недель при дозе ретинола в 1200 МЕ/кг на 21 и 30%, при дозе 2400 МЕ/кг - на 32 и 38%, при дозе 4800 МЕ/кг - на 39 и 43% (р 0.05). Объясне ние правомерно ещё и потому, что толерантность к тромбину, увеличившаяся при замедлении НВСК (рис. 3), продолжает расти и с повышением дозы ретинола в рационе.

ПДФ D-димеры Фиб-з ТкТР 85 105 55 39 56 44 39 -45 -21 -30 -32 -38 -39 - 10 12 10 12 10 нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, МЕ/кг: 1200 2400 Рисунок 3. Изменения (в % к контролю) уровня ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке ретинола в рационе.

Следовательно, избыток ретинола в дозах, эквивалентных лечебным для чело века, замедляет НВСК, ускоряет фибринолиз и увеличивают ТкТР.

НВСК, фибринолиз, ТкТР, ЛПО и АОП при рационе питания без токоферола и с его возрастающим количеством. Схема опыта: группа контроля добавок не получала, подопытные группы получали с рационом токоферол (ТФ) в дозах 3.0, 6.0, 12 и 24 мг/кг массы.

В пробах крови определяли кроме этого активность фибринолиза, так как вы явилась роль его сдвигов в парадоксальной динамике уровня ПДФ, D-димеров и фибринолиза, активность которого, как известно, в одних случаях растет, в дру гих - снижается (R.Vibo, 2007;

A.Blinc e.a., 2007).

Как и в условиях А-авитаминного питания, при содержании на рационе без витамина Е, ускорялась ЛПО и падал АОП уже за две первые недели. Степень изменений уменьшало введение токоферола в дозах, составляющих 25, 50% и 75% от потребности. При 2-кратной против потребности дозе токоферола за 4 не дели ЛПО замедлялась. Ещё быстрее это произошло при больших дозах ТФ (как это находили и в рассмотренных выше опытах с ретинолом).

Отсутствие токоферола в рационе ускорило НВСК за 6, и заметнее за 8 недель.

Толерантность к тромбину (ТкТР) падала уже за 4, и сильнее за 6 и за 8 недель, как и в опытах с ретинолом. При дозах токоферола меньших потребности, огра ничивались все эти сдвиги, не устраняясь полностью. С увеличением доз токофе рола происходило то же, что при введении средних или больших доз ретинола.

Принципиальное сходство сдвигов ЛПО, АОП и показателей состояния гемо стаза во всех вариантах опытов со сдвигами, найденными при изучении эффектов ретинола, отраженных в таблицах 1-4, позволяют не усложнять изложения приве дением абсолютных значений, полученных в экспериментах, так как направлен ность и степень сдвигов практически идентичны в опытах с ретинолом и токофе ролом. Поэтому мы приводим ниже результаты графического анализа этих экспе риментов и результаты оценки ранговой корреляции.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R = 0, 35 R = 0, - -25 R = 0, R = 0, - 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Рисунок 4. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии токоферола в рационе (тонкие линии – графики;

жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Здесь видно, что при содержании крыс на Е-авитаминном рационе питания то лерантность к тромбину (ТкТР) отрицательно и тесно ассоциирована с интенсив ностью липидпероксидации (ЛПО) и непрерывного внутрисосудистого свертыва ния крови (НВСК), и тесно положительно - с антиоксидантным потенциалом (АОП).

Анализ эффектов возрастающих доз токоферола (рис. 5) позволяет видеть, что двукратный его избыток замедляет липидпероксидацию и повышает антиок сидантный потенциал, чему сопутствует замедление непрерывного внутрисосу дистого свертывания крови (НВСК) и рост толерантности к тромбину (ТкТР). Че тырёхкратный избыток вызывает более сильные сдвиги, которые становятся ещё значительнее при восьмикратном избытке, сохраняясь примерно такими же и при шестнадцатикратном избытке токоферола.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) R2 = 0, 50 R2 = 0, - - - -70 R2 = 0, -90 R2 = 0, 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед. 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Дозы, мг/кг: 3,0 6,0 12,0 24, Рисунок 5. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке токоферола;

тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) В целом зависимости НВСК, ЛПО, АОП и ТкТР от количества в рационе то коферола таковы: величина rBs (-0.86) для пары ДК-ПИ указывает на их тесную B отрицательную связь, для пары ДК-РКМФ (rBs = 0.66) - на слабую положительную, B для пар ДК-ТкТР и ДК-ПИ (rBs = -0.54, -0.51 соответственно) на слабую отрица B тельную связь, для пары РКМФ-ТкТР (rBs = -0.9) на тесную отрицательную связь.

B Фибринолиз при Е-авитаминном рационе замедляется, будучи тесно положитель но ассоциирован с ТкТР, и отрицательно - с ПИ (rBs = 0.88 и -0.89). B Выявлены сходные зависимости НВСК, ЛПО, АОП и ТкТР от количества в рационе ТФ: величина rBs (-0.86) для пары ДК-ПИ указывает на их тесную отрица B тельную связь, для пары ДК-РКМФ (rBs = 0.66) - на слабую положительную, для B пар ДК-ТкТР и ДК-ПИ (rBs = -0.54, -0.51) на слабую отрицательную связь и для па B ры РКМФ-ТкТР (rBs = -0.9) на тесную отрицательную связь. Фибринолиз при Е B авитаминном рационе замедляется, будучи тесно положительно ассоциирован с ТкТР, и отрицательно - с ПИ (rBs = 0.88 и -0.89).B Следовательно, при Е-авитаминозе ТкТР находится в тесной отрицательной связи со скоростью ЛПО и НВСК, и в прямой - с АОП и фибринолизом. Это под тверждается ещё и тем, что с увеличением дозы ТФ (в пределах потребности) степень сдвигов падает. При избытке ТФ сдвиги этих величин сохраняют направ ленность: увеличение длительности опыта с избытком ТФ замедляет ЛПО и уве личивает АОП, замедляет НВСК, повышает фибринолиз и ТкТР.

Усредненные графики данных из опытов с токоферолом, близки к приведен ным на рис. 3 для ретинола. Величина rBs для пары ЛПО-НВСК (0,72), отражает B положительную связь с относительно невысокой теснотой. Связь между ЛПО и АОП тесная отрицательная (rBs = -0.87), что вообще характерно для отношения B ЛПО/АОП в тромбоцитах при экстремальных воздействиях или заболеваниях [Г.А.Сулкарнаева, 2004;

Р.Г.Алборов, 2006]. Связь НВСК-ТкТР умеренно тесная отрицательная (rBs = -0.79), как и при эффектах, вызываемых отсутствием ТФ.

B Связь фибринолиз-РФМК слабая отрицательная (rBs = -0.48).

B Если учесть, что уровень РФМК растет при ускорении фибринолиза [З.С.Бар каган, 1998], что нами и было найдено, то уровень РФМК должен был бы возрас тать. Однако у крыс при избытке токоферола уровень РФМК падал, т.е. связь РФМК-фибринолиз отсутствует, а фибринолиз и толерантность к тромбину свя заны тесно положительно (rBs = 0.80). Таким образом, избыток ТФ ведет к сдвигам, B обратным тем, которые возникают при его дефиците или отсутствии - замедление ЛПО и НВСК, рост АОП и ускорение фибринолиза. Главное, что все это сопро вождается ростом толерантности к тромбину (ТкТР).

Следовательно, при Е-авитаминозе ТкТР находится в тесной отрицательной связи со скоростью ЛПО и НВСК, и в прямой - с АОП и фибринолизом. Это под тверждается ещё и тем, что с увеличением дозы ТФ (в пределах потребности) степень сдвигов падает. При избытке ТФ сдвиги этих величин сохраняют направ ленность: увеличение длительности опыта с избытком ТФ замедляет ЛПО и уве личивает АОП, замедляет НВСК, повышает фибринолиз и ТкТР.

Усредненные графики данных полученных в опытах с ТФ, близки к приведен ным на рис. 3 для ретинола. Величина rBs для пары ЛПО-НВСК (0,72), отражает B положительную связь с относительно невысокой теснотой. Связь между ЛПО и АОП тесная отрицательная (rBs = -0.87), что вообще характерно для отношения B ЛПО к АОП в тромбоцитах при экстремальных воздействиях и заболеваниях [Г.А.Сулкарнаева, 2004;

Р.Г.Алборов, 2006]. Связь между НВСК и ТкТР умерен но тесная отрицательная (rBs = -0.79), как и при эффектах, вызываемых отсутствием B токоферола. Связь фибринолиз-РФМК слабая отрицательная (rBs = -0.48).

B Если учесть, что уровень РФМК растет при ускорении фибринолиза [З.С.Бар каган, 1998], что нами и было найдено при введении высоких доз ТФ, то уровень РФМК должен был бы возрастать. Однако у крыс при избытке ТФ уровень РФМК падал, т.е. связь РФМК-фибринолиз отсутствует, а фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР) связаны тесно положительно (rBs = 0.80). B Таким образом, избыток токоферола ведет к сдвигам, обратным тем, которые возникают при его дефиците или отсутствии - замедление липидпероксидации и непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, рост антиоксидантного по тенциала и ускорение фибринолиза. Главное, что все это сопровождается ростом толерантности к тромбину.

Зависимости между сдвигами ЛПО, АОП, НВСК и ТкТР одинаковы при раз ных избыточных дозах токоферола (в том числе, и в дозах, недостигающих су точной потребности, которые не приведены на графике).

Касаясь характера связей в парах ДК-ПИ, ДК-РКМФ, ДК-ТкТР, РКМФ-ТкТР, отметим, что он таков же, как и при отсутствии или дефиците ретинола: тесная отрицательная, тесная положительная, тесная отрицательная и тесная отрица тельная связь соответственно. Поэтому, как и в случае с ретинолом, отсутствие токоферола в сбалансированном по другим нутриентам рационе, ускоряет ЛПО и НВСК, снижает АОП, и ТкТР.

На рис. 6 представлены соотношения сдвигов ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке токоферола в рационе.

ПДФ D-димеры Фиб-з ТкТР 105 85 76 58 56 45 44 43 - -45 - -35 -38 -39 - 10 12 10 12 10 нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, мг/кг: 12,0 24,0 48, Рисунок 6. Изменения (в % к контролю) уровня ПДФ, D-димеров, фибринолиза и ТкТР при избытке токоферола в рационе.

При рассмотрении диаграмм видно, что растет уровень ПДФ и D-димеров при избытке ТФ, и объясняется это (как и при избытке ретинола), активацией фибри нолиза, ускорившегося за 10 и 12 недель при дозе токоферола в 24 мг/кг на 32 и 38%, при дозе 48 мг/кг - на 39 и 43%, (р 0.05). Толерантность к тромбину, уве личившаяся при замедлении НВСК, продолжает расти и при повышении в рацио не дозы токоферола. Этим объясняется упоминавшаяся выше парадоксальность рост уровня ПДФ и D-димеров при одновременном замедлении НВСК. Связано это с тем, что уровень ПДФ и D-димеров растет за счет ускорения фибринолиза, а не только в результате ускорения НВСК. Следовательно, в отсутствии или избыт ке токоферола в рационе сдвиги таковы же, как в отсутствии или избытке ретино ла. Для уточнения возможной роли антиоксидантных свойств ТФ во влиянии на гемостаз мы провели опыты с его введением вместе с прооксидантом или антиок сидантом (табл. 5).

Таблица 5. Сдвиги ЛПО, АОП, уровня маркеров НВСК, фибринолиза и ТкТР при введении прооксиданта (свинца) или антиоксиданта (димефосфона) на фоне Е-авитаминного рацио на и рациона, содержащего витамин Е в соответствии с суточной потребностью (верх няя строка - через 6, нижняя - через 8 недель от начала опыта) Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа (без ТФ), (1,5 мг/кг (без ТФ+ (1,5 мг/кг (без ТФ+ДМ), (1,5 мг/кг n=12 ТФ), свинец) ТФ+свинец), n=6 ТФ+ДМ),n= n=6 n=6 n= 0.069±0.001* 0.053±0.004* 0.089±0.003P» 0.059±0.003+ ДК, 0.060±0.003^ 0.051±0.006# P А/мг ЛП 0.075±0.002* 0.054±0.003* 0.099±0.008P» 0.061±0.004+ 0.068±0.005^ 0.046±0.003# P 1.41±0.07P» ТБК, 0.85±0.02* 0.73±0.04* 0.81±0.05+ 0.88±0.07^ 0.70±0.04# P 1.55±0.09P» ед./мг ЛП 0.95±0.03* 0.74±0.05* 0.84±0.09+ 0.94±0.006^ 0.69±0.04# P » ПИ, 38.0±1.0* 45.8±1.2* 26.7±1.4P 35.6±1.5+ 37.3±0.7^ 41.4±1.3# P 23.5±1.7P» мин/мл 33.7±1.4* 45.4±1.0* 41.9±1.4+ 35.0±1.1^ 48.4±1.4# P 1.22±0.09P» СО, 0.90±0.03* 0.73±0.04* 0.85±0.07+ 0.80±0.05^ 0.70±0.02# P ммP3 1.48±0.005P» 0.95±0.04* 0.74±0.03* 0.95±0.04+ 0.87±0.006^ 0.69±0.03# P/мл/мин P » Ф. РB3,% 99.9±1.2* 88.9±1.1* 111±1.6P 102±1.2+ 94.1±1.2^ 85.2±1.2# B P 128±2.1P» 104±1.9* 89.2±1.2* 110±1.5+ 95.8±1.3^ 83.4±1.0# P 4.8±0.06P» 4.5±0.03* 3.5±0.02* 3.9±0.03+ 3.7±0.01 3.0±0.01# P 5.8±0.09P» Ф. РB4, с 5.5±0.04* 3.2±0.06* 4.6±0.04+ 4.4±0.03^ 2.9±0.02# B P » 2.1 ±0.03* 2.1 ±0.03 2.1 ±0. 1.9±0.06 1.7±0.03P 2.2±0. P 1.1±0.02P» ФГ, г/л 1.3±0.08* 2.0±0.05* 2.0±0.02 1.6±0.03 2.0±0. P 23.5±1.4P» ПДФ, 21.4±1.2* 15.7±0.8* 22.1±0.6+ 18.1±0.4^ 14.0±0.6# P 28.6±1.7P» мг% 25.6±1.3* 15.1±1.1* 23.2±1.3+ 19.2±0.2^ 13.5±0.4# P 35.0±0.6P» РКМФ, 34.2±0.8* 22.8±0.9* 27.8±0.9+ 28.5±0.6^ 20.0±0.8# P 40.4±0.8P» мкг/мл 38.9±0.9* 22.4±0.8* 29.2±0.7+ 33.4±0.4^ 19.7±0.4# P 0.31±0.009* 0.20±0.008* 0.35±0.008P» 0.26±0.004+ D-Д, 0.25±0.005 0.19±0. P 0.35±0.007* 0.21±0.005* 0.39±0.005P» 0.29±0.002+ мкг/мл 0.27±0.004^ 0.18±0.002# P Ф.XIIа зависи мый фибри- 14.6±0.06* 8.2±0.05* 15.8±0.06* 13.2±0.06* 13.2±0.08* 9.5±0.04* нолиз, мин 18.0±0.05* 8.0±0.06* 16.9±0.05* 14.3±0.07* 15.4±0.05* 8.9±0.01* 66.9±1.1P» ТкТР, % 73.1±1.2* 72.1±1.1^ 100±1.8* 70.1±1.5+ 112±1.7# P 53.4±1.0P» 58.1±1.1* 66.4±0.7^ 100±1.5* 65.8±1.6+ 121±1.5# P Обозначения: как в табл. 1;

* - достоверные отличия от величин, найденных в соответст вующие сроки в группе 2-й от группы 1-й,P» группеP от группы 1-й, + - в группе 4-й от P-P Pв P3-й группы 2-й, ^ - в группе 5-й от группы 1-й, # - в группе 6-й от группы 2-й.

Сопоставляя данные, полученные при введении токоферола одновременно с про- или антиоксидантом невитаминной природы (табл. 5), нашли, что воспроиз велись результаты аналогичного опыта с ретинолом - Е-авитаминоз ускоряет ли пидпероксидацию, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови, снижает антиоксидантный потенциал, подавляет фибринолиз и толерантность к тромбину (ТкТР). Так, сравнение величин в столбцах 4 и 3 показывает, что если свинец вводится с рационом, содержащим ТФ в дозе, равной потребности, эффект проок сиданта ограничивается - сдвиги имеют ту же направленность, но менее выраже ны у крыс, получавших свинец и токоферол, чем у крыс, получавших только ТФ.

Антиоксидант ослабил сдвиги у крыс, получавших Е-авитаминный рацион пита ния (столбцы 5 и 1), повысил АОП, замедлил ЛПО и НВСК (столбцы 6 и 2), огра ничил угнетение фибринолиза и повысил толерантность к тромбину. Следова тельно, действие токоферола на гемостаз действительно реализуется благодаря его антиоксидантным свойствам.

Эффекты отсутствия кобаламина (КБ), его дефицита или избытка. Схема опытов не отличается от уже использованной. Сходны и полученные данные, ко торые мы в связи с этим приводим в графическом изображении.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (ТкТР) Линейный (РКМФ) R = 0, R = 0, - -25 R = 0, R = 0, - 2 нед. 4 нед. 6 нед. 8 нед.

Рисунок 7. Сдвиги (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, значений РКМФ и ТкТР в отсутствии кобаламина в рационе (тонкие линии – графики;

жирные – тренды, сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) На рис. 7 видно, что в отсутствии в рационе кобаламина ускоряется ЛПО и снижается АОП, начиная с 4-й недели (рост уровня ДК и ТБК, увеличение СО и удлинение ПИ). При введении кобаламина в дозах, составляющих 25, 50 и 75% потребности сдвиги ослабевают, не исчезая полностью, сохраняя прежнюю зави симость - чем ближе доза к суточной потребности, чем менее выражены послед ствия дефицита витамина.

На рис. 8 видно, что двукратная против потребности доза предупреждала сдвиги, а через 6 и 8 недель ограничивала ЛПО, скорость окисления (СО) и удли няла ПИ.

ДК ПИ РКМФ ТкТР Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) Линейный (ТкТР) Линейный (ПИ) R = 0, 10 R = 0, -10 R = 0, R = 0, - - - 2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед. нед.

Дозы, мкг/кг: 2,0 4,0 8,0 16, Рисунок 8. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ и ТкТР при избытке кобаламина;

тонкие линии – графики, жирные – тренды (сверху вниз ДК, ПИ, РКМФ и ТкТР) Вместе с тем, эффекты более высоких доз кобаламина, подчиняясь в общих чертах уже установленной закономерности во влиянии на липидпероксидацию и антиоксидантный потенциал тромбоцитов, не были строго пропорциональны дозе и длительности введения кобаламина, отличаясь в этом отношении по эффекту от ретинола и токоферола. Однако толерантность к тромбину более строго «соблю дала» пропорциональность, увеличиваясь с повышением дозы и длительности введения кобаламина. Об этом свидетельствует и характер трендов - величины коэффициентов аппроксимации (RP2 близкие к единице, т.е. свидетельствующие P), о корректности аппроксимации, обнаруживаются здесь только для трендов, ха рактеризующих динамику уровня в тромбоцитах диеновых конъюгат и динамику периода индукции, в остальных случаях эти величины далеки от единицы.

Влияние на ЛПО, АОП, НВСК, фибринолиз и ТкТР рационов без ниацина (НЦ) и с его возрастающим количеством. Схема опытов этой серии не от личалась от предыдущих. Диаграммы рис. 9 свидетельствуют, что у крыс, не получавших витамина ВB5, ускорение липидпероксидации и снижение антиок B сидантного потенциала выявляется через 6 недель от начала опыта, и это ста новится ещё более выразительным после 8 недель.

Пробы взяты:

через 2 недели через 4 недели через 6 недель через 8 недель ДК ТБК ПИ СО 35 24 25 20 17 16 15 11 10 9 11 11 66 5 4 4 5 0000 0000 0000 0000 0 00 00 -5 -2 - - -6 - -7 -8 -8 - - - - - - 0% 25% 50% 75% 0% 25% 50% 75% 0% 25% 50% 75% 0% 25% 50% 75% Рисунок 9. Изменения (в % от контроля) уровня ДК, ТБК, длительности ПИ и скорости окисления (СО) в тромбоцитах при содержании крыс на рационе без ниацина и с ниацином в дозах, составляющих 25, 50 и 75% от суточной потребности. Знаки 0 на графике означают отсутствие сдвига (периоды отбора проб приведены над рисунком) У крыс, получавших ниацин в количестве, составляющем 25, 50 и 75% от суточной потребности (соответственно 62.5, 125.0 и 187.5 мкг/кг), степень сдвигов интенсивности липидпероксидации и антиоксидантного потенциала, возникающих в его отсутствии, после 6 и 8 недель от начала опыта, уменьша ется с увеличением дозы. Однако и при наибольшей из этих доз величины, ха рактеризующие состояние перекисного окисления липидов ещё отличаются от контроля, хотя и в небольшой, но достоверной степени (р 0,05). Следова тельно, ускорение ЛПО и снижение АОП у крыс, получавших ниацин в дозах, не достигающих суточной потребности, менее выражены в сравнении с обна руженным при ВB5-авитаминном рационе, однако, не исчезает полностью и к B концу опыта.

При введения избытка витамина ВB5 (рис. 10, где рассмотрены в качестве по B казателей состояния ЛПО и АОП уровень ДК и период индукции - ПИ, состояния НВСК – изменения РКМФ) с увеличением длительности эксперимента снижа ется интенсивность липидпероксидации (убыль уровня ДК) и растет АОП (уд линение ПИ), замедляется НВСК (снижение уровня РКМФ), активируется фибринолиз (укорочение времени лизиса сгустка фибрина), а также повышает ся толерантность к тромбину (ТкТР).

ДК ПИ РКМФ Фиб-лиз ТкТР Линейный (ТкТР) Линейный (Фиб-лиз) Линейный (ПИ) Линейный (ДК) Линейный (РКМФ) 114 106 R = 0, 105 94 83 85 79 R = 0, 33 31 31 31 25 R = 0, 12 0 0 0 0 0 -4 R = 0, -15 - -16 - - -23 - -28 -35 R = 0, -30 - -34 - -37 - -39 - - -55 - 2 нед.

8 нед.

2 нед.

4 нед.

6 нед.

4 нед.

6 нед.

8 нед.

2 нед.

4 нед.

6 нед.

8 нед.

Дозы ниацина: 1000 мг/кг 2000 мг/кг 4000 мг/кг Рисунок 10. Изменения (в % к контролю) уровня ДК, длительности ПИ, уровня РКМФ, активности фибринолиза и толерантности к тромбину (ТкТР) при избытке ниацина в рацио не крыс (тренды сверху вниз: ПИ, фибринолиз, ТкТР, РКМФ и ДК) Сдвиги уровня ДК (показатель скорости липидпероксидации) ассоциированы с изменениями антиоксидантного потенциала (по значениям ПИ) достаточно тес ной отрицательной связью (rBs = -0.87), с уровнем РКМФ - тесной положительной B связью (rBs = 0.83), как это находили и при изучении витаминов А, Е и ВB12. Тесная B B положительная связь выявлена также между активностью фибринолиза и толе рантностью к тромбину (rBs = 0.91). B При дозе ниацина в 2, 4, 8 и 16 превосходящей потребность, липидпероксида ция протекала медленнее, чем в контроле, а антиоксидантный потенциал увели чивался. Степень сдвигов, как видно по характеру диаграмм, менялась непропор ционально дозе, начиная с восьмикратной.

Особенностью влияния ВB5-авитаминного рациона питания, не представленной B на диаграмме, является то, что за 6 и особенно за 8 недель замедлилось высвобо ждение фф. РB3, РB4, Непрерывное свертывание крови (НВСК) замедлилось и упала B B активность фибринолиза, снизилась ТкТР. При введении ниацина в дозах мень ших, чем потребность, эти сдвиги, как и сдвиги в процессах перекисного окисле ния липидов, уменьшались, но не исчезали. Фибринолиз, будучи замедленным в отсутствии НЦ, активировался параллельно приросту дозы НЦ. Сниженная при ВB5-авитаминозе толерантность к тромбину, увеличивалась с введением ниацина B пропорционально его дозе.

При двукратной против потребности дозе ниацина (500 мкг/кг) через 2 недели интенсивность НВСК была такой же, как у крыс, получавших ниацин в соответ ствии с потребностью. Активность фибринолиза за 8 недель стала выше кон трольной, как и ТкТР (на 123%). Введение НЦ в четырёхкратной дозе влияло на НВСК аналогичным образом, активность же фибринолиза повышалась, начиная со 2-й недели и за 8 недель превысила контроль на 40,7%. Толерантность к тром бину (ТкТР) уже через 2 недели была выше контроля, а за 8 недель превысила его на 131%. Степень ускорения фибринолиза и роста ТкТР относительно контроля оставалась такой же, как и при четырёхкратной дозе. При введении шестнадцат рикратной дозы НЦ сдвиги по времени появления, направленности и степени не отличаются от найденных при введении ниацина в восьмикратной дозе.

Влияние внутривенного введения ниацина на ЛПО, АОП, НВСК, фибрино лиз и ТкТР. Так как эффекты ниацина на гемостаз зависят от пути введения (Г.Х.Довгялло и др., 1967;

J.A.Pires, 2007), мы провели опыты с его внутривен ными инъекциями. Инъекция растворителя («слепой» опыт) не меняла показате лей. После инъекций ниацина нашли, что его введение в дву- и четырёхкратной дозе изменений ЛПО и АОП в течение 1 ч не вызывала, а при восьмикратной до зе через 1 ч наблюдалось замедление ЛПО и рост АОП.

При шестнадцатикратной дозе это выявилось уже через 0.5 ч, усилившись че рез 1 ч. Судя по значениям m индивидуальные колебания выше, чем у крыс, по лучавших ниацин с пищей.

При введении двукратной дозы ниацина через 30 и 60 мин в одинаковой сте пени снижена фибриногенемия и ускорено НВСК. Фибринолиз ускорился через 15 и 30 мин, а ТкТР увеличилась. При четырёхкратной дозе гипофибриногенемия усугубилась, ускорилось НВСК (на 15-й и 60-й мин), заметнее активировался фибринолиз (начиная с 15-й мин и до конца опыта) и увеличилась ТкТР (начиная с 5-й мин).

При 8-кратной дозе за 30 и 60 мин увеличился уровень фф. РB3 и РB4, усугуби B B лась гипофибриногенемия. Ускорение НВСК выявлялось уже через 15 мин, уси ливаясь к концу опыта. Скорость фибринолиза была выше, чем в контроле, как и при четырёхкратной дозе, и сравнялась с контролем к концу опытов. ТкТР при этой дозе на 5-й и 15-й мин выше, чем при четырёхкратной, а к 60-й минуте упала ниже контроля.

После введения ниацина в шестнадцатикратной дозе уровень фф. РB3 и РB4 ос B B тался таким же, как и при восьмикратной, гипофибриногенемия усугубилась.

Скорость НВСК изменялась, как и при восьмикратной дозе. Заметнее ускорился фибринолиз, сравнявшись к 60-й мин с контролем. ТкТР на 5-й и 15-й мин выше, чем при 8-кратной дозой, на 30-й минуте снизилась, и через 60 мин стала ниже контрольной.

В целом эффекты введения ниацина в вену свидетельствуют, что скорость НВСК после инъекции растет с увеличением дозы. Растет при этом и уровень РФМК, постепенно снижаясь к концу опыта. Параллельно ускоряется фибрино лиз и растет ТкТР, и это также через 1 ч сменяется снижением.

Эта фазность сдвигов при введении НЦ в вену потребовала изучить показатели общей свертываемости крови - АВР и АЧТВ. В эксперименте мы нашли, что че рез 5 и заметнее через 15 мин, но слабее через 30 мин после инъекции ниацина дозазависимо сокращается АВР и АЧТВ, нормализуясь через 60 мин.

После введения НЦ в 4-, 8- и 16-кратной дозе через 30 мин АВР и АЧТВ удли нены в степени, возрастающей с увеличением дозы.

Принимая во внимание данные об изменении ответа на повторные внутривен ные инъекции НЦ [Е.В.Шаповалова, 1967;

G.J. Kato e.a., 2008], мы провели опы ты с ежедневным введением ниацина в вену хвоста в дозах, эквивалентных ле чебным, отбирая пробы крови через 5, 15, 30 и 60 мин. После 5-й инъекции ( мкг/кг ежедневно) укорочение АВР и АЧТВ наблюдали лишь через 30 мин, сте пень укороченния становилась менее заметной через 60 мин. Активность фибри нолиза повышалась в малой мере лишь через 60 мин, а ТкТР не изменялась.

При бльших дозах ниацина повторное введение не сказывалось на значении АВР, АЧТВ, фибринолиза и ТкТР в период наблюдений. После 10-й и 20-й еже дневной инъекции ниацина изменения протекали с такой же динамикой.

ЛПО и гемостаз у морских свинок при питании рационом без витамина С и с его избытком также выполнены по общей схеме.

В отсутствии АК (рис. 11) через 2 недели плавно ускоряется ЛПО, и позже снижается АОП.

ДК ПИ РКМФ ПДФ D-димеры Фиб-лиз ТкТР Линейный (ДК) Линейный (ПИ) Линейный (РКМФ) Линейный (Фиб-лиз) Линейный (ТкТР) Линейный (ПДФ) Линейный (D-димеры) R = 0, 30 10 0 0 0 0 0 R = 0, -10 -7 R = 0, -10 -11 R = 0, -20 - R = 0, - -30 R = 0, R = 0, -40 - д.

д.

д.

д.

2 не 4 не 6 не 8 не Рисунок 11. Изменения (в % к контролю) ДК, ПИ, РКМФ, ПДФ, фибринолиза и ТкТР в от сутствии АК в рационе морских свинок. Примечания: линии трендов (сверху вниз) - дина мика ДК, РКМФ, ПДФ, D-димеров, ПИ, фибринолиза и ТкТР;

рядом с трендами располо жены значения RP2 знаки 0 на рисунке означают отсутствие отклонений от контроля P;

При дозе АК, составляющей 25% потребности, сдвиги ЛПО менее выражены. При дозе АК, составляющей 50% или 75% от потребности, ускорение ЛПО ещё менее значительно. При двукратной против потребности дозе уже за 4 недели замедляется ЛПО и растет АОП. Через 6 и 8 недель сдвиги усилены. При четырёхкратной дозе до 6-й недели сдвигов не было, а через 8 недель ЛПО ускорилась, а АОП упал. При восьмикратной дозе ускорение ЛПО и падение АОП выявились через 6 недель, то же нашли и при шестнадцатикратной дозе АК.

Способность витамина С повышать общую коагулоактивность тромбоцитов согла суется с его свойством поддерживать активность энзимов-антиоксидантов [T.W.Stief e.a. 2000;

S.A.Raghavan e.a., 2003], а снижение АОП при С-авитаминном рационе пиания свидетельствует, что оксидативный стресс является одним из проявлений дефицита аскорбата.

То, что прооксидантный эффект АК заметнее проявляется у аскорбатзависимых животных, согласуется с понятием «степень насыщения организма витамином С»:

потребность в АК определяется её количеством в организме, превышение которого в рационе уже не изменяет «насыщенности» крови аскорбатом в связи с ускоренным его выведением с мочой (В.В.Ефремов, 1964, 1969;

П.Н.Шараев, 2004) Графический анализ выявил у аскорбатзависимых животных то, что на рационе без АК динамика исследуемых величин отличается от найденной при изучении эффекта рационов без ретинола, токоферола или кобаламина: RP2 трендов, описывающих сдвиги P РКМФ, ПИ и фибринолиза, заметно ниже единицы потому, что в ранние сроки эти величины не менялись.

Однако ряд показателей изменялся пропорционально протяженности опытов. Так, коэффициенты RP2 близки к единице: в паре ДК-ПИ (здесь найдена тесная отрицатель P ная связь _ rBs = -0.92), пара ДК и ТкТР ассоциированы такой же связью (rBs = -0.83), как P P B B и ДК-фибринолиз (хотя теснота во втором случае ниже - rBs = -0.65). Связи между B РКМФ и ПДФ, РКМФ и D-димерами, ПДФ и D-димерами положительны, но малозна чимы (rBs от 0.34 до 0.41) из-за разной величины сдвигов на отдельных этапах наблю B дений. Вместе с тем связь этих сдвигов с отсутствием АК несомненна, так как даже в дозах меньших, чем потребность, аскорбат ограничивает эти сдвиги, хотя и не устра няет их полностью.

Следовательно, отсутствие аскорбата в рационе аскорбатзависимых животных снижает коагулоактивность тромбоцитов, изменяет скорость НВСК, что не наблюда лось при авитаминозах А, Е, ВB5 и ВB12. B B Снижение уровня фф. РB3 и РB4 не связано со сдвигами ЛПО и АОП. Более вероятно, B B что снижение высвобождающей способности тромбоцитов сопряжено с торможением фибринолиза при С-авитаминозе. Видимо, ускорение ЛПО в этом случае сказывается на активности фибринолитического процесса, сопровождаясь снижением толерантно сти к тромбину.

То, что С-авитаминоз сопровождается снижением способности тромбоцитов вы свобождать фф. РB3 и РB4, раскрывает механизм уменьшения «тромбопластической B B активности» кровяных пластинок, обнаруженного ещё в то время, когда пред ставления о реакции высвобождения только начали формироваться [Г.В.Андреенко и др., 1958, 1959, 1960].

Влияние всех возможных сочетаний из пяти витаминов на ЛПО, АОП, НВСК, фибринолиз и ТкТР. Рассмотренные выше опыты не выявили равно выраженной зависимости между эффектами отсутствия, дефицита или избытка каждого из этих витаминов на ЛПО, АОП, НВСК или фибринолиз. Вместе с тем, близкими были изменения ТкТР при всех рассмотренных видах авитаминоза (лишь при ВB12-авитами- B нозе ТкТР снижена в меньшей мере, чем в других случаях). По влиянию избытка витаминов на ТкТР они ранжированы так: А Е ВB12 С = ВB5. B B Так как толерантность к тромбину - это результирующая взаимодействия многих физиологических систем, ответственных за реакцию организма на гипертромбинемию, при постановке очередных опытов, мы ориентировались на сдвиг ТкТР, роль которой в жизнеобеспечении детально изучена лабораторией физиологии гемостаза МГУ [Б.А.Кудряшов, 1975] и подтверждена во многих экспериментальных и клинических ситуациях (А.Ш.Бышевский и др., 1963, 1964, 2005, 2007;

В.А.Полякова, 1994;

Е.А.Матейкович, 2006;

Р.Г.Алборов, 2006;

Э.В.Багумян и др., 2007).

Из всех возможных сочетаний мы начали с сочетания по 2 из 5, используя дозы, эквивалентные лечебным (четырёх- и восьмикратные против потребности). Вводили эти сочетания 8 недель с тем, чтобы сопоставить их эффекты при максимальном сдвиге ТкТР. Результаты опытов (табл. 6) свидетельствуют, что при всех сочетаниях растет степень их влияния на ТкТР в сравнении с эффектом тех же витаминов, вводи мых порознь.

Таблица 6. Влияние на ТкТР (в % к контролю, принятому в среднем за 100%) сочетаний ви таминов А, Е, С, ВB5, и ВB12 по 2 (4- и 8-кратный избыток каждого) в рационе в течение 4 и B B B недель (1-я и 2-я цифра в строке соответственно) Крысы (n = 5 на каждом этапе) получали витамины, обозначен Сочетания витаминов по два ные в столбце 1-м 4-кратный избыток 8-кратный избыток Е+С 125±2.4*;

140±2.7* 125±2.3*;

129±2.1* Е+РР 125±2.7*;

127±2.3* 126±2.4* 139±2.7* Е+А 140±2.1*;

147±2.4* 150±2.8*;

174±3.1* 138±2.2*;

154±2.9* Е+ВB12 127±2.2*;

135±2.7* B С+РР 120±2.6;

132±1.8 130±3.4*;

137±3.1* С+А 131±2.8*;

140±3.7* 139±4.1*;

148±2.7* С+ВB12 115±2.2*;

118±1.3* 120±3.2*;

128±2.9* B РР+А 143±3.2*;

162±4.5* 152±3.6*;

165±4.1* РР+ВB12 129±2.1*: 137±2.6* 133±3.1*;

154±4.7* B 134±2.1*;

140±2.6* 152±3.4*;

159±4.3* А + ВB12 B Знак * - достоверное отличие от контроля Изучили также влияние на ТкТР сочетаний по 3, 4 и 5 витаминов. По данным табл. 7 сочетания по три эффективнее, чем по два, ещё эффективнее сочетания по четыре, и максимальны – сочетание всех пяти.

Оказалось, что все сочетания усиливают влияние витаминов на ТкТР, повы шающееся с увеличением длительности введения (как и при их исследовании по рознь). Прирост ТкТР при сочетании из пяти относительно невелик.

Чтобы выяснить не связано ли это с прооксидантными свойствами высоких доз АК, сопоставили эффект на ТкТР сочетания из пяти витаминов, вводя АК в дозе, проявляющей антиоксидантную активность (в 4-хкратной против потребно сти). В этом случае ТкТР увеличилась со 100 до 232±5.1% (на 132%), т.е. силь нее, чем при введении того же сочетания с 8-кратной дозой АК, когда ТкТР вы росла только на 98±4.8%.

Итак, снижение (при сочетании из пяти) дозы АК с 8- до 4-кратной усилило влияние на ТкТР. Следовательно, ограничение эффекта при восьмикратной дозе АК в составе сочетания обусловлено тем, что четырёхкратная доза не проявляет столь выраженной прооксидантной активности.

Таблица 7.

Влияние на ТкТР сочетаний витаминов А, Е, С, ВB5, и ВB12 по 3, 4 и 5 (4- и 8- кратный из B B B быток каждого) в рационе в течение 4 и 8 недель (1-я и 2-я цифра в строке соответственно) Крысы (n = 5 на этапе) получали в избытке Перечень сочета витамины, обозначенные в первом столбце ний витаминов по 3, 4и 4-кратный избыток 8-кратный избыток Е+С+ВB5 129±2.2*;

136±2.1* 129±2.1*;

146±2.8* B Е+С+А 157±3.1*;

179±4.1* 150±2.8*;

198±5.1* Е+С+ВB12 140±3.3*;

167±2.9* 162±4.5*;

189±5.2* B С+ВB5+А 143±3.2*;

159±4.1* 166±3.7*;

176±5.2* B С+ВB5+ВB12 125±2.3;

145±2.7 133±3.4;

148±3. B B ВB5+А+ВB12 145±3.0*;

150±3.2* 161±3.6*;

165±4.2* B B Е+С+ВB5+ВB12 149±4.0*;

171±4.3* 157±3.8*;

178±4.3* B B Е+С+ВB5+А 153±3.5*;

175±4.6* 160±3.9*;

181±4.4* B С+ВB5+ВB12+А 160±3.5*;

173±4.7* 163±4.2*;

178±4.7* B B Е+С+ВB5+ВB12+А 157±3.6*;

193±4.6* 166±4.5*;

198±4.8* B B Знак * - достоверное отличие от контроля При всех исследованных нами видах авитаминоза однонаправлено изме няется ТкТР. Степень её сдвигов (в сравнении с найденными при введении витаминов порознь), позволяет судить о характере кооперации эффектов, вы зываемых сочетаниями.