авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Влияние хорионического гонадотропина на пролиферацию и апоптоз клеток у крыс-носителей лимфосаркомы плисса

На правах рукописи

ФИЛАТОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА

ПРОЛИФЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ КЛЕТОК У КРЫС-НОСИТЕЛЕЙ

ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА

03.03.01 – физиология

03.03.03 - иммунология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Нижний Новгород

2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор В.В. Новиков Доктор медицинских наук, профессор И.М. Солопаева

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Смирнов В.П.

Доктор медицинских наук, профессор Курников Г.Ю.

Ведущая организация:

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, РАМН, г. Москва

Защита состоится «»2010 года в «» часов на заседании диссертационного совета Д. 212.166.15 Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 1, биологический факультет e-mail: kfg@bio.unn.ru тел. 8(831)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского Автореферат разослан «_»2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. биол. наук С.В. Копылова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Хорионический гонадотропин (ХГ) – гетеродимерный гликопротеид массой 46 kД, который принадлежит к семейству гонадотропных гормонов, включающему также соматомаммотропин, фолликуло-стимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон (ЛГ). Гликопротеидные гормоны состоят из консервативной, общей для всех -субъединицы и уникальной субъединицы, которая определяет биологическую специфичность гормона.

Субъединицы в гетеродимере связаны нековалентно (Кольман Я., Рём К.-Г., 2000;

Miller-Lindholm A.K. et al., 1999).

Аминокислотный состав -субъединиц ХГ и ЛГ сходен на 83%, они проявляют большую степень гомологии. Структурное подобие -субъединиц этих гормонов отражает их функциональную схожесть: они связываются с одним рецептором (ЛГ/ХГ-рецептор) и проявляют похожие свойства (Lapthorn A.J. et al., 1994;

Themmen A.P.N., Huhtaniemi I.T., 2000). субъединица ХГ высококонсервативна в эволюционном плане, что проявляется в высоком сходстве ее структур у разных видов млекопитающих и отсутчтвии видоспецифического действия гормона (Adam J. et al., 2007;

Funaro A. et al., 2003).

Хорионический гонадотропин синтезируется и функционирует в хорионе трофобласта, плаценте, в тканях плода (Huhtaniemi I.T. et al., 1975), многих тканях детей и взрослых обоих полов (Borkowski A., Muguardt C., 1979;

Braunstein C.D. et al., 1979;

Yochimoto J. et al., 1979). Гормон в очень больших количествах, на несколько порядков больше, чем в норме, обнаруживается во время беременности в организме матери не только в крови и моче, но и во всех других тканях и жидкостях. Этому гормону отводят особую роль в поддержании беременности и развитии тканей зародыша. Он предотвращает регрессию желтого тела, обеспечивает достаточно высокий уровень прогестерона во время беременности и обладает депрессивным эффектом на продукцию антител организмом матери (Younger J.B. et. al., 1969). При этом гормон способен также оказывать влияние и на процессы жизнедеятельности зрелого организма, например, на процессы регенерации тканей и органов, на иммунную систему (Солопаева И.М., 2007;

Khil L.U. et al., 2007;

Russo I.H., Russo J., 2007;

Wan H. еt al., 2008).

На состояние популяции клеток оказывают влияние два процесса:

пролиферация и апоптоз. Пролиферация приводит к увеличению общего количества клеток организма, а апоптотические процессы регулируют численность клеток, приводя к их элиминации. При этом оба процесса характерны как для нормальных клеток организма, так и для злокачественно трансформированных, однако регуляция пролиферации и апоптоза в данных клетках различается.

Показано, что ХГ усиливает регенерацию нормальных органов и тканей, стимулируя в них пролиферацию клеток (Солопаева И.М., 2007).

Обнаружено влияние ХГ на пролиферацию и апотоз злокачественно трансформированных клеток. В исследованиях разных авторов гормон угнетал размножение опухолевых клеток при саркоме Капоши, плоскоклеточном раке легкого, раке простаты, острой миелоидной лейкемии (Говалло В.И., Дубровский А.В., 1981;

Мкртчян Л.Н. и др.,1990;

Feldman T.S.

et al., 1998;

Gill P.S. et al., 1996;

Hamed H. et al., 2008;

Pfeffer U. et al., 2002;

Samaniego F. et al., 1999;

), но стимулировал рост опухолевых клеток при зпителиальных карциномах, таких как цервикальной карциноме и хориокарциноме (Hamada A.L. et al., 2005;

Iles R.K., 2007;

Li D. et al., 2008;

).

В связи с неоднозначностью данных о действии ХГ на опухолевый рост и организм-опухоленоситель, мы провели экспериментальное изучение этого вопроса с использованием модельной системы, представляющей собой крыс носителей лимфосаркомы Плисса. При этом проводилось изучение действия хорионического гонадотропина на апоптоз и пролиферацию не только в злокачественно трансформированных клетках лимфосаркомы Плисса, но и сравнение его с воздействием, оказываемым гормоном на нормальные клетки организма, в качестве которых выступали, в частности, мононуклеарные клетки крови животных-опухоленосителей.

Цель и задачи исследования Целью данной работы являлось изучение влияния ХГ на апоптотическую активность и показатели роста злокачественно трансформированных опухолевых клеток и нормальных мононуклеарных клеток периферической крови на модели крыс-носителей лимфосаркомы Плисса.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать наличие низкомолекулярной фрагментации ДНК мононуклеарных клеток периферической крови и опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса у крыс при воздействии различных доз ХГ в зависимости от схемы его введения и срока развития новообразования.

2. Определить характер влияния различных доз и способов введения ХГ на морфологические характеристики опухолевых клеток, а также морфологическое строение опухоли лимфосаркома Плисса.

3. Выявить характер влияния ХГ на митотическую активность опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса в зависимости от дозы гормона, сроков его введения и количества перевиваемых опухолевых клеток.

4. Определить характер влияния различных доз и сроков введения ХГ на размер опухоли лимфосаркома Плисса на различные сутки развития новообразования.

5. Исследовать влияние ХГ на относительное содержание RT-Ia+ и СD4+ клеток в периферической крови крыс-опухоленосителей в зависимости от дозы гормона, схемы его введения и сроков наблюдения.

Научная новизна Впервые показано дозозависимое действие ХГ на показатели роста злокачественно трансформированных клеток лимфосаркомы Плисса и нормальных мононуклеарных клеток крыс-опухоленосителей.

Установлено разнонаправленное действие, оказываемое гормоном на параметры роста здоровых и злокачественно трансформированных клеток.

Показано, что ХГ способствует активации апоптотических процессов в опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса, снижению их пролиферативной активности, замедлению темпов роста опухоли, а также нарушению ангиогенеза в опухоли. В то же время показано, что ХГ не является индутором апоптотических процессов в мононуклеарных клетках периферической крови и при этом нормализует измененное вследствие развития лимфосаркомы Плисса относительное содержание RT-Ia+ и СD4+ клеток в периферической крови крыс-опухоленосителей.

Было установлено, что наиболее эффективно действие гормона проявляется на ранних сроках развития новообразования.

Практическая значимость Полученные в данной работе данные дополняют современные представления о влиянии ХГ на показатели роста злокачественно трансформированных опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и нормальных мононуклеарных клеток периферической крови крыс при опухоленосительстве.

Обнаруженные в ходе выполнения работы свойства ХГ оказывать комплексное воздействие на опухоль лимфосаркому Плисса, а также корректировать нарушения иммунной системы, возникшие вследствие онкоиммунодефицита, позволяют рассматривать этот гормон как потенциальный препарат для использования в комплексной противоопухолевой терапии.

Положения, выносимые на защиту 1. ХГ оказывает влияние на апоптотические процессы, деление и морфологическое строение опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса, а также на относительное содержание RT-Ia+ и СD4+ мононуклеарных клеток периферической крови крыс при лимфосаркоме Плисса.

2. ХГ оказывает разнонаправленный эффект на апоптотические процессы и процессы деления злокачественно трансформированных опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и здоровых СD4+ клеток периферической крови крыс.

3. Действие ХГ является дозозависимым и в наибольшей степени проявляется на ранних стадиях развития лимфосаркомы Плисса, однако не зависит от способа введения гормона.

Апробация работы Основные материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на V Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 21-22 марта г.);

Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология»

(Москва, 26-27 февраля 2008 г.);

XIII Нижегородской сессии молодых ученых, секции естественнонаучных дисциплин (Нижегородская обл., 20- апреля 2008 г.);

Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20 летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 15-17 июня 2009 г.);

IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа в объеме 145 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов.

Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 21 таблицами.

Библиографический указатель включает 151 источков литературы ( отечественных и 83 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Изучение хорионического гонадотропина как индуктора апоптотических процессов, размножения и развития нормальных и злокачественно трансформированных клеток проводили на экспериментальной модели неоплазии. В работе использовали перевиваемый опухолевый штамм “Лимфосаркома Плисса”, полученный из Российского онкологического научного центра им. академика Н.Н. Блохина, РАМН. В качестве подопытных животных использовали самцов белых беспородных крыс массой 180-200 грамм, которым подкожно вводили штамм опухолевых клеток в различном объеме, но не менее 0,3 мл, в правый бок. Забор материала для исследования проводили на различных сроках развития новообразования. Материалом для исследований служили мононуклеарные клетки периферической крови крыс и образцы опухоли.

При постановке экспериментов использовали коммерческий препарат «Гонадотропин хорионический» российского производства, применение которого на животной модели оправданно вследствие отсутствия видоспецифического действия на биологические процессы, протекающие в организме млекопитающих (Funaro A. et al., 2003;

Adam J. et al., 2007;

Солопаева И.М. и др., 1980;

Солопаева И.М., 2007).

Для выделения из клеток тотальной нуклеиновой кислоты использовали лизирующий раствор в объеме 200 мкл, содержащий 47,2 % гуанидина, 0,16 % цитрата натрия, 0,5 % Tween 80 и 2 % -меркаптоэтанола.

Для разрушения клеток проводили троекратное замораживание образцов при -20оС с последующим оттаиванием при комнатной температуре. Затем к образцам добавляли по 100 мкл ацетата натрия рН 7,0, 250 мкл фенола и такое же количество хлороформа. Полученную смесь центрифугировали минут при 15 тыс. об/мин. 300 мкл полученной водной фазы переносили в изопропанол, выдерживали при температуре -20оС в течение 30 минут, осадок отделяли центрифугированием. Выделенную нуклеиновую кислоту промывали 75%-ным этиловым спиртом и высушивали при комнатной температуре. Электрофоретический анализ проводили в 1,5%-ной агарозе фирмы «Serva» в трис-ацетатном буферном растворе (Sambrook J. et al., 1989). Для визуализации результатов использовали систему «ViTran»

(«Biocom», Москва). Признаки упорядоченной фрагментации ДНК расценивали как доказательство наличия апоптотических процессов в исследуемых образцах.

Популяционный состав мононуклеарных клеток периферической крови крыс оценивали методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител ИКО-101 против CD4 антигена крыс и ИКО- против антигенов II класса главного комплекса системы гистосовместимости крыс (Сандова О.М. и др., 1993). Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови крыс в градиенте фикол-верографина плотностью 1,068-1,069.

Динамику роста опухоли определяли, оценивая площадь поперечного сечения опухоли. Митотическую активность определяли по формуле: МИ = количество митозов х 1000 / общее количество просмотренных клеток. В каждом препарате в среднем просматривали от сорока до пятидесяти тысяч клеток. Митотический индекс выражали в промиллях (‰), то есть количество митозов на одну тысячу опухолевых клеток.

Препараты для гистологических исследований готовили в соответствии с рекомендациями Волковой О.В. и Елецкого Ю.К. (1982) и использовали для изучения морфологического строения опухолевой ткани и определения морфологических признаков апоптоза Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы «Biostat», применяли коэффициент Стьюдента.

Результаты и их обсуждение Исследование проапоптотических свойств хорионического гонадотропина При изучении проапоптотических свойств хорионического гонадотропина животным с привитой лимфосаркомой Плисса вводили подкожно или в опухоль гормон в разных дозах на разных сроках развития новообразования.

Гормон в дозе по 75 или 150 ЕД ХГ вводили дважды: на третьи и седьмые сутки развития новообразования. На пятые сутки после перевивки опухоли обнаруживалась низкомолекулярная фрагментация хромосомной ДНК у животных, которым был введен гормон в дозе 75 ЕД (рис. 1А). В опухолевых клетках животных контрольной группы и животных, которым вводили ХГч в дозе 150 ЕД, на пятые сутки после перевивки лимфосаркомы Плисса признаков упорядоченной фрагментации хромосомной ДНК не было выявлено. Однако на десятые сутки развития лимфосаркомы Плисса фрагментация ДНК опухолевых клеток обнаруживалась у всех животных, которым вводили ХГ (рис. 1Б). В образцах опухолевых клеток животных контрольной группы, не получавших гормона, упорядоченная фрагментация 150 75 150 А Б Рис. 1. Электрофореграмма области фрагментации хромосомной ДНК клеток лимфосаркомы Плисса животных-опухоленосителей, получавших по 150 и 75 ЕД ХГ, соответственно. А – пятые сутки, Б – десятые сутки развития новообразования.

отсутствовала. Влияния способа введения ХГ (подкожно или в опухоль) на его проапоптотическую активность не обнаружили.

Таким образом, ХГ в дозах 75 ЕД и 150 ЕД стимулирует апоптоз в опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса у крыс. При этом действие гормона в дозе 75 ЕД проявлялось быстрее и не зависело от способа введения гормона в организм животного.

Также исследовали влияние доз ХГ, равных 25, 50 и 75 ЕД, на индукцию апоптоза в клетках лимфосаркомы Плисса. Гормон вводили дважды, на третьи и седьмые сутки развития новообразования. На ранних сроках развития новообразования (четвертые и пятые сутки после перевивки опухоли) упорядоченная фрагментация хромосомной ДНК опухолевых клеток была выявлена только у животных, получавших ХГ в дозе 75 ЕД (рис.

2 А). С увеличением срока развития лимфосаркомы Плисса (восьмые и одиннадцатые сутки) признаки упорядоченной фрагментации ДНК опухолевых клеток наблюдались на электрофореграммах образцов ДНК, полученных от животных всех исследуемых групп (рис. 2 Б). Как и в первой серии экспериментов, ХГ в дозе 75 ЕД вызывал проапоптотический эффект раньше, чем в меньших дозах, что указывает на дозозависимое действие гормона.

Исследовали также проапоптотическое влияние ХГ в дозах 150 и 75 ЕД на мононуклеарные клетки периферической крови животных-носителей лимфосаркомы Плисса. Гормон вводили дважды на третьи и седьмые сутки развития опухоли. На пятые и на десятые сутки развития новообразования упорядоченной фрагментация ДНК мононуклеарных клеток выявлено не было. Это указывает на неспособность ХГ в дозах 150 и 75 ЕД индуцировать апоптоз в клетках крови животных-опухоленосителей на исследованных нами сроках. У животных-опухоленосителей, получавших ХГ в дозах 25, и 75 ЕД, признаков апоптоза также не было вывлено. Можно заключить, что использованный нами режим введения ХГ не вызывает апоптоза мононуклеарных клеток крови, но приводит у животных опухоленосителей к выраженной фрагментации ДНК клеток лимфосаркомы Плисса.

В литературе представлены данные других авторов о влиянии ХГ на апоптотические процессы в опухолевых клетках. Было выявлено, что ХГ влияет на рост и развитие некоторых злокачественных новообразований главным образом за счет регуляции апоптоза и ангиогенеза в опухоли (Pfeffer U. et al., 2002. Это соответствует полученным нами данным о проапоптотическом влиянии гормона на опухолевые клетки у крыс носителей лимфосаркомы Плисса.

Анализ представленных результатов и данных литературы позволяют заключить, что ХГ может оказывать свое действие на клетки лимфосаркомы Плисса путем взаимодействия как через собственные рецепторы, так и через рецепторы факторов роста семейства CKGF (Cystine Knot Growth Factor). К семейству CKGF относят белки, содержащие в своей структуре так К 25 50 А К 25 50 Б Рис. 2. Электрофореграмма области фрагментации хромосомной ДНК клеток лимфосаркомы Плисса животных-опухоленосителей, не получавших ХГ, и получавших по 25, 50 и 75 ЕД ХГ, соответственно. А – пятые сутки, Б – одиннадцатые сутки развития новообразования.

называемый «цистиновый узел», ответственный за нековалентное объединение белковых субъединиц. Один из таких белков, TGF (трансформирующий фактор роста-бета) обладает бифункциональным свойством регулировать апоптоз в опухолевых клетках: стимулирует программируемую клеточную смерть в карциномах, но подавляет в саркомах, лимфосаркомах и прочих опухолях мезенхимального происхождения. Основной путь регуляции клеточного цикла при взаимодействии рецептора TGF- со своим лигандом осуществляется при участии SMAD-белков. В норме их фосфорилирование приводит к формированию комплексов с различными факторами транскрипции, остановке клетки в G1 стадии клеточного цикла и последующей дифференцировке или вхождению в апоптоз. Однако в опухолевых клетках мезенхимного происхождения зачастую сигнальные пути TGF- повреждены и часто встречаются мутации в генах, кодирующих сигнальные белки (SMAD4). Это приводит к неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток, подавлению апоптоза, активной миграции опухолевых клеток, синтезу молекул адгезии и васкуляризации опухоли вследствие стимуляции ангиогенеза (Blobe G.C., Schiemann W.P., Lodish H.F., 2000;

Nam J.S. et al., 2008).

Было выявлено структурное подобие молекулы ХГ и молекул Гомология последовательностей, составляющих данные белки и молекулу гормона, слабая, однако и в структуре гормона присутствует цистиновый узел. Вследствие структурного подобия белков семейства CKGF и ХГ возможно перекрестное связывание мономера ХГ с рецептором TGF-, расположенным на мембране опухолевых клеток, что приводит к конкурентному ингибированию рецептора (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000;

McDonald N.Q., Hendrickson W.A., 1993;

Sun P.D., Davies D.R., 1995). Таким образом, ХГ способен «снимать» отрицательный эффект, оказываемый TGF на опухолевые клетки, подавлять их пролиферацию, васкуляризацию и препятствовать метастазированию.

Одновременно ХГ способен влиять на опухолевые клетки через собственный рецептор. Получены данные о повышении апоптотического индекса в клетках опухоли молочной железы при введении ХГ (Russo I.H., Russo J., 2007;

Lopez D. et al., 2008). При этом в клетках наблюдается повышение экспрессии генов проапоптотических факторов (р53, с-myc, ICE, bcl-XS), в то время как экспрессия генов факторов, подавляющих апоптоз, значительно не изменяется, что облегчает активацию апоптоза (Mazumdar M.

et al., 2003).

Можно заключить, что выявленная нами индукция апоптоза в клетках лимфосаркомы Плисса при воздействии ХГ обусловлена его влиянием на экспрессию проапоптотических факторов, как путем активации собственных рецепторов, так и путем ингибирования активации рецепторов ростовых факторов.

Влияние хорионического гонадотропина на морфологическую структуру лимфосаркомы Плисса Исследовали влияние ХГ на морфологическое строение опухоли в дозах 150 и 75 ЕД, вводимых подкожно или в опухоль. Гормон вводили дважды – на третьи и седьмые сутки развития лимфосаркомы Плисса. На десятые сутки после перевивки лимфосаркомы Плисса животным, не получавшим ХГ, в препаратах опухолевой ткани, взятой от животных контрольной группы, наблюдались все морфологические признаки опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса. Клетки опухоли, подверженные апоптозу, либо совсем не встречались на препарате, либо были представлены в незначительном или даже единичном количестве (рис. 3 А). На препаратах опухолевой ткани животных, которым проводили инъекции хорионического гонадотропина, значительное количество клеток обладало морфологическими признаками апоптоза. Наблюдался дозозависимый эффект: по сравнению с опухолевой тканью крыс, получавших препарат в дозе 150 ЕД, опухолевая ткань животных, которым вводили гормон в дозе ЕД, характеризовалась значительно большей площадью, занимаемой подвергающимися апоптозу клетками (рис. 3 Б). Мы объясняем этот факт тем, что доза ХГ 75 ЕД оказывала проапоптотический эффект раньше, чем доза 150 ЕД.

Полученные данные подтверждают приведенные выше результаты, свидетельствующие о более раннем и более эффективном проапоптотическом действии гормона ХГ в дозе 75 ЕД по сравнению с дозой 150 ЕД. Различий в действии ХГ в зависимости от способа введения обнаружено не было.

Также при изучении морфологических изменений в ткани лимфосаркомы Плисса после введения ХГ нами были обнаружены в большем количестве, чем в опухолевой ткани животных контрольной группы, множественные кровоизлияния разной величины, которые были результатом повреждения сосудистой стенки в новообразовании. Это свидетельствует о способности гормона приводить к значительному нарушению кровоснабжения опухолевой ткани. При этом, в регенерирующей ткани ряда органов после стимуляции регенерации ХГ таких явлений не было обнаружено (Солопаева И.М., 2007). Кроме того, интенсивное восстановление ткани без сопутствующего усиления кровоснабжения невозможно. Следовательно, присущая гормону способность индуцировать ангиогенез (Zygmun M. et al., 2002) в злокачественных опухолях не проявляется. Мы полагаем, что данный эффект может являться следствием конкурентного ингибирования рецепторов TGF- при связывании его с гормоном. Подавление стимуляции ангиогенеза и васкуляризации опухолевой ткани, которое является следствием воздействия TGF- на злокачественную опухолевую ткань, выражается в том, что под влиянием ХГ наблюдается торможение пролиферации сосудов и разрушение сосудистых стенок.

А Б Рис. 3. Препараты ткани лимфосаркомы Плисса (увеличение 90 х 2,5 х 10): А – животных, не получавших ХГ, толстыми линиями указаны опухолевые клетки;

Б – животных, дважды получавших по 75 ЕД ХГ, тонкими линиями указаны апоптотирующие клетки опухоли.

Влияние хорионического гонадотропина на митотическую активность клеток лимфосаркомы Плисса Исследование митотической активности показало, что на десятый день развития новообразования количество митотически делящихся клеток под влиянием ХГ, введённого в дозе 150 ЕД до или после перевивки 1 мл взвеси опухолевых клеток, было статистически значимо ниже в 2,3 и 2,0 раза, соответственно, по сравнению с количеством митотически делящихся клеток в опухолях животных контрольной группы (рис. 4, серия 1). Разные сроки введения гормона (за сутки до перевивки опухоли или на третьи сутки ее развития) не влияли на уровень снижения митотического индекса в клетках лимфосаркомы Плисса при введении 150 ЕД ХГ. Митотический индекс в опухолевых клетках животных, получавших 1000 ЕД ХГ за сутки до перевивки новообразования, оказался статистически значимо выше, чем у животных контрольной группы. У животных, получавших гормон в дозе 1000 ЕД на третьи сутки развития опухоли, количество митозов в клетках новообразований достоверно не отличалось от количества митотически делящихся клеток в опухолях животных, которые ХГ не получали (рис. 4, серия 1).

При инокуляции животным в три раза меньшего количества опухолевых клеток были получены сходные результаты. На 10 сутки развития опухоли количество митотически делящихся клеток лимфосаркомы Плисса у животных второй группы, получавших 150 ЕД ХГ, было достоверно снижено также в 2,2 раза по сравнению с данным показателем у контрольных животных (рис. 4, серия 2).

Было обнаружено более выраженное влияние меньшей дозы гормона на количество митозов в опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса.

Выявлено достоверное торможение митотической активности опухолевых клеток под влиянием 150 ЕД ХГ в 2,1 раза по сравнению с контролем, тогда как при введении животным ХГ в дозе 75 ЕД уровень митотической активности опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса достоверно снижался в 3,8 раза относительно данного показателя у животных контрольной группы (рис. 4, серия 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ в разных дозах и при разных схемах введения тормозит митотическую активность опухолевых клеток. При этом доза ХГ 75 ЕД оказалась самой эффективной в отношении снижения пролиферативной активности опухолевых клеток.

Группы животных:

Контрольная;

животным с опухолью не вводили ХГЧ.

Животные получали по 150 ЕД ХГ за сутки до перевивки опухоли.

Животные получали по 150 ЕД ХГ на третьи сутки после перевивки опухоли.

Животные получали по 1000 ЕД ХГ за сутки до перевивки опухоли.

Животные получали по 1000 ЕД ХГ на третьи сутки после перевивки опухоли.

Животные получали по ЕД ХГ на третьи сутки после перевивки опухоли.

Рисунок 4. Влияние ХГ на митотическую активность опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса.

* - p 0,05 – статистически значимые отличия относительно контрольных групп животных Примечание: в каждой серии опытов изменение митотического индекса опухолевых клеток подсчитано относительно митотического индекса контрольной группы, который принят за единицу Связывание ХГ и ЛГ/ХГ-рецептора приводит к трансдукции сигнала, осуществляемой преимущественно через цАМФ и включает в себя активацию протеинкиназы А (Narayan et al., 2002). Вероятно, с помощью протеинкиназы А происходит подавление фосфорилирования, распад фактора IkBa, подавление синтеза MAP и JN-киназ в опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса, что в итоге приводит к снижению активности транскрипционных факторов NF-kB и AP-1 и к подавлению пролиферации опухолевых клеток, что ранее было показано на различных моделях in vitro (Manna S.K. et al., 2000). Приведенные механизмы действия гормона объясняют способность ХГ тормозить митотическое деление опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса.

Влияние хорионического гонадотропина на темпы роста лимфосаркомы Плисса Животные были разделены на экспериментальные группы в соответствии с таблицей 1. При изучении влияния доз ХГ 150 и 1000 ЕД на темпы роста опухоли на пятые сутки после ее перевивки у животных, получавших 150 ЕД ХГ за сутки до перевивки опухоли, площадь поперечного сечения новообразования была достоверно меньше в 1,3 раза, а у животных, которым вводили по 150 ЕД ХГ на третьи сутки после перевивки лимфосаркомы Плисса - в 1,2 раза по сравнению с животными контрольной группы (табл. 1). На 6 и 7 сутки после перевивки опухоли у животных этих групп наблюдалась статистически недостоверная тенденция к уменьшению площади поперечного сечения новообразования, на 8 сутки она исчезала. У животных, получавших гормон в дозе 1000 ЕД, статистически достоверных изменений в темпе роста опухоли на 5, 6, 7 и 8 сутки развития лимфосаркомы Плисса не наблюдали.

При изучении влияния меньших доз гормона у животных, получавших дважды по 25 ЕД ХГ, на четвертые сутки после перевивки опухоли темпы роста новообразования были достоверно снижены в 2,7 раза, на пятые – в 1,7 раза, на восьмые сутки - в 1,8 раза, на 11 сутки - в 1,6 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой животных. В группе животных, дважды получавших ХГ в дозе 50 ЕД на четвертые сутки после перевивки наблюдалось достоверное снижение линейных параметров новообразования в 1,7 раз, на пятые сутки – в 2,5 раз, на восьмые сутки – в 1,7 раз, соответственно, относительно данного параметра у животных контрольной группы. В группе животных, дважды получавших гормон в дозе 75 ЕД, размеры опухолей были близки к размерам опухолей в контрольной группе (табл. 1).

В целом в ходе эксперимента нами была обнаружена способность ХГ в дозах 25, 50 и 150 ЕД снижать темпы роста лимфосаркомы Плисса на ранних стадиях ее развития. Было выявлено дозозависимое действие гормона: среди изученных нами доз доза гормона 25 ЕД продемонстрировала наиболее эффективное торможение темпов роста лимфосаркомы Плисса.

Таблица Влияние хорионического гонадотропина на площадь поперечного сечения лимфосаркомы Плисса (мм2) Время от момента перевивки опухоли (сутки) опытов Серия Схема введения ХГ 4 5 6 7 8 1 – не вводили н.т. 328,8 ± 4,5 407,4 ±49,1 562,3 ±31,5 713,8 ±68,4 н.т.

2 – 150 ЕД за сутки до н.т. 253,1 ±22,5* 366,8 ±39,7 526,5 ±44,4 713,1 ±60,2 н.т.

перевивки опухоли 3 – 150 ЕД на третьи сутки н.т. 272,2 ±16,2* 360,2 ±22,4 566,4 ±32,9 754,1 ±35,8 н.т.

после перевивки опухоли 4 – 1000 ЕД за сутки до н.т. 287,4 ±27,4 433,4 ±36,8 692,6 ±59,2 839,8 ±69,1 н.т.

1 перевивки опухоли 5 – 1000 ЕД на третьи сутки после перевивки н.т. 306,0 ±21,4 337,6 ±24,9 562,0 ±44,2 692,7 ±47,1 н.т.

опухоли 1 – не вводили 217,0 ±4,1 189,3 ±11,9 н.т. 222,0 ±13,3 338,0 ±18,9 810,0 ±33, 2 – 25 ЕД на третьи и седьмые сутки после 80,0 ±5,8* 108,0 ±5,2* н.т. 228,5 ±20,4 187,0 ±12,7* 513,0 ±17,4* 2 перевивки 3 – 50 ЕД на третьи и седьмые сутки после 131,3 ±21,3* 77,0 ±13,3* н.т. 208,2 ±40,6 195,0 ±34,0* 820,0 ±113, перевивки 4 – 75 ЕД на третьи и седьмые сутки после 293,0 ±49,4 208,5 ±0,9 н.т. 287,3 ±47,9 361,0 ±22,7 820,0 ±1, перевивки - р 0,05 – статистически значимые отличия относительно контрольной группы;

н.т. – не тестировали.

На фоне снижения количества митотически делящихся клеток лимфосаркомы Плисса под влиянием 150 и 75 ЕД ХГ, хочется отметить отсутствие выраженного торможения роста новообразования под влиянием данных доз гормона на 10 сутки после перевивки опухоли (табл. 1, рис. 4).

ХГ в дозе 150 ЕД тормозил рост лимфосаркомы Плисса в течение 5-ти дней после перевивки, причем в этот период развития опухоли ее структура была достаточно однородна. При дальнейшем развитии новообразования, в нем формировались кровеносные сосуды и включения соединительной ткани, вносящие свой вклад в массу и объем опухоли. Мы полагаем, что выявленное нами торможение роста лимфосаркомы Плисса под влиянием ХГ на ранних стадиях ее развития связано с индукцией апоптоза в опухолевых клетках и снижением их митотической активности.

Изучение влияния разных доз хорионического гонадотропина на состояние иммунной системы животных-опухоленосителей Изучали влияние на состояние иммунной системы ХГ в дозах 150 и 1000 ЕД, введенных на третьи сутки после перевивки новообразования.

Исследуемый материал забирали на десятые сутки развития лимфосаркомы Плисса. В периферической крови крыс контрольной группы, которым была перевита лимфосаркома Плисса, наблюдалось снижение в 3,6 раза содержания популяции Т-хелперов (CD4+ мононуклеарных клеток) по сравнению с данным показателем животных контрольной группы, содержавшихся на рационе вивария. Также наблюдалось достоверное повышение количества клеток крови, несущих на поверхности антигены гистосовместимости II класса (RT-Ia+ клеток) (рис. 5). У животных опухоленосителей, которым вводили 150 или 1000 ЕД ХГ, на десятые сутки развития лимфосаркомы Плисса количество CD4+ и RT-Ia+ клеток в периферической крови достоверно не отличалось от количества данных клеток в крови здоровых крыс.

Таким образом, у крыс-опухоленосителей, не получавших ХГ, наблюдалось нарушение системы иммунитета, проявляющееся в виде дефицита субпопуляции Т-хелперов и увеличения содержания клеток, положительных по антигенам гистосовместимости II класса. Выявленное нами увеличение относительного количества RT-Ia+ клеток свидетельствует о мобилизации клеточного звена в ответ на прогрессирующий опухолевый процесс, в том числе, активации моноцитов. Снижение относительного количества CD4+ клеток отражает развитие иммунодефицита, который в условиях эксперимента может быть вызван только развитием лимфосаркомы Плисса в организме животных.

Рисунок 5. Влияние ХГ на относительное содержание мононуклеарных клеток в периферической крови крыс на десятые сутки развития опухоли.

Группы животных: 1 – интактная группа;

2 – контрольная группа;

3 –крысы–опухоленосители, получавшие ХГ в дозе 150 ЕД;

4 - крысы–опухоленосители, получавшие ХГ в дозе 1000 ЕД.

- р 0,005 – статистически значимые отличия относительно интактной группы.

Исследовали влияние ХГ на состояние иммунитета животных опухоленосителей после введения гормона в дозах от 25 до 75 ЕД. Из рисунка 6 видно, что на четвертые и пятые сутки количество СD4+ клеток в периферической крови контрольных животных, не получавших гормон, было снижено по сравнению с данным показателем у интактных крыс, соответственно, в 1,9 и 2,0 раза. У перевитых животных, получавших по 25 и 50 ЕД ХГ, оно также было понижено в данные сроки. Однако, у животных, получавших по 75 ЕД ХГ, содержание CD4+ клеток достоверно не отличалось от данного показателя у интактных крыс.

На более поздних сроках развития лимфосаркомы Плисса, а именно, на восьмые сутки после ее перевивки, относительное содержание CD4+ клеток в крови животных с опухолью, не получавших гормон и получавших ХГ в дозе 75 ЕД, статистически не отличалось от данного показателя в крови животных, не подвергавшихся каким-либо воздействиям. При этом введение ХГ в дозах 25 и 50 ЕД по-прежнему не оказывало влияния на пониженное содержание Т хелперов в крови животных: по сравнению со здоровыми крысами, данный показатель был достоверно ниже в среднем в 1,5 раза. На одиннадцатые сутки после перевивки клеток лимфосаркомы Плисса снижение относительного содержания CD4+ клеток обнаружено в крови животных с перевитой опухолью, как не получавших гормон, так и получавших его в дозах 25, 50 и 75 ЕД (рис. 6).

Таким образом, гормон в дозе 75, 150 и 1000 ЕД, особенно на ранних сроках после перевивки опухоли, нормализует относительное содержание CD4+ мононуклеарных клеток в периферической крови животных, а следовательно коррегирует онкозависимый иммунодефицит, возникающий на фоне развития новообразования.

Ранее было показано, что ХГ способен оказывать влияние на иммунную систему организма. Гормон способен стимулировать миграцию полипотентных стволовых клеток костного мозга в центральные органы иммуногенеза и Т- и В-лимфоцитов в кровоток, но тормозить кооперацию Т и В-лимфоцитов (Солопаева И.М., 2007). Существуют данные о способности гормона восстанавливать структуру тимуса и стимулировать Т-клеточное звено иммунитета при выраженной атрофии тимуса на фоне цирроза печени у крыс (Колпащикова И.Ф., 1983), а также стимулировать пролиферацию ядросодержащих клеток в органах иммунной системы – тимусе, костном мозге, селезенке и лимфатических узлах (Солопаева И.М., 2000).

Рецепторы ХГ были обнаружены во многих органах и тканях млекопитающих. Отсутствие ярко выраженного проапоптотического действия гормона на мононуклеарные клетки периферической крови позволяет предположить нефункциональность рецепторов или наличие факторов, ингибирующих апоптоз. Так же как и на опухолевые клетки, на мононуклеарные клетки периферической крови ХГ может воздействовать, блокируя рецептор TGF-. TGF- вносит существенный вклад Группы животных:

Интактная Контрольная, животные с опухолью не получали ХГ.

Животные дважды получали по 25 ЕД ХГ.

Животные дважды получали по 50 ЕД ХГ.

Животные дважды получали по 75 ЕД ХГ.

Рис. 6. Изменение относительного содержания CD4+ Т - клеток в периферической крови крыс-опухоленосителей под влиянием разных доз ХГ.

* - p 0,05 – статистически значимые отличия относительно интактной группы животных.

** - p 0,05 – статистически значимые отличия относительно контрольной группы животных.

в развитие онкозависимого иммунодефицита. Он вызывает развитие супрессорных Treg-клеток, индуцируя экспрессию транскрипционного фактора FOXP3. Treg-клетки в свою очередь продуцируют TGF- и ингибируют пролиферацию лимфоцитов, а также блокируют + + дифференцировку CD8 -цитотоксических клеток, CD4 Т-хелперов 1 и 2 типа (Nam J.-S. et al., 2008;

Tang Q., Bluestone J. A., 2008;

de Visser K. E. et al, 2006). Вероятно, ингибирование рецептора TGF- молекулой ХГ способно нивелировать эффект TGF-, что приводит к нормализации количества мононуклеарных клеток периферической крови животных-опухоленосителей и активации противоопухолевого иммунитета.

Таким образом, продемонстрировано разнонаправленное действие ХГ на мононуклеарные клетки периферической крови животных опухоленосителей и клетки лимфосаркомы Плисса. В опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса ХГ тормозит митотическую активность, оказывает на систему ангиогенеза повреждающее действие, стимулирует апоптотические процессы. В мононуклеарных клетках периферической крови гормон вызывает нормализацию пониженного содержания CD4+ клеток крови и не стимулирует апоптоз.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что ХГ в дозах 75 и 150 ЕД является индуктором апоптотических процессов в опухолевых клетках лимфосаркомы Плисса на ранних сроках ее развития вне зависимости от способа введения гормона.

2. Показано, что ХГ не вызывает фрагментации хромосомной ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови крыс-носителей лимфосаркомы Плисса вне зависимости от схемы его введения и сроков наблюдения.

3. Продемонстрировано, что ХГ в дозах 75 и 150 ЕД тормозит митотическое деление клеток лимфосаркомы Плисса, пролиферацию кровеносных сосудов и повреждает сосудистые стенки в опухоли на десятые сутки ее развития.

4. Обнаружена способность ХГ в дозах от 25 до 150 ЕД тормозить рост лимфосаркомы Плисса на разных сроках развития опухоли.

Показана способность ХГ нормализовать сниженное содержание CD4+ 5.

клеток и повышенное содержание RT-Ia+ клеток в периферической крови крыс-носителей лимфосаркомы Плисса на различных сроках развития новообразования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Влияние хорионического гонадотропина на лимфосаркому Плисса и иммунный ответ крыс-опухоленосителей / И.М. Солопаева, В.В.

Новиков, Н.М. Иванова, Т.В. Аксенова, Е.Н. Филатова // Российский Биотерапевтический Журнал. Материалы V всероссийской научно практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». - 2006. – Т.5, №1. – С. 20-21.

2. Действие хорионического гонадотропина человекана развитие лимфосаркомы Плисса и содержание CD4+ мононуклеарных клеток в периферической крови крыс / Е.Н. Филатова, Т.В. Аксенова, Ю.Ю.

Хахина, В.В. Новиков, И.М. Солопаева, Н.Л. Иванова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2008. - № 1. С. 67-72.

3. Влияние хорионического гонадотропина человека на рост лимфосаркомы Плисса у крыс / Е.Н. Филатова, Т.В. Аксенова, Ю.Ю.

Хахина, А.Ю. Барышников, В.В. Новиков, И.М. Солопаева, Н.Л.

Иванова // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. – Т.7, № 3.

- С. 42-47.

4. Коррекция онкозависимого иммунодефицита у крыс с помощью хорионического гонадотропина / Е.Н. Филатова, В.В. Новиков, И.М.

Солопаева, Н.Л. Иванова // Труды Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология»: Междисциплинарные проблемы, Москва, 26-27 февраля. 2008. – М., 2008. - С. 313-314.

5. Филатова, Е.Н. Влияние хорионического гонадотропина человека на содержание CD4+ мононуклеарных клеток крови крыс-носителей лимфосаркомы Плисса / Е.Н. Филатова // Нижегородская сессия молодых ученых: Естественнонаучные дисциплины, Нижегородская обл., 20-25 апреля. 2008. - Н. Новгород: Гладкова О.В., 2008. – С. 31 32.

6. Индукция хорионическим гонадотропином апоптоза клеток лимфосаркомы Плисса / Е.Н. Филатова, В.В. Новиков, О.В. Уткин, И.М. Солопаева, Д.В. Новиков // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90 летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 15-17 июня. 2009. – Н. Новгород: Гладкова О.В., 2009. – С.

194-196.

7. Филатова, Е.Н. Влияние хорионического гонадотропина на состояние иммунной системы животных-опухоленосителей / Е.Н. Филатова, В.В.

Новиков, И.М. Солопаева // Российский Биотерапевтический Журнал.

Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». 2010. – Т.9, №1. – С. 61-61.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.