авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс

На правах рукописи

Карпова Ярослава Дмитриевна

ИММУННЫЕ ПРОТЕАСОМЫ В РАЗВИТИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И В

УСЛОВИЯХ ЭФФЕКТИВНОГО И НЕЭФФЕКТИВНОГО ИММУННОГО

ОТВЕТА У КРЫС

03.03.05 «Биология развития и эмбриология»

03.03.01 «Физиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им.

Н.К. Кольцова РАН Научные руководители: доктор биологических наук ШАРОВА Наталья Петровна кандидат биологических наук ЛЮПИНА Юлия Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН НЕМОВА Нина Николаевна (Институт биологии Кар НЦ РАН) доктор биологических наук, профессор ЗИНОВЬЕВА Рина Дмитриевна (ИБР РАН)

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 22 февраля 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (http://idbras.comcor.ru) Автореферат разослан «_» _ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Е.Б. Абрамова ele0806@yandex.ru 2   

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов становления иммунной системы в онтогенезе и развития иммунных реакций и иммунологической толерантности является актуальной проблемой современной биологии. Решение данной проблемы поможет понять, в какой период онтогенеза начинает функционировать иммунитет, чем определяется развитие иммунных реакций или иммунологической толерантности в ответ на появление того или иного антигена, и выявить причины различных нарушений в работе иммунной системы. В связи с этим наиболее перспективным представляется исследование иммунных протеасом, играющих ключевую роль в образовании антигенных эпитопов из чужеродных белков в клетках лимфоидных и нелимфоидных органов. Совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I антигенные эпитопы выносятся на поверхность клеток для представления Т-лимфоцитам CD8+-фенотипа. В антигенпредставляющих клетках вторичных лимфоидных органов этот процесс важен для активации наивных CD8+-лимфоцитов, а в клетках любого иного органа, за исключением головного мозга, – для предъявления их цитотоксическим Т-лимфоцитам. В рамках данной проблемы наиболее актуально исследование иммунных протеасом селезенки, вторичного лимфоидного органа, ответственного за развитие иммунных реакций, и печени – органа с особым иммунным статусом. Печень является местом развития иммунологической толерантности к пищевым и другим попадающим в нее антигенам, в эмбриональный период печень выполняет функции первичного лимфоидного органа. Вместе с тем, в случае инфицирования клеток печени вирусами гепатитов зараженные гепатоциты служат мишенями Т-клеточного иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем иммунных протеасом. Не меньший интерес представляет изучение экспрессии иммунных протеасом в клетках злокачественных опухолей при их развитии и регрессии и в клетках трансплантатов при индукции иммунологической толерантности или 3    в ее отсутствие. Выявление особенностей функционирования иммунных протеасом в различных иммунологических ситуациях может прояснить роль отдельных форм иммунных протеасом.

Цель работы: исследовать особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии иммунной системы в раннем онтогенезе и в различных иммунологических ситуациях: при росте и регрессии злокачественной опухоли и трансплантации ткани яичника.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику экспрессии и распределения иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в раннем онтогенезе в сравнении с изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей и экспрессии тотального пула протеасом.

2. Исследовать относительный уровень иммунных протеасом в печени плодов крысы после индукции воспаления у матери введением липополисахарида.

3. Выявить особенности экспрессии иммунных протеасом в карциносаркоме Walker 256 при ее росте у крыс линии WAG и при ее регрессии у крыс линии Brattleboro.

4. Исследовать относительное содержание иммунных протеасом в трансплантате ткани яичника и в печени реципиента в условиях индукции донорспецифической портальной толерантности и в ее отсутствие.

Научная новизна. Впервые изучена динамика экспрессии иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии и выявлена связь этой динамики с клеточными процессами, происходящими в этих органах. Обнаружены особенности миграции В- и Т-лимфоцитов из красной пульпы в белую пульпу в развивающейся селезенке и показано, что миграция Т-лимфоцитов завершается к концу третьей постнатальной недели – именно в тот период, когда возрастает 4    экспрессия иммунных протеасом в гепатоцитах. Таким образом, выявлены причины неэффективности иммунитета в первые недели после рождения.

Впервые исследованы особенности функционирования иммунных протеасом в процессе регрессии опухоли (на модели карциносаркомы Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro). Показано повышение экспрессии иммунных протеасом в клетках опухоли в период, предшествующий началу ее регрессии, что может объяснить причину распознавания опухоли иммунной системой.

Впервые описана разница функций различных форм иммунных протеасом при трансплантации: иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP7, важны для развития иммунных реакций и отторжения трансплантата, в то время как иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP2, играют роль в развитии иммунологической толерантности и приживлении трансплантата.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты важны как для понимания молекулярных механизмов становления и регуляции иммунной системы, так и для практического применения в медицине – для разработки инновационных подходов к противоопухолевой терапии и создания препаратов, регулирующих на молекулярном уровне процесс приживления трансплантатов. Результаты и выводы диссертации могут быть взяты за основу для разработки новых курсов лекций по биологии развития, физиологии и иммунологии.

Личное участие автора. Все разделы диссертации выполнены непосредственно автором или при его активном участии в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 23-25 апреля 2007 г.), Международной научной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, Беларусь, 25-26 октября 2007 г.), 5    Конференции «Современные проблемы биологии развития» (Москва, 14- ноября 2007 г.), Пятой конференции по экспериментальной и трансляционной онкологии (Краньска Гора, Словения, 26-30 марта 2008 г.), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября г.), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К.

Кольцова РАН (Москва, 2007 г., 2010 г., 2011 г.), Первом международном конгрессе по исследованию рака (Анталия, Турция, 21-24 мая 2009 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), Конференции EMBO (Барселона, Испания, 4-7 сентября 2010 г.), Пятом Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 8-10 октября 2010 г.), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа г.), 36-м конгрессе FEBS «Биохимия для медицины завтра» (Турин, Италия, 25 30 июня, 2011 г.).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит 34 рисунка, 3 таблицы, 132 источника литературы.

Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликованы статьи в журналах перечня ВАК, 3 статьи в иностранных рецензируемых журналах, 12 тезисов докладов на Российских конференциях, 5 тезисов докладов на зарубежных конференциях.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 06-04-48229-а и № 09-04-00077-а) и Министерством образования и науки Российской Федерации (госконтракт № 02.512.12.2047).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Исследование становления иммунной системы проводили на крысах Вистар в эмбриональном развитии (Е14—Е21) и в раннем постнатальном развитии (Р1—Р26). Воспаление индуцировали у беременных крыс инъекцией липополисахарида (LPS) на 12-й день беременности 6    внутрибрюшинно из расчета 18 мкг на 1кг веса животного. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Эксперименты по трансплантации проводили на 3-4-х месячных самках крыс Август и Вистар. Для индукции донор-специфической толерантности (ДСТ) крысам Август в портальную вену печени вводили 1 мл суспензии выделенных спленоцитов крыс Вистар (в количестве 1107 клеток). Через дней после этого крысам Август проводили овариоэктомию и трансплантировали неонатальные яичники крыс Вистар под капсулу левой почки (2 яичника на одного реципиента). Исследование трансплантатов и органов (печень, селезенка) осуществляли на 30-е сутки после трансплантации.

В эксперименте выделяли несколько групп животных: 0 группа – интактный контроль, 1 группа – ложнооперированные животные (введение чистого физиологического раствора интрапортально и имитация трансплантации), группа – животные с индукцией ДСТ и трансплантацией, 3 группа – животные с трансплантацией без индукции ДСТ.

Исследование роста и регрессии карциносаркомы Walker 256 проводили на шестимесячных самцах крыс линий Brattleboro и WAG весом 200—250 г.

Крысы линии Brattleboro характеризуются инактивацией гена аргинин вазопрессина (АВП) из-за делеции гуанина в кодирующей области и смещении рамки считывания. Физиологически нормальные крысы линии WAG использованы в качестве контрольных животных. Гомология геномных аллелей у этих линий крыс составляет более 95%. В заднюю конечность крыс внутримышечно инъецировали суспензию клеток Walker 256 (в количестве 8105 клеток). В первые дни у крыс Brattleboro происходит развитие опухоли, а затем – ее регрессия (после 17 дней развития), у крыс WAG – только развитие (Хегай и др., 2006). Опухоли выделяли на 7, 14, 17 и 24-й дни после инъекции клеток.

Определение активностей протеасом. Химотрипсин- и каспазаподобную активности протеасом определяли по гидролизу 7    флуорогенных пептидов Suc-LLVY-AMC и Z-LLE-AMC, соответственно.

Наличие примесных протеолитических активностей выявляли с помощью специфических ингибиторов протеасом MG132 и AdaAhx(3)L(3)VS.

Исследование экспрессии протеасом. Экспрессию тотального пула протеасом и иммунных протеасом в органах и тканях исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с применением антител к субъединицам 1,2,3,5,6,7, входящим в состав всех форм протеасом, и к иммунным субъединицам LMP7 и LMP2, соответственно. Результаты нормализовали на относительное количество -актина. Экспрессию иммунных протеасом в клетках исследовали с помощью иммунофлуоресцентного мечения клеток на срезах и стеклах антителами к иммунным субъединицам протеасом и клеточным маркерам.

Флуоресценцию анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа DM RXA2 («Leica», Германия) и конфокального микроскопа TCS SP («Leica», Германия). Специфичность первых антител подтверждалась с помощью контролей, при которых реакция проводилась только со вторыми антителами.

Отсутствие перекрестной реакции между первыми и вторыми антителами проверялось путем инкубации каждого из первых антител с противоположными вторыми антителами.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного приложения Excel. Данные представлены как среднее значений, полученных минимум в 3-х аналогичных экспериментах, стандартная ошибка. Статистическую достоверность оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, достоверными считали различия при р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы у крыс 1.1. Иммунные протеасомы в развивающейся селезенке. В селезенке иммунные субъединицы LMP2 и LMP7 выявляются уже на Е21, затем 8    % %  Рис. 1 (А) Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов селезенки крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом в осветленных гомогенатах селезенки. За 100% принимали количество субъединиц LMP2 на Р15 и количество иммунной субъединицы LMP7 на Р5. *p0,05.

происходит увеличение их количества к Р1 и более значительное увеличение – к Р18 и Р21 при постоянном тотальном пуле протеасом (Рис. 1). Подобные изменения сказываются на активностях пула протеасом: возрастает химотрипсинподобная активность, но падает каспазаподобная активность (Рис.

2). Полученный результат согласуется с литературными данными о том, что при замене протеолитических конститутивных субъединиц на иммунные субъединицы более выраженными становятся химотрипсин- и трипсинподобная активности при уменьшенной каспазаподобной активности (Rock and Goldberg, 1999). Это обусловливает способность протеасом образовывать антигенные эпитопы с нужной С-концевой аминокислотой, гидрофобной или положительно заряженной. Однако обнаруженная нами динамика изменения активностей не объясняется только 9    Рис. 2. Химотрипсинподобная (А, Б) и каспазаподобная (В, Г) активности протеасом в осветленных гомогенатах селезенки (Б, Г) и печени (А, В) крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. По оси абсцисс – дни развития, до 0 – эмбриональные стадии, после 0 – постнатальные. Приведены средние значения минимум трех экспериментов (± стандартная ошибка среднего), * p 0,05.

заменой протеолитических субъединиц, но носит более сложный характер, зависящий и от других факторов, в том числе, регуляторов протеасом.

Чтобы определить, какие процессы на клеточном уровне лежат в основе изменений экспрессии иммунных протеасом, было проведено двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах селезенки на разных стадиях раннего онтогенеза. Выявлено, что в эмбриогенезе иммунные протеасомы локализуются преимущественно в Т- и В-лимфоцитах в красной пульпе, белая пульпа остается незанятой (Рис. 3 и 4). Данный метод также позволил проследить необычную миграцию лимфоцитов в процессе формирования морфофункциональных зон селезенки. К 9-му постнатальному дню В лимфоциты занимают маргинальную зону белой пульпы (Рис. 4), Т-лимфоциты в этот период выстраиваются плотным тяжом у маргинальной зоны, как будто 10    Рис. 3. Двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах селезенки крысы на 21-й день эмбрионального развития (А) и 4-й (Б), 9-й (В), 15-й (Г) и 19-й (Д) дни постнатального развития. Использованы поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные CY3 (левый столбец, «красная» метка), моноклональные антитела мыши к CD3 (маркеру Т-лимфоцитов) и антитела к IgG мыши, меченные FITC (средний столбец, «зеленая» метка). Правый столбец – двойное мечение.

11    Рис. 4. Двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах селезенки крысы на 21-й день эмбрионального развития (А) и 4-й (Б), 9-й (В) и 19-й (Г) дни постнатального развития. Использованы поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные CY3 (левый столбец, «красная» метка), моноклональные антитела мыши к CD45RA (маркеру В-лимфоцитов у крыс) и антитела к IgG мыши, меченные FITC (средний столбец, «зеленая» метка). Правый столбец – двойное мечение.

готовясь к «прыжку», в конце третьей недели «прыжок» завершается, нам удалось увидеть Т-лимфоциты в процессе «прыжка» (Рис. 3). Изучению формирования белой пульпы селезенки у млекопитающих, в том числе у крыс, посвящен ряд работ (Veerman, 1975;

Dijkstra and Dopp, 1983, van Rees, et al., 1990;

Fu and Chaplin, 1999). Основное внимание в этих работах уделено изучению последовательности накопления различных субпопуляций 12    лимфоцитов в белой пульпе. Нам впервые удалось не только исследовать распределение иммунных протеасом в клетках селезенки в раннем развитии, но и описать особенности миграции Т- и В-лимфоцитов из красной пульпы в белую в процессе ее формирования. У взрослых животных Т- и В-лимфоциты поступают из первичных лимфоидных органов с током крови и лимфы непосредственно в белую пульпу (Dllmann, et al., 2006). Наши результаты указывают на то, что в раннем постнатальном развитии красная пульпа служит помощником для формирования белой пульпы. Обнаруженный нами относительно высокий уровень иммунных протеасом в В-лимфоцитах связан, по-видимому, с их ролью антиген-представляющих клеток. В Т-лимфоцитах, иммунные протеасомы выполняют другую функцию, а именно участвуют в контроле пролиферативной активности лимфоцитов (Caudill, 2006).

1.2. Иммунные протеасомы в развивающейся печени. В печени иммунные протеасомы с субъединицами LMP7 и LMP2 не обнаруживаются методом Вестерн-блоттинга на 14-й день эмбрионального развития, но отчетливо выявляются на E16, их количество возрастает к Е18 и остается на этом уровне до Р3, немного снижается к Р5. Значительное увеличение уровня иммунных протеасом наблюдается к концу третьей постнатальной недели, становится наибольшими по сравнению с ранними сроками (Рис.

5). Тотальный пул протеасом не меняется.

Химотрипсин- и каспазаподобная активности также, как и в селезенке, претерпевают изменения в раннем развитии печени, и эти изменения носят сложный характер (Рис. 2). Важно отметить общую черту: и в печени и в селезенке обе активности имеют «провал» в период между постнатальными 10 12-м днями. Как это можно объяснить? Известно, что период полужизни протеасом в норме составляет 12-15 дней (Tanaka, Ichihara, 1989). Возможно, что в указанный период происходит истощение старых пулов протеасом в печени и селезенке и начало сборки новых протеасом.

13    %  % Рис. 5. (А) Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов печени крыс в разные периоды эмбрионального и постнатального развития. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом в осветленных гомогенатах печени. За 100% принимали количество субъединиц LMP7 и LMP2 на Р3.*p0,05.

Для того, чтобы объяснить, чем обусловлены изменения экспрессии иммунных протеасом в раннем развитии печени крысы, было проведено иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах печени антителами к иммунным субъединицам LMP7 или LMP2, маркеру В-лимфоцитов CD45RA или маркеру Т-лимфоцитов CD3 и вторыми флуоресцентными антителами.

Оказалось, что на Е14 в гепатоцитах слабо выявляются иммунные протеасомы, лимфоциты на этом сроке в печени не обнаруживаются. На 21-й эмбриональный день в печени присутствуют Т- и В-лимфоциты, причем количество иммунных протеасом в В-лимфоцитах превышает их содержание в Т-клетках, интенсивность флуоресценции которых находится практически на одном уровне с интенсивностью флуоресценции гепатоцитов. На Р3 в печени присутствуют и Т-, и В-лимфоциты, причем с тем же содержанием в них иммунных протеасом, что и на Е21 (Рис. 6). Оба типа клеток исчезают к Р8.

14    Рис. 6. Двойное иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах печени крысы (А-Г) - 14-й, (Д-З) - 21-й дни эмбрионального и (И-M) – 3-й дни постнатального развития.

(А, В, Д, Ж, И, Л) - поликлональные антитела кролика к LMP7 и антитела к IgG кролика, меченные Alexa 546;

(Б, Е, К) - моноклональные антитела мыши к CD3 и (Г, З, М) - CD45RA и антитела к IgG мыши, меченные Alexa 488.

Таким образом, первый период подъема уровня иммунных протеасом в печени, обнаруженный Вестер-блоттингом, связан с присутствием в печени В лимфоцитов, обогащенных иммунными протеасомами. Кроме того, в эмбриональном и постнатальном развитии печени иммунные протеасомы содержатся в макрофагах и эндотелиальных клетках синусоидов (Рис. 8).

Возможно, отдельные формы иммунных протеасом играют в этих клетках роль, не связанную с функцией представления антигена, поскольку была выявлена разница в распределении иммунных протеасом, содержащих субъединицу LMP7, и иммунных протеасом, содержащих субъединицу LMP2, в макрофагах.

Субъединица LMP7 располагается равномерно по цитоплазме макрофага, в то время как субъединица LMP2 локализуется в околомембаранной цитоплазме, в 15    100m 10m Рис. 7. Распределение субъединиц иммунных протеасом LMP2 и LMP7 по цитоплазме макрофага печени на Е (макрофаги указаны белыми стрелками, 10m определялись по экспрессии специфического маркера). Использовались антитела к субъединицам LMP7 и соответствующие вторые антитела, меченные Alexa 488.

10m Рис. 8. Двойное иммунофлуоресцентное мечение мононуклеарных клеток печени крысы на E21 и P15. Использованы антитела к субъединицам LMP7 и соответствующие вторые антитела, меченные Alexa 488, и антитела к SE-1 (маркера эндотелиальных клеток синусоида печени) или антитела клона His36 (маркера тканевых макрофагов) и соответствующие вторые антитела, меченные Alexa 546.

выростах и псевдоподиях макрофага (Рис. 7). С чем связано такое распределение иммунной субъединицы LMP2 остается неясным, но указывает на ее особое значение и уникальность выполняемых функций, возможно, в ослаблении окислительного стресса. Иммунные протеасомы выявлены нами и в гепатоцитах. Причем в процессе развития печени происходит значительное увеличение количества иммунных протеасом в гепатоцитах, что следует из резкого повышения интенсивности флуоресценции на Р21 по сравнению с Р3 и Р8 (данные не приведены). Эти результаты подтверждают результаты, полученные с помощью Вестерн-блоттинга. Итак, увеличение экспрессии иммунных протеасом в гепатоцитах происходит в тот период, когда завершается формирование функциональной Т-зоны белой пульпы селезенки.

Иными словами, Т-клеточный иммунный ответ по отношению к гепатоцитам со стороны селезенки у крыс возможен начиная с третьей постнатальной недели.

16    Рис. 9. (А) Вестерн-блоты осветленных гомогенатов печени плодов крыс на Е17 и Е после введения LPS матери на 12 день беременности и печени плодов контрольных животных. (Б) Относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом в осветленных гомогенатах печени. За 100% принимали количество субъединиц группы Е19 LPS. *p0,05.

1.3. Иммунные протеасомы при воспалении в эмбриональном развитии.

Вместе с тем, важно понять, возможно ли увеличение экспрессии иммунных протеасом в эмбриональной печени при воспалении подобно тому, что происходит у взрослых особей. Для ответа на этот вопрос самкам на 12-й день беременности вводили LPS и через 5 и 7 дней исследовали изменения в пуле протеасом печени плодов. Оказалось, что повышенная экспрессия иммунных протеасом при воспалении возможна в печени уже на 17 и 19 день эмбрионального развития (Рис. 9), несмотря на то, что вторичные лимфоидные органы в этот период еще не сформированы. Полученный результат указывает на высокую пластичность иммунных реакций на уровне иммунных протеасом.

2. Иммунные протеасомы при трансплантации в условиях индукции донорспецифической портальной толерантности и в ее отсутствие Одной из экспериментальных моделей неэффективного и эффективного иммунного ответа служила трансплантация ткани яичника крысам в условиях 17    Рис. 10. Трансплантаты овариальной ткани на 30-е сут после трансплантации: А – отторгнутый трансплантат 3-й группы животных (аллотрансплантация);

Б – прижившийся трансплантат 2-й группы животных (предтрансплантационное введение спленоцитов и аллотрансплантация).

Трансплантаты указаны стрелками.

200m  индукции ДСТ и в ее отсутствие, соответственно. На основании гистологического исследования (Рис. 10) и анализа гормонального уровня сделано заключение, что при аллотрансплантации ткани яичника под капсулу почки крысам без индукции ДСТ развивается острое отторжение трансплантата, а у животных с индукцией ДСТ установлена хорошая выживаемость трансплантата. Обнаружено увеличение общего пула протеасом и содержания иммунных протеасом с субъединицей LMP7 и иммунных протеасом с субъединицей LMP2 в селезенке как ложнооперированных, так и неиндуцированных и индуцированных животных по сравнению с нативным контролем. Этот факт, скорее всего, связан с иммунными реакциями, развивающимися в селезенке в ответ на оперативное вмешательство (Рис. 11).

Принципиально иные результаты получены при исследовании печени и трансплантатов у крыс различных групп. Так, в печени животных с индукцией ДСТ происходит увеличение экспрессии субъединицы LMP2 иммунных протеасом по сравнению с печенью животных контрольных групп и неиндуцированных животных. Напротив, количество субъединицы LMP иммунных протеасом наиболее высоко в печени крыс без индукции ДСТ.

Похожая картина наблюдается в трансплантатах овариальной ткани (Рис. 11).

Общий пул иммунных протеасом, увеличенный в трансплантатах опытных групп животных по сравнению с контрольными неонатальными яичниками, обогащен иммунной субъединицей LMP2 в прижившемся трансплантате и LMP7 – в отторгнувшемся. Тотальный пул протеасом при этом постоянен. Мы связываем увеличение количества иммунной субъединицы LMP2 в печени и 18    трансплантате с развитием портальной иммунологической толерантности и приживлением трансплантата, а увеличение количества иммунной субъединицы LMP7 – с развитием иммунного ответа и отторжением трансплантата.

Рис. 11. Вестерн-блоты осветленных гомогенатов овариальной ткани и печени (А), селезенки (В) Относительное количество (оптическая плотность блотов) LMP7, LMP2 и субъединиц овариальной ткани и печени (Б), селезенки (Г). За 100% принимали количество субъединиц 0 группы. По оси абсцисс – группы животных. Выравнивали на относительное количество actin. Обозначены достоверные отличия при р 0,05 по сравнению с группой 0 * и группой 2 ¤.

19    3. Иммунные протеасомы при росте и регрессии опухоли.

Второй экспериментальной моделью неэффективного и эффективного иммунного ответа служили рост карциносаркомы Walker 256 у физиологически нормальных крыс WAG и ее регрессия у крыс Brattleboro, дефектных по синтезу аргинин-вазопрессина, соответственно. Показано, что экспрессия тотального пула протеасом и субъединиц LMP7 и LMP2 не изменяется в опухоли между 7-м и 24-м днями после имплантации крысам WAG. При этом в клетках опухоли практически не выявляются молекулы ГКГ класса I (Рис. 12).

В опухоли, имплантированной крысам Brattleboro, наоборот, происходит увеличение экспрессии тотального пула протеасом и субъединиц LMP7 и LMP между 7-м и 14-м днями и достигает максимального значения в период между 14-м и 17-м днями после введения опухолевых клеток, то есть в период, предшествующий началу регрессии опухоли. Одновременно с увеличением экспрессии иммунных протеасом в клетках опухоли повышается уровень Рис. 12. Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов опухоли Walker 256, выделенной на разных сроках после введения исходных опухолевых клеток крысам линий Brattleboro и WAG. Представлено относительное количество (оптическая плотность блотов) исследуемых субъединиц протеасом: LMP7 и LMP2. *p0,05.

20    молекул ГКГ класса I (Рис. 12). Таким образом, низкий уровень молекул ГКГ класса I и иммунных протеасом связан с неэффективностью системы продукции и представления антигена. Увеличение же уровня иммунных протеасом и молекул ГКГ класса I в опухоли у крыс линии Brattleboro способствует восстановлению нормальной продукции антигена и, как следствие, полной регрессии опухоли.

ВЫВОДЫ 1. В печени и селезенке крысы в развитии увеличивается доля иммунных протеасом, включающих субъединицы LMP7 и LMP2, при постоянном общем количестве протеасом.

2. В селезенке увеличение содержания иммунных протеасом обусловлено миграцией обогащенных ими В- и Т-лимфоцитов, постепенно заполняющих белую пульпу селезенки. В печени этот процесс осуществляется за счет изменения ее клеточного состава и увеличения экспрессии иммунных протеасом в гепатоцитах.

3. Возрастание доли иммунных протеасом в общем пуле сопровождается нелинейными изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей.

Спад активностей в обоих органах на 10-12-й дни постнатального развития отражает процесс деградации старого пула и наработку новых протеасом.

4. Увеличение уровня иммунных протеасом в печени крысы при воспалении возможно уже в эмбриональном развитии в ответ на введение в организм матери липополисахарида.

5. Обнаружена связь между судьбой опухоли и содержанием в ней иммунных протеасом. Так, у физиологически нормальных крыс линии WAG карциносаркома Walker 256 развивается при постоянном содержании в ней иммунных протеасом. У крыс линии Brattleboro, дефектных по синтезу аргинин-вазопрессина, значительно повышается уровень иммунных протеасом в клетках карциносаркомы Walker 256 в период, предшествующий ее регрессии.

21    6. При индукции донорспецифической портальной толерантности происходит приживление трансплантата и обогащение его клеток иммунными протеасомами с субъединицей LMP2. Иммунный ответ против трансплантата, напротив, сопряжен с его обогащением иммунными протеасомами с субъединицей LMP7. Подобная зависимость обнаружена и для клеток печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналахперечня ВАК 1. Мельникова В.И., Карпова Я.Д., Афанасьева М.А., Захарова Л.А.

Шарова Н.П. Иммунные протеасомы в формирующейся селезенке крысы // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. C. 163—168.

2. Шарова Н.П., Мельникова В.И., Хегай И.И., Карпова Я.Д., Дмитриева С.Б., Астахова Т.М., Афанасьева М.А., Попова Н.А., Иванова Л.Н., Захарова Л.А. Особенности экспрессии протеасом в клетках опухоли Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // Докл. РАН. 2008. Т. 419, № 6. C. 833—837.

3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Карпова Я.Д., Абатурова С.Б., Люпина Ю.В., Богомягкова Ю.В., Абрамова Е.Б., Ерохов П.А. Множественные формы протеасом как мишени противоопухолевых лекарств нового поколения // Онкохирургия. 2011. Т. 3. № 2. С. 37—42.

4. Божок Г.А., Карпова Я.Д., Люпина Ю.В., Легач Е.И., Богомягкова Ю.В., Бондаренко Т.П., Шарова Н.П. Возможная роль протеасом печени в реализации механизмов трансплантационной толерантности. Вестник трансплантологии и искусственных органов // 2011. Т. XIII. №3. С. 73—81.

Статьи в иностранных рецензируемых журналах 1. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д., Захарова Л.А. Роль иммунных протеасом в молекулярных механизмах становления иммунитета // Известия Национальной Академии Наук Беларуси. Серия медицинских наук. 2008. № 1. С. 106—111.

2. Sharova N.P., Zakharova L.A., Astakhova T.M., Karpova Ya.D., Melnikova V.I., Dmitrieva S.B., Lyupina Yu.V., Erokhov P.A. New approach to study of T cellular immunity development: Parallel investigation of lymphoid organ formation and changes in immune proteasome amount in rat early ontogenesis // Cell. Immunol.

2009. V. 256. P. 47—55.

3. L.A. Zakharova, I.I. Khegai, N.P. Sharova, V.I. Melnikova, Y.D. Karpova, T.M. Astakhova, N.A. Popova, L.N. Ivanova. Pattern of MHC class I and immune proteasome expression in Walker 256 tumor during growth and regression in Brattleboro rats with the hereditary defect of arginine-vasopressin synthesis // Cell.

Immunol. 2011. V. 271. P. 385—391.

22   

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.