авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии

На правах рукописи

ЛИСКОВЫХ

Михаил Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ

ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ

ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЦЕЛЯХ ТКАНЕЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук, Томилин Алексей Николаевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, Тиллиб Сергей Владимирович Институт биологии гена РАН, Москва

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук, Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита диссертации состоится «11» ноября 2011 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru Факс: 8(812)297-35-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «» октября 2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одной из актуальных задач исследований, проводимых на стыке биологии и медицины, является выбор модельного организма. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии, фармакологии, трансплантологии, иммунологии, онкологии и изучении старения и сердечно-сосудистой системы. При сравнимой с продолжительностью репродуктивного цикла у мышей и стоимостью содержания крыса имеет более подходящий размер, например, для рутинного отбора проб крови и измерения физиологических параметров. Так же, полное понимание физиологических процессов невозможно без описания функции генов, что в свою очередь должно опираться на генный нокаут. Проведение генного нокаута на мыши стало возможным только благодаря возможности получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (Evans et al., 1981).

Проведение генного нокаута на крысе до недавнего времени не представлялось возможным, так как ЭС клетки этого вида были впервые получены только в 2008 году (Buehr et al., 2008). К тому же, процесс их получения оказался очень трудоёмким и дорогостоящим. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы позволит обойти особо трудоёмкий процесс получения ЭС клеток и приблизит нас к проведению исследований, использующих крысу как экспериментальную модель заболеваний человека.

Известно, что попадание в организм взрослой мыши хотя бы нескольких ЭС клеток приводит к возникновению тератом – быстрорастущих опухолей, несущих в своём составе типы клеток и тканей, являющихся производными трёх зародышевых листков. Несмотря на значительный прогресс в области изучения биологии плюрипотентных стволовых клеток, одним из важнейших препятствий, стоящих на пути практического применения этих клеток в клинике является их туморогенность. Кроме того, по существующим протоколам направленной дифференцировки ЭС клеток in vitro получаются весьма гетерогенные популяции клеток, в которых практически всегда присутствуют резидуальные недифференцированные клетки, обладающие высоким туморогенным потенциалом. Очевидно, что описанная выше ситуация в полной мере относится и к иПС клеткам. Таким образом, в клинике присутствие даже небольшого количества недифференцированных ЭС/иПС клеток (и даже одной такой клетки) в трансплантируемом пациенту клеточном материале недопустимо ввиду возможности возникновения тератомы. Соответственно, разработка технологий, гарантирующих полное удаление резидуальных ЭС/иПС клеток из гетерогенных клеточных суспензий, остаётся одной из самых актуальных на сегодняшний день задач в области биологии стволовых клеток. Данная проблема особенно актуальна в свете бурно развивающегося направления заместительной клеточной/тканевой терапии.

Цели и задачи исследования:

Данное исследование преследовало две цели: 1) получить и всесторонне охарактеризовать иПС клетки крысы;

2) предложить метод безопасного использования ЭС/иПС клеток в терапевтических целях.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить ряд конкретных задач:

1. Разработать протокол эффективного репрограммирования крысиных эмбриональных фибробластов (КЭФ) в иПС клетки.

2. Генерировать иПС клетки из КЭФ и получить несколько независимых клеточных линий.

3. Изучить плюрипотентные свойства полученных линий иПС клеток крысы в экспериментах in vitro и in vivo.

4. Использовать полученные иПС клетки крысы для проведения генетических манипуляций, таких как стабильное внедрение в геном чужеродной ДНК (трансгенез).

5. Разработать стратегию контроля над туморогенностью ЭС/иПС клеток, заключающуюся в генетической сенсибилизации этих клеток за счет «суицидальной кассеты», несущей гена тимидин киназы (ТК).

6. Протестировать разработанную технологию в экспериментах по тканезамещению на модельных лабораторных животных (мышах).

Основные положения, выносимые на защиту Использование нового метода получения и поддержания в культуре иПС клеток 1.

крысы, позволяет повысить выживаемость иПС клеток по меньшей мере в 2 раза по сравнению с опубликованными ранее протоколами.

Полученные иПС клетки крысы, при использовании вирусных векторов с 2.

последующим их удалением, обладают нормальным кариотипом и плюрипотентными свойствами. О плюрипотентности полученных иПС клеток свидетельствуют экспрессия в них известных маркеров плюрипотентности (Nanog, Oct4, SSEA1, щелочной фосфатазы), а также способность этих клеток образовать тератомы и участвовать в формировании химерного организма.

Возможно внедрение в геном иПС клетки крысы стабильного трансгена, что является 3.

необходимым шагом на пути к проведению генного нокаута путём гомологической рекомбинации.

Стабильное введение в геном ЭС/иПС клеток мыши и крысы «суицидальной кассеты»

4.

2A2Btk–TKiresPuro обеспечивает контроль над туморогенностью, что подтверждено в в экспериментах in vitro и in vivo.

Эксперимент по восстановлению кроветворения у летально облучённых мышей 5.

доказывает работоспособность предлагаемой «суицидальной стратегии» в тканезамещении.

Научная новизна полученных результатов В настоящей работе впервые представлены сравнительные данные по эффективности получения иПС клеток крысы при помощи предлагаемого нами и уже известных протоколов. Проведён всесторонний анализ полученных линий иПС клеток крысы, доказана необходимость присутствия в среде культивирования используемых ингибиторов и LIF.

Доказана возможность использования иПС клеток крысы в экспериментах по введению стабильного трансгена, что является первым шагом на пути к проведению гомологичной рекомбинации и изучению функции гена с помощью генного нокаута.

Разработана стратегия безопасного (безопухолевого) использования ЭС/иПС клеток в терапевтических целях, принципиально отличающаяся от известных опубликованных экспериментальных данных и патентов. Достоверно подтверждено, в экспериментах in vitro и in vivo, что обработка клеточных культур и экспериментальных животных ганцикловиром безопасна.

Теоретическое и практическое значение работы Открывается перспектива проведения генетических исследований, использующих крысу как основную экспериментальную модель.

Несмотря на то, что к настоящему моменту есть только одна модель, на которой была продемонстрирована возможность тканезамещения с использованием ЭС клеток, данную технологию необходимо активно развивать. Это позволит уже в недалёком будущем разработать принципиально новые методы лечения и направить знания из фундаментальной области биологии в прикладное русло. В дальнейшем предполагается расширить спектр моделей заболеваний человека, а так же набор экспериментальных животных.

Применение описанной кассеты 2A2Btk–TKiresPuro в экспериментах in vitro и in vivo открывает перспективы безопасного использования иПС клеток крысы в исследованиях связанных с тканезамещением в терапевтических целях. Кроме того, открывается возможность рассматривать крысу как основную животную модель при изучении возможности лечения различных заболеваний человека методами тканезамещения.

С учётом того, что ганцикловир является одобренным противовирусным препаратом, технология имеет все шансы вырасти в полноценную методику лечения, основанную на клеточном материале, полученном непосредственно от пациента (аутологичные иПС клетки).

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на Школе-конференции «Биология развития» (Звенигород, 2008);

Отчетной конференции по Программе президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва 2008, 2009);

Всероссийском симпозиуме «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009);

III Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010);

3-м международном конгрессе «3rd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation» (Дрезден, Германия, 2010);

конференции «The 18th International Workshop on Genetic Systems in the Rat» (Киото, Япония, 2010).

Финансовая поддержка работы Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований и Объединения Гельмгольца (проект 07-04 92281/HRJRG-024), программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Госконтрактов 02.512.11.2253 и 16.512.11.2085, а также фонда некоммерческих программ «Династия» ДП–Б-22/10.

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы» и «результаты и обсуждения», выводов, списка цитируемой литературы и одной страницы приложений. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 10 таблиц.

Материалы и методы исследований Получение мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) из 13.5-суточных плодов мыши. Беременных мышей умерщвляли на 13.5 сутки после оплодотворения (д.п.о.). Маточные трубы с эмбрионами промывали 3 раза по 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением гентамицина (до конечной концентрации мМ) (Биолот, Россия). Эмбриональные сумки открывали, используя хирургические пинцет и ножницы, и извлекали эмбрионы. Эмбрионы переносили в новую чашку и промывали 3 раза по 10 мл PBS с гентамицином и освобождали их от мягких висцеральных тканей;

затем переносили в новую чашку, промывали 3 раза по 10 мл PBS с гентамицином и измельчали ножницами. Измельчённые фрагменты далее инкубировали в 2 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА (Gibco, США) в течение несколько минут. К полученной суспензии добавляли ещё 5 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА (Gibco, США), интенсивно пипетировали 5-6 раз и помещали в инкубатор еще на 15 мин. По окончании инкубирования отбирали 5 мл суспензии клеток, ингибировали действие трипсина добавлением среды, содержащей сыворотку. Содержимое интенсивно перемешивали, переносили в 15-миллилитровую пробирку и центрифугировали при 1700 об/мин 3 мин. К клеточному осадку добавляли 10 мл среды, содержащей сыворотку, ресуспендировали и переносили на 10-сантиметровую культуральную чашку (Corning, Orange или Falcon, Германия). Полученные МЭФ оставили в инкубаторе, при 37С и 5% СО2. К оставшемуся содержимому добавляли ещё 5 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА и проводили описанную процедуру ещё дважды. Чашки с МЭФ инкубировали (37С и 5% СО2) в течение ночи.

Плотность МЭФ, прикрепившихся к поверхности чашки, оценивали визуально с помощью световой микроскопии утром следующего дня. Когда плотность клеток составляла 90%, клетки пересевали согласно общепринятой методике.

МЭФ (а также эмбриональные фибробласты крыс (КЭФ) и клетки линии HEK293T) культивировали на среде DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) (Gibco, США) с добавлением 10% сыворотки плодов коровы (Sigma, Германия), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США).

КЭФ получали из 20-суточных зародышей аналогичным методом.

Культивирование ЭС клеток мыши. ЭС клетки мыши культивировали на среде Knock-OUT DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% сыворотки плодов коровы (Sigma, Германия), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США), 50 мг/мл пирувата натрия (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США), 50 мкМ -меркаптоэтанола (Sigma, Германия).

Клетки культивировали на культуральных чашках, предварительно обработанных 0.1% ным раствором желатина (Sigma, Германия).

Трансфекция кальций-фосфатным методом. За день до трансфекции клетки линии HEK293T рассевали в плотности 4106 на 10-сантиметровую культуральную чашку. За 2 ч до трансфекции клеткам меняли среду на свежую. Свежие трансфекционные смеси готовили следующим образом: в пробирке смешивали 87.5 мкл 2 М CaCl2 (Sigma, Германия), 32.5 мкл ТЕ, необходимое количество ДНК, объём доводили до 600 мкл стерильной H2O. Далее, в полученный раствор вкапывали (примерно 1 капля в секунду) 600 мкл 2-кратного буфера HBS (NaCl 280 мМ, Hepes 100 мМ, Na2HPO4 1.5 мМ;

7.11pH7.13). Полученную смесь оставляли на 15 мин при комнатной температуре для образования преципитата, который затем медленно вкапывали в среду культивирования подготовленных для трансфекции клеток HEK293T. Клетки инкубировали с преципитатом в течение ночи при 37С и 5% СО2. Среду меняли на свежую через 16-18 ч.

Упаковка вирусных частиц. Полноразмерные кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc получали из ЭС клеток мыши путем реакции обратной транскрипции, амплифицировали методом ПЦР и клонировали в лентивирусный вектор LVTHM, предоставленный Д. Троно (Wiznerowicz and Trono, 2003). Для сборки вирусных частиц клетки линии HEK293T (4106 на 10-сантиметровую чашку) трансфецировали кальций фосфатным методом, одновременно вводя плазмиду pMD2G (4 мкг), кодирующую белки вирусной оболочки, плазмиду pCMV-dR8.74PAX2 (8 мкг), кодирующую белки, необходимые для сборки вирусной частицы, и одну из лентивирусных плазмид, кодирующих Oct4, Sox2, Klf4, cMyc или EGFP (11 мкг). На следующий после трансфекции день клеткам меняли среду. Супернатант, содержащий вирусные частицы, собирали в течение 2 последующих дней. Общий объём супернатанта, содержащего вирусные частицы, фильтровали через целлюлозо-ацетатные фильтры 0.22 мкм (Millipore, Германия). Вирусные частицы концентрировали путём ультрацентрифугирования (Backman, rotor SW-32-Ti, США) 17000 об/час в течение 3 ч. Осаждённые вирусы растворяли в бессывороточной среде (OptiMEM, Gibco, США) в течение ночи при +4С при постоянном покачивании, титровали по стандартной методике (http://tcf.epfl.ch/page 6764.html) и хранили в аликвотах при –80С.

Получение иПС клеток крысы. КЭФ пассажа 3 высевали за день до заражения в плотности 1.5105 клеток / 9.4 см2 (1 лунка 6-луночного планшета) и инфицировали на следующий день лентивирусами, экспрессирующими Oct4, Sox2, Klf4, cMyc и, для визуализации эффективности трансфекции, EGPF. Через четыре дня после вирусного заражения клетки пересевали на культуральные чашки (10см, Falcon, США), предварительно покрытые монослоем митотически инактивированных МЭФ, и культивировали в одной из следующих сред: (1) N2B27, 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США), 0. мМ -меркаптоэтанола (Gibco, США), 3 мкМ CHIR99021 (Stemgent, США) – ингибитора GSK3, 0.5 мкМ PD0325901 (Stemgent, США) – ингибитора MEK, и 103 Ед/мл LIF (leukemia inhibitory factor) (PAA, Австрия) (Buehr et al., 2008) (далее по тексту – среда N2B27+2i+LIF);

(2) KnockOUT-DMEM (Gibco, США), 20%-ного заменителя сыворотки KnockOut-SR™ (Gibco, США), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 50 мг/мл L-глютамина (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США), 0.1 мМ -меркаптоэтанол, 3 мкМ CHIR99021, 0.5 мкМ PD0325901, 0.5 мкМ A-83-01 (Tocris Bioscience, США) – ингибитора ALK5 и 103 Ед/мл LIF (PAA, Австрия) (Li et al., 2009) (далее по тексту – среда KSM+3i+LIF). Через 10-12 сут после пересева колонии крысиных иПС клеток индивидуально отбирали, обрабатывали трипсином (0.25% TrypLE™ Express, Gibco, США) и переносили в лунки 96-луночного планшета, предварительно покрытые митотически инактивированными МЭФ, и продолжали вести 1-2 пассажа в соответствующих средах. В дальнейшем, культивирование всех полученных культур иПС клеток крысы проводилось в среде N2B27+2i+LIF. Замена среды производилась каждые 1-2 сут.

Получение иПС клеток мыши. иПС клетки мыши получали аналогично крысиным клеткам, при помощи лентивирусного заражения на среде N2B27+2i+LIF.

Далее, иПС клетки мыши культивировали в среде на основе KnockOUT-DMEM (Gibco, США), 20%-ного заменителя сыворотки KnockOut-SR™ (Gibco, США), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 50 мг/мл L глютамина (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США), 0.1 мМ меркаптоэтанола, 103 Ед/мл LIF (PAA, Австрия) на чашках, покрытых митотически инактивированными фибробластами или желатином, в зависимости от задачи.

Электропорация ЭС клеток мыши и иПС клеток крысы. Находящиеся в логагифмической фазе роста ЭС (иПС) клетки, культивируемые на подслое из митотически инактивированных фибробластов, обрабатывали трипсином, действие трипсина останавливали средой для культивирования МЭФ, клетки ресуспендировали до одноклеточной суспензии и оставляли в инкубаторе для удаления МЭФ, имеющих более высокие в сравнении с ЭС (иПС) клетками адгезионные свойства (для клеток, культивируемых на желатине, этот шаг опускали). Через 30 мин. суспензию ЭС (иПС) клеток собирали, центрифугировали и отмывали один раз PBS. ЭС (иПС) клетки мыши электропорировали (5x106 клеток;

кюветы 0.4 см;

BioRad GenePulser: 240В, 500 мкФ) линеаризованной плазмидой p2A2B-tk-TKiresPuro;

в случае иПС клеток крысы проводили ко-электропорацию циркулярной плазмидой pMC-Cre и линеаризованной плазмидой p2A2B-tk-TKiresPuro в молярном отношении 10:1. После электропорации клетки высевали на чашки, покрытые митотически инактивированными фибробластами, и культивировали в соответствующих средах. Через 48 ч после электропорации в среду культивирования добавляли пуромицин (Sigma, Германия) до конечной концентрации 1 мкг/мл, селекцию проводили в течение двух суток. Через 10-12 д после окончания селекции колонии ЭС (иПС) клеток индивидуально отбирали, обрабатывали трипсином и культивировали, как описано выше.

Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемых клеток. Адгезивные клетки фиксировали в 4%-ном ПФА на PBS 10 мин при комнатной температуре, промывали в PBS и блокировали в блокировочном растворе (2% БСА (бычий сывороточный альбумин), 1% овечья сыворотка, разведённые в PBS) 30 мин при комнатной температуре. Клетки затем промывали один раз PBS с добавлением детергента Tween-20, разведенного до конечной концентрации 0.1%. Первичные антитела на исследуемые белок (Oct4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology Inc), SSEA-1 (MC-480, Developmental Studies Iowa Hybridoma Bank), Nanog (ab21603, Abcam), III -Tubulin (TUJ1) (MMS-435P, Covance)) разводили в блокировочном растворе и инкубировали с образцом один час при 37С или в течение ночи при 4С. После этого препараты промывали 5-6 раз 0.1%-ном Tween-20-PBS и инкубировали 0.5 ч при комнатной температуре в блокировочном буфере со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa-488 или Alexa-546 (Molecular Probes, США), отмывали два раза в 0.1% Tween-20-PBS. Для флуоресцентной визуализации клеточных ядер образцы докрашивали раствором DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, Германия), концентрацией 1 мкг/мл. Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert40 (Zeiss, Германия) или лазерного сканирующего микроскопа Leica (Leica, Германия).

Проточная цитофлуореметрия (FACS). Мышей анестезировали раствором кетамина. Кровь для FACS-анализа (примерно 1 мл) забирали из сердца шприцом, содержащим 100 мкл 2.5%-ную ЭДТА, перемешивали и переносили в пробирку. К клеткам затем добавляли 10 мл буфера ERY (Erythrocyte-lysis–buffer: 155 мМ NH4Cl;

мМ Na2CO3;

1 мМ ЭДТА pH 7.3). Кровь центрифугировали при скорости 1200 об/мин в течение 3 мин. Осадок промывали 1 раз в PBS. Если сохранялся красный цвет клеточного осадка, раунд промывки с использованием буфера ERY повторяли. Клетки суспендировали в буфере FACS (2% FBS;

2 мМ EDTA на PBS) (5-10106 кл/мл). Антитела (CD45.1 (BD Pharmingen, CD 45.1-PE (clone: A20) BD 553776) CD45.2 (BD Pharmingen, CD 45.2 APC (clone:104) BD 558702)) разводили 1:10 в буфере FACS. 10 мкл свежеприготовленного раствора антител смешивали с 100 мкл суспензии клеток в буфере FACS (5-10105 клеток). Клетки затем инкубировали 20 мин в темноте, промывали дважды буфером FACS, суспендировали в 500 мкл буфера FACS и инкубировали с мкг/мл йодида пропидия. Полученную суспензию анализировали на проточном цитофлуориметре FACSAria2 (BD Biosciences, США).

Результаты и обсуждение Раздел 1. Получение иПС клеток крысы После нескольких неудачных попыток репрограммирования крысиных фибробластов в иПС клетки по стандартным протоколам, зарекомендовавшим себя при получении иПС клеток мыши и человека (Takahashi and Yamanaka, 2006;

Okita et al., 2007;

Takahashi et al., 2007;

Yu et al. 2007), мы использовали недавно предложенную методику получения ЭС клеток крысы (Buehr et al., 2008). Методика базируется на продемонстрированном в более ранних публикациях положительном эффекте удаления сыворотки при одновременном добавлении ингибитора MAP киназы (MEK1/ERK), PD0325901, ингибитора киназы гликоген-синтазы 3 (GSK3b) CHIR99021 и активатора LIF/STAT3 сигнального пути LIF на поддержание плюрипотетности ЭС клеток человека и мыши (Buehr et al., 2008).

Использование такой среды (сокращенно обозначенной в настоящей работе как N2B27+2i+LIF) позволило нам успешно получить иПС клетки из КЭФ (Рис.1).

В А Б Рис. 1. Получение иПС клеток крысы. (А) Исходные эмбриональные фибробласты крысы;

(Б) полученные из них при помощи заражения Oct4, Sox2, Klf4, cMyc первичные колонии иПС клеток крысы;

(В) иПС клетки крысы после нескольких пассажей в среде N2B27+2i+LIF Далее мы сравнили эффективность репрограммирования КЭФ при культивировании в среде N2B27+2i+LIF и в KSM+3i+LIF – среде, успешно использованной для получения иПС клеток (Li et al., 2009). Эффективность репрограммирования в случае использования среды N2B27+2i+LIF была в 1.5 раза ниже, однако доля выживаемости отбираемых клонов через два пассажа культивирования в этой среде был примерно в 3 раза выше (Таблица 1).

Таблица 1.

Эффективность получения иПС клеток крысы при различных условиях культивирования.

Среда культивирования Источник Эффективность Доля репрограммирования выживаемости в % от общего числа клонов DMEM + 10-15% FCS + LIF (Takahashi and 0 Yamanaka, 2006) 8.9±1.3x10- DMEM + SR + 2i + LIF + A-83-01 (Li et al., 2009) 5.4± 0.9x10- N2B27 + 2i + LIF (Buehr et al., 2008) Известно, что анеуплоидия и принадлежность ЭС клеток (вероятно, это же относится и к иПС клеткам) к женскому полу негативно сказывается на их способности дифференцироваться в клетки полового пути – свойство, абсолютно необходимое для проведения генного нокаута. Поэтому, для дальнейшей работы были отобраны 6 клонов, давших положительную ПЦР на наличие Y-хромосомы (Таблица 2).

Изначально кариотипировали 6 клонов иПС клеток, у которых с помощью ПЦР был выявлен мужской генотип. У всех клонов, за исключением IIIA10, который оказался смесью двух клонов, был подтверждён статус XY. При анализе выявилась довольно высокая для как тетраплоидных, так и анеуплоидных клеток. Для дальнейшей работы был выбран клон (IIIB9), геном которого сохранил максимальную целостность (Таблица 2, Рис.2).

Таблица 2.

Анализ кариотипа полученных клонов иПС клеток крысы.

Клоны (субклоны) Кариотип в Доля метафаз, % иПС клеток диплоидных клетках диплоидных анеуплоидных полиплоидных IVF3 42,XY 60 17 н/а IVF2 42,XY 50 IVC2 42,XY 68 9 IIIA10 42,XY/42XX 45 27 IVG3 42,XY 25 25 IIIB9 42,XY 79 1 G3* 42,XY 58 36 G4* 42,XY 90 6 H5* 42,XY 63 58 *- Cубклоны IIIB9 после выщепления лентивирусов н/а – не анализировано Б А Рис. 2. Результат кариотипирования клона IIIB9 (А) иПС клеток крысы и производного клона G4 после Cre опосредованного удаления лентивирусов из генома (Б).

Нестабильность хромосомного состава культивируемых ЭС клеток – явление, недавно описанное в литературе. Недавнее исследование, проведённое на ЭС клетках человека, показало, что увеличение числа центросом, наблюдаемое в процессе культивирования, приводит к возникновению как поли-, так и анеуплоидии (Holubcova et al., 2010). В результате подробного анализа 540 линий ЭС клеток мыши было выяснено, что только 60% обладают нормальным кариотипом, у 25% линий была обнаружена потеря X-хромосомы, у 5% обнаружены иные аномалии (Sugawara et al., 2006). Подобные исследования проводились также и для иПС клеток мыши (Takahashi and Yamanaka, 2006;

Minina Iu et al., 2010). Возможно, причиной хромосомных нарушений являются, с одной стороны, условия культивирования, с другой – собственно свойства иПС клеток. Также, возможно, что причиной хромосомных нарушений являются изменения в эпигенетическом статусе клеток.

Несмотря на то, что лентивирусные векторы на основе ВИЧ, как считается, не подвержены процессу эпигенетического глушения в большинстве дифференцированных клеток, в иПС клетках, равно как и в других плюрипотентных клетках любых видов, мы наблюдали частую спонтанную деактивацию лентивирусов. Кроме того, постоянная экспрессия 4 репрограммирующих факторов в иПС клетках может негативно сказаться на их дифференцировке. Сообщалось также, что реактивация провируса cMyc после прохождения через клетки полового пути может приводить к опухолевому росту (Okita et al., 2007;

Brambrink et al., 2008). Таким образом, чтобы избежать возможных проблем, нами была поставлена задача удалить провирусы из генома репрограммированных клеток, для чего были использованы loxP-сайты, введенные в LTR (long terminal repeats) использованных для репрограммирования вирусных векторов (Wiznerowicz and Trono, 2003). Клон IIIB9 ко-электропорировали двумя плазмидами: циркулярной плазмидой, кодирующей Cre-рекомбиназу, необходимую для выщепления провирусов из генома иПС клеток, и линеаризованной плазмидой p2A2Btk-TKiresPuro, преимущества стабильного введения которой в геном иПС клеток приведены ниже. Первичную оценку успешного удаления провирусов из генома – отсутствие сигнала EGFP – проводили визуально, с помощью флуоресцентной микроскопии (Рис. 3А). Удаление остальных провирусов отслеживали при помощи ПЦР геномной ДНК, используя праймеры, специфичные к экзогенным Oct4, Sox2, Klf4, cMyc и GFP (Рис. 3Б). В двух из 96 проанализированных клонов (G4 и H5) успешно прошло удаление всех пяти провирусов.

А Б Рис. 3. А – Визуализация выщепления EGFP лентивируса на примере исходного клона IIIB9 и его производных – клонов H5, G3 и G4. Б – Выщепление лентивирусов из генома клона IIIB9 (кроме Oct4 в G3), показанное при помощи ПЦР на экзогенные Oct4, Klf4, Sox2, cMyc, EGFP и гена тимидинкиназы (tkTK) ДНК. ПЦР на ген Sry (расположен на Y хромосоме) проведена для нормализации и для подтверждения пола иПС клеток крысы.

Все проанализированные субклоны имели нормальный кариотип 42,XY (Рис. 2Б), сохраняли морфологию, подобную ЭС клеткам (Рис. 3А), и экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния, такие как Oct4, Nanog, SSEA1 (Рис. 4).

Рис. 4. Иммунофлуоресцентная окраска иПС клеток (клон H5) на указанные маркеры плюрипотентного состояния. Верхний ряд – окраска ядер DAPI, нижний – антителами, специфичными для указанного белка.

При введении иПС клеток (1-2x106) под кожу иммунодефицитным крысам или мышам линии Nude у животных-реципиентов наблюдалось образование тератом (Рис. 5) – опухолей, несущих в своём составе клетки и ткани, которые являются производными всёх трёх зародышевых листков.

Рис. 5. Гистологический анализ срезов тератом, образованных при инъекции иПС клеток (клон H5) бестимусным крысам. Показаны слева направо: многослойный эпителий (эктодерма), хрящ (мезодерма), и бронхиальный эпителий (эндодерма).

Все вышеперечисленные данные достоверно подтверждают, что нами были получены новые линии иПС клеток крысы, отвечающие общепринятым критериям клеточной плюрипотентности. Результаты этой части работы также свидетельствуют о том что Cre-опосредованное удаление провирусов из генома не приводит к появлению хромосомных нарушений и не влияет на плюрипотентный статус полученных клеток.

На следующем этапе работы была поставлена задача проверить зависимость иПС клеток крысы от присутствия в среде культивирования ингибиторов MAP киназы (MEK1/ERK), PD0325901, киназы гликоген-синтазы 3 (GSK3b) CHIR99021 и известного активатора LIF/STAT3 сигнального пути – фактора ингибирования лейкимии (LIF). С этой целью был проведён клональный анализ, который показал, что для поддержания пролиферативной активности и жизнеспособности этим клеткам абсолютно необходимы и LIF, и CHIR99021, а удаление из среды культивирования хотя бы одного из них приводит к гибели клеток. Удаление из среды культивирования ингибитора PD0325901 приводит к быстрой дифференцировке клеток (Рис. 6).

Рис 6. Клональный тест иПС клеток крысы. Типичный пример окраски на щелочную фосфатазу (маркер недифференцированных иПС клеток). Примерно 500 клетки сеяли в лунку 6-луночного планшета и культивировали в течение 5 сут в указанных условиях. Слева – изображение при увеличении в 2.5 раза, справа – при увеличении в 10 раз.

Таким образом, наличие обоих ингибиторов и LIF необходимо как для репрограммирования, так и для поддержания плюрипотентного состояния в процессе дальнейшего культивирования иПС клеток крысы, что согласуется с литературными данными, касающимися ЭС клеток крысы (Buehr et al., 2008;

Ying et al., 2008).

Стабильное введение 2A2Btk–TKiresPuro кассеты, помимо впервые показанной в настоящей работе возможности проведения трансгенеза на иПС клетках (необходимой предпосылки для дальнейших попыток проведения гомологичной рекомбинации в заданных геномных локусах, необходимой для дальнейшего осуществления генного нокаута на крысах с использованием иПС клеток), сообщало иПС клеткам крысы важные свойства. Так, даже в присутствии в среде культивирования LIF и обоих ингибиторов киназ, полученные нами иПС клетки крысы имели предрасположенность к спонтанной дифференцировке при культивировании in vitro и могли поддерживаться в культуре, сохраняя недифференцированное состояние, лишь ограниченное число пассажей (Рис. 7).

Рис. 7. Элиминация дифференцированных производных от иПС клеток крысы после двухдневного культивирования в присутствии пуромицина (правая колонка). Для сравнения показаны клетки без подобной обработки (левая колонка). Верхний ряд – окраска на щелочную фосфатазу (AP), известный маркер недифференцированных плюрипотентных клеток, нижний ряд – фазовый контраст.

Присутствие же 2A2Btk–TKiresPuro кассеты позволяло, даже после кратковременного воздействия на культуры иПС клеток пуромицином, существенно улучшать морфологические характеристики, эффективно элиминируя дифференцированные клетки (Рис.7). С другой стороны, присутствие гена тимидин киназы (TK) в кассете позволяло не менее эффективно удалять из популяции недифференцированные клетки при обработке ганцикловиром (GCV) как in vitro, так и in vivo (данные не представлены). Последнее свойство особенно ценно при проведении исследований, нацеленных на использование иПС (равно как и ЭС) клеток в целях заместительной клеточной терапии, поскольку предупреждает возникновение и рост тератом из остаточных недифференцированных иПС и ЭС клеток, которые практически всегда присутствуют при направленной дифференцировке этих клеток in vitro.

Рис. 8. Вид сформированных живых (слева) и погибающих (справа) эмбриональных телец соответственно при формировании на среде N2B27+CHIR и среде, содержащей 15% сыворотки.

В дальнейшем нами была исследована способность полученных линий иПС клеток крысы дифференцироваться in vitro. Во-первых, нами был сделан вывод о необходимости присутствия ингибитора CHIR99021 в процессе формирования эмбриональных телец (ЭТ) из иПС клеток крысы, так как формирование ЭТ, равно как и культивирование иПС клеток крысы, невозможно в присутствии сыворотки (Рис. 8). После того как были подобраны условия для успешного формирования ЭТ, нами был опробован протокол нейрональной дифференцировки. Для этого ЭТ, сформированные в течение двух сут. по методике «висячих капель» и дополнительно культивируемые в течение 4 сут. на низкоадгезивных чашках, помещали на покрытые ультратонким слоем матригеля чашки и культивировали в среде N2B27. По прошествии недели в культурах визуально выявлялись нейроны, что подтверждалось при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток на известный нейрональный маркер – 3-тубулин (Tuj1) (Рис 9, а, б).

в а б Рис 9. Результаты дифференцировки иПС клеток крысы. а, б - Дифференцировка иПС клеток в нейроны, показанная при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания на белок 3-тубулин (Tuj1). в - Анализ экспрессии различных маркеров в эмбриональных тельцах на основе иПС клеток 2 и 4 сут. после формирования (EB2, EB6) и 6 дней после рассева (dpp6), показанный методом ОТ-ПЦР. Анализировали мезодермальные (AFP и Flk1), эндодермальные (Gata4 и Sox17) и эктодермальный (Nestin) маркер клеточных типов.

Направленная дифференцировка в другие клеточные типы в настоящей работе детально не исследовалась. Однако нами были проанализированы, с помощью ОТ-ПЦР, РНК из эмбриональных телец на разных стадиях зрелости и была выявлена экспрессия генов, характерных для всех 3 зародышевых листков (Рис 9, в).

Несмотря на то, что мышь и крыса являются близкородственными видами, условия культивирования ЭС и иПС клеток двух видов заметно отличаются. Составы сред, подходящие для получения и рутинного культивирования ЭС (иПС) клеток мыши, вызывают гибель крысиных клеток;

то же касается и дифференцировочных сред.

Невозможность использования сыворотки в дифференцировочных протоколах значительно усложняет подбор условий для направленной дифференцировки. Кроме того, исключается возможность использования уже имеющихся протоколов, в которых используется сыворотка, успешно работающих на клетках мыши. Однако такие ограничения заставляют выискивать новые протоколы дифференцировки на основе бессывороточных условий, что особо актуально ввиду их востребованности в заместительной терапии у человека. иПС клетки крысы культивируются нами в среде N2B27, изначально разработанной для культивирования клеток нейронального ряда, то при удалении ингибиторов и LIF, клетки имеют больший потенциал к дифференцировке именно в нейрональном направлении. При рассмотрении крысы и крысиных иПС клеток как полноценной модели при изучении вопросов заместительной клеточной терапии человека очевидна необходимость разработки протоколов дифференцировки на основе бессывороточных сред. Это позволит в дальнейшем провести параллель между экспериментами на крысе и исследованиями на человеке.

Наиболее строгим доказательством плюрипотентной природы иПС клеток является их способность встраиваться в три зародышевых листка в процессе эмбриогенеза.

Поэтому полученные нами иПС клетки крысы (клон H5) были использованы в эксперименте по формированию химерного организма. На 18-ые сутки после подсаживания эмбрионов псевдобеременным крысам самок-реципиентов забивали и проводили ПЦР-анализ на включение иПС клеток в различные части эмбриона. Как можно видеть по результату ПЦР-анализа геномной ДНК (Рис. 10), химера №12 показала включение иПС клеток во все проанализированные ткани эмбриона, представляющие производные всех 3 зародышевых листков.

Рис. 10. Участие дифференцированных потомков иПС клеток в иПС-крысиных химерах. Показан генотипический ПЦР-анализ геномной ДНК эмбриона №13 (негативный контроль) и №12. Потомки иПС клеток присутствуют в хвосте (Т), печени (L), голове (H), почках (K), но, как и ожидалось, не в плаценте (P).

Анализ проводили с помощью праймеров на тимидинкиназу (ТК).

Таким образом, подтверждается принципиальная возможность дифференцировки полученных нами иПС клеток во все клеточные типы. Представленные данные могут служить заделом для дальнейших исследований, в частности, стимулировать работы по поиску условий для направленной дифференцировки в клеточные типы, не описанные в настоящем исследовании.

Раздел 2. Метод генетической сенсибилизации При создании суицидальной кассеты 2A2Btk–TKiresPuro нами был использован энхансер 2A+2B из дистальной консервативной области гена Pou5f1 (Oct4), представляющий собой последовательность из 200 нуклеотидов, содержащую сайт связывания для гетеродимера Oct4/Sox2 (2B) и ДНК элемент для связывания неизвестного транскрипционного фактора (2A). В сочетании с промотором гена Pou5f1 или же с иным минимальным промотором, таким как промотор гена тимидинкиназы (tk), энхансер 2A+2B может служить элементом управления транскрипции, специфичным для ЭС клеток в опытах по временной трансфекции (Okumura-Nakanishi et al., 2005). Описанный комбинированный регуляторный элемент 2A2Btk может эффективно и, что особо важно, избирательно экспрессироваться в плюрипотентных клетках при условии стабильной интеграции в геном. Исходя из этого мы поместили под контроль регуляторного элемента 2A2Btk бицистронную кассету TKiresPuro, позволяющую проводить как позитивную (за счет маркера резистентности к пуромицину (Puro)), так и негативную селекцию (за счет гена тимидинкиназы (TK) вируса герпеса, сообщающего клеткам чувствительность к ганцикловиру). Относительно небольшой размер 2A2Btk–TKiresPuro кассеты позволил нам поместить её в лентивирусный вектор и, тем самым, осуществлять её доставку в геном посредством вирусного заражения (Рис. 11).

Рис. 11. Ген-сенсибилизатор, кодирующий тимидинкиназу вируса герпеса (HSV-TK), введен под транскрипционный контроль энхансера (2A2B) и промотора (СR1) гена Oct4 или промотра гена тимидинкиназы (tk), обеспечивающих экспрессию TK в недифференцированных ЭСК/иПСК, но не в производных дифференцированных клетках. IresPuro (часть этой бицистроной кассеты) позволит отбирать, в присутствии пуромицина, обладающие ею ЭС/иПС клетки. Кассета помещена в геномный, плазмидный и лентивирусный векторы. LTR/SIN, cPPT, WPRE, tetO, H1 – необходимые элементы вируса, loxP – loxP-сайт, pA – сигнал полиаденилирования.

Для доставки в ЭС/иПС клетки геномный и плазмидный конструкты линеаризовались и вводились в эти клетки путем электропорации, а лентивирусный конструкт упаковывался в вирусные частицы, как описано в разделе «Материалы и методы», и использовался для вирусного заражения ЭС/иПС клеток. Селекцию стабильно трансфицированных/трансдуцированных клонов проводили в присутствии пуромицина (1-2 мкг/мл). Резистентные клоны (названные TK-ЭС или TK-иПС) отбирали на 8–12-е сут. после электропорации/инфицирования и подвергали дальнейшему тестированию – направленной дифференцировке и негативной селекции в присутствии ганцикловира. О присутствии остаточных недифференцированных ЭС/иПС клеток судили по морфологическим характеристикам (Рис. 12) и окрашиванию фиксированных культур клеток на щелочную фосфатазу – известный маркер недифференцированных ЭС/иПС клеток (Рис. 13 и 14).

Рис. 12. Функциональное тестирование ЭС клеток, несущих стабильно интегрированный 2A2B-tk-TКiresPuro плазмидный конструкт (ТК-ЭС). (А) обычный вид культуры ЭС клеток: присутствуют как недифференцированные, так и спонтанно дифференцированные клетки. (Б) В присутствии пуромицина (Puro) последние эффективно элиминируются, тогда как недифференцированные ЭС клетки остаются жизнеспособными. ЭС клетки направлялись в дифференцировку в монослое под действием ретиноевой кислоты (RA) (В) или через формирование эмбриональных телец (Г), а затем подвергались негативной селекции в присутствии ганцикловира, элиминирующего остаточные недифференцированные ЭС клетки.

Рис. 13. Эффективное удаление резидуальных недифференцированных ЭС/иПС клеток после дифференцировки ТК-ЭСК/иПСК в монослое под действием RA и дальнейшего культивирования в присутствии ганцикловира, показанное окраской на щелочную фосфатазу – маркер недифференцированных ЭС/иПС клеток (А). Необработанные ганцикловиром культуры показывают высокое содержание позитивных на щелочную фосфатазу клеток (Б).

Рис. 14. Эффективное удаление резидуальных недифференцированных ЭС/иПС клеток после дифференцировки ТК-ЭС/иПС в нейрональном направлении посредством образования эмбриональных телец. Культивируемые клетки обрабатывали после дифференцировки ганцикловиром и окрашивали либо антителами на нейрональный маркер TuJ1 (А) либо на щелочную фосфатазу (Б). Необработанные ганцикловиром культуры показывают высокое содержание позитивных на щелочную фосфатазу клеток (В).

Наиболее достоверным способом оценки присутствия резидуальных ЭС/иПС клеток явилось введением клеточных суспензии под кожу иммунодефицитным мышам линий NUDE и отслеживанием образования тератом спустя 3-6 недель (Рис. 15).

А Б В Б Рис. 15. (А) Типичный пример тератом, возникающих у реципиентных мышей линии NUDE спустя недели после введения им под кожу недифференцированных ЭС или иПС клеток, либо дикого типа, либо несущих 2A2A-tk-TKiresPuro трансген (ТК-ЭСК) и не прошедших курс инъекций ганнцикловира. (Б) Вырезанные тератомы;

отрезок соответствует 1 см. (В) Парафиновые срезы тератом, окрашенные гематоксилином и эозином;

представлены различные типы тканей (поперечно-полосатые мышцы, хрящ, нейрональный эпителий, многослойный эпителий, бокаловидный эпителий, кишечный эпителий и др.) – потомков всех трех зародышевых листков.

Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении функций повреждённой поджелудочной железы.

У лабораторных мышей линии Nude индуцировали сахарный диабет путём интраперитонеального (i/p) введения стрептозотоцина (STZ) (Sigma, Германия) (Schein et al., 1967) (Lenzen, 2008), растворённого в ледяном цитратном буфере (pH 4.5), из расчета 200 мг/кг массы тела. Нарушение функции поджелудочной железы у ряда экспериментальных животных наблюдалось уже через 24 ч после введения препарата. За основу данного эксперимента нами была взята работа (Takeshita et al., 2006), в которой авторы демонстрируют хоуминг и заселение повреждённой поджелудочной железы ЭС клетками при их интраперитонеальном введении, но наблюдается образование тератом и не наблюдается терапевтического эффекта и восстановление функции органа. Динамика событий в ходе заложенного нами эксперимента отражена в таблице 3 и на рис. 16.

Таблица Сводная таблица условий проведения эксперимента по восстановлению функций повреждённой поджелудочной железы.

STZ GCV масса доза ЭС клон опухоли Glc Glc s.c./i.p. Glc Glc i.m. Glc ( (мМ) мг/кг (мМ) мЭС/5542 (106/106) (мМ) (мМ) мг/кг) (мМ) № г 1 23.2 7.9 200 9.3 G2 1/1 23.4 18.8 29. + 2 22.7 7.0 200 2.9 G2 1/1 20.6 24.0 31. + 3 23.6 7.3 200 7.0 G2 1/1 13.0 15.5 15. - + 4 23.5 6.2 200 7.8 G2 1/1 11.0 12.8 17. + 5 19.6 7.8 200 6.9 G2 1/1 7.3 10.4 8. + 6 22.9 7.8 200 8.5 - - 8.8 25.2 27. + 7 23.7 5.8 200 8.0 G2 1/1 7.2 8.7 9.4 + 8 23.4 8.3 - 7.5 G2 1/1 7.7 6.3 8. - + 9 25.1 8.5 200 7.3 A1 1/1 12.4 18.1 23. + 10 24.8 6.6 200 9.0 A1 2/2 9.9 15.4 25. - + 11 23.4 7.1 200 7.6 A1 2/2 8.9 9.0 9. + 12 24.0 6.7 200 7.5 - - 8.9 23.5 22. + 13 25.1 6.4 200 4.1 A1 2/2 8.6 16.9 20. - + 14 20.0 6.1 - 3.8 A1 2/2 4.6 6.7 4. д10 д0 д1 д2 д9 д Примечание. № - номер экспериментального животного. Glc – глюкоза, STZ – стрептозотоцин, A1 и G2 – имена клонов ЭС клеток мыши, s.c./i.p. – метод введения клеток, соответственно подкожно и внутрибрюшинно (subcutaneous/ intraperitoneal), GCV – ганцикловир, i.m. – intramuscular (внутримышечно).

д-день эксперимента.

Измерение уровня глюкозы (глюкометр AccuCheck-Performa) в крови подопытных животных проводили начиная с первого дня и в течение двух месяцев. Динамика измерений приведена на рис. 16.

Ряд Ряд Ряд Ряд Ряд Ряд Ряд 15 Ряд Ряд Ряд 5 Ряд Ряд Ряд 0 2 4 6 8 10 Ряд Рис 16. Диаграмма, отражающая изменение уровня глюкозы в крови подопытных животных. По оси абсцисс – время (недели), по оси ординат – концентрация глюкозы в крови (мМ). Ряд – номер экспериментального животного, соотретствует номеру в таблице 3.

Через два месяца после введения клеток подопытных мыши умерщвляли, проводили вскрытие, извлечение опухолей, поджелудочных желёз и их анализ. Опухоли и поджелудочные железы заключали в парафин и анализировали гистологически и иммуногистохимически.

Во всех случаях при обработке мышей ганцикловиром опухоли не возникают (Таблица 3, мыши 1, 2, 4, 5, 6, 9, 11, 12). Cледует, однако, отметить, что среди мышей, не обработанных ганцикловиром (Таблица 3, мыши 3, 7, 8, 10, 13) хоминг в область повреждения был достоверно обнаружен только у мыши №7 (Рис 17).

Рис. 17. Результат вскрытия экспериментальной мыши №7. Чёрной стрелкой обозначена контрольная опухоль, образованная клетками, введёнными под кожу. Белой стрелкой обозначена опухоль в области ПЖЖ, демонстрирующая хоминг ЭС клеток, введённых внутрибрюшинно.

Следовательно, наблюдается разночтение с работой (Takeshita et al., 2006), в которой авторы демонстрируют хоминг в 100% случаев. Но, так как эксперимент был поставлен лишь единожды, мы не можем настаивать на этом, возможно, нами не были соблюдены некоторые технологические нюансы.

Поджелудочные железы мышей, которые прошли обработку ганцикловиром, анализировали иммуногистохимически, сравнивая с железами не обработанных STZ мышей из контрольной группы (Рис. 18).

Рис. 18. Окрашивание парафиновых срезов поджелудочной железы антителами на инсулин здоровой (слева) мыши и обработанной STZ и пролеченной ТК-ЭС клетками и ганцикловиром (справа).

Хоуминг клеток в нашем случае обнаружен не был, о чем свидетельствует отсутствие позитивной окраски на инсулин у экспериментальной группы животных.

Исходя из выше описанных данных, можно сделать вывод, что на данном этапе испытания предлагаемая технология не даёт достоверного терапевтического эффекта на модели химически индуцированного диабета.

Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении гематопоэза у летально облучённых мышей.

Для доказательства возможности применения «суицидальной стратегии» для восстановления функции органа или ткани реципиента in vivo, что должно достигаться путем прямого введения недифференцированных TK-ЭС клеток без каких-либо предварительных дифференцировок и удаления резидуальных TK-ЭС клеток в культуре, была предложена модель восстановления гематопоэза у летально облучённых мышей (Рис. 19).

Рис. 19. Схема эксперимента по восстановлению кроветворения у летально облученных мышей путем прямой инъекции ТК-ЭС клеток (вместе с клетками-помощниками, полученным из костного мозга CD45. мышей). Справа показан ожидаемый результат анализа периферической крови реципиентных мышей спустя 6 недель после инъекции ТК-ЭС клеток, проведенного методом проточной цитофлуориметрии.

Использованные антитела позволяют различать аллели пан-гемапоэтического поверхностного маркера СD45.

Иллюстрацией предложенного подхода является описанный ниже эксперимент, показывающий восстановления кроветворной функции костного мозга мышей за счет TK ЭС клеток. Гибридных мышей (129 C57Bl6, представляющие собой гемизиготы CD45.1/CD45.2) подвергали летальной дозе облучения (2x5.5 Гр c 5-минутным интервалом). В тот же день мыши получали внутривенную инъекцию пуромицин резистентных ТК-ЭС клеток (2x106 клеток) и, для облегчения визуализации развития тератом, дополнительно подкожную инъекцию (1x106 клеток) различных клонов TK-ЭС клеток, представляющих собой CD45.2/CD45.2 гомозиготы. Дополнительно, мышам вводили 5x105 клеток-помощников, взятых из костного мозга мышей линии С57Bl (генотип СD45.1). По прошествии 6-10 сут., в течение которых, как мы ожидали, основная масса TK-ЭС клеток должна дифференцироваться в клетки крови, проводился 5-7 дневный курс внутримышечных инъекций ганцикловира (10 мг/кг веса тела). Спустя еще 6 недель (а) регистрировалось наличие тератом в месте введения TK-ЭС клеток, (б) проводился анализ клеток крови с использованием метода проточной цитофлуориметрии, имевшего целью обнаружить среди клеток крови потомков донорских TK-ЭС клеток (генотип CD45.2/CD45.2). Общая схема прохождения эксперимента отражена так же в таблице 4.

Таблица Сводная таблица условий проведения эксперимента по восстановлению кроветворения у летально облучённых мышей д д д д д д д д д д д0 д 6 7 8 9 10 11 12 13 14 п ТК о ЭСК л клон ККМ № G G G G G G G G G 6 2*10 0,5* 1 f 15 + + + + + + + + 2 f 15 + + + + + + + + 3 f 15 + + + + + + 4 f 15 + t_sc+ l 5 f 15 + t_sc+ tg t_ 6 f 15 + sc t_sc+ l/b 7 f 15 - ++ + + + + + + + 8 f 15 9 m 14 + + + + + + + + 10 m 14 + + + + + + + + 11 m 14 + + + + + + 12 m 14 + t_sc+ tg 13 m 14 + t_sc+ b 14 m 14 + t_sc+ l Сокращения, использованные в таблице: № - номер экспериментального животного;

f, m – принадлежность особи к женскому и мужскому полу соответственно;

ККМ- клетки костного мозга (они же «клетки помощники» выше по тексту);

G – инъекции ганцикловира;

д – день эксперимента;

t_sc – опухоль, выросшая при подкожном введении ЭС клеток (+ l- в легких, +tg – в щитовидной железе, +b – в костном мозге).

Красным отмечены мыши, умершие на 9 (мышь №11) и 13-ые сутки (мыши 7, 8).

Во-первых, все облученные реципиенты (Таблица 4, мыши 7, 8), не получившие инъекции клеток, как и ожидалось, погибали на 8-14-ые сутки после облучения. Во вторых, у всех реципиентов (Таблица 4, мыши 4, 5, 6, 12, 13, 14), получивших инъекции TK-ЭС клеток, но не прошедших курс ганцикловира (Г–), развились опухоли в месте подкожного введения и, что обнаруживалось после вскрытия, в других местах (щитовидная железа, костный мозг, легкие и т.д.). Развитие тератом явилось причиной гибели Г– реципиентов к 6-й неделе после облучения. В то же время, у всех реципиентов, получивших инъекцию TK-ЭС клеток и ганцикловира (Г+) (Таблица 4, мыши 1, 2, 3, 9, 10), тератомы не развивались.

Рис. 20. Вклад производных ТК-ЭСК (клоны 14 и 15) в клетки периферической крови через 6 недель после облучения реципиентных мышей в ходе эксперимента, проиллюстрированного на Рис. 19.

Рис. 21. СD45.2-позитивные гемапоэтические потомки ТК-ЭС клеток способны дифференцироваться как в B- и Т-лимфоциты, так и в миелоидные клеточные типы гемопоэтической системы, как показано методом проточной цитофлуориметрии с использованием поверхностных маркеров на соответствующие типы клеток.

Анализ клеток периферической крови с использованием метода проточной цитофлуориметрии показал значительный (до 40%, в среднем 20%) вклад TK-ЭС клеток как в миелоидные, так и в лимфоидные типы клеток реципиентов как у Г–, так и у Г+ реципиентов, причем у последних – без каких-либо видимых тератомных или иных осложнений (Рис. 20, 21).

Таким образом, проведенный эксперимент демонстрирует возможность применения в клинической практике ЭС/иПС клеток. Основная идея заключается в безопасном (безопухолевом) и прямом (не нуждающемся в дорогостоящей, длительной и неэффективной предварительной дифференцировке в культуре) применении недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток для заместительной терапии по схеме, приведенной на Рис. 22.

Рис. 22. Схема, иллюстрирующая разработанный в настоящей работе подход (выделен жирной линией) к безопухолевому использованию ЭС/иПС клеток в клинической практике, без использования более традиционной процедуры (пунктирная линия), включающей в себя этап дифференцировки in vitro, чаще всего неэффективной и негомогенной.

Выводы 1. Новый, разработанный автором метод получения и поддержания в культуре иПС клеток крысы позволяет повысить выживаемость иПС клеток по меньшей мере в раза по сравнению с опубликованными ранее протоколами.

2. Полученные иПС клетки крысы, при использовании вирусных векторов с последующим их удалением, обладают нормальным кариотипом и плюрипотентными свойствами. О плюрипотентности полученных иПС клеток свидетельствуют экспрессия в них известных маркеров плюрипотентности (Nanog, Oct4, SSEA1, щелочной фосфатазы), а также способность этих клеток образовать тератомы и участвовать в формировании химерного организма.

3. Возможно внедрение в геном иПС клетки крысы стабильного трансгена, что является необходимым шагом на пути к проведению генного нокаута путём гомологической рекомбинации.

4. Стабильное введение в геном ЭС/иПС клеток мыши и крысы «суицидальной кассеты»

2A2Btk–TKiresPuro обеспечивает контроль над туморогенностью, что подтверждено в в экспериментах in vitro и in vivo.

5. Эксперимент по восстановлению кроветворения у летально облучённых мышей доказывает работоспособность предлагаемой «суицидальной стратегии» в тканезамещении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Лисковых М.А., Толкунова Е.Н., Бадер М., Аленина Н. и Томилин А.Н. (2008) На пути к получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) крысы // Школа конференция «Биология развития», Звенигород. Сборник тезисов. с 57- Томилин А.Н., Толкунова Е.Н., Лисковых М.А., Попов Б.В., Петров Н.С., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И. Михайлова Н.А., Морозова Л.П. (2008) Изучение возможности применения эмбриональных стволовых (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых (иПСК, iPS) клеток в заместительной терапии у человека // "Отчетная конференция по Программе президиума РАН Молекулярная и клеточная биология", Москва. Сборник тезисов. с 146- Лисковых М.А., Толкунова Е.Н., Минина Ю.А., Шилов А.Г., Петров Н.С., Попов Б.В., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Жданова Н.С., Томилин А.Н. (2009) Изучение возможности применения эмбриональных (ЭС) и индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС, iPS) клеток в заместительной терапии у человека // Всероссийский симпозиум «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий», Санкт Петербург. // Цитология. 51(9): 774- Томилин А.Н., Толкунова Е.Н., Лисковых М.А., Попов Б.В., Петров Н.С., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И. Михайлова Н.А., Морозова Л.П. (2009) Изучение возможности применения эмбриональных стволовых (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых (иПСК, iPS) клеток в заместительной терапии у человека // "Отчетная конференция по Программе президиума РАН Молекулярная и клеточная биология", Москва. Сборник тезисов. c Минина Ю.М, Жданова Н.С., Шилов А.Г., Толкунова Е.Н., Лисковых М.А., Томилин А.Н. (2010) Нестабильность хромосомного состава культивируемых in vitro плюрипотентных клеток мыши// Цитология. 52(5): 420- Лисковых М., Чуйкин И., Толкунова E., Минина Ю., Жданова Н., Ранян А., Бадер М., Аленина Н., Томилин А. (2010) Получение и анализ индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы // III Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва. Сборник тезисов. c Liskovykh M., Chuykin I., Tolkunova E., Ranjan A., Bader M., Tomilin A., Alenina N. (2010) Derivation of iPS cells from rat embryonic fibroblasts // 3rd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation in Dresden. Germany. p Liskovykh M., Chuykin I., Safina D., Ranjan A., Peter A., Tolkunova E., Mullins J., Bader M., Tomilin A., Alenina N. (2010) Derivation of iPS cells from rat embryonic fibroblasts // The 18th International Workshop on Genetic Systems in the Rat. Kyoto. Japan. p Liskovykh M., Chuykin I., Ranjan A., Safina D., Popova E., Tolkunova E., Mosienko V., Minina Iu., Zhdanova N., Mullins J.J., Bader M., Alenina N., Tomilin A. (2011) Derivation, characterization, and stable transfection of induced pluripotent stem cells Fischer rat // PLoS ONE.

Лисковых М.А., Чуйкин И., Ранян А., Сафина Д.А., Толкунова Е.Н., Минина Ю.М., Жданова Н.С., Дыбан П.А., Маллинс Дж., Костылева Е.И., Чихиржина Е.В., Бадер М., Аленина Н., Томилин А.Н. (2011) Получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы: анализ условий репрограммирования и культивирования // Цитология. 53(12): 927- Лисковых М.А., Чуйкин И., Ранян А., Попова Е., Толкунова Е.Н., Чечик Л.Л., Мосиенко В., Бадер М., Аленина Н., Томилин А.Н. (2011) Проведение генетических манипуляций и исследование дифференцировочных свойств индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы // Цитология. 53(12): 934- Список цитируемой литературы Brambrink T., Foreman R., Welstead G.G., Lengner C.J., Wernig M., Suh H., Jaenisch R.

Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells // Cell Stem Cell. 2008. 2: 151–159.

Buehr M., Meek S., Blair K., Yang J., Ure J., Silva J., McLay R., Hall J., Ying Q.L., Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts // Cell. 2008. 135:

1287-1298.

Evans M.J., Kaufman, M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. 292: 154–156.

Holubcova Z., Matula P., Sedlackova M., Vinarsky V., Dolezalova D., Brta T., Dvok P, Hampl A. Human embryonic stem cells suffer from centrosomal amplification // Stem Cells.

2010. 29: 46–56.

Lenzen S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia.

2008. 51:216–226.

Li W., Wei W., Zhu S., Zhu J., Shi Y., Lin T., Hao E., Hayek A., Deng H., Ding S. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors // Cell Stem Cell. 2009. 4: 16–19.

Minina Iu. M., Zhdanova N.S., Shilov A.G., Tolkunova E.N., Liskovykh M.A., Tomilin A.N.

Chromosomal instability of in vitro cultured mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells // Tsitologiia. 2010. 52: 420-425.

Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells // Nature. 2007. 448: 313-317.

Okumura-Nakanishi S., Saito M., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/ gene in embryonic stem cells // J Biol Chem. 2005. 280: 5307-5317.

Schein P.S., Cooney D.A., Vernon M.L. The use of nicotinamide to modify the toxicity of streptozotocin diabetes without loss of antitumor activity // Cancer Res. 1967. 27:2324–2332.

Sugawara A., Goto K., Sotomaru Y., Sofuni T., Ito T. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan // Comp Med. 2006. 56: 31-34.

Takahashi K. and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. 126: 663-676.

Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S.

Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007.

131: 861–872.

Takeshita F., Kodama M., Yamamoto H., Ikarashi Y., Ueda S., Teratani T., Yamamoto Y., Tamatani T., Kanegasaki S., Ochiya T., Quinn G. Streptozotocin-induced partial beta cell depletion in nude mice without hyperglycaemia induces pancreatic morphogenesis in transplanted embryonic stem cells // Diabetologia. 2006. 49:2948–2958.

Wiznerowicz M., Trono D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector– mediated drug–inducible RNA interference // J Virol. 2003. 77: 8957–8961.

Ying Q.L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble B., Woodgett J., Cohen P., Smith A.

The ground state of embryonic stem cell self-renewal // Nature. 2008. 453: 519-523.

Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., Jonsdottir G.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // Science. 2007. 318: 1917–1920.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.