авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Укописи сазонова елена викторовна механизмы реализации регуляторного влияния интерлейкина-2 на апоптоз лимфоцитов крови

На права х р укописи

Сазонова Елена Викторовна

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ РЕГУЛЯТОРНОГО

ВЛИЯНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2

НА АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ

14.03.03 – патологическая физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Кемерово – 2010

2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Томск Научные руководители:

доктор медицинских наук, Рязанцева Наталья Владимировна профессор доктор медицинских наук Жукова Оксана Борисовна Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, Лисаченко Геннадий Васильевич профессор доктор медицинских наук Литвинова Лариса Сергеевна Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высше го профессионального образования «Омская государственная медицинская ака демия Росздрава», г. Омск Защита состоится «» _ 2010 г. в часов на заседании диссертаци онного совета Д 208.035.02 при ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава» (650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а) С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава»

Автореферат разослан «_» _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Разумов А.С.

доктор медицинских наук, профессор ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. К ключевым системам, обеспечивающим стратегию адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фун даментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апопто тическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необхо димая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением – с другой.

Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществ ляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят интерфероны, колоние стимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004;

Prasad T.S. et al., 2009].

Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность имму нокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого вре мени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фаго цитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников С.В. и со авт., 2004;

Лебедев Л.Р. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или aнтиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимули рующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточно го рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыва нием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активирован ный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли [Walczak H. et al., 1997].

Изменение продукции IL-2 и связанное с этим нарушение реализации та натогенной программы является причиной многих патологических процессов.

Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опу холевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рас сматривать данный цитокин в качестве одного из факторов, способствующих малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998;

Eriksen K. et al., 2001]. Высокая интен сивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, выявлена при инфекционной патологии. Так, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Ca2+, определяющего актив ность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice C.M., 2001;

Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отме чается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/AP 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al., 2003].

Для моделирования дисбаланса системы IL-2–IL-2R используются раз личные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его ре цептора, конструирование генов - и -субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.C. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивиро вание лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2.

Следует признать, что в настоящее время молекулярные механизмы диз регуляции системы IL-2–IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литера туре данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный ха рактер. В связи с этим важным становится исследование молекулярных меха низмов IL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска но вых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток.

Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

Задачи исследования:

1. Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концен трациях от 0,1 до 1,0 нг/мл.

2. Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состоя ние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови.

3. Определить роль белков семейства Bcl-2, транскрипционных факторов NFkB, P53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2.

4. Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении реком бинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом про цессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 (у пациен тов с клещевым энцефалитом).

Научная новизна. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зави симости от концентрации цитокина и условий культивирования. Впервые опре делены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоп тотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с 0,1 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них актив ных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белков регуляторов Bcl-2 и Bcl-XL, активации транскрипционных факторов NFkB и P53.

Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной про дукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, P53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внут риклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Bcl-2).

Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммуноком петентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит).

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменения про граммированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интер лейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловлен ные участием транскрипционных факторов (NFkB и P53) и белков семейства Bcl-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных кле ток с использованием цитокинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффек ты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток: количество апопто тических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с кон центрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционально его дозе на фоне действия дексаметазона.

2. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов кро ви здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при кле щевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфо цитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, актив ных форм кислорода, NFkB, P53 и обусловленной смещением баланса Bcl-2 белков в сторону проапоптотических.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специали стов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), XIII и XV Межгородской конфе ренции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт Петербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), Х Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни им мунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллерго логов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конфе ренции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных ос нов клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые па тологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры мор фологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по при оритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемно ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии»

(ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами на учно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физио логии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных мо лекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государст венной поддержке научных исследований молодых российских ученых докторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Th1- или Th2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 – в журналах, рекомендованных ВАК для публикации ма териалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 страни це машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора лите ратуры, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 226 – иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками.

Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссерта ции, планирование исследования, выделение и культивировпние лимфоцитов крови, оценка продукции лимфоцитов крови и его рецепторов, апоптоза лим фоцитов крови, количества клеток со сниженным уровнем потенциала мито хондриальной мембраны, содержания активных форм кислорода, факторов транскрипции и белков регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови, статистиче ский анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования В основу работы положены результаты комплексного клинико лабораторного обследования 65 человек (30 мужчин и 35 женщин в возрасте от 18 до 50 лет), включая 45 пациентов с клещевым энцефалитом и 20 здоровых доноров.

Критериями исключения из программы исследования являлись возраст моложе 18 и старше 50 лет;

период обострения хронических воспалительных заболеваний;

аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алко гольная и наркотическая зависимости.

Пациенты находились на диспансерном учете или стационарном лечении в терапевтическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач И.Н.Бартфельд, зав. отделением О.В. Буров), инфекционном отделении гос питальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелёв, зав. отделением канд. мед. наук Н.С.

Бужак) и инфекционном отделении МЛПУ ГБ №3 (главный врач М.А. Лука шов, зав. отделением Г.В. Запаздаева).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром на тощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином ( Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра мо лекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель – канд.

мед. наук О.Е. Чечина) и лаборатории клинической иммунологии ФГУЗ Кли ническая больница № 81 ФМБА России (зав. лабораторией – канд. мед. наук Т.Т. Радзивил).

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования работа была разделена на два последовательных этапа. На первом этапе проводилась оценка эффекта rIL-2 на реализацию клеточной гибели в зависимости от его до зы. В работе было использовано инкубирование клеток здоровых доноров с различными концентрациями рекомбинантной формы IL-2 (rIL-2) человека.

Для анализа антиапоптотического действия IL-2 лимфоциты крови инкубиро вали в полной среде, содержащей дексаметазон, выступавший в качестве ин дуктора апоптоза, и rIL-2.

Второй этап исследования был посвящен изучению механизмов проапоп тотического действия IL-2 на экспериментальной модели IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитарных клеток крови, полученных у здоровых доноров и у пациентов с клещевой нейроинфекцией. Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными мето дами исследования представлено в таблице 1.

Лимфоциты выделяли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (=1,077 г/см3) («Pharmacia», Швеция). Выделенные клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37С в полной питатель ной среде, в среде с добавлением rIL-2 в диапазоне концентраций 0,015-1, нг/мл, а также в полной среде при одновременном внесении 10-4 моль/мл дек саметазона и rIL-2 в дозах 0,025-0,050 нг/мл. Продукцию лимфоцитами IL- Та б л и ц а 1 – Распределение обследованных лиц в соответствии с методами исследования лимфоцитов крови (n=65) Лимфоциты, Лимфоциты Лимфоциты пациен Лимфоциты Лимфоциты, инкубированные с пациентов с тов с хронической Методы исследования 0,1 нг/мл rIL-2 и острым клеще- антигенемией вируса здоровых инкубированные с 10-4 М дексамета доноров 0,1 нг/мл rIL-2 вым энцефали- клещевого зона том энцефалита Исследование содержания IL-2 в су пернатантах культур лимфоцитов ме- 16 – – 17 тодом иммуноферментного анализа Оценка количества IL-2R презентирующих лимфоцитарных кле- 16 – – 17 ток методом проточной цитофлюориметрии Определение количества апоптотиче ски измененных лимфоцитов в аннек- 20 20 20 20 синовом тесте методом проточной цитофлюориметрии Определение числа лимфоцитов со сниженным уровнем трансмембранно- 20 10 10 16 го потенциала митохондрий методом проточной цитофлюориметрии Оценка содержания в клетке АФК ме- 20 10 10 22 тодом проточной цитофлюориметрии Исследование содержания факторов транскрипции (Р53 и NFkB), Р21 и бел ков-регуляторов апоптоза (Bad, Bax, 12 12 12 12 Bcl-2, Bcl-XL) методом иммуноблоттинга оценивали методом иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем («Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

Содержание лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности мем бранную форму рецептора к IL-2, определяли методом проточной лазерной ци тометрии с использованием стандартных моноклональных антител к IL-2R (CD25), меченных фикоэритрином (CD25-PE) («R&D Systems», США).

Оценку реализации программированной гибели лимфоцитов проводили с ис пользованием FITC-меченного аннексина V и пропидиум йодида (PI) («Beckman Coulter», США) [Van Engeland M., 1998] методом проточной лазер ной цитометрии на цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран () регистрировали с помощью набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США), ключевым реагентом которого является флюорохром 5,5’,6,6’ тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид (JC-1). Ок рашенные JC-1-лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США), определяя процентное содержание клеток в гейтах неапоптотических (FL-1 и FL-2) и апоптотических клеток (FL-1-свечение). Для оценки уровня активных форм кислорода в клетках применяли краситель с за блокированной флюоресценцией дихлорфлюоресцеин диацетат («Sigma», США). После 20-минутной инкубации с данным препаратом реакцию останав ливали 200 мкл лизирующего раствора. Затем оценивали параметры зеленой флюоресценции в гейте лимфоцитарных клеток, выявленных на FL1-канале с помощью проточного цитометра Epics XL («Beckman Coulter», США) [Дамбае ва С.В. и соавт., 2001].

Для исследования содержания белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl XL, Bax, Bad), а также транскрипционных факторов (NFkB, Р53, Р21) был ис пользован иммуноблоттинг. Белки разделяли по молекулярной массе под дей ствием электрического поля (10 В/см пути). Использовали белковые маркеры молекулярного веса (14,3 – 220,0 kDa, «Fermentas», EU). Для последующего ис следования белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мем брану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА. В работе были использованы антитела к Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, Р53, NFkB, Р («Biosource», США) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Оценку полученных данных проводили методами статистического описа ния и проверки статистических гипотез [Кремер Н.Ш., 2004]. Проверку нор мальности распределения количественных показателей проводили с использо ванием критерия Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли ме диану (Me), первый и третий квартили (Q1 и Q3). Сравнение изученных показа телей проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых групп и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса для нескольких независимых групп. Различия считали достоверными при уровне значимости р0,05 [Кремер Н.Ш., 2004].

Результаты исследования и их обсуждение Культивирование лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, в при сутствии рекомбинантной формы IL-2 (rIL-2) показало, что данный цитокин начинал проявлять своё проапоптотическое действие в отношении лимфоци тарных клеток, когда его концентрация в среде культивирования составляла 0,100 нг/мл. При последующем увеличении дозы медиатора отмечалось повы шение числа фосфатидилсеринэкспрессирующих лимфоцитов, пропорциональ ное дозе циткина (рис. 1).

% * * * * * нг/мл 0,000 0,015 0,025 0,050 0,100 0,150 0,350 0,500 1, * – р0,05 по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных в безцитокиновой среде Р и с у н о к 1 – Изменение количества апоптотических лимфоцитов в зависимости от концентрации rIL-2 в культуральной среде Следует отметить, что в литературе на сегодняшний день не описан дозо зависимый характер проапоптотического действия IL-2. В настоящем исследо вании было впервые обнаружено, что для реализации апоптозиндуцирующего эффекта rIL-2 на лимфоциты крови в условиях in vitro необходим определен ный порог концентрации цитокина. Наличие подобного «барьера» действия IL 2 может быть объяснено строением его рецептора и работой внутриклеточных сигнальных путей [Boytim M.L. et al., 2000;

Lindemann M.J., 2003;

Stauber D.J. et al., 2006].

На модели глюкокортикоидиндуцированного апоптоза лимфоцитов, вы званного добавлением 10-4 М дексаметазона, установлено протективное дейст вие rIL-2 (рис. 2). Существует множество причин отмены апоптоза данным ци токином. Одна из них способность данного цитокина запускать пролифера тивный каскад по JAK/STAT, PI3K или MAPKсигнальным путям, сходя щимся на регуляции экспрессии гена bcl-2, результатом повышения которой является клеточное выживание и пролиферация [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003].

% * * * нг/мл 0,000 0,025 0,050 0, * – р0,05 – по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных с 0,1 ммоль/л дексаметазона Р и с у н о к 2 – Количество апоптотически измененных лимфоцитов в условиях культивирования в среде, содержащей дексаметазон и rIL-2 в различ ных концентрациях Дозозависимый характер этого явления может быть объяснен увеличени ем количества активированных IL-2R с повышением дозы цитокина и усилени ем интенсивности антиапоптотических сигнальных путей в клетке [Lindemann M.J. et al., 2003].

Установлено, что течение острого клещевого энцефалита характеризуется повышением уровня продукции IL-2, снижением содержания IL-2R положительных клеток и усилением вовлечения лимфоцитов в процесс апопто за (рис. 3). Усиление секреции IL-2, на наш взгляд, является проявлением адек ватной реакции иммунной системы, направленной на элиминацию возбудителя.

Как известно, инициация противовирусного иммунитета путем включения спе цифического иммунного ответа осуществляется за счет взаимодействия Т лимфоцита с антигенпредставляющей клеткой [Хаитов Р.М., 2001]. Сочетание сигналов, поступающих на Т-хелпер через комплекс ТСR-CD3 и CD28, приво дит к активации клетки, т.е. выходу ее из фазы покоя G0 в фазу клеточного цик ла G1. Основной результат этого состоит в индукции экспрессии генов росто вых факторов, в частности IL-2, что подготавливает клетку к пролиферации, лежащую в основе любых форм проявления активности лимфоцитов [Хаитов Р.М., 2001;

Кашкин К.П., 2004].

% от нормы 250 Здоровые доноры * Больные острым 150 клещевым энцефалитом * Пациенты с хронической * ** антигенемией вируса клещевого энцефалита Содержание Количество Количество Содержание IL-2, Количество IL-2R+ Количество + лимфоцитов в IL-2, пг/мл IL-2R лимфоцитов, % лимфоцитов в пг/мл лимфоцитов, % апоптозе, % апоптозе, % * – р0,05 по сравнению с аналогичными значениями у здоровых доноров Р и с у н о к 3 – Продукция IL-2 лимфоцитами, содержание IL-2R презентирующих клеток и количество лимфоцитов в апоптозе у пациентов с клещевым энцефалитом При взаимодействии IL-2 с IL-2R сигнал передается на внутриклеточный протеинкиназный комплекс, каскадная активация которого проявляется в апоп тогенном или митогенном влиянии цитокина на клетку. В ходе настоящего ис следования было установлено, что у лиц с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита отмечено снижение доли IL-2R-презентирующих и уве личение количества апоптотически измененных лимфоцитов на фоне неизмен ной цитокинпродуцирующей способности (рис. 3). Этот факт, возможно, объ ясняется недостаточной реактивностью макроорганизма, которая, в свою оче редь, обусловливает неэффективность иммунной защиты в ответ на действие инфекта [Хаитов Р.М., 2001], становясь одним из механизмов, ведущих к хро низации инфекционного процесса [Рязанцева Н.В. и соавт., 2006].

Таким образом, результаты настоящей работы позволили выявить факт модификации программированной гибели лимфоцитов в условиях эксперимен тальной модели интерлейкин-2-зависимого апоптоза и у пациентов с клещевой нейроинфекцией, сопровождающейся изменением состояния системы интер лейкина-2 и его рецептора. Это явилось основанием для проведения этапа ис следования, направленного на выявление молекулярных мишеней апоптотиче ского каскада, запускаемого при участии IL-2.

Известно, что функциональное состояние клетки зависит от уровня со держания в ней активных форм кислорода (АФК) [Buzek J. et al., 2002;

Pastori G.M. et al., 2002], которые используются как посредники при передаче сигнала от мембранных рецепторов на внутриклеточные системы протеинкиназ [Pastori G.M. et al., 2002]. Эксперимент, проведенный с рекомбинантным IL-2 в услови ях in vitro, продемонстрировал повышение уровня АФК в клетке и их участие в реализации проапоптотического эффекта цитокина (рис. 4а).

усл.ед. % 1, 0, 0, 0, Медиана 0, 25%-75% Min-Max 0,0 -0, 1 2 3 1 2 3 а б 1 интактные лимфоциты здоровых доноров;

2 лимфоциты здоровых доноров, инкубиро ванные с 0,100 нг/мл rIL-2;

3 лимфоциты, полученные у больных острым клещевым энце фалитом;

4 лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса кле щевого энцефалита;

трансмембранный потенциал митохондрий Р и с у н о к 4 – Содержание активных форм кислорода в лимфоцитах крови (а), численность лимфоцитов со сниженным трансмембранным потен циалом митохондрий (б) При оценке внутриклеточной продукции АФК лимфоцитами крови у па циентов с клещевой нейроинфекцией выявлено, что величина данного парамет ра возрастает, при этом более выраженные изменения исследуемого показателя отмечаются у пациентов с острым клещевым энцефалитом (рис. 4а).

Рассматривая механизмы АФК-опосредованного апоптоза клетки, особое внимание следует уделить митохондриям, которые, образуя сложную систему взаимовлияний, являются как мишенями, так и продуцентами кислородных ра дикалов [Зенков Н.К. и соавт., 2001;

Бра М., 2005;

Черняк Б.В., 2005;

Меньши кова Е.Б. и соавт., 2006]. В проведенном нами исследовании было зафиксирова но повышение количества лимфоцитов со сниженным значением в лимфо цитарных клетках, полученных у здоровых доноров и подвергнутых воздейст вию rIL-2 в концентрации 0,1 нг/мл, и у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 4б), что дало возможность предположить заинтересованность митохонд риального пути апоптоза в реализации проапоптотического действия IL-2.

Контроль над выходом из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль регуляторов апоптоза обеспечивают белки семейства Bcl-2, динамиче ское равновесие которых определяет выбор клетки между жизнью и смертью [Fridman J.S., Lowe S.W.,2003]. Исследование, выполненное методом иммуноб лоттинга, показало, что при действии 0,1 нг/мл rIL-2 происходило значительное снижение внутрилимфоцитарного содержания белков Bcl-2 и Bcl-XL по сравне нию с величиной данных показателей в интактных клетках. Аналогичные изме нения были зарегистрированы у пациентов с клещевой нейроинфекцие (рис. 5а, б).

Анализ содержания белка Bax в лимфоцитах, культивированных с rIL-2 в дозе 0,1 нг/мл, показал, что уровень данного проапоптотического белка был вдвое ниже величины аналогичного показателя в интактных клетках. Можно заметить, что у больных острым клещевым энцефалитом и у антигеноносителей данного возбудителя уровень Bax в лимфоцитах практически не изменялся (рис. 5в).

Точный механизм, благодаря которому данные белки регулируют прони цаемость мембраны митохондрий, до сих пор неясен. Имеются литературные данные о том, что Bcl-XL способен связываться с уже вышедшим цитохромом с, предотвращая дальнейшую активацию каспаз [Cheng E.H. et al., 2001]. Помимо этого установлено, что Bcl-2 и Bcl-XL могут гетеродимеризоваться с проапоп тотическим протеином Вах, тем самым ингибируя его каналформирующую способность [Brenner C. et al., 2000]. В то же время Bax в ответ на смертельный сигнал изменяет свою конформацию и встраивается в мембрану митохондрии с образованием пор.

усл.ед. усл.ед.

2, 2, 2, 1,8 1, 1,6 1, 1,4 1, 1,2 1, 1,0 1, 0,8 0, Медиана 0,6 0, 25%-75% 0,4 0, Min-Max 0,2 0, 1 2 3 4 1 2 3 а б усл.ед. усл.ед.

1,4 1, 1,3 1, 1,2 1, 1,1 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Медиана 0, 0, 25%-75% 0, 0, Min-Max 0,3 0, 1 2 3 4 1 2 3 в г Р и с у н о к 5 – Уровень белков Bcl-2 (а), Bcl-XL (б), Bax (в), Bad (г) в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 – интактная культура клеток, – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефа литом (3 – больные острым клещевым энцефалитом, 4 – лица с хронической ан тигенемией вируса клещевого энцефалита) Важно подчеркнуть, что в присутствии rIL-2 было зарегистрировано дву кратное увеличение количества другого апоптотического индуктора – Bad, в то время как значения данного показателя у пациентов с клещевым энцефалитом сохранялись на неизменном уровне (рис. 5г).

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют заклю чить, что сдвиг равновесия между содержанием про- и антиапоптотических Bcl 2-белков в сторону проапоптотических лежит в основе апоптозиндуцирующего действия rIL-2.

Регуляция активности белков семейства Bcl-2 осуществляется транскрип ционными факторами NFkB и Р53, которые управляют экспрессией генов этих белков [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. В проведенном нами исследовании бы ло установлено, что культивирование интактных лимфоцитарных клеток здоро вых лиц с rIL-2 в проапоптотической дозе, равной 0,1 нг/мл, а также лимфоци тов пациентов с клещевым энцефалитом в безцитокиновой питательной среде сопровождается статистически значимым повышением содержания свободной субъединицы RelA NFkB (рис. 6).

усл.ед.

1, 1, 1, NFkB 0, (Mr=65 kDa) 0,6 Медиана 25%-75% 0, GAFDG Min-Max 0, 1 2 3 Р и с у н о к 6 – Уровень NFkB в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 – интактная культура клеток, 2 – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефалитом (3 – больные острым клещевым энцефалитом, 4 – лица с хронической антигенемией вируса клещевого энцефа лита) Большинство авторов рассматривает данный транскрипционный фактор в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера, опосредующего передачу пролиферативного сигнала от IL-2 с плазматической мембраны к ядру клетки [Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001;

Beyaert R., 2004;

Gilmore T.D., 2006;

Perkins N.D., 2007]. Однако в ряде экспериментальных работ была показана возмож ность NFkB-опосредованной активации Р53, ведущей к транскрипции генов проапоптотических белков [Kucharczak J. et al., 2003;

Prasad T.S. et al., 2009].

В ходе проведенного исследования установлено снижение содержания нефосфорилированной формы белка Р53 в лимфоцитарных клетках здоровых лиц, инкубированных с проапоптотической дозой цитокина, а также в лимфо цитах крови, полученных у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 7). Это можно объяснить, по-видимому, переходом данного белка в активное, а именно усл.ед.

1, 1, 1, 1, Р 1, (Mr=53kDa) 0, Медиана 0,6 25%-75% GAFDG Min-Max 0, 1 2 Р и с у н о к 7 – Уровень Р53 в лимфоцитах, полученных у здоровых до норов (1 – интактная культура клеток, 2 – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у больных острым клещевым энцефалитом (3) фосфорилированное состояние, поскольку транскрипционный фактор Р функционирует только в такой модификации [Burlacu A., 2006]. В качестве од ного из возможных механизмов этого процесса можно рассматривать способ ность IL-2 активировать MAP-киназу JNK и белок NFkB, задействованные в фосфорилировании N-терминального домена Р53 [Kucharczak J. et al., 2003].

Одной из молекулярных мишеней белка Р53 выступает универсальный ингибитор циклинзависимых киназ Р21 (Waf1, Cip1, Sdi1), способный приво дить к остановке клеточного цикла и запуску программы апоптоза в ответ на различные стрессовые стимулы [Rodriguez R., Meuth M., 2006].

С использованием метода иммуноблоттинга было показано, что культи вирование лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров, с рекомби нантным IL-2 приводит к увеличению внутриклеточного содержания Р [0,48(0,48-0,72) усл.ед., р=0,032] по сравнению с соответствующим параметром в интактных клетках [0,35(0,35-0,40) усл.ед.]. Повышение уровня Р21 наряду с Р53, вероятно, свидетельствует о блоке клеточного цикла в поздней G1- и S фазе, что увеличивает чувствительность лимфоцитарных клеток к индукции апоптоза [Gartel A.L., Radhakrishnan S.K., 2005.

Таким образом, оценка молекулярных механизмов IL-2-опосредованного апоптоза показала наличие сложной многокомпонентной реакции клетки в от вет на изменение условий ее жизнедеятельности (рис.8). Было выявлено, что индуцированное данным цитокином усиление наработки активных форм кисло Взаимодействие IL-2 с IL-2R Активация PI3/Akt пути Возрастание уровня внутриклеточных АФК Активация фосфорилирования Активация фосфорилирования JNK P38 МАРК Активация фактора Активация фактора транскрипции NFkB транскрипции Р Активация проапоптотиче синтеза синтеза Активация ских белков семейства Bcl- Bcl-2 MnSOD IAPs Открытие пор пермеабилизационного перехода митохондриальных мембран дисмутации Ингибирование каспаз -3, -6, супероксида -7,-8,-9 Снижение трансмембранного по тенциала митохондрий Выход в цитозоль апоптозиндуци рующих факторов Экспрессия фосфатидилсерина на цитоплазматической мембране и повышение её проницаемости Ингибирование апоптоза лимфо- Апоптоз лимфоцитов крови цитов крови Инфекционные заболевания (клещевой энцефалит, ви Опухолевая прогрессия русный гепатит В и С, ту (лейкозы) беркулез), аутоиммунные заболевания повышение, снижение, ингибирование, усиление Рисунок 8 – Молекулярные механизмы про- и антиапоптотического эф фекта интерлейкина-2 [по данным J. Kucharczak et al., 2003;

A. Matsuzawa et al., 2005;

R. Rodriguez, M. Meuth, 2006 и результатам собственных исследований (выделено цветом)] рода сопровождается активацией транскрипционных факторов, приводящей к изменению профиля экспрессии соответствующих генов. При этом, как показа ли полученные данные, судьба клетки решается на уровне белков семейства Bcl-2. Последние могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, вышестоящими компонентами сигнальных систем, а также окислительной модификации. Важно подчеркнуть, что молекулярные механиз мы реализации апоптотической программы лимфоцитов крови в использован ной нами модели in vitro во многом схожи с таковыми при клещевой нейроин фекции. При этом АФК, вероятно, принадлежит роль вторичных мессенджеров, опосредующих активацию факторов транскрипции. Под действием последних происходит индукция синтеза белков, участвующих, в частности, в усилении митохондриальной проницаемости.

Следует заметить, что устранение апоптозиндуцирующего действия IL-2, наблюдаемое при культивировании лимфоцитов в цитокинсодержащей среде в присутствии индуктора клеточной гибели дексаметазона, подтверждает гипоте зу о том, что эффект данного медиатора определяется физиологическим со стоянием клеток. Известно, что в организме на лимфоциты, помимо IL-2, дей ствует множество различных сигнальных молекул, состав которых и интенсив ность действия зависит от степени зрелости клеток, их фенотипа и стадии им мунного ответа. При разных физиологических и патологических процессах и состояниях в клетке активируются различные сигнальные пути, и меняется со став белков-регуляторов, благодаря чему IL-2 способен оказывать противопо ложные эффекты на апоптоз лимфоцитов (рис. 8). Точные внутриклеточные механизмы двойственности эффектов IL-2 требуют дальнейшего изучения. Это, в свою очередь, позволит понять процессы, лежащие в основе гомеостаза им мунной системы, что даст возможность для разработки новых методов лечения и диагностики заболеваний, связанных с дизрегуляцией апоптоза иммукомпе тентных клеток.

ВЫВОДЫ 1. При культивировании лимфоцитов, полученных у здоровых доно ров, с рекомбинантным интерлейкином-2 в дозах 0,1-1,0 нг/мл увеличивается содержание апоптотически измененных клеток пропорционально концентрации цитокина. На фоне глюкокортикоидиндуцированного апоптоза (дексаметазон в дозе 10-4 М) рекомбинантный интерлейкин-2 оказывает антиапоптотический эффект на лимфоциты крови, который также носит дозозависимый характер.

2. Механизмы проапоптотического действия на лимфоциты рекомби нантного интерлейкина-2 в дозе 0,1 нг/мл обусловлены снижением трансмем бранного потенциала митохондрий на фоне внутриклеточного накопления ак тивных форм кислорода, дисбалансом белков семейства Bcl-2 с про- и анти апоптотической функцией (уменьшение уровня Bcl-2, Bcl-XL и Bax, повышение – Bad) и увеличением содержания ингибитора циклинзависимых киназ Р21.

3. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при клещевом энцефалите (снижение числа лимфоцитов, презентирующих рецепторы к интерлейкину- на фоне повышенной или нормальной продукции цитокина у больных острым клещевым энцефалитом и у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита, соответственно) сопровождается индукцией апоптоти ческой гибели лимфоцитов, повышением количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и высоким внутриклеточным уровнем активных форм кислорода.

4. У пациентов с клещевым энцефалитом апоптоз лимфоцитарных клеток крови опосредован смещением баланса белков семейства Bcl-2 в сторо ну проапоптотических: снижение содержания Bcl-2 и Bcl-XL на фоне отсутст вия изменений уровня Bax и Bad.

5. При нарушении в системе интерлейкина-2 и его рецептора как в ус ловиях in vitro, так и инфекционного процесса (клещевой энцефалит) молеку лярные механизмы модуляции апоптотической гибели лимфоцитов являются однотипными и связаны с активацией митохондриального пути апоптоза, а также транскрипционных факторов NFkВ и Р53.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Роль p53 и NFkВ в реализации IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова и др. // Медицинская иммунология. – 2009. – № 4-5. – С. 380.

2. Система TNF-TNF–RI и апоптоз лимфоцитов крови при хронической анти генемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечи на, Е.В. Сазонова и др. // Медицинская иммунология. – 2009. – № 4-5. – С. 334.

3. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при дисба лансе Th1- и Th2-цитокинов / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В.

Сазонова и др. // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2(11), № 2-3. – С. 259.

4. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов / О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова и др. // Аллергология и иммуноло гия. – 2009 – Т. 10, № 2. – С. 176.

5. Роль цитокинов в редоксзависимой регуляции апоптоза / О.Е. Чечина, А.К.

Биктасова., Е.В. Сазонова и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2009. – №2. – С. 67-71.

6. Роль NFkB, p53 и р21 в регуляции ФНО-a-опосредованного апоптоза лим фоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, О.Е.

Чечина, Е.В. Сазонова // Бюллетень экспериментальной биологии и медици ны – 2010. – № 1. – С. 56-59.

7. Состояние TNF-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови при длительной антигенемии вируса клещевого эн цефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е.Чечина, Е.В. Сазонова // Мате риалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2007. – С. 168.

8. TNF-опосредованная регуляция программированной гибели лимфоцитов при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жуко ва, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Межгородской конферен ции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». – СПб, 2007. – С. 13-14.

9. Клинико-иммунологическая характеристика клещевого энцефалита / И.Н.

Удинцева, О.Е. Чечина, Н.Г. Жукова, Л.В. Лукашова, Н.В. Рязанцева, А.М.

Попонина, Л.А. Малышева, Н.Н. Бартфельт, З.С. Кемерова, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова // Межрегиональная научно-практическая конференция с ме ждународным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций».

– Медицина в Кузбассе. – 2008. – № 5. – С. 152-156.

10. P53 и NFkB – сигнальные трансдукторы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о челове ке». – Томск, 2009. – С. 101-102.

11. Дисбаланс белков семейства Bcl-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н.

Марошкина, О.Е. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, Т.С. Прохоренко, А.К. Биктасова, М.В. Белкина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Междуна родной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»: сб. ста тей молодых ученых. – Пущино, 2009. – С. 457-461.

12. Дозозависимые эффекты IL-2 на программированную гибель лимфоцитар ных клеток / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Ма териалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные про блемы патофизиологии». – СПб, 2009. – С. 96-97.

13. Нарушение TNF-опосредованного апоптоза лимфоцитов как механизм формирования хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова // Материалы Меж городской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофи зиологии». – СПб, 2009. – С. 18-19.

14. Изменение содержания транскрипционных факторов при TNF опосредованном апоптозе лимфоцитов крови / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы Х Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, имму нологии и иммунофармакологии». – Казань, 2009.– С. 278.

15. Роль белков семейства Bcl-2 в регуляции IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови / Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова и др. // Ма териалы Х Международного конгресса «Современные проблемы аллерголо гии, иммунологии и иммунофармакологии». – Казань, 2009. – С. 308.

16. Участие транскрипционных факторов и белков семейства Bcl-2 в TNF опосредованном апоптозе лимфоцитов / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е.

Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специа листов «Науки о человеке». – Томск, 2009. – С. 71-72.

17. Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНО при поляризации иммунного ответа по Th1- и Th-2-пути / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные ас пекты компенсаторно-приспособительных процессов» – Новосибирск, 2009.

– С. 225-226.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода FITC – флюоресцеинизотиоцианат Th – Т-хелпер-лимфоцит – митохондриальный трансмембранный потенциал NFkB – nuclear factor kB, ядерный фактор kB Bad – Bсl-2 agonist of cell death, Bcl-2-агонист клеточной смерти Bax – Bcl-2-associated X protein, Bcl-2-ассоциированный белок Х Bcl-2 – В-cell lymphoma/leukemia protein 2, белок 2 В-клеточной лимфомы/лейкемии Bcl-XL – Bcl-2 related protein, long isoform, Bcl-2-связанный белок, длинная изоформа GAFDG – глицеральдегидфосфатдегидрогеназа IL – interleukin, интерлейкин IL-2R – interleukin-2 receptor, рецептор к интерлейкину- MnSOD – магниевая супероксиддисмутаза rIL-2 – recombinant interleukin-2, рекомбинантный интерлейкин- Автор выражает благодарность заведующей лабораторией клинической иммунологии ФГУЗ Клиническая больница № 81 ФМБА России канд. мед. наук Т.Т. Радзивил, зав. кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава профессору, д-ру мед. наук А.В. Лепехину, профессо ру кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ру мед. наук Н.Г. Жуковой за ценные теоретические и методические советы.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.