авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Морфофункциональная характеристика гипоталамо- гипофизарно-адренокортикальной и иммунной систем организма экспериментальных животных при воздействии хрома и бензола

На правах рукописи

ЕРМОЛИНА Евгения Вячеславовна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИПОТАЛАМО-

ГИПОФИЗАРНО-АДРЕНОКОРТИКАЛЬНОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ

ОРГАНИЗМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ

ВОЗДЕЙСТВИИ ХРОМА И БЕНЗОЛА

03.03.04. Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оренбург 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Стадников Александр Абрамович доктор медицинских наук, профессор Смолягин Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, зав.кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Суворова Галина Николаевна доктор биологических наук, профессор кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы и фармакологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» Топурия Лариса Юрьевна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится июня 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.04 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Шевлюк Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Проблема устойчивости и приспособления организма к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды остается в настоящее время одной из наиболее значимых в биологии и медицине. В настоящее время представляет большой интерес решение таких важных проблем, как всестороннее изучение взаимодействия организма человека и химических факторов среды, адаптации к химическим воздействиям, влияния на иммунный гомеостаз, механизмов длительного воздействия веществ с целью профилактики неблагоприятного влияния на здоровье человека (Курляндский Б.А., 1998;

Шандала М.Г., 1998).

Актуальность изучения комбинированного действия химических соединений, загрязняющих окружающую среду, общеизвестна. Однако, несмотря на большое число исследований, посвященных этому вопросу (Кацнельсон Б.А., 1993;

Боев В.М., Сетко Н.П., 2001;

Пинигин М.А., 1986), многие аспекты этой проблемы до сих пор остаются предметом научной дискуссии.

Среди важнейших регулирующих систем организма весьма существенна роль гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС) в поддержании тканевого и клеточного гомеостаза, обеспечении процессов адаптации и компенсации нарушенных функций различных органов висцеральных систем (Поленов А.Л., 1993;

Акмаев И.Г., 1997;

Шевлюк Н.Н., Руди В.Н., 2000;

Стадников А.А., Бухарин О.В., 2012). Одной из наиболее чувствительных систем организма, чутко реагирующей на контакт с химическими веществами, является система иммунитета. Поэтому иммунная система может выступать как показатель воздействия на организм различных антропогенных факторов, т.е. быть чувствительной индикаторной системой наличия в регионе экологически неблагоприятной ситуации (Хаитов Р.М. с соавт., 2006).

Особо значимыми в формировании опасности для здоровья человека являются бензол и соединения хрома (Aksoy M., 1989;

Гильденскиольд Р.С. с соавт., 1992;

Новиков С.М. с соавт., 1998;

Barseloux D.G., 1999;

Пинигин М.А. с соавт. 2001).

Бензол применяется во многих отраслях производства, присутствует в качестве примеси в автомобильном бензине и в большом количестве - в выхлопных газах, а также в промышленных отходах предприятий, использующих бензол и загрязняющих окружающую среду обитания человека (Зорина Л.А., 1990;

Филов В.А., 1990;

Ouyang Y. et al., 2000;

Куценко С.А., 2004;

Williams P.R. et al., 2008).

Основными промышленными источниками хрома являются производство цветных металлов, стали, удобрений, автомобильное, нефтехимическое, красильное, ткацкое производство, гальванопластика, очистка нефти, производство и обработка оконного стекла, цемента, асбеста (Авцын А.П. с соавт., 1991;

Ревич Б.А., 2010).

В литературе имеются работы, посвященные исследованию влияния хромовых соединений и бензола на различные органы и ткани как в эксперименте, так и клинических условиях (Передельский Е.А., 2003;

Izumi H. еt al., 2005;

Antonini J.M., 2007;

Минигалиева И.А. с соавт., 2007;

Романюк А.М. с соавт., 2011). Вместе с тем, недостаточно изучены вопросы, посвященные комбинированному влиянию данных экотоксикантов на состояние ГГАКС и иммунной систем организма.

Учитывая тесные связи нейроэндокринной и иммунной систем, представляло существенный интерес исследование комбинированного влияния хрома и бензола на особенности состояния данных регуляторных систем. Все вышеизложенное послужило основанием для проведения данной работы.

Цель и задачи исследования Цель работы - определение диапазона морфофункциональных изменений гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной систем при хроническом воздействии бензола и хрома в эксперименте.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние бензола, бихромата калия и их смеси на морфологические изменения органов ГГАКС (гипоталамус, гипофиз, надпочечники) у крыс линии Вистар.

2. Исследовать влияние бензола, бихромата калия и их смеси на морфологические изменения органов иммунной системы (тимус, селезенка, лимфатические узлы) у экспериментальных животных.

3. Оценить изменения иммунологических показателей при воздействии бензола, бихромата калия и их смеси у экспериментальных животных.

Научная новизна полученных результатов Впервые в условиях модельного эксперимента выявлены морфофункциональные изменения ГГАКС и иммунной систем крыс Вистар при воздействии бензола и хрома.

Установлено, что бензол в концентрации 0,6 мл/кг, бихромат калия в концентрации 20 мг/кг и их сочетание способны вызывать выраженные морфофункциональные нарушения ГГАКС и лимфоидных органов. Показана функциональная активизация нонапептидэргических нейросекреторных центров гипоталамуса и кортикотропоцитов у крыс, получавших только хром или только бензол, и блокирование высвобождения гипоталамических нейропептидов на уровне нейрогипофиза, которое протекает на фоне ультраструктурных повреждений нейросекреторных клеток гипоталамуса, аденоцитов гипофиза и клеток коркового вещества надпочечников при комбинированном воздействии исследованных химических факторов.

Впервые дана структурно-функциональная характеристика тимуса крыс при длительном влиянии бензола, хрома и их смеси. Установлен комплекс структурно-функциональных изменений, свидетельствующих о статусе акцидентальной инволюции органа.

При гистологическом анализе действия бензола, хрома и их смеси на селезенку и лимфатические узлы крыс установлено снижение активности популяции Т-лимфоцитов, отражающее состояние Т-клеточного иммунодефицита у экспериментальных животных.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование сочетанного влияния бензола и хрома на тимус, селезенку и лимфатические узлы крыс, что показало индуцирование программированной гибели тимоцитов, а также лимфоцитов в Т-зонах селезенки и лимфатических узлах крыс.

Впервые исследовано влияния бихромата калия, бензола и их смеси на уровень цитокинов, продуцируемых спленоцитами крыс. Установлено увеличение уровня противовоспалительного ИЛ-4 и снижение концентрации провоспалительного цитокина ИЛ-6.

Теоретическое и практическое значение Диссертационная работа относится к фундаментальным исследованиям в области клеточной биологии, цитологии и иммунологии, расширяющим представления о морфологических и иммунологических нарушениях при экспериментальном воздействии бензола, хрома и их смеси.

Выявленные изменения являются обоснованием гистологических и цитологических закономерностей иммуноморфологии в аспектах нейроэндокринной регуляции адаптивных свойств органов иммуногенеза, что существенно для разработки подходов к предупреждению отрицательных последствий воздействия данных ксенобиотиков.

Полученные результаты могут быть использованы для анализа нарушений ГГАКС и иммунной системы при профессиональной хронической интоксикации у лиц, работающих с бензолом и соединениями хрома.

Проведенная комплексная оценка как изолированного, так и сочетанного действия данных химических факторов может быть использована в качестве критериев оценки их влияния, что важно при обосновании и корректировке существующих гигиенических нормативов для данных соединений.

По данным работы издано информационное письмо «Морфофункциональная характеристика гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и иммунной систем организма экспериментальных животных при воздействии хрома и бензола».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Длительное пероральное воздействие бензола и хрома на крыс Вистар при изолированном введении приводит к активизации секреторной деятельности ГГАКС, а при комбинированном - и к блокированию высвобождения гипоталамических нейропептидов на уровне нейрогипофиза, что в свою очередь ведет к лимитированию деятельности адренокортикотропоцитов, кортикоцитов надпочечников, которое протекает на фоне ультраструктурных повреждений нейросекреторных клеток гипоталамуса, аденоцитов гипофиза и клеток коркового вещества надпочечников.

2. Воздействие бензола, хрома и их комбинации в течение 45, 90 и 135 суток на крыс Вистар приводит к снижению массы тимуса и числа тимоцитов, вызывает комплекс структурно-функциональных изменений, свидетельствующих о статусе акцидентальной инволюции органа, индуцирует программированную гибель тимоцитов и лимфоцитов в Т-зонах селезенки и лимфатических узлах.

3. Бензол, хром и их комбинация угнетают клеточный (количество лейкоцитов, лимфоцитов, фагоцитарные показатели в периферической крови, число спленоцитов, CD3-, CD4-, CD8-лимфоцитов селезенки, миелокариоцитов) и гуморальный иммунный ответ (число АОК в селезенке, титр антител к Т-зависимому антигену, уровень лизоцима и содержание ИЛ 6).

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на IV конференции Иммунологов Урала (Уфа, конференции Иммунологов Урала 2005);

V «Актуальные проблемы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии», (Оренбург, 2006);

Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008);

Российской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты формирования вторичных иммунодефицитных состояний у жителей Южно-Уральского региона» (Оренбург, 2011);

X Российской конференции Иммунологов Урала (Тюмень, 2012).

Публикация результатов исследования Материалы диссертации изложены в 14 научных публикациях, в том числе в статьях, опубликованных в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ для защиты докторских и кандидатских диссертаций.

Внедрение результатов исследования Новые сведения о гистофизиологических особенностях ГГАКС и органов иммуногенеза, диапазоне их структурно-функциональной реорганизации при длительном воздействии хрома и бензола, комплекс методов гистологического, иммунологического и морфометрического анализа внедрены в учебный процесс и научную работу кафедр: гистологии, цитологии и эмбриологии;

микробиологии, иммунологии и вирусологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», 3 главы собственных исследований, обсуждение, выводы и указатель литературы, включающий 132 отечественных и 121 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 11 таблицами и 25 рисунками.

Материалы и методы исследования Эксперименты проведены на 180 здоровых половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 180-200г. Сведения по количественному распределению крыс по группам и срокам экспериментов представлены в табл.1. В работе использована модель комбинированного воздействия хрома (K2Cr2O7) из расчёта 20 мг/кг и бензола (C6H6) из расчёта 0,6 мл/кг массы при пероральном поступлении с водой. Дозы веществ соответствовали одной предельно допустимой концентрации в питьевой воде (ГН 2.1.5.1315-03 Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно питьевого и культурного водопользования;

СанПиН 2.1.4.1074-01 Питьевая вода.

Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества). Все животные были разделены на группы.

Первая группа (контрольная) получала воду. На протяжении 135 дней вместе с водой животные получали: вторая группа – бензол («Полихим», Россия), третья бихромат калия («Полихим», Россия), четвертая – бензол комбинированно с бихроматом калия.

Таблица Количественное распределение крыс по группам и срокам экспериментов Группы животных Сроки Количество животных эксперимента, Для Для иммунологических сутки морфологических исследований исследований 1 группа 45 5 Контрольные 90 5 животные 135 5 2 группа 45 5 Пероральное 90 5 введение C6H6 (0,6 135 5 мл/кг массы тела) 3 группа 45 5 Пероральное 90 5 введение K2Cr2O (20 мг/кг) 135 5 4 группа 45 5 Пероральное 90 5 введение C6H 135 5 комбинированно с K2Cr2O Всего животных 60 Через 45, 90 и 135 дней животные выводились из эксперимента декапитированием под эфирным наркозом в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, от раженными в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей" (Страсбург, 1985).

Морфологические исследования проводились у 20 экспериментальных крыс (по 5 животных из каждой группы) на 45-ый день, у 20 крыс (по 5 животных из каждой группы) на 90-ый день и у 20 крыс (по 5 животных из каждой группы) на 135-й день эксперимента с использованием общепринятых морфометрических и гистологических методов исследования.

Весь полученный материал (гипоталамус, гипофиз, надпочечники, тимус, селезенка, мезентериальные лимфатические узлы) был подвергнут однотипной гистологической обработке на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях.

Для светооптического исследования материал фиксировали в 12% водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, жидкости Буэна и затем дегидратировали в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин целлоидин. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм, изготовленные на ротационном микротоме МПС-2, окрашивали гематоксилином Майера и эозином, а также по Ван-Гизону. Рибонуклеопротеиды выявляли метиловым зеленым и пиронином «Ж» по методу Браше, суммарный белок – по методу Даниэлли, углеводные субстраты по Мак-Манусу, с постановкой соответствующих энзиматических контролей (Пирс Э., 1962). Количественная информация о размерах ядер, ядрышек, цитоплазмы, ядерно-цитоплазматических (ЯЦО) и ядрышко-ядерных (ЯдрЯО) отношениях была получена путем морфометрических исследований гистологических препаратов с использованием винтового окуляр микрометра МОВ-1х4,5У (Автандилов Г.Г., 1990).

Для электронно-микроскопического изучения материал фиксировали в охлажденном (t+4оС) 2,5% растворе глютарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия по Millonig G. (1961), обезвоживали в ацетоне c возрастающей концентрацией и заключали в ЭПОН-812 (Hayat М.А., 1989).

Полутонкие срезы (1мкм) окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи Sato T., Shamoto M. (1973). Ультратонкие срезы, приготовленные на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma) подвергали двойному контрастированию в цитрате свинца и растворе уранилацетата по Reynolds E. (1963). Исследование и фотографирование ультратонких срезов производили в электронном микроскопе ЭВМ-100 АК при увеличении от х10000 до х40000. Вычисление площади поверхности ультраструктур осуществляли наложением на электронограмму квадратной сетки (размер квадрата 10х10 мм), содержащей внутри каждого квадрата 25 точек (расстояние между точками 1,5 мм). Оценку морфометрических параметров проводили путем подсчета точек (пересечений квадратов), проецирующихся на срез ультраструктуры (Якубов А.С., Кац В.А., 1984).

Для определения экспрессии проапоптотического белка р53 и антиапоптотического белка bcl2 объекты фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, дегидратировали и заливали в парафин.

Гистологические срезы инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (наборы «Kit» фирмы «ДАКО», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для визуализации структур использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод (Киясов А.П., 2001). Подсчет окрашенных иммунопозитивных клеток (в %) осуществляли при анализе не менее 1000 клеток в различных полях зрения микроскопа МБИ-15, 25 мм2, ув. об. 90, ок.10.

Для проведения иммунологических исследований у 60 животных (по 15 в каждой группе) на 45-й день, у 60 крыс (по 15 в каждой группе) на 90-й день и у крыс (по 15 в каждой группе) на 135-й день эксперимента изучали в крови – содержание эритроцитов, лейкоцитов и подсчитывали лейкоформулу;

определяли массу тимуса и селезенки, а также количество ядросодержащих клеток в тимусе, селезенке и костном мозге;

оценивали клеточный состав селезенки и костного мозга в соответствии с лабораторными методами исследования экспериментальных животных (Горизонтов П.Д. с соавт., 1983).

При исследовании фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов в мазках определяли процентное содержание фагоцитирующих клеток - фагоцитарный показатель (ФП) и поглотительную способность нейтрофилов - фагоцитарный индекс (ФИ) в отношении тест-культуры Staphylococcus aureus (штамм 209-Р, ГКИ им. Л.А.

Тарасевича). Метаболическая активность сегментоядерных нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов исследовалась в спонтанном и индуцированном зимозаном А ("Sigma", США) тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тесте) (Волчегорский И.А. с соавт., 2000).

Иммунофенотипирование спленоцитов проводили с использованием моноклональных антител ("eBioscience", США) к молекулам CD3, CD4, CD8.

Процентное содержание CD3+-, CD4+-, CD8+- лимфоцитов селезенки определяли на проточном двухлазерном цитофлюориметре "FACS Canto II" ("Becton Dickinson", США). Математический анализ (сбор и обработка данных) проводили с применением программного обеспечения "CellQuest Pro". В каждой пробе анализировали не менее 10000 лимфоцитов.

Концентрацию цитокинов в супернатантах культур спленоцитов определяли методом иммуноферментного анализа. Для определения концентрации ИФН, ИЛ 4, ИЛ-6, ИЛ-10 использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа (Bender Австрия). Результаты анализа учитывали MedSystems, спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на фотометре Multiskan ("Labsystems", Финляндия). Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, и по ней определяли содержание цитокинов в исследуемых образцах.

Первичный иммунный ответ к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ) исследовали путем определения прямых антителообразующих клеток (АОК) в селезенке по методу Ерне и количества гемагглютининов в сыворотке крови (Волчегорский И.А. с соавт., 2000).

Содержание лизоцима исследовали турбидиметрическим методом (Бухарин О.В. с соавт., 1972).

Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета программ для ПК “Microsoft Excel 7.0,” “STATISTICА 5.0” и представлены в виде среднеарифметического значения (M±m), медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). Для сравнения групп использовали U-критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента.

Результаты собственных исследований и их обсуждение Результаты светооптических и электронно-микроскопических исследований крупноклеточных супраоптических (СО) и паравентрикулярных (ПВ) ядер гипоталамуса, а также нейрогипофиза крыс трех опытных групп показали значительную цитофизиологическую активизацию нейросекреторных клеток (НСК). Это выражалось в увеличении объемов цитоплазмы, ядер и ядрышек «светлых», функционально активных нонапептидергических нейронов (рис.1).

35 * * * 30 * * * * * 25 * Ядро * * * * * 20 * мкм * Цитоплазма Ядрышко * 10 * * 0 Достоверность группа группа группа группа группа группа группа группа группа (р0,05) по отношению к контролю Контроль 45 суток 90 суток 135 суток Рис.1 Морфометрические показатели функционально активных («светлых») нейросекреторных клеток супраоптических ядер гипоталамуса крыс Вистар.

Вместе с тем, комбинированное применение хрома и бензола не сопровождается адекватной экструзией секреторных гранул на уровне аксовазальных комплексов нейрогипофиза и срединного возвышения экспериментальных животных (рис.2).

А Г Б В Рис.2 Фрагмент нейрогипофиза крысы в условиях комбинированного воздействия бензола и хрома на 90 день эксперимента. А – гемокапилляр;

Б – митохондрии;

В – липосомы;

Г – секреторные гранулы. Ув. х Описываемые ультраструктурные изменения можно расценить как показатели локальных мембранных повреждений НСК, развивающихся на фоне их функционального напряжения и лимитирования биоэнергетики.

С другой стороны было установлено существенное изменение соотношения между нонапептидергическими аксонами НСК и моноаминергическими нервными волокнами на уровне срединного возвышения. Так, на фоне возрастания количества аксонов НСК СО и ПВ ядер гипоталамуса (переполненных секреторными гранулами) существенно понижалась численность моноаминергических структур гипоталамуса крыс преимущественно 4-ой группы во все сроки наблюдений (рис.3). Одновременно наблюдались явления ультраструктурных повреждений исследованных нервных волокон на уровне нейрогипофиза. Полученные факты свидетельствуют о зависимости процессов высвобождения секреторных гранул из нонапептидергических терминалей НСК крупноклеточных ядер гипоталамуса от присутствия моноаминергических нервных волокон на уровне срединного возвышения. Это в свою очередь позволяет высказать суждение о триггерной роли моноаминов в процессах экструзии гипоталамических нонапептидов в портальный кровоток и общую гемоциркуляцию (Поленов А.Л., 1983).

Рис.3 Соотношение нонапептид- и моноаминергических структур в срединном возвышении гипоталамуса крыс Вистар при комбинированном воздействии бензола и хрома Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что при воздействии на организм экспериментальных животных хрома и бензола возникает разбалансировка (диспропорция) между уровнем продукции нонапептидов и их высвобождения из терминалей аксонов НСК. Это приводит к ультраструктурным повреждениям в виде нарастания содержания крупных лизосом и аутофагосом как в НСК, так и питуицитах, что является признаками «изнашивания» ГГАКС и ограничения ее адаптивных возможностей.

Иммуноцитохимический анализ НСК СО и ПВ ядер гипоталамуса (по показателям экспрессии проапоптотического протеина р53) показал возрастание иммунопозитивных клеток преимущественно у крыс 4-й группы. Так у крыс 1-й группы (контроль) этот показатель составил 0,22±0,01 промилле (СО) и 0,24±0, (ПВ), а у крыс 4-й группы через 45 сут - 0,86±0,03 и 0,94±0,03 соответственно;

через 90 суток – 0,90±0,02 и 0,93±0,3;

через 135 сут – 0,95±0,01 и 0,89±0, промилле. С другой стороны отмечено подавление синтеза антиапоптотического белка bc12 в 2,3 раза на стадии 90 суток опыта у крыс той же группы. В своей совокупности можно сделать предположение, что воздействие на организм животных бензола и хрома может приводить к развитию «апоптотической доминанты» в нонапептидергических нейросекреторных центрах гипоталамуса.

При анализе цитологического состояния аденогипофиза через 45, 90 и суток эксперимента были отмечены признаки усиления его адренокортикотропной функции крыс трех опытных групп по сравнению с контролем. Вместе с тем, такая активация носила избыточный характер. Так секреторные гранулы расположены не только линейно по периферии клетки, но и внутри цитоплазмы. На стадии суток отмечены факты кринофагии, набухание митохондрий с разрушением крист, дискомплексации цитомембран, формирование крупных липосом, появление вакуолярных расширений эндоплазматического ретикулума (рис.4). Таким образом, бензол и хром вызывают ультраструктурные изменения адренокортикотропоцитов дегенеративного характера.

Б А В Рис.4 Кортикотропоцит аденогипофиза крысы в условиях комбинированного воздействия бензола и хрома на 90 день эксперимента: А- секреторные гранулы;

Б– эндоплазматический ретикулум;

В – набухание и дискомплектация митохондрий Гистологическое изучение надпочечников у крыс 2-й и 3-й групп во все сроки наблюдений показало функциональную активизацию кортикотропоцитов, сочетающуюся с возрастанием протяженности пучковой зоны коры надпочечников. В то же время у крыс 4-й группы усиление секреторной деятельности кортикотропоцитов не только не сопровождалось адекватной реакцией коры надпочечников, но, напротив, отмечалось уменьшение протяженности пучковой зоны органа (рис.5).

Иными словами, будучи эффекторным звеном ГГАКС, надпочечники крыс, получавших смесь бензола и хрома, во все сроки наблюдений не проявили структурных особенностей, свидетельствующих об усилении их функционирования. Это может свидетельствовать либо о затруднении выведения кортикотропина из аденогипофиза в общий кровоток, либо о потере Рис.5 Протяженность зон коры надпочечников крыс Вистар при комбинированном воздействии бензола и хрома «чувствительности» кортикоцитами надпочечников к аденогипофизотропному влиянию, либо о сочетании обоих механизмов.

Определенный вклад в формирование подобных расстройств регуляторной системы вносит описанный нами феномен блокировки высвобождения адаптивных гипоталамических нонапептидов на уровне нейрогипофиза и срединного возвышения гипоталамуса, что лимитирует реализацию параденогипофизарного пути нейроэндокринной регуляции выработки кортикостероидов (Стадников А.А., 2001;

Стадников А.А., Бухарин О.В., 2012).

При структурно-функциональной характеристике тимуса у крыс трех опытных групп во все сроки наблюдений отмечен комплекс структурно функциональных изменений, свидетельствующий о статусе акцидентальной инволюции органа. Это проявлялось в выраженной клеточной реорганизации паренхимы и стромы, ультраструктурных повреждениях цитоплазматических компонентов, увеличении деструктивных форм тимоцитов, существенном снижении их числа в корковом веществе долек тимуса (рис.6), увеличении числа телец Гассаля и адипоцитов, фибриллогенезе стромы органа, реактивных изменениях сосудов микроциркуляции, снижении количества функционально специализированных ретикулоэпителиоцитов и их взаимодействий с Т лимфоцитами. Данные изменения со всей очевидностью приводят к функциональному расстройству центрального звена иммунной системы.

А Б Рис.6 Корковое вещество дольки тимуса контрольной крысы (А) и крысы 4-й группы через 90 дней эксперимента (Б) Фиксация: А - спирт-формол, Б - 10%раствор нейтрального формалина Окраска: А - периодат Шифф-реакция, Б - гематоксилин Майера и эозин Ув. об. 40, ок. Гистологическое изучение селезенки крыс трех опытных групп на 45-й, 90-й и 135-й день эксперимента показало выраженное полнокровие трабекулярных и пульпарных сосудов, а также увеличение размеров лимфоидных фолликулов.

Гиперпластическая реакция герминативных зон сочетается с накоплением в них плазмоцитов и макрофагов. Морфометрический анализ показал увеличение массы белой пульпы селезенки за счет возрастания территории В-зон (табл.2). На фоне активации плазмоцитарно-макрофагальных элементов в реактивных зонах регистрируются клетки с признаками кариопикноза и кариорексиса. Значимого возрастания Т-зависимых (периартериальных) зон не происходило. Данные изменения Т- и В-зон селезенки были особенно выражены при комбинированном воздействии хрома и бензола, а также нарастали к 135-му дню эксперимента. При этом в селезенке обнаруживались многочисленные сидерофаги в красной пульпе органа, что свидетельствует о высокой загруженности межклеточных структур селезенки гемосидерином, неуспевавшим элиминироваться.

Таблица Морфометрические показатели белой пульпы селезенки крыс Вистар (мкм) Группы Герминативный центр (В-зона) Периартериальные влагалища животных (Т-зона) 45 суток 90 суток 135 суток 45 суток 90 суток 135 суток 810,8±10,6 196,7±4, контроль 2 группа 910,7±7,3* 917,8±4,9* 1150,7±6,8* 190,6±4,1 192,6±3,7 201,6±4, 3 группа 892,6±8,7* 910,6±4,3* 1010,6±4,7* 181,6±3,6* 189,9±4,1 200,6±3, 4 группа 967,6±6,7* 998,7±5,1* 1231,7±7,7* 197,9±5,1 199,6±4,1 200,9±3, * - обозначены достоверные отличия (р 0,05) по отношению к контролю При структурно-функциональной оценке лимфатических узлов крыс 2-й, 3-й и 4-й групп во все сроки эксперимента было установлено увеличение размеров лимфатических узлов и резкое их полнокровие, приводящее к дискомплексации клеточных элементов. Ретикулоэндотелиальные клетки краевых, промежуточных и воротных синусов резко гипертрофируются и многие из них реорганизуются в макрофаги. Ультраструктурный анализ паракортикальной зоны выявил нарушения внутриклеточных компартментов ретикулярных клеток и лимфоцитов. Особенно это касалось дендритных клеток (интердигитирующих), их отростки утрачивались.

В цитоплазме регистрировались мелкие митохондрии с признаками разрушения крист, а также появлялись липосомы.

Иммуноцитохимические исследования показали, что воздействие хрома и бензола индуцирует программированную гибель тимоцитов и лимфоцитов в Т зонах селезенки (периартериальная муфта) и лимфатических узлах (паракортикальная зона) (рис.7). При этом апоптозные дискретные тельца не подвергаются фагоцитозу, а чаще всего находятся в окружении стромальных элементов, которые иногда формируют кистозные полости. Появление подобных апоптозных клеток и их группировок свидетельствует, скорее всего, о межклеточной индукции программированной клеточной гибели.

Рис.7 Содержание проапоптотического белка р53 в органах иммунной системы крыс Вистар при комбинированном воздействии хрома и бензола В своей совокупности полученные сведения свидетельствуют о понижении активности Т-лимфоцитов, что отражает, очевидно, состояние Т-клеточного иммунодефицита. Вероятно, это происходит на фоне дисфункции иммуноцитов (в частности В-клеточные зоны проявляли морфологические признаки гиперреактивности). Таким образом, развивающаяся морфологическая картина у экспериментальных животных свидетельствует о содружественной реактивности центральных и периферических органов иммуногенеза, что проявляется лимфоретикулярной гиперплазией и плазмоцитарно-макрофагальной трансформацией лимфатических узлов и селезенки.

Исследование влияния бензола, хрома и их смеси на количество лейкоцитов в крови крыс Вистар показало их снижение у крыс 2-ой и 4-ой группы на 90-й день соответственно на 37,6% и на 31,7%. Относительное и, особенно, абсолютное число лимфоцитов имело тенденцию к снижению и было наиболее выраженным у животных 4-й группы на 45-й, 90-й и 135-й день (соответственно 6,05±0,41;

5,46±0,42;

7,0±0,02 против 8,49±0,003109 в контроле).

При исследовании фагоцитарной и метаболической активности сегментоядерных нейтрофилов периферической крови крыс установлено снижение фагоцитарной активности у животных трех опытных групп, метаболической – у крыс 3-ей группы на 90-й и 135-й день эксперимента. При анализе изменений фагоцитарной и метаболической активности перитонеальных макрофагов крыс показано снижение фагоцитарной активности у крыс 2-й и 4-й групп, метаболической – у крыс 3-ей группы на 135-й день наблюдений.

Установлено снижение массы тимуса и количества тимоцитов крыс 3-ей группы на 135 сутки, 2-ой и 4-ой группы - во все сроки наблюдений (рис.8).

Рис 8. Влияние бензола, хрома и их смеси на количество клеток тимуса крыс Вистар Масса селезенки и количество клеток в ней также снижались у крыс 2-й и 4-й групп во все сроки наблюдений, у крыс 3-й группы – на 135-й день эксперимента (рис.9).

При исследовании влияния хрома и бензола на клеточный состав селезенки крыс Вистар нами установлено снижение как абсолютного, так и относительного количества клеток лимфоидного ряда (рис.10), абсолютного на 90-й день, а на 135 й и относительного количества плазматических клеток и увеличение относительного содержания клеток эритроидного ряда у крыс трех опытных групп.

Установлено снижение абсолютного количества CD3-лимфоцитов у крыс 2-й группы на 45-й, 90-й и 135-й день, 3-й группы – на 90-й и 135-й день, 4-й группы – на 90-й день эксперимента. Абсолютное количество CD4-лимфоцитов снижалось у крыс 2-й и 4-й группы с максимумом на 90-й день, 3-й группы – на 135-й день.

Абсолютное количество CD8-лимфоцитов селезенки крыс трех опытных групп было снижено на 90-й день.

Рис.9 Влияние бензола, хрома и их смеси на количество клеток селезенки крыс Вистар Рис.10 Влияние бензола, хрома и их смеси на количество лимфоидных клеток селезенки крыс Вистар Влияние исследуемых химических веществ на костный мозг проявлялось (на 45-й, 90-й и 135-й дни) в снижении уровня миелоидного ряда, нейтрофилов и, напротив, в увеличении на протяжении всех сроков наблюдения количества лимфоидных клеток (рис.11), а также содержания эритроидных клеток (на 135-й день).

Рис.11 Влияние бензола, хрома и их смеси на относительное количество клеток костного мозга крыс Вистар Исследование влияния бензола, хрома и их смеси на гуморальный иммунный ответ показало снижение числа антителообразующих клеток (АОК), титра антител к эритроцитам барана (ЭБ) и уровня лизоцима у крыс трех опытных групп во все сроки наблюдений. Установлено увеличение индуцированной продукции спленоцитами крыс уровня ИЛ-4 трех опытных групп во все сроки наблюдений (рис.12) и понижение уровня ИЛ-6 у крыс 2-ой группы на 45-й день (на 58%) и 135-й день (на 53,6%), 3-ей группы - на 135 сутки (на 12,2%) и 4-ой группы на сутки (на 66,3%). Содержание ИФН и ИЛ-10 существенно не изменялось.

Рис.12 Влияние бензола, хрома и их смеси на уровень ИЛ-4 крыс Вистар Таким образом, анализ морфофункциональных изменений ГГАКС и иммунной систем крыс Вистар при длительном пероральном воздействии бензола и хрома позволил выделить три основных момента:

- комбинированное воздействие хрома и бензола оказывает потенцирующий (по сравнению с изолированным влиянием) негативный эффект на функцию ГГАКС, проявляющийся активизацией ее секреторной деятельности на фоне блокирования высвобождения гипоталамических нейропептидов на уровне нейрогипофиза и ультраструктурных повреждений нейросекреторных клеток гипоталамуса, аденоцитов гипофиза и клеток коркового вещества надпочечников;

- воздействие бензола, хрома и их комбинации приводит к структурно функциональным изменениям, свидетельствующим о статусе акцидентальной инволюции, лимфоретикулярной гиперплазии и плазмоцитарно-макрофагальной трансформации лимфатических узлов и селезенки, индуцирует программированную гибель тимоцитов и лимфоцитов в Т-зонах селезенки и лимфатических узлах.

- бензол, хром и их комбинация угнетают клеточный (количество лейкоцитов, лимфоцитов, фагоцитарные показатели в периферической крови, число спленоцитов, CD3-, CD4-, CD8-лимфоцитов селезенки, миелокариоцитов) и гуморальный иммунный ответ (число АОК в селезенке, титр антител к Т зависимому антигену, уровень лизоцима и содержание ИЛ-6).

Выводы 1. Бензол и хром при изолированном длительном воздействии вызывают функциональную активизацию нонапептидэргических нейронов гипоталамуса и кортикотропоцитов аденогипофиза стрессорного характера.

2. Комбинированное воздействие исследованных химических факторов в течение 135 суток, вызывая активизацию секреторной деятельности ГГАКС, блокирует высвобождение гипоталамических нейропептидов на уровне нейрогипофиза, что, в свою очередь, ведет к лимитированию функциональной деятельности адренокортикотропоцитов гипофиза и кортикоцитов надпочечников.

3. Длительное комбинированное действие бензола и хрома на органы иммунной системы крыс Вистар проявляется в снижении массы тимуса и числа тимоцитов, в том числе за счет индукции программированной гибели тимоцитов, в формировании комплекса структурно-функциональных изменений тимуса, свидетельствующих об акцидентальной инволюции органа (выраженная клеточная реорганизация паренхимы и стромы, увеличение деструктивных форм тимоцитов, существенное снижение их числа в корковом веществе долек тимуса, снижение количества функционально специализированных ретикулоэпителиоцитов), а также в усилении апоптоза лимфоцитов в Т-зонах селезенки и лимфатических узлах (по данным иммуноцитохимического исследования).

4. Особенность влияния бензола, хрома и их смеси при длительном воздействии на периферическую кровь проявляется в снижении количества лейкоцитов, лимфоцитов, фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса.

5. Бензол, хром и их смесь вызывают морфофункциональные изменения в селезенке, характеризующиеся снижением ее массы и количества CD3+-, CD4+-, CD8+-лимфоцитов), спленоцитов (включая клеток лимфоидного ряда и плазматических клеток.

6. Влияние исследуемых химических веществ на костный мозг проявлялось (на 45-й, 90-й и 135-й дни) в снижении уровня клеток миелоидного ряда, нейтрофилов и, напротив, в увеличении на протяжении всех сроков наблюдения количества лимфоидных клеток, а также содержания эритроидных клеток (на 135-й день).

7. Воздействие бензола, хрома и их смеси на гуморальный иммунный ответ проявляется снижением абсолютного числа АОК, титра антител к ЭБ, уровня лизоцима и уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6 и увеличением уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-4 у крыс на протяжении 45 и 90 суток наблюдения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК при Минобрнауки РФ:

1. Ермолина Е.В. Особенности биологического действия бихромата калия и бензола на крыс Вистар/ И.В. Михайлова, А.И. Смолягин, Е.В. Ермолина, М.В. Боев, В.М. Боев// Вестник ОГУ. - 2005. - №12. – С. 85 – 89.

2. Ермолина Е.В. Показатели иммунного и микроэлементарного статуса у крыс Вистар под влиянием бихромата калия, бензола и их солей/ И.В. Михайлова, А.И. Смолягин, Е.В. Ермолина// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - Т.3(1). - С. 158-160.

Ермолина Е.В. Влияние соединений хрома и бензола на клеточные 3.

показатели иммунной системы и содержание микроэлементов у крыс/ А.И.

Смолягин, И.В. Михайлова, Е.В. Ермолина, Л.А. Пушкарева// Гигиена и санитария. – 2009. - №4. - С. 75-77.

4. Ермолина Е.В. Влияние соединений хрома и бензола на факторы естественной резистентности у экспериментальных животных// А.И.

Смолягин, Е.В. Ермолина, Л.А. Пушкарева, И.В. Михайлова// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1. - С. 72-73.

5. Ермолина Е.В. Морфологические изменения гипоталамо-гипофизарной адренокортикальной и иммунной систем крыс при комбинированном действии хрома и бензола/ Е.В. Ермолина//Морфология. – 2011. - №5. - С. 84-85.

6. Ермолина Е.В. Влияние бензола и хрома на пролиферативную активность клеток селезенки экспериментальных животных/ А.И. Смолягин, И.В.

Михайлова, Е.В. Ермолина// Цитокины и воспаление. – 2011. – Т. 10. - № 3. С. 122-124.

7. Ермолина Е.В. Влияние бензола и хрома на иммунологические показатели крыс Вистар/ Е.В. Ермолина, И.В. Михайлова// Вестник ОГУ. – 2011. №16(135). - С. 274-276.

8. Ермолина Е.В. Влияние ксенобиотиков на апоптоз спленоцитов крыс Вистар/ Е.В. Ермолина, А.А. Стадников, И.В. Михайлова// Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. – 2012. - №4 (41). - С. 34-35.

9. Ермолина Е.В. Морфологические особенности органов иммунной системы в условиях воздействия хрома и бензола/ Е.В. Ермолина, А.А.Стадников, А.И.

Смолягин// Гигиена и Санитария. – 2012. - №3. - С. 69-71.

10. Ермолина Е.В. Исследование длительного комбинированного влияния бензола и хрома на морфофункциональное состояние нейроэндокринной и иммунной систем крыс Вистар/ Е.В. Ермолина, А.А. Стадников, И.В.

Михайлова, А.И. Смолягин// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2012. - Т.14. - №5(2). - С. 444-447.

11. Ермолина Е.В. Экспериментальное исследование влияние бензола и хрома на иммунную систему организма/ А.И. Смолягин, И.В. Михайлова, Е.В.

Ермолина, С.И. Красиков, В.М. Боев// Иммунология. – 2013. - Т.34. - №1. - С.

57-60.

Статьи и материалы конференций:

1. Ермолина Е.В. Влияние бихромата калия и бензола на иммунный и микроэлементный статус крыс/ И.В. Михайлова, А.И. Смолягин, В.М. Боев, Е.В. Ермолина, А.Р. Сарлыбаева//Иммунология Урала. - 2005. - № 1(4). -С. 19 20.

2. Ермолина Е.В. Особенности клеточного иммунитета у крыс под влиянием неорганических и органических веществ, содержащихся в питьевой воде/ И.В.

Михайлова, Е.С. Кислинская, Л.А. Каштанова, А.В. Чеснокова, Е.В. Ермолина// Российский Иммунологический Журнал, 2008.-Т. 2(11).-№2-3.- С.180.

3. Ермолина Е.В. Изменение клеточного состава крови селезенки и костного мозга под влиянием бихромата калия и бензола, растворенных в воде/Е.В.

Ермолина, Л.А. Пушкарева, Р.И. Галлямова, Л.А. Айжанова// Информационный архив (медицина, биология, образование). – 2009. –Т. 3. №3. - С. 57-59.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.