авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Состояние апоптоза нейтрофилов периферической крови

На правах рукописи

БАЛАШОВА Светлана Николаевна

СОСТОЯНИЕ АПОПТОЗА НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ

03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Архангельск – 2013

Работа выполнена в лаборатории регуляторных механизмов иммунитета

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения Российской академии наук кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Ставинская Ольга Александровна Данилова Раиса Игнатьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова», заведующая кафедрой социальной работы и социальной безопасности института комплексной безопасности Миролюбова Ольга Алексеевна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет», заведующая кафедрой факультетской терапии Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:

учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Защита состоится «05» июня 2013 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.008.04 на базе ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу:

163045, г. Архангельск, пр. Бадигина, д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова».

Автореферат разослан «03» мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета Старцева Лариса Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Нейтрофилы являются самой Актуальность исследования.

многочисленной популяцией клеток периферической крови, на долю которых приходится до 70% общего содержания лейкоцитов. Анализируя состав периферической крови, фактически можно оценить только 50% клеток гранулоцитов, т.е. циркулирующий пул. Оставшиеся 50% составляют пристеночные нейтрофилы, готовые выйти из сосудов в ткани для осуществления фагоцитоза и связанного с ним кислородного взрыва (А.Н. Маянский, 1989;

И.С. Фрейдлин, 1998;

Н.М. Калинина, 2008). Помимо фагоцитоза пристеночные клетки могут образовывать нейтрофильные экстрацеллюлярные сети (NET), способные фиксировать микроорганизмы благодаря трехмерной структуре (S. Yousefi, 2009;

M.J. Kaplan, 2012). В свою очередь, циркулирующие нейтрофилы, находящиеся в периферической крови, не являются клетками, ограниченными в специализации. Они способны к молекулярной перестройке хроматина, реализации генетической информации, могут дифференцироваться под влиянием микроокружения в антигенпрезентирующие клетки (И.В. Нестерова, 2010).

Нейтрофилы секретируют огромное количество биологически активных веществ, в том числе почти все известные цитокины. Есть сведения, что гранулоциты способны активировать макрофаги, действуя на каспазу-6 и комплекс IL-1R/киназа-М (H. Kobayashi, 2011);

могут стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов (I. Muller, 2009), инициировать созревание дендритных клеток (S. Boudaly, 2009), вызывать CCL2-зависимый хемотаксис Th17 (M. Pelletier, 2010) и стимулировать секрецию гистамина из базофилов посредством HRA-N фактора (M.V. White, 1987). Кроме того, нейтрофилы осуществляют антителозависимую цитотоксичность, реализующуюся в реакциях противоопухолевой защиты (В.Н. Блиндарь, 2005).

Пролиферация нейтрофилов происходит в гемопоэтических элементах костного мозга, откуда в кровоток в физиологических условиях выделяются палочкоядерные формы. Продолжительность жизни нейтрофилов после выхода их из костного мозга составляет около 10 часов в циркулирующей крови и еще 2-3 дня в тканях (С.А. Луговская, 2001). Естественная гибель клеток совершается по механизму апоптоза, в очаге воспаления преимущественно некрозом (J.F. Kerr, 1972;

L. Wei-Chieh, 2011).

Существует несколько вариантов инициации апоптоза клетки. Внешний путь осуществляется за счет семейства рецепторов к фактору некроза опухоли, в частности, Fas-рецептора (APO-1, CD95), TNFR1 (p55, CD120a), TRAIL-RI и RII и др. (W.C. Liles, 1996;

P.H. Krammer, 1999), расположенных на клеточной мембране нейтрофилов. Внутренний путь программируемой гибели происходит в результате изменений в ядре и сопровождается увеличением концентрации Ca2+ в цитоплазме, активизацией эндонуклеаз и клеточных протеаз, нарушением проницаемости мембраны митохондрий (D.J. McConkey, 1989;

X.

Liu, 1996). Есть сведения о малом содержании митохондрий в зрелых гранулоцитах, что приводит к значительному сокращению процессов окислительного фосфорилирования и ограничению уровня митохондриальных белков, запускающих и регулирующих программу апоптоза (А.Н. Маянский, 1989;

K.K. Peachman, 2001). Однако представлены убедительные доказательства достаточности этого минимального количества и спектра белковых молекул для инициации программируемой гибели нейтрофилов внутренним путем (B.M. Murphy, 2003).

Вместе с тем, сведения, касающиеся динамики апоптотической активности нейтрофилов под влиянием цитокинов, противоречивы. Данных о воздействии на нейтрофилы вазомоторных аминов (гистамина и серотонина) нет. Не ясно, как меняется программируемая гибель гранулоцитов от уровня их пролиферации, фагоцитарной реакции в физиологических условиях и при патологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы – определить уровень апоптоза нейтрофилов в зависимости от их функциональной активности, цитокинового профиля, содержания вазомоторных аминов и лимфоидной реакции периферической крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность апоптоза нейтрофилов периферической крови у клинически здоровых людей и при патологии.

2. Выявить характер взаимосвязи апоптоза нейтрофилов с уровнем их пролиферации и фагоцитоза.

3. Установить влияние цитокинов и вазомоторных аминов на апоптоз гранулоцитов.

4. Изучить соотношение уровня апоптоза нейтрофилов и выраженности реакций со стороны лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Апоптоз нейтрофилов сопровождается увеличением количества палочкоядерных нейтрофилов, не влияя при этом на фагоцитарную их активность.

2. Уровень некроза значительно ниже программируемой гибели нейтрофилов, что способствует поддержанию клеточного гомеостаза без воспалительной реакции.

3. Активность апоптоза нейтрофилов ассоциируется с повышением содержания в крови IL-4, TNF-, свободного лиганда TRAIL и серотонина.

4. Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов снижает экспрессию рецепторов к главному комплексу гистосовместимости класса II на лимфоцитах.

Научная новизна исследования. Впервые выявлено, что увеличение количества апоптотических нейтрофилов AnV+/PI- в периферической венозной крови соответствует повышению концентрации палочкоядерных форм, отражающих пролиферативную активность клеток миелоидного ряда.

Установлен механизм регуляции уровня апоптоза нейтрофилов посредством шеддинга лиганда sTRAIL в межклеточное пространство.

Материалы Научно-практическая значимость исследования.

диссертации рекомендуются для использования в научно-экспериментальных исследованиях в области физиологии, иммунологии, в учебном процессе на кафедрах общей биологии, клинической иммунологии и нормальной физиологии высших учебных заведений.

Полученные в работе данные о содержании апоптотических нейтрофилов AnV+/PI- и некрозных клеток AnV-/PI+ периферической крови у клинически здоровых людей могут быть использованы в качестве нормативов физиологических колебаний исследуемых нейтрофилов у человека в различных состояниях.

Материалы исследования внедрены в практику работы врачей медицинской компании «Биокор» (акт внедрения от 18.01.2013 г.) с целью повышения точности диагностирования и своевременного назначения лечебных мероприятий.

По результатам исследования разработан способ оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы (патент на изобретение РФ № 2475743 от 31.10.2011).

Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом НИР Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН по теме «Выявление иммунных, эндокринных и метаболических маркеров возрастных перестроек функций человека, разработка методов сохранения работоспособности и продления активного периода жизни» (№ государственной регистрации 0120.0.951605).

Апробация работы. Материалы и основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях Ученого Совета Института физиологии природных адаптаций УрО РАН (Архангельск, 2010-2012);

XI Международном конгрессе проблемы иммунологии, «Современные аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011);

IV молодежной научной конференции «Экология 2011» (Архангельск, 2011);

VI конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (2011-2012);

VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012);

XI Молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012);

Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Адаптация человека на Севере: медико-биологические аспекты» (Архангельск, 2012), Архангельском отделении физиологического общества имени И.П. Павлова (Архангельск, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 121 страницах и состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 таблицами и рисунками. Список использованной литературы включает 279 публикаций, из них 41 отечественных и 238 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводили в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов 1964 год (с изменениями и дополнениями на 2008 год).

Исследовали 200 жителей Архангельской области в возрасте от 20 до лет. Обследуемые лица являлись клинически здоровыми добровольцами, у которых на момент взятия крови не было острых заболеваний. С целью определения возрастных особенностей содержания апоптотических нейтрофилов обследуемые были разделены на пять возрастных групп: 20-29 лет (56 человек), 30-39 лет (42 человека), 40-49 лет (38 человек), 50-59 лет (47 человек) и 60-77 лет (17 человек). Для анализа иммунологической реактивности и определения активности апоптоза на проточном лазерном цитофлуориметре осуществлено обследование 49 клинически здоровых людей (контрольная группа) в возрасте от 21 до 60 лет, их них 30 мужчин и женщин.

В целях определения особенностей взаимосвязи активности апоптоза нейтрофилов и иммунологических показателей данная группа (49 человек) клинически здоровых людей разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов, деление проводилось с учетом среднеквадратичного отклонения ±. Уровень указанных нейтрофилов рассчитывался как по результатам проточной лазерной цитофлуориметрии AnV+/PI- менее 3% (n=18) и более 8% (n=15), так и по показателям морфологических изменений в ядре: гранулоциты с пятью и более фрагментами ядра менее 3% (n=16) и более 6% (n=16).

Для сравнения активности программируемой гибели гранулоцитов дополнительно изучено состояние иммунной системы 120 больных – пациентов медицинской компании МК «Биокор» – в возрасте от 20 до 60 лет, из них мужчин и 93 женщины. По характеру течения и причинам возникновения патологии обследуемые лица были поделены на 2 группы: 1) группа пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения, куда включены 70 человек с заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей (хронический назофарингит, хронический тонзиллит, хронических фарингит, хронический бронхит), заболеваниями мочеполовой системы (хронический простатит, хронический аднексит, эндометрит);

2) группа пациентов с инфекционно-аллергическими процессами бактериально-грибковой этиологии в количестве 50 человек. Кроме того, обследовано 49 человек с метаболическим синдромом, диагноз поставлен врачами городского эндокринологического консультативного центра г. Архангельска. В момент исследования указанные лица проживали на территории Архангельской области и входили в возрастную группу 28–60 лет. Работа осуществлялась в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». Группа обследуемых лиц с заболеваниями была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (менее 3% и более 6%). Учет результатов осуществлялся по признакам морфологических изменений ядра и степени фрагментации хроматина. В качестве группы сравнения взяты клинически здоровые лица (n=49, 21–60 лет).

Определение апоптоза нейтрофилов периферической крови производилось в несколько этапов. Взвесь нейтрофилов выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколла плотностью 1,093-1,095 и 1,075-1,077 г/см3. После инкубации с Annexine V-FITS и Propidium Iodid нейтрофилы анализировали на проточном лазерном цитофлуориметре «Epics XL» («Beckman Coulter», США) с выделением 3 кластеров: живые клетки (AnV-/PI-), нейтрофилы, находящиеся на стадии апоптоза (AnV+/PI-), поврежденные (некротические) клетки (AnV-/PI+).

Структуру лейкограммы и сегментограммы нейтрофильных гранулоцитов изучали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза. Сегментограмму изучали по методу Й. Тодорова (1968). Нейтрофильные гранулоциты дифференцировали по содержанию фрагментов ядра. Уровень выраженности апоптоза у нейтрофилов определяли по содержанию клеток с пятью и более фрагментами ядра и наличию гранулированного хроматина. Пролиферативную активность гранулоцитов выявляли по содержанию палочкоядерных форм.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли путем инкубации клеток крови с частицами латекса в течение 30 минут при температуре 37°С. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывали % активных фагоцитов и среднее фагоцитарное число на 100 нейтрофильных лейкоцитов.

Содержание фенотипов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71+, CD95+, HLA DR+) периферической крови определяли с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва) на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли».

Для количественного исследования цитокинов IL-4, IL-6, IL-10, IFN-, IL-17F, TNF- и лиганда sTRAIL в сыворотке крови использовался метод иммуноферментного анализа с применением диагностических наборов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия). Оценка результатов проводилась на фотометре «Multiskan MS» фирмы «Labsystems» (Финляндия), а также на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-RAD»

(США) тест-наборами «Вектор БЕСТ» (Россия). Содержание серотонина и гистамина также определяли методом ИФА тест-наборами «DRG» (Германия).

Учет результатов проводили на спектрофотометре серии Multiscan (Финляндия). Показатели липидного обмена (фосфолипиды, АпоВ) изучали в сыворотке крови на биохимическом анализаторе «Stat fax 1904 Plus»

реагентами фирмы «Human» (Германия).

Полученные данные были статистически обработаны с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Exel MX» (США) и «Statistica 6.0»

(«StatSoft», США). Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли при помощи критерия Шапиро-Уилка. Для оценки полученных данных манипулировали методами описательной статистики с определением средней арифметической величины (М), величины средней ошибки (m), минимальных и максимальных значений, а также стандартного отклонения (). В случае, если распределение отличалось от нормального, использовали медиану (Ме) и 25–75 перцентили. Уровень дисбалансов иммунологических показателей рассчитывался по данным частоты регистрации повышенных и пониженных их концентраций относительно нормативных пределов физиологических колебаний (Л.К. Добродеева, 2005). Проверку нулевой гипотезы о равенстве всех средних в исследуемых группах осуществляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа.

Статистическую значимость различий между выборками выявляли при помощи t критерия Стъюдента и с использованием непараметрических методов – Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни;

различия сравниваемых показателей принимались достоверными при уровне значимости p0,05-0,001.

Корреляционный анализ проводился с определением коэффициентов линейной корреляции Пирсона (r). Выявление значимых предикторов, определяющих уровень апоптоза нейтрофилов, проводили методом дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Активность апоптоза нейтрофилов периферической венозной крови у клинически здоровых людей в среднем составляет 6,09±0,36%, и колеблется в пределах 1 от 3,31 до 8,87%. Уровень некроза в 2 раза ниже 3,58±0,24%, в пределах 1 от 1,57 до 5,59%. Живые клетки в среднем составляют 90,33±0,66%, диапазон колебаний их содержания имеет размах от 86,04 до 94,64% в пределах 1 (рис. 1). По всей вероятности преобладание апоптоза над некрозом имеет большой биологический смысл, который заключается: 1. в предотвращении воспалительной реакции от продуктов некроза;

2. обновлении клеточной популяции;

3. получении фактически неизмененных субстанций клетки, за счет чего в организме идет пополнение резерва биологически активных веществ, тем более что апоптоз – это энергетически затратный механизм, требующий значительное потребление энергии.

апоптоз 6,09±0,36% некроз 3,58±0,24% живые 90,33±0,66% Рис. 1. Структура относительного содержания живых, апоптотических и некрозных нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей В составе сегментограммы периферической крови содержание апоптотических нейтрофилов с 5 и более фрагментами ядра составило:

относительное 5,33±0,49%, абсолютное 0,25±0,03109 кл/л. По данным Й. Тодорова (1968) в нормальных условиях содержание нейтрофилов с пятью сегментами ядра составляет 1 %, что значительно ниже нашего значения.

Установлено, что активность апоптоза нейтрофилов у клинически здоровых людей 20–29 лет (0,18±0,02109 кл/л) достоверно выше, чем у лиц 40–49 лет (0,10±0,01109 кл/л), 50–59 лет (0,11±0,01109 кл/л) и 60–77 лет (0,10±0,01109 кл/л) (рис. 2).

0, * 0, х 10 кл/л 0, 0, 0, 20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет 60-77 лет Рис. 2. Содержание апоптотических нейтрофилов периферической крови обследуемых лиц в анализируемых возрастных группах Примечание: * – р0,05 по сравнению с возрастными группами 40–49 лет, 50–59 лет и 60–77 лет клинически здоровых людей Определено, что до 60 лет происходит снижение общего количества нейтрофилов и их сегментоядерных форм. Минимум содержания данных клеток регистрировался в возрастной группе 50–59 лет: 3,09±0,19109 кл/л и 2,79±0,17109 кл/л;

максимум – в возрастной группе 20–29 лет:

4,01±0,21109 кл/л и 3,70±0,20109 кл/л. Однако у лиц после 60 лет происходит повышение общего количества нейтрофилов и их сегментоядерных форм:

3,93±0,33109 кл/л и 3,41±0,26109 кл/л. Концентрация палочкоядерных нейтрофилов не имела статистически значимых отличий в возрастных интервалах: 20–29 лет и 30–39 лет (0,32±0,03109 кл/л), 40–49 лет (0,34±0,04109 кл/л), 50–59 лет (0,29±0,03109 кл/л);

и лишь после 60 лет содержание данных клеток увеличивается до 0,52±0,05109 кл/л. Фагоцитарное число увеличивалось в группе 40–49 лет (5,53±0,46 ед/кл) в сравнении с возрастами: 20–29 лет (4,57±0,21 ед/кл) и 50–60 лет (4,46±0,49 ед/кл). Процент активных фагоцитов начинает достоверно снижаться в возрастных группах 30–39лет (41,83±4,79%) и 40–49 лет (42,07±4,20%) по сравнению с группой 20–29 лет (52,96±2,09%). Минимум содержания процента активных фагоцитов регистрировался в возрастной группе 50–60 лет: 36,73±3,70%. Вероятно, программируемая клеточная гибель усиливается в ответ на увеличение общего содержания нейтрофилов в результате перераспределения популяции гранулоцитов внутри сосудистого русла и выхода клеток из пристеночного депо. В то же время у лиц 60–77 лет наблюдается усиление пролиферативных процессов гранулоцитов, что может быть ассоциировано с риском возникновения дефектов противоопухолевой защиты.

Для определения особенностей взаимосвязи активности апоптоза и пролиферации нейтрофилов с иммунологическими показателями крови группа клинически здоровых людей (n=49, возраст от 21 до 60 лет) была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов. Уровень указанных нейтрофилов рассчитывался по результатам проточной лазерной цитофлуориметрии (AnV+/PI- менее 3% и более 8%).

Среднее содержание апоптотических нейтрофилов в группе с относительно пониженной концентрацией данных клеток составило:

относительное – 2,01±0,20%, абсолютное – 0,11±0,03 109 кл/л;

в группе с относительно повышенной концентрацией – 13,08±0,44% или 0,58±0, 109 кл/л. Cравнительный анализ лейкограммы показал, что в группе с относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов выше содержание палочкоядерных нейтрофилов (0,24±0,07109 кл/л против 0,13±0,04109 кл/л) на фоне заметного снижения общего количества нейтрофилов и их сегментоядерных форм. Так, среднее число нейтрофилов при активизации их программируемой гибели составило 4,43±0,54109 кл/л, сегментоядерных нейтрофилов – 4,19±0,49109 кл/л. В группе с относительно пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов общее число 5,40±0,48109, гранулоцитов составило сегментоядерных форм – 5,27±0,4710 кл/л;

установлена обратная корреляционная взаимосвязь между апоптозом нейтрофилов и относительным содержанием сегментоядерных нейтрофилов (r = -0,33;

р= 0,048). Таким образом, мы подтверждаем данные P. Weinmann и коллег (2003) о регулирующей роли апоптоза нейтрофилов в поддержании гомеостаза данных клеток в периферической крови. Средние значения фагоцитарного числа изменяются с 5,13±0,40 ед/кл в группе с пониженным содержанием клеток в стадии апоптоза до 4,10±0,41 ед/кл во второй группе исследуемых. Процент активных фагоцитов не меняется:

56,94±2,73 и 55,00±2,31% соответственно. Установлено, что некроз нейтрофилов имеет взаимосвязь с активностью фагоцитоза (r = 0,38;

р= 0,02) и фагоцитарным числом (r = 0,36;

р= 0,03).

Исследование содержания фенотипов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71+, CD95+) не выявило достоверных различий в анализируемых группах (р0,05). Только количество лимфоцитов HLA DR+ снижается с 0,77±0,04 до 0,66±0,03109 кл/л при активизации апоптоза гранулоцитов. Отсутствие взаимосвязи между уровнем программируемой гибели нейтрофилов и процессами пролиферации, дифференцировки и апоптоза лимфоцитов периферической крови можно объяснить наличием значительной временной разницы реакции нейтрофилов и лимфоцитов на любой стимулирующий фактор, эта разница достигает 72 часа. В связи с чем, регуляция апоптоза нейтрофилов осуществляется преимущественно аутокринно.

Выявлено, что концентрация IL-4 увеличивалась на фоне повышенной активности апоптоза с 2,66(2,16-4,22) до 3,72(1,18-5,64) пг/мл. Таким образом, мы не можем подтвердить данные Girard D. (1997) о задержке программируемой гибели гранулоцитов под влиянием IL-4. В литературе также показано, что при совместном действии IL-4, IL-6, IL-3 и эритропоэтина рост клеток миелоидного ряда становится более интенсивным (D. Rennick, 1989).

На фоне повышенного содержания апоптотических нейтрофилов регистрировался подъем уровня провоспалительного цитокина TNF (22,79(18,78-31,35) против 19,81(19,34-39,70) пг/мл). В ходе проведенного анализа не были выявлены статистически значимые различия в концентрациях IL-6, IFN- и IL-17F в анализируемых группах (р0,05). Нужно отметить, что в индукции апоптоза нейтрофилов большое значение играет семейство TNF, в частности, лиганд этого семейства цитокинов sTRAIL (P. Golstein, 1997).

Установлено повышение концентрации свободного TRAIL с 14,64(8,42-56,62) до 27,51(4,13-60,08) пг/мл на фоне усиления апоптоза гранулоцитов. Методом дискриминантного анализа свободный лиганд TRAIL определен как важный предиктор, влияющий на результирующее значение апоптоза нейтрофилов (p0,029, точность 74,3%). Увеличение количества свободных форм лиганда, вероятнее всего, происходит в результате протеолитического шеддинга (удаления) внеклеточного домена специфическими металлопротеиназами путем альтернативного сплайсинга или в составе секретируемых эндовезикул (О.В. Уткин, 2012). Все это свидетельствует об использовании TRAIL во внешнем пути инициации апоптоза нейтрофилов и последующем сбросе лиганда. Подтверждением активизации внешнего пути запуска программы смерти является также повышение содержания TNF-, который при взаимодействии с рецептором TNFRI стимулирует реакции эффекторных каспаз -3, -6, -7 и последующие морфологические изменения ядра, связанные с апоптозом. В свою очередь, свободная форма TRAIL не просто накапливается и утилизируется в межклеточной среде (A. Thorburn, 2007), но в дальнейшем может комплексироваться с мембранным рецептором и вызывать новый виток апоптотической активности.

С целью выяснения особенностей программируемой гибели нейтрофилов в условиях дефектов иммунологической реактивности проведен дополнительный сравнительный анализ уровня апоптоза нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей (контрольная группа) и лиц с патологиями. В ситуации хронического воспаления выявлено снижение активности апоптоза нейтрофилов (рис. 3) по сравнению с клинически здоровыми людьми (с 5,33±0,49 до 4,09±0,16%). Полученные результаты подтверждают сведения (А.Н. Маянский, 1989;

E. Pluskota, 2008;

N. Fotouhi-Ardakani, 2010) о подавлении программируемой гибели гранулоцитов в условиях воспаления. Возможно, это происходит в результате активизации нейтральной сфингомиелиназы, повышения уровня сфингозин-1-фосфата, и фосфорилирования p38 MAPK киназ в цитозоле нейтрофилов (L. Wei-Chieh, 2011). Однако, существуют данные о значительном влиянии на задержку апоптоза нейтрофилов миелопероксидазы путем передачи сигналов через интегрин CD11b/CD18 (M2, Mac-1), что вызывает одновременную активизацию внеклеточной сигнал-передающей киназы и Akt, фосфорилирование и последующую активизацию каспазы- Bad (E.K. Driss, 2008).

* % * контроль метаболический инфекционная хроническое синдром аллергия воспаление Рис. 3. Уровень апоптоза нейтрофилов периферической крови клинически здоровых людей и лиц с патологиями Примечание: * – р0,05 по сравнению с контрольной группой Не установлено статистически значимых отличий в содержании апоптотических гранулоцитов у лиц с инфекционной аллергией (6,31±0,27 и 5,33±0,49% соответственно, р0,05). По данным A. S. Saffar (2007) нейтрофилы людей, страдающих аллергическими заболеваниями, экспрессируют повышенный уровень высокоаффинного рецептора FcRI и несут на себе большее количество мембранно-связанного IgE. Последний в своем мономерном состоянии способен in vitro оказывать антиапоптотический эффект на гранулоциты, что выражается в снижении выброса Smac из митохондрий и деактивации каспазы-3.

При метаболическом синдроме, наоборот, отмечено увеличение уровня программируемой гибели гранулоцитов до 7,29±0,38%. Выявленное максимальное содержание гранулоцитов с пятью и более фрагментами ядра в крови у лиц с метаболическими нарушениями свидетельствует о повышении уровня апоптотической гибели нейтрофилов в условиях дислипидемии и гипергликемии. Вероятно, это объясняется снижением в нейтрофилах окислительной реакции глутатиона, подавлением активности G6PDH и глутаминазы на фоне увеличения уровня фосфофруктокиназы (T.C. Alba-Loureiro, 2006). По сведениям Pithon-Curi T.C. и коллег (2003) глутатион ингибирует апоптотические процессы в гранулоцитах, восстанавливая трансмембранный потенциал митохондрий и предотвращая фрагментацию хроматина.

Для изучения влияния серотонина и гистамина на апоптоз нейтрофилов в условиях дислипидемии были выделены группы с относительно повышенным и пониженным содержанием вазомоторных аминов. Концентрация серотонина – более 270 нг/мл (n=14) и менее 150 нг/мл (n=15);

гистамина – более 10 нг/мл (n=10) и менее 1 нг/мл (n=10).

Установлено, что при относительно высоких концентрациях серотонина в крови заметно повышается содержание нейтрофильных лейкоцитов с пятью и более фрагментами ядра с 0,18±0,03 до 0,27±0,05109 кл/л. Известно, что серотонин оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз (M. Freire-Garabal, 2003) и, возможно, активизация фагоцитарной реакции объясняет повышение уровня содержания фагоцитов, подвергающихся апоптозу. На фоне относительно высоких концентраций серотонина выше содержание сывороточных фосфолипидов [5,33(3,70-7,34) и 4,37(3,84-5,27) ммоль/л], дополнительное встраивание которых в состав цитоплазматической мембраны может резко менять её проницаемость и активность функционирования. При этом увеличение содержания фосфатидилсерина в структуре клеточной мембраны имеет непосредственное отношение к активизации апоптоза.

Подтверждением возможности указанного механизма стимуляции апоптоза клеток крови является резкое сокращение утилизации ЛПНП в связи со снижением лиганда АпоВ [91,5(81,9-137,7) и 161,1(90,2-201,4) мг/дл].

При увеличении концентрации гистамина более 10 нг/мл в плазме крови у лиц с метаболическим синдромом снижается общее содержание нейтрофильных гранулоцитов (с 3,70±0,24 до 2,99±0,30109 кл/л), в основном за счет палочкоядерных форм (с 0,29±0,05 до 0,16±0,03109 кл/л). Значительно увеличивается фагоцитарная способность нейтрофилов с 23,7±3,23 до 39,1±5,09 % и интенсивность данного процесса (3,4 и 5,0 ед/кл.). В структуре нейтрограммы отмечается снижение уровня гранулоцитов с пятью и более сегментами ядра (с 0,35±0,05 до 0,19±0,03109 кл/л), без значительных отличий со стороны нейтрофилов с тремя и четырьмя сегментами. Из литературных сведений известно, что через Н2 рецепторы гистамин ингибирует выделение свободного внутриклеточного Ca2+ путем изменения уровня цАМФ в нейтрофилах (L. Leino, 1993). Данный факт подтверждает наши результаты, так как при инициации апоптоза активность транслоказы в большинстве типов клеток млекопитающих подавляется. Одним из механизмов данного процесса является возрастание концентрации внутриклеточного Ca2+, что приводит к накоплению фосфатидилсерина в наружном слое мембраны. Это необходимо для последующего фагоцитоза и элиминации апоптозных телец.

Дополнительно каждая группа обследуемых лиц с заболеваниями была разделена на две подгруппы с относительно пониженным и относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (менее 3% и более 6%). Учет результатов осуществлялся по признакам морфологических изменений ядра и степени фрагментации хроматина.

Полученные данные при исследовании сегментограммы показали, что у клинически здоровых людей уровень апоптоза нейтрофилов растет параллельно увеличению палочкоядерных нейтрофилов с 0,15±0,02 до 0,22±0,03109 кл/л, что подтверждает данные проточной цитофлуориметрии. При метаболическом синдроме наблюдается лишь тенденция к росту палочкоядерных нейтрофилов с 0,19±0,03 до 0,23±0,04109 кл/л при активизации апоптоза (рис. 4). При аллергических реакциях и воспалении пролиферация преобладает, апоптоз отстает и замещается некрозом. Так, у лиц с инфекционно-аллергическими процессами и хроническим воспалением при пониженном содержании апоптотических нейтрофилов уровень палочкоядерных клеток выше: 0,31±0, и 0,25±0,04109 кл/л соответственно.

палочкоядерные нейтрофилы 109 кл/л 0, 0, 0, 0,25 * * * 0, 0, 0, 0, контроль метаболический инфекционная хроническое синдром аллергия воспаление группы с пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов группы с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов Рис. 4. Уровень пролиферации нейтрофилов в зависимости от активности их апоптоза Примечание: * – р0,05 по сравнению с группой пониженного содержания апоптотических нейтрофилов В ходе проведенного анализа нами не были установлены статистически значимые различия в содержании активных фагоцитов в группах с пониженным и повышенным уровнем апоптотических нейтрофилов у обследуемых лиц: у клинически здоровых людей 57,25±2,61 и 59,25±2,72%;

у лиц с метаболическим синдромом 36,06±3,68 и 30,04±2,71%;

у пациентов с инфекционной аллергией 45,67±1,37 и 42,76±1,37%;

у людей с хроническим воспалением 44,31±1,08 и 43,16±1,11%. Однако, повышение активности апоптоза обуславливает снижение интенсивности фагоцитоза по фагоцитарному числу: у клинически здоровых людей с 5,63±0,41 до 4,44±0,22 ед/кл;

у лиц с метаболическим синдромом с 5,44±0,63 до 3,88±0,37 ед/кл;

у людей с хроническим воспалением с 10,20±0,69 до 8,85±0,54 ед/кл;

кроме лиц с инфекционной аллергией (9,12±0,49 и 9,82±0,43 ед/кл).

Сравнительный анализ лейкограммы лиц с метаболическими нарушениями показал, что в группах с относительно повышенным и пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов нет различий по концентрации нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, как общего содержания (3,20±0,24 и 3,50±0,19109 кл/л), так и сегментоядерных форм (3,01±0,24 и 3,27±0,16109 кл/л). Однако выше содержание моноцитов в группе с относительно повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (0,45±0,07109 кл/л против 0,35±0,06109 кл/л). Лимфоцитарный фон обследуемых лиц с метаболическими нарушениями характеризуется повышенными содержаниями CD10+ лимфоцитов, CD71+ лимфоцитов и HLA DR+ лимфоцитов в группе с апоптотическими нейтрофилами 6%.

Среднее количество исследуемых клеток в данной группе составило:

0,77±0,03109 кл/л;

0,72±0,03109 кл/л и 0,74±0,03109 кл/л соответственно.

Однако при активизации апоптоза гранулоцитов снижается содержание CD8+ лимфоцитов с 0,75±0,04 до 0,64±0,02109 кл/л. Установлено, что концентрации IFN- увеличивались на фоне повышенной активности апоптоза с 8,50(6,00-15,00) до 27,00(13,00-39,00) пг/мл. В ходе проведенного анализа нами не были выявлены статистически значимые различия в концентрациях IL-4, IL-6, TNF-, IL-17F и sTRAIL в анализируемых группах (р0,05).

У лиц с инфекционно-аллергическими процессами анализ лейкограммы в зависимости от активности апоптоза нейтрофилов показал, что в группе с апоптотическими нейтрофилами 6% ниже содержание лейкоцитов, нейтрофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с группой, где апоптотических нейтрофилов 3%. Так лейкоциты снижаются с 8,01±0,36 до 6,25±0,34109 кл/л, нейтрофилы – с 4,92±0,29 до 3,67±0,25109 кл/л, палочкоядерные нейтрофилы – с 0,31±0,03 до 0,20±0,03109 кл/л, сегментоядерные нейтрофилы – с 4,61±0,35 до 3,67±0,29109 кл/л. При активизации апоптоза нейтрофилов у лиц с инфекционно-аллергическими процессами снижается содержание CD3+ лимфоцитов с 1,20±0,04 до 0,95±0,03109 кл/л и CD4+ лимфоцитов с 0,75±0, до 0,59±0,04109 кл/л. Исследование содержания фенотипов лимфоцитов CD8+, CD10+, CD25+, CD71+, HLA DR+, CD16+, CD95+ не выявило достоверных различий между анализируемыми группами (p0,05). В условиях инфекционной аллергии концентрация провоспалительного цитокина TNF достоверно не отличалась в анализируемых группах: 37,88(22,51-48,16) и 36,53(24,00-51,21) пг/мл (p0,05).

У лиц с хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения в группе с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов ( 6%) ниже как относительная, так и абсолютная концентрация палочкоядерных нейтрофилов (2,71±0,52%;

0,19±0,04109 кл/л) по сравнению с группой апоптотических нейтрофилов 3% (3,55±0,45%;

0,25±0,04109 кл/л).

Установлено, что активизации апоптоза нейтрофилов сопутствует увеличение относительного и абсолютного содержания эозинофилов с 2,12±0,28 до 2,80±0,37% и с 0,14±0,02 до 0,18±0,03109 кл/л. По уровню фенотипов лимфоцитов не выявлено достоверных различий между анализируемыми группами (р0,05). Концентрация провоспалительного цитокина TNF- при хронических воспалительных заболеваниях снижалась в группе с повышенным содержанием апоптотических нейтрофилов (34,86(23,16-69,32) пг/мл);

в группе с пониженным содержанием апоптотических нейтрофилов содержание TNF составило 43,15(28,16-81,16) пг/мл. Можно предположить, что при активизации программируемой гибели нейтрофилов в ситуации хронического воспаления задействован внутренний митохондриальный путь инициации апоптоза. Это подтверждается сокращением концентрации TNF- и стабилизацией уровня лимфоцитов CD16+ в периферической крови. Известно, что при взаимодействии TNF- со своим рецептором TNFRI запускается рецепторный путь гибели клетки (D. Wallach, 1998). Лимфоциты CD16+ или натуральные киллеры также вызывают каспазозависимый апоптоз гранулоцитов посредством активизации рецепторов Fas и NKp46 (F.B. Thoren, 2012) Таким образом, инициация апоптоза нейтрофилов у клинически здоровых людей происходит рецепторным (внешним) путем под влиянием TNF-, лиганда sTRAIL и IL-4 с последующим увеличением внутриклеточного уровня эффекторных каспаз -3, -6, -7. Активизация апоптоза гранулоцитов ассоциирована с повышением их палочкоядерных форм на фоне снижения количества зрелых дифференцированных клеток. Программируемая гибель нейтрофилов не меняет активность фагоцитарной реакции, однако сокращается интенсивность данного процесса за счет уменьшения фагоцитарного числа.

Реакция со стороны лимфоцитов выражается в снижении экспрессии HLADR II, участвующих в презентации экзогенных антигенов.

У лиц с инфекционной аллергией и хроническим воспалением на фоне активизации апоптоза нейтрофилов нарушается баланс клеточных событий, что выражается в снижении их пролиферативной активности. Запуск апоптотических изменений происходит за счет внутренних клеточных механизмов, при которых из митохондрий в цитозоль выходят цитохром с, факторы Apaf-1, Smac/DIABLO и HtrA2/Omi. В ситуации метаболических нарушений пролиферативная способность нейтрофилов компенсируется достаточным уровнем апоптоза, который, вероятно, также инициируется внутренним митохондриальным путем. Это подтверждается тем, что внешние факторы запуска программируемой гибели клетки TNF- и sTRAIL не изменяют своего содержания при значительной динамике уровня сегментоядерных нейтрофилов с 5 и более фрагментами ядра.

ВЫВОДЫ 1. Уровень апоптоза нейтрофилов у клинически здоровых людей в периферической крови в среднем составляет 6,09±0,36% с пределами колебаний 3,31-8,87%.

2. Увеличение активности апоптоза нейтрофильных гранулоцитов (с 2,01±0,20 до 13,08±0,44%) сопряжено с нарастанием концентрации палочкоядерных форм (с 0,13±0,04 до 0,24±0,07109 кл/л).

3. Уровень апоптоза нейтрофилов (у клинически здоровых людей, при хронических воспалительных процессах и метаболическом синдроме) не оказывает влияние на активность фагоцитоза, но снижает интенсивность фагоцитарной реакции.

4. Активность апоптоза нейтрофилов ассоциирована с увеличением концентрации сывороточных цитокинов IL-4, TNF- и лиганда sTRAIL без изменения со стороны IL-6, IFN- и IL-17F.

5. Серотонин способствует повышению содержания в крови апоптотических нейтрофильных гранулоцитов с 0,18±0,03 до 0,27±0, кл/л;

гистамин, наоборот, сокращает количество данных клеток с 0,35±0,05 до 0,19±0,03109 кл/л.

6. Программируемая гибель нейтрофилов сопряжена со снижением концентрации HLADR II, участвующих в презентации экзогенных антигенов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В условиях преобладания некроза нейтрофилов при хронических воспалительных процессах рекомендуется включить в комплекс лечебно профилактических мероприятий сорбционную терапию с целью эффективного связывания и удаления из организма продуктов клеточного метаболизма.

2. Снижение активности фагоцитоза нейтрофилов периферической крови у лиц с воспалительными заболеваниями, инфекционной аллергией и метаболическими нарушениями обусловливает необходимость стимуляции фагоцитарного звена иммунитета.

3. Для оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы в динамике проводимого лечения у обследуемых лиц в периферической венозной крови необходимо определять относительный уровень активных фагоцитов и абсолютное содержание лимфоцитов CD8+. При увеличении уровня активных фагоцитов на 30% и более, и снижении содержания CD8+ не менее чем на 25% от исходного значения - лечение оценивается как эффективное.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Роль нейтрофилов в регуляции иммунологической реактивности человека / С.Н. Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К. Добродеева // Мат-лы докл. IV Междунар. молодежной науч. конф.

«Экология – Ч 52 2011». – Архангельск, 2011. – С. 299–300.

2. Ставинская О.А. Активность апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при ожирении / О.А. Ставинская, С.Н. Якушкина (С.Н. Балашова), В.П. Патракеева // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. – № 2, Т. 1 – С. 201–202.

3. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Апоптоз нейтрофилов периферической крови при обострении хронических ЛОР-патологий / С.Н.

Якушкина, О.А. Ставинская // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. – № 2, Т. 1 – С. 222–223.

4. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов при инфекционно-аллергических процессах у человека / С.Н. Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К. Добродеева // Российский аллергологический журнал. – 2011. – № 4. – С. 436–437.

5. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Способ оценки эффективности лечения хронических воспалительных процессов дыхательной системы / С.Н.

Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К. Добродеева // Патент РФ № 2475743, дата приоритета 31.10.2011.

6. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Взаимосвязь активности апоптоза нейтрофилов и содержания цитокинов крови у больных сахарным диабетом типа / С.Н. Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К. Добродеева // Мат-лы XI Всероссийской молодежной науч. конф. Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. – Сыктывкар, 2012. – С. 268–271.

7. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Апоптотические процессы нейтрофильных гранулоцитов крови при обострении заболеваний верхних дыхательных путей / С.Н. Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К. Добродеева // VII Сибирский съезд физиологов: Мат-лы съезда. – Красноярск, 2012. – С. 630–631.

8. Якушкина С.Н. (Балашова С.Н.) Функциональная роль IL-17F у практически здоровых людей / С.Н. Якушкина, О.А. Ставинская, Л.К.

Добродеева // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – № 4 (41). – С. 78–79.

9. Балашова С.Н. Влияние IL-17F на активность нейтрофильных гранулоцитов и содержание цитокинов крови у человека / С.Н. Балашова, О.А. Ставинская // Адаптация человека на Севере: медико-биологические аспекты: Мат-лы Всероссийской молодежной науч.-практ. конф. – Архангельск, 2012. – С. 22–25.

10. Ставинская О.А. Апоптоз иммуноцитов крови у лиц с метаболическими нарушениями в зависимости от показателей иммунологической реактивности / О.А. Ставинская, С.Н. Балашова // Адаптация человека на Севере: медико-биологические аспекты: Мат-лы Всероссийской молодежной науч.-практ. конф. – Архангельск, 2012. – С. 296–300.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.