авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика вилочковой железы при экспериментальном канцерогенезе в условиях вторичной иммунной недостаточности

На правах рукописи

МОСКВИЧЕВ ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ В УСЛОВИЯХ

ВТОРИЧНОЙ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Оренбург 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор МЕРКУЛОВА Лариса Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ПОЛЯКОВА Валентина Сергеевна, зав.кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия»Минздрава России доктор медицинских наук, профессор ЧЕЛЫШЕВ Юрий Александрович, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО«Казанский государственный медицинский университет»Минздрава России доктор медицинских наук, профессор ЯМЩИКОВ Николай Васильевич, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»2013 г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.04 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия»

Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: Россия, г.

Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Ученого совета

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке академии.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Н.Н. Шевлюк ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них имеет устойчивый рост в последние годы (Давыдов М.И. и др., 2011). Среди возможных причин повышения заболеваемости рассматриваются общее старение населения, ухудшение экологии, увеличение воздействия канцерогенов, возрастающий процент иммунодефицитов.

Иммунный гомеостаз - необходимая составляющая жизнедеятельности.

Обменные процессы организма находятся под надзором иммунной системы, которая, в свою очередь, подчиняется нейрогуморальной регуляции при участии эндокринной системы (Barnard A et al., 2008). В задачи иммунной системы входит не только распознавание чужеродного антигенного материала и борьба с ним, но и надзор за собственными клетками с целью предотвращения приобретения ими новых свойств.

Каждая клетка организма выполняет определенные функции в пределах органа или системы. Однако, при некоторых условиях она может эти функции утратить и приобрести новые, несвойственные для себя характеристики. Как правило, это происходит вследствие генетической мутации, которая, в свою очередь, может быть обратимой или нет. Обратимые изменения генома, чаще всего, распознаются клетками иммунной системы еще до того, как клетка приобрела несвойственные для себя функции. Обратимая мутация в геноме клетки подвергается репарации через удаление измененного фрагмента ДНК с последующей репликацией. Если это невозможно – запускается многоступенчатый механизм запрограммированной гибели через апоптоз (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). В случае если и этот механизм оказывается неэффективным, измененная клетка подвергается лизису и фагоцитозу. Иммунокомпетентные клетки присутствуют в этой схеме на каждом этапе. Они отвечают за распознавание мутантов, инициацию «лечения» или апоптоза и, в конечном итоге, - за их элиминацию. Звенья иммунной системы работают в совокупности через сложные механизмы межклеточных взаимодействий и выпадение одного из них может приводить к дисфункции всей иммунной системы.

Одной из естественных причин угнетения защитных сил организма считают старение. С возрастом происходит уменьшение соотношения лимфоидной ткани, снижение реактивности иммунокомпетентных клеток, а также инволюция органов иммуногенеза. Процесс возрастной инволюции ранее других начинается и наиболее выражено протекает в вилочковой железе.

Снижение защитных сил с возрастом считается одной из причин частого развития опухолей у стариков. Помимо естественного старения организма существует значительное количество причин, вызывающих острую инволюцию тимуса и другие вторичные иммунодефициты, одной из которых является удаление селезенки.

Спленэктомия – операция, применяемая при ряде патологических состояний (Пугачев А.Г. и др., 1983;

Кущ Н.Л. и др., 1988;

Benoist S., 2000;

Eber S.W. et al., 2001). Однако чаще спленэктомию выполняют с целью профилактики массивного кровотечения при травматических разрывах и интраоперационных повреждениях селезенки. Широкое распространение спленэктомии обусловлено трудностью выполнения органосохраняющих операций, что связано с особенностями строения и кровоснабжения органа. Проблема тем более актуальна, что спленэктомия по-прежнему остается операцией выбора во многих, даже крупных, хирургических клиниках (Игнатьев В.Г., Михайлова В.М. 2000;

Pabst R. 1999). Известно, что после удаления селезенки развивается комплекс патологических сдвигов, получивший название «постспленэктомический гипоспленизм» (Апарцин К.А. 2000). Этот синдром проявляется уменьшением иммунологической резистентности, возможностью развития «молниеносных»

инфекций, а также ростом заболеваемости острыми и хроническими вирусными и бактериальными инфекциями на протяжении дальнейшей жизни больного (Кущ Н.Л. и др., 1987;

Епифанов Н.С., 1991;

Spelman D., 2001). Помимо этого, удаление селезенки приводит к быстрой акцидентальной инволюции центрального органа иммуногенеза – тимуса (Стручко Г.Ю. 2003;

Павлова И.Е.

2007).

Следовательно, удаление селезенки приводит к стойкому необратимому угнетению иммунитета, что, несомненно, должно снижать противоопухолевую защиту организма и потенцировать рост новообразований. Однако в доступной литературе мы встретили лишь единичные и, зачастую, противоречивые работы по изучению канцерогенеза на фоне вторичного иммунодефицита (Maral J. et al., 1983;

Barosi G. et al., 1998;

Ben-Hur H et al., 2002). В литературе также отсутствуют сведения о состоянии иммунных органов при канцерогенезе на фоне вторичного иммунодефицита после спленэктомии, что не может достоверно отражать взаимосвязь этих процессов. Таким образом, изучение морфологического статуса и иммуногистохимического фенотипа центрального органа иммуногенеза – тимуса при возрастной инволюции, удалении селезенки, введении канцерогена, при канцерогенезе на фоне иммунной недостаточности после спленэктомии, а также при иммунокоррекции является актуальным и представляет научный интерес для широкого круга специалистов. Исходя из вышеизложенного, нами была поставлена цель и определены конкретные задачи исследования.

Цель исследования На основании оценки изменений морфологии и молекулярного фенотипа тимуса установить особенности инволютивных изменений и степень сохранности его функциональной активности при разных экспериментальных моделях (возрастная атрофия, введение полиоксидония, канцерогенез, спленэктомия, канцерогенез на фоне спленэктомии).

В соответствие с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить морфометрические характеристики долек тимуса и относительную массу железы при возрастной инволюции у интактных крыс 6- месяцев, а также через 1-5 месяцев после воздействия в следующих моделях:

введение полиоксидония, введение канцерогена;

спленэктомия;

введение канцерогена на фоне спленэктомии.

2. Выявить экспрессию маркеров апоптоза и клеточной пролиферации в структурах тимуса крыс с возрастной инволюцией и при указанных экспериментальных моделях.

3. Установить особенности распределения эпителиальных клеток в корковом и мозговом веществе долек тимуса у крыс при возрастной инволюции и в экспериментальных моделях.

4. Оценить клеточный состав нетимопоэтического микроокружения долек тимуса при разных экспериментальных моделях и возрастной инволюции.

5. Определить особенности распределения разных форм лимфоцитов, их количество и соотношение в корковом и мозговом веществе долек железы при возрастной инволюции и указанных экспериментальных моделях.

6. Выявить особенности распределения клеток нейроэндокринного и нейроэктодермального происхождения в структурах тимопоэтического компонента коркового и мозгового вещества долек тимуса в эксперименте и при возрастной инволюции в указанные сроки.

7. Охарактеризовать динамику морфологических и молекулярных изменений в тимусе с позиций оценки степени инволютивных изменений и сохранности структур тимопоэтического компонента и нетимопоэтического окружения при разных экспериментальных моделях и возрастной инволюции.

8. Разработать концепцию патогенетических изменений и определить возможные варианты исхода инволютивных изменений тимуса при возрастной атрофии и указанных экспериментальных воздействиях у крыс 10 месяцев.

Научная новизна работы Представлены новые данные об изменениях в популяциях эпителиальных клеток долек, тимоцитов коркового и мозгового вещества, антигенном составе компонентов тимопоэтического и нетимопоэтического микроокружения, а также экспрессии маркеров клеточной пролиферации и апоптоза в структурах тимуса крыс 6-10 месяцев при возрастной инволюции и через 1-5 месяцев после воздействий (введение полиоксидония, введение канцерогена, спленэктомия, введение канцерогена на фоне спленэктомии).

Впервые показано, что атрофия тимуса в моделях со спленэктомией уже через четыре месяца после воздействия сопровождается дезорганизацией сетевой структуры эпителиальных клеток мозгового вещества, которая сочетается со снижением клеточной пролиферации в структурах дольки и уменьшением числа зрелых тимоцитов в мозговом веществе. В группах без спленэктомии на этом сроке подобных изменений не выявлено.

Впервые продемонстрировано, что инволюция тимуса через 4 и месяцев после воздействия в моделях с изолированным введением канцерогена, спленэктомией и введением канцерогена на фоне спленэктомии характеризуется изменением нормального соотношения CD3+ тимоцитов мозгового и коркового вещества с преобладанием этих клеток в корковом веществе. При этом установлено, что в моделях со спленэктомией этот феномен обусловлен, преимущественно, уменьшением количества CD3+ клеток в мозговом веществе, тогда как в модели с изолированным введением канцерогена реализован за счет значительного увеличения количества CD3+ клеток в корковом веществе дольки.

В исследовании представлены новые данные об изменении в популяциях тимических дендритных клеток и клеток APUD серии при разных экспериментальных моделях и при возрастной инволюции у крыс 6-10 месяцев.

Показано, что инволюция тимуса крыс во всех группах сопровождается волнообразным изменением количества клеток APUD серии (Synaptophysin+) и дендритных клеток (S-100+), причем наиболее значимо число этих клеток возрастает в модели с изолированным введением канцерогена.

Установлено, что наибольшая морфологическая и функциональная сохранность тимической паренхимы у крыс 10 месяцев отмечается в группах с возрастной инволюцией, введением полиоксидония и изолированным введением канцерогена, тогда как в моделях со спленэктомией морфологические признаки атрофии паренхимы тимуса сочетались с выраженными изменениями в его клеточном и антигеном составе.

Научно-теоретическая значимость Результаты работы расширяют представления о клеточных механизмах инволюции центрального органа иммуногенеза - тимуса при возрастной атрофии, канцерогенезе, вторичной иммунной недостаточности после спленэктомии, а также при канцерогенезе на фоне вторичной иммунной недостаточности.

Впервые представлены данные о влиянии курсового введения иммуномодулятора полиоксидоний на течение возрастной инволюции тимуса.

Впервые проведен многофакторный анализ изменений молекулярного фенотипа разных структурных элементов вилочковой железы, исследованы особенности апоптоза и клеточной пролиферации компонентов тимопоэтического и нетимопоэтического микроокружения при разных экспериментальных моделях.

Разработана концепция патогенеза инволютивных изменений тимуса при разных моделях и представлено схематическое морфологическое обоснование возможных вариантов исхода инволюции с позиций сохранности тимопоэтического компонента железы при разных воздействиях.

Основные результаты исследований используются в материалах лекций и практических занятий на кафедрах функциональной и лабораторной диагностики;

цитологии, эмбриологии и гистологии;

госпитальной хирургии № медицинского факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», а также в практической работе врачей-онкологов БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской республики.

Практическая значимость Исследование представляет интерес для широкого круга специалистов:

гистологов, иммунологов, патологов, онкологов, практических хирургов и геронтологов, занимающихся проблемами иммунных нарушений, старения и канцерогенеза. Результаты работы могут быть использованы для обоснования профилактики иммунных нарушений после спленэктомии, а также возможного применения корригирующей иммунотерапии на разных стадиях канцерогенеза.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Степень сохранности тимопоэза у крыс 10 месяцев, оцениваемая по совокупности показателей (количество и соотношение зрелых тимоцитов, экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза, количественные и качественные изменения в популяции клеток тимопоэтического микроокружения), достоверно ниже в моделях с вторичной иммунной недостаточностью после спленэктомии по сравнению с изолированным введением канцерогена, введением полиоксидония и возрастной атрофией.

2. Интенсивность экспрессии маркеров клеточной пролиферации, а также соотношение зрелых тимоцитов и клеток-предшественников тимопоэза в корковом веществе долек тимуса находятся в прямой зависимости от степени сохранности сетевой структуры TEC коркового и мозгового вещества.

Приоритетным следует признать ключевое значение сохранности сетевой структуры TEC с адекватным поступлением в тимус незрелых костномозговых клеток-предшественников в поддержании тимопоэтической функции вилочковой железы у крыс 10 месяцев.

3. Введение канцерогена на фоне спленэктомии через пять месяцев после воздействия приводит к снижению клеточной пролиферации и усилению экспрессии белков-регуляторов апоптоза в структурах коркового вещества долек тимуса, которые сочетаются с изменением количественного соотношения эпителиальных клеток коркового и мозгового вещества с дезорганизацией их сетевой структуры, а также уменьшением числа CD3+ тимоцитов коркового и мозгового вещества.

Апробация работы и публикации Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009);

VIII Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2009);

Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ивановской школы лимфологов (Иваново, 2009);

XVII Международном конгрессе по реабилитации (Париж, Франция, 2011);

II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии»

(Курск, 2011);

Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Республиканского клинического онкологического диспансера «Новые технологии в диагностике и лечении злокачественных новообразований» (Чебоксары, 2011);

XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2011);

IV Всероссийской научно практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии:

фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011);

III Съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011);

IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2012);

XI Конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара 2012);

Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения профессора Д.С. Гордон (Чебоксары, 2012).

По теме диссертации опубликовано 47 научных работ (тезисы–28, статьи 19). 20 работ (из них 15 - статьи) опубликованы в ведущих рецензируемых российских научных журналах из перечня ВАК РФ, рекомендованного для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученых степеней, выпущено одно учебное издание.

Связь с базовыми научными программами Исследование является частью комплексной темы «Иммунология злокачественного роста. Типирование опухоли желудочно-кишечного тракта на фоне иммунной недостаточности» № гос. регистрации 01201055242 от 04.05. г. Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ МД-5000.2008.7, гранта Президента РФ МД-2936.2011.7, гос. контракта 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 2013гг.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована таблицами, 55 рисунками. Список использованной литературы включает источников, из них 274 - иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования выполнены на 260 белых нелинейных крысах-самцах массой 190-320 граммов. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли по нормам и правилам обращения с лабораторными животными (Западнюк И.П.

и др., 1983), в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных»

(1985), правилами лабораторной практики в Российской федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 № 267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999г. Проведение исследования единогласно одобрено на заседании Этического комитета медицинского факультета ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова» (протокол №6 от 01.03.2013г). Эксперименты проводились круглогодично с июня 2004 года по октябрь 2011 года.

Животные были разделены на пять группы: 1-интактные (n=60);

2 животные с введением полиоксидония (n=50);

3- животные с введением канцерогена (n=50);

4-спленэктомированные крысы (n=50);

5 – животные с введением канцерогена на фоне спленэктомии (n=50). Спленэктомия выполнялась под местной анестезией с соблюдением всех правил асептики и антисептики через разрез по белой линии живота. Введение водного раствора канцерогена (1,2-диметилгидразин дигидрохлорид) проводилось еженедельно внутрибрюшинно из расчета 20 мг/кг массы крысы в течение 5 недель, согласно модели R.F. Jacoby с соавт. (1991). Инъекции полиоксидония проводились внутримышечно из расчета 0,1мг/кг 2 раза в неделю в течение 3х недель.

Препарат вводился в средней терапевтической дозе для человека в пересчете на вес животного. Расчет проводился, исходя из соотношения средней массы человека и крысы. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1, 2, 3, 4 и 5 месяцев после окончания воздействий (введение полиоксидония, удаление селезенки, введение канцерогена) путем декапитации (Западнюк И. П.

и др. 1983). Одновременно из эксперимента выводились интактные животные соответствующего возраста. Для сопоставления результатов исследования в разных моделях эксперименты планировались и проводились с таким расчетом, чтобы на момент выведения из эксперимента, вне зависимости от воздействия, все животные имели одинаковый биологический возраст. При аутопсии животных из групп с введением канцерогена проводилась ревизия органов брюшной полости с вскрытием толстой кишки, забором и исследованием опухолевого материала. Животные, у которых не произошло формирования опухоли, в исследовании не учитывались. Объектом исследования служил тимус, в группах с введением канцерогена параллельно проводилось исследование морфологии и биологических свойств выявленных новообразований.

В работе использовались следующие методы:

1. Окраска гематоксилином-эозином (Ромейс Б., 1954) для исследования морфологии тимуса и проведения морфометрических измерений. Ткань тимуса фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре Leica ASP 200. После проводки кусочки ткани тимуса заливали в парафин и готовили парафиновые блоки. Парафиновые срезы тимуса толщиной 3 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла Mentzel Glasses super frost и выполняли окраску гематоксилином и эозином по стандартной методике.

2. Иммуногистохимический метод (George L. Kumar, Lars Rudbeck, 2011).

Иммуногистохимические исследования выполнялись в соответствии со стандартными протоколами. Тканевые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные L-polysine, высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Окраса проводилась ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия) с применением систем визуализации En-vision (DAKO, Дания) и NovoLink polymer (NovoCastra, Великобритания). Контролем чувствительности и специфичности реакции служили неиммунизированные кроличьи и мышиные сыворотки, а также срезы контрольных тканей (лимфоидная миндалина, аппендикс, селезенка интактной крысы 4 месяцев). В работе использованы следующие моно- и поликлональные антитела:

1) Моноклональное антитело к цитокератинам, клон AE1/AE3 (NovoCastra, Великобритания) 2) Моноклональное антитело к кластеру дифференцировки лимфоцитов типа (CD3), клон M-20 (Santa Cruze, США) 3) Моноклональное антитело к кластеру дифференцировки лимфоцитов типа (CD30), клон Ber-H2 (NovoCastra, Великобритания) 4) Поликлональное антитело к белку S-100, Rtu (DAKO, Дания) 5) Поликлональное антитело к Synaptophysin (Spring Bioscience, США) 6) Моноклональное антитело к кластеру дифференцировки лимфоцитов типа (CD68), клон ED-1 (Abcam, Великобритания) 7) Поликлональное антитело к антиапоптотическому белку p-53 (Santa Cruze, США) 8) Поликлональное антитело к белку bcl-2 (Santa Cruze, США) 9) Моноклональное антитело к иммуноглобулинам класса М (JgM) (Santa Cruze, США) 10) Моноклональное антитело к иммуноглобулинам класса G (JgG) (Santa Cruze, США) 11) Моноклональное антитело к актину гладких мышц (SMA) (DAKO, Дания) 12) Моноклональное антитело к маркеру клеточной пролиферации Ki-67, клон ММ-1 (NovoCastra, Великобритания) 3. Компьютерная морфометрия. Цифровые снимки микропрепаратов получены с применением системы архивирования на базе микроскопа Leica DM4000B с использованием цветной фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0. Микрофотографии для проведения морфометрических измерений были получены при увеличениях х100 и х400, с обозначением градуировочной линейки на каждом снимке. Линейные морфометрические измерения выполнены с использованием лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0. Количественное измерение интенсивности ядерной иммуногистохимической реакции проведено путем подсчета числа окрашенных ядер к числу неокрашенных и переводом значений в проценты. Количественные морфометрические измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением лицензионной программы «Микро-Анализ», а также демо-версии программы Sigma Scan Pro. Площадь мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценена методом автоматического выделения и подсчета площади интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка. Затем числовые значения площади позитивной иммуногистохимической реакции переводились в процентное отношение к общей площади снимка. Для каждого среза выполнены измерения не менее чем в 10 интересующих полях зрения. При малом количестве клеток, дающих цитоплазматическую или мембранную окраску, применен метод их визуального подсчета в десяти интересующих полях зрения при увеличении х400.

4. Статистическая обработка цифровых данных проводилась на компьютере Intel Core 2 Duo с помощью лицензионного пакета Microsoft Office 2003 (Word и Excel), а также программ G-Stat и «Биостатистика», достоверность определяли критерием Стьюдента (t) (Гублер Е.В. и др., 1973;

Автандилов Г.Г., 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Структура вилочковой железы у крыс 5-10 месяцев в процессе возрастной инволюции претерпевает ряд изменений и сопровождается снижением массы органа, частичной перестройкой его морфологии и молекулярного фенотипа. У взрослых крыс 10-ти месяцев тимус состоит из долек разной величины. В центре органа располагаются крупные дольки с хорошо различимым корковым и мозговым веществом, а по периферии - дольки меньшего размера с плохо различимой границей зон, между которыми определяется небольшое количество жировой ткани. При морфометрическом исследовании установлено, что снижение относительной массы железы совпадает с уменьшением размеров долек, которое обусловлено преимущественно снижением толщины коркового и, в меньшей степени, площади мозгового вещества. Следует отметить, что снижение морфометрических показателей долек более выражено, чем уменьшение относительной массы железы. Это, вероятно, обусловлено замещением паренхимы жировой и соединительной тканью, что частично компенсирует потерю массы.

При иммуногистохимическом исследовании тимуса крыс 10 месяцев по сравнению с животными 5 месяцев выявлено более чем двукратное увеличение числа CD3+ тимоцитов коркового вещества на фоне снижения этих клеток в мозговом веществе, аналогичные изменения регистрируются в популяции эпителиальных клеток. Следует подчеркнуть, что, несмотря на существенные количественные изменения в популяции CD3+ тимоцитов, их соотношение в корковом и мозговом веществе не меняется на протяжении всего эксперимента и через 10 месяцев зрелых клеток в мозговом веществе по-прежнему больше, чем в корковом. Экспрессия маркера клеточной пролиферации Ki-67 достоверно снижена во всех исследуемых структурах. Уменьшено количество сосудов мышечного типа, дающих реакцию с SMA. На этом фоне в структурах дольки значительно повышена экспрессия таких антигенов как S-100, Synaptophysin, CD30, CD68, JgG, bcl-2 и p-53.

Через месяц после курсового введения иммуномодулятора полиоксидоний в тимусе крыс регистрируется небольшое увеличение толщины коркового вещества и площади дольки, тогда как показатели площади мозгового вещества не отличаются от значений у интактных животных. Изменение морфометрических показателей дольки сопровождается увеличением относительной массы железы на 16%. В корковом веществе дольки отмечается достоверное повышение количества CD3+ тимоцитов и экспрессии белка клеточной пролиферации Ki-67 на фоне снижения экспрессии Pan-cytokeratin.

Эти изменения совпадают с увеличением количества CD68+ макрофагов в кортико-медуллярной зоне, дендритных клеток, экспрессирующих S-100, в мозговом веществе дольки, а также клеток, позитивных к Bcl-2. Через два месяца после введения полиоксидония в тимусе по-прежнему больше макрофагов и Bcl-2+ клеток. Через три месяца регистрируется лишь достоверное повышение числа дендритных клеток, в то время как другие исследуемые показатели не отличаются от интактных животных соответствующего возраста. Через четыре и пять месяцев после введения полиоксидония мы не выявили достоверных отличий в морфологии и иммуногистохимическом фенотипе тимуса по сравнению с изменениями при возрастной инволюции. Следовательно, курсовое введение полиоксидония оказывает на тимус выраженный, но кратковременный стимулирующий эффект, который сохраняется через один месяц и не влияет на течение его возрастной инволюции в динамике.

Ведение канцерогена через 5 месяцев вызывает развитие злокачественной опухоли толстой кишки, имеющей морфологию аденокарциномы.

Формированию опухоли предшествуют предопухолевые изменения в виде пролиферации крипт и дисплазии, которые выявляются через 3 и 4 месяца после введения канцерогена. Внешнее строение тимуса крыс и его морфология на светооптическом уровне через 1, 2 и 3 месяца после ведения канцерогена в целом соответствует изменениям у интактных животных соответствующего возраста, однако через 4 и 5 месяцев после воздействия в морфологии тимуса появляется ряд отличий. Установлено, что инволюция железы на этих сроках сопровождается формированием сливающихся долек с общим корковым веществом. В центре тимуса располагаются крупные дольки с различимой границей коркового и мозгового вещества, а на периферии - более мелкие, сливающиеся между собой. Кроме этого, в периферических отделах органа встречаются дольки, изолированные от основной массы железы жировой тканью.

При компьютерной морфометрии через 4 и 5 месяцев после воздействия выявляется достоверное снижение площади дольки и мозгового вещества, а также толщины коркового вещества.

Изменения в молекулярном фенотипе тимуса начинаются раньше морфологической перестройки и совпадают с появлением в кишке предопухолевых изменений. Наибольшие отличия иммуногистохимического профиля отмечаются через 4 и 5 месяцев после введения канцерогена. Нами установлено, что на этих сроках в корковом веществе дольки достоверно больше CD3+ тимоцитов и клеток, позитивных к CD30. При сопоставлении количественных данных CD3+ клеток коркового и мозгового вещества выявляется перекрест с преобладанием зрелых клеток в корковом веществе железы, который регистрируется между 4 и 5 месяцем эксперимента.

Значительно возрастает экспрессия Pan-cytokeratin в эпителиальных клетках коркового и мозгового вещества, при этом в соотношении эпителиальных клеток также регистрируется перекрест с преобладанием в корковом веществе дольки.

Своеобразная динамика выявлена в распределении антигенов нейроэндокринной и нейроэктодермальной дифференцировки. Показано, что количество S-100+ и Synaptophysin+ клеток в структурах дольки достоверно возрастает уже через 2 месяца после воздействия, а через 5 месяцев количество этих клеток больше, чем у интактных животных в два раза. Повышается экспрессия маркеров клеток микроокружения: CD68 - через 4 месяца, иммуноглобулинов классов M и G - через 4 и 5 месяцев после введения канцерогена. Определение белков-регуляторов апоптоза выявляет значительное повышение экспрессии bcl-2 в структурах дольки тимуса, начиная с третьего месяца эксперимента, тогда как экспрессия его антагониста - белка p-53, напротив, снижается и становится меньше, чем у интактных животных.

Достоверные отличия выявлены и в экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67. Установлено, что число пролиферирующих клеток достоверно выше в структурах тимуса животных с введением канцерогена через 4 и 5 месяцев после воздействия. Достоверных изменений в экспрессии SMA не выявлено на протяжении всего эксперимента, что указывает на сохранность сосудистого компонента в структурах PVS.

Известно, что белок-супрессор апоптоза bcl-2 локализуется на мембране митохондрий и в большом количестве встречается в долгоживущих клетках (нейроны головного мозга, иммунные клетки памяти, хондроциты и др.) (Lu Q.L., 1993). Экспрессия этого белка возрастает при высокой интенсивности клеточного деления (Reed J.C. et al., 1987). Ген P-53 и кодируемый им белок осуществляет надзор за состоянием ДНК. При повреждении ДНК этот ген запускает либо репарацию ДНК, либо, когда это невозможно, запрограммированную клеточную гибель через апоптоз (Sturnzbecher H., Deppert W., 1994). Появление этого белка в клетке может указывать на запуск механизма апоптоза, а также сочетаться с повышенной клеточной пролиферацией (Warnakulasuriya K.A., Johnson N.W., 1994). При активации в цитоплазме клетки bcl-2 вступает в комплекс с белком p 53 и инактивирует его, тем самым блокирует апоптоз (Israels L.G., Israels E.D., 1999). Таким образом, белки p53 и bcl-2, являясь регуляторами апоптоза, между собой выступают антагонистами.

Synaptophysin является протеином пресинаптических везикул и окрашивает клетки нейроэндокринного происхождения, к которым в тимусе относятся клетки APUD - серии, а так же некоторые популяции эпителиальных клеток (Bai M. et al., 2008). Единичные клетки, экспрессирующие нейроэндокринные маркеры, встречаются в составе компонентов TES коркового вещества, тогда как в составе PVS количество этих клеток значительно больше.

Они осуществляют роль трансмиттеров нервного импульса на клетки тимопоэтического окружения (Deschaux P., Rouabhia M., 1988). Белок S-100 маркер нейроэктодермальной дифференцировки, в тимусе экспрессируется интердигитирующими дендритными клетками в структурах PVS и некоторыми популяциями эпителиальных клеток (Raica M. et al., 2006). Известно, что дендритные клетки тимуса, входящие в состав сети PVS мозгового вещества, необходимы для заключительного этапа негативной клональной селекции аутореактивных тимоцитов (Sempowski G.D. et al., 2000). Мы полагаем, что увеличение числа клеток APUD-серии и дендритных клеток в тимопоэтическом окружении и структурах PVS, а также изменения в экспрессии белков регуляторов апоптоза через 3 месяца свидетельствует о реакции центрального органа иммуногенеза тимуса на канцерогенез уже на стадии предопухолевых изменений.

Спленэктомия приводит к более существенным изменениям морфологии и молекулярно фенотипа тимуса по сравнению с моделями, описанными выше, которые выявляются на всех сроках после операции. Через 5 месяцев после спленэктомии железа дряблая, желтого цвета, граница коркового и мозгового вещества сохраненных долек определяется с трудом. Мозговое вещество сохраненных долек имеет оксифильную окраску, в нем определяются многочисленные скопления эпителиальных клеток, локализованные на границе коркового и мозгового вещества, которые формируют переплетающиеся пучки в виде густой сети. В периферических дольках, подверженных инволюции, мозговое вещество представлено компактными скоплениями эпителиальных клеток с немногочисленными лимфоцитами. Атрофичные дольки окружены жировой и соединительной тканью, которая проникает в междольковые септы.

Уже через месяц после спленэктомии отмечается достоверное снижение всех исследуемых морфометрических показателей дольки, которое сохраняется на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что уменьшение массы железы в первые два месяца после операции менее выражено, чем снижение морфометрических характеристик, что указывает на интенсивное замещение паренхимы жировой тканью. Через 3, 4 и 5 месяцев после операции масса тимуса достоверно ниже, чем у интактных животных соответствующего возраста.

Определение экспрессии CD3 демонстрирует постепенное увеличение числа CD3+ клеток в корковом веществе с уменьшением в мозговом. Подобная динамика регистрируется на протяжении всего эксперимента, а между 4 и месяцем после воздействия изменяется соотношение зрелых тимоцитов дольки с их преобладанием в корковом веществе. Мы считаем, что снижение числа CD 3+ клеток медуллярной зоны, по-видимому, является реакцией тимуса на удаление селезенки, направленной на компенсацию недостаточности периферических Т лимфоцитов, развивающейся после спленэктомии (Westerhausen M. et al., 1981).

Тогда как увеличение этих клеток в корковом веществе может быть обусловлено токсическим влиянием избыточного уровня глюкокортикоидов на костный мозг с нарушением поступления в тимус клеток-предшественников (Стручко Г.Ю., 2003;

Jeklova E. et al., 2008).

Более существенные изменения отмечены в популяции эпителиальных клеток. Установлено, что количество эпителиоцитов коркового вещества постепенно возрастает на протяжении всего эксперимента, тогда как в мозговом веществе их число меняется волнообразно. При этом изменяется цитоархитектоника эпителиоцитов мозгового вещества с их конденсацией в кортико-медуллярной зоне. Подобное распределение эпителиальных клеток приводит к образованию двух перекрестов в их соотношении, выявляемых между 2 и 3, а также между 4 и 5 месяцем эксперимента. Мы полагаем, что волнообразное колебание количества эпителиоцитов в мозговом веществе и их конденсация в кортико-медуллярной зоне через 2 и 3 месяца после спленэктомии может быть вызвано увеличением числа клеток нетимопоэтического микроокружения в структурах PVS и, вероятно, является признаком акцидентальной инволюции тимуса.

Другой особенностью инволюции тимуса после спленэктомии является повышение клеточной пролиферации в корковом веществе через один и два месяца, которое совпадает с увеличением экспрессии белков-регуляторов апоптоза bcl-2 и p-53. Вероятно, этот феномен обусловлен компенсаторным повышением активности тимуса, направленным на восполнение недостаточности периферических Т-лимфоцитов после спленэктомии. На поздних сроках эксперимента (4 и 5 месяцев), напротив, отмечено снижение экспрессии Ki-67 в корковом веществе долек железы, совпадающее с увеличением числа CD68+, JgM+, JgG+ клеток, а также, по-видимому, клеток APUD – серии и дендритных макрофагов. Достоверных отличий в экспрессии SMA не выявлено на протяжении всего эксперимента, что указывает на сохранность сосудистого компонента тимуса у животных данной модели.

Таким образом, на ранних сроках после спленэктомии в тимусе отмечаются признаки усиления тимопоэза, носящие, вероятно, компенсаторный характер. Изменения железы через 5 месяцев после спленэктомии характеризуются признаками, указывающими на высокую интенсивность инволютивных процессов с апоптозом клеток, фагоцитозом паренхимы и ее жировым замещением. Тем не менее, сохранность сосудистого компонента, сетевой структуры эпителиальных клеток коркового и мозгового вещества, а также незначительное уменьшение количества зрелых тимоцитов мозгового вещества на фоне сохранения экспрессии МКП Ki-67 в его структурах позволяют судить о частичном сохранении тимопоэза.

Введение канцерогена спленэктомированным крысам вызывает изменения общегистологической картины тимуса, схожие с моделью изолированной спленэктомии через 1, 2 и 3 месяца эксперимента. Однако через и 5 месяцев после воздействия строение тимуса существенно отличается от всех моделей.

Морфометрические характеристики дольки тимуса и его масса через 1, 2, и 4 месяца после воздействия достоверно ниже по сравнению с группой с введением канцерогена, введением полиоксидония и интактными животными, но не отличаются от животных со спленэктомией. Через 5 месяцев после воздействия тимус уменьшен в размерах, паренхима значительно замещена жировой тканью, граница коркового и мозгового вещества определяется с трудом. В периферических отделах органа вместо долек определяются скопления эпителиальных клеток без лимфоцитов, окруженные жировой тканью. В центральных отделах железы видны небольшие дольки, в мозговом веществе которых отчетливо визуализируются скопления оксифильных эпителиоцитов.

Масса тимуса и исследуемые морфометрические показатели дольки достоверно снижены по сравнению со всеми моделями.

В мозговом веществе дольки через 3 месяца после воздействия регистрируется значительное снижение количества CD3+ тимоцитов, которое сохраняется на протяжении всего эксперимента. Следует подчеркнуть, что значимого повышения числа CD3+ клеток в корковом веществе, выявляемого при этом в других экспериментальных моделях, не выявлено. Тем не менее, в соотношении зрелых тимоцитов коркового и мозгового вещества у животных данной модели также наблюдается перекрест, который, в отличие от других групп, регистрируется уже через 3 месяца после воздействия и обусловлен, преимущественно, уменьшением числа CD3+ клеток в мозговом веществе (рисунок 1).

Интактные (корковое в-во) Интактные (мозговое в-во) площадь структур дольки, позитивных к CD3 (%) Полиоксидоний (корковое в-во) Полиоксидоний (мозговое в-во) 40 Канцероген (корковое в-во) Канцероген (мозговое в-во) Спленэктомия (корковое в во) Спленэктомия (мозговое в во) Спленэктомия+канцероген 10 (корковое в-во) Спленэктомия+канцероген (мозговое в-во) 5 мес. 6 мес./ 30 суток 7 мес./ 60 суток 8 мес./ 90 суток 9 мес./120 суток 10 мес./ суток возраст крыс/срок после воздействия Рисунок 1. Экспрессия CD 3 в клетках коркового и мозгового вещества долек у крыс 5-10 месяцев с возрастной инволюцией и после экспериментальных воздействий Эпителиоциты коркового вещества долек частично сохраняют сетевую организацию даже на поздних сроках эксперимента, тогда как расположение медуллярных клеток существенно изменяется. Уже через два месяца после введения канцерогена спленэктомированным крысам медуллярные эпителиоциты располагаются на границе коркового и мозгового вещества, при этом в центральной области мозгового вещества эпителиальные клетки отсутствуют (рисунок 2). Количество клеток на этом сроке достоверно ниже, чем у животных других групп. Подобные изменения сохраняются через три месяца эксперимента. Через пять месяцев отмечается значительное повышение количества эпителиальных клеток мозгового вещества по сравнению со всеми группами (рисунок 3). Эпителиальные клетки мозгового вещества на этом сроке располагаются компактными скоплениями, формируя периваскулярные розетки, лишенные тимоцитов. Подобная картина наблюдается как в периферических дольках, подверженных атрофии, так и в центральных, имеющих сохраненную сеть TEC в корковом веществе (рисунок 4).

Рисунок 2 - Тимус спленэктомированной крысы через 2 месяца после введения канцерогена. Скопления эпителиальных клеток на границе коркового и мозгового вещества. Иммуногистохимическая реакция к pan-cytokeratin, ув.

100х Интактные (корковое в-во) площадь структур дольки, позитивных к Pan-cytokeratin (%) Интактные (мозговое в-во) Канцероген (корковое в-во) Канцероген (мозговое в во) Спленэктомия (корковое в во) Спленэктомия (мозговое в 15 во) Спленэктомия+канцероген (корковое в-во) Спленэктомия+канцероген (мозговое в-во) 5 мес. 6 мес./ 30 суток 7 мес./ 60 суток 8 мес./ 90 суток 9 мес./120 суток 10 мес./ суток возраст крыс/срок после воздействия Рисунок 3 - Экспрессия Pan-cytokeratin в эпителиальных клетках тимуса у крыс 5- месяцев с возрастной инволюцией и после воздействий Рисунок 4 - Тимус спленэктомированной крысы через 5 месяцев после введения канцерогена. Розетки эпителиальных клеток в мозговом веществе сохраненных долек тимуса. 1-компактные скопления эпителиальных клеток в мозговом веществе дольки, 2-сеть кортикальных эпителиоцитов.

Иммуногистохимическая реакция к pan-cytokeratin, ув. 400х В количестве клеток, позитивных к S-100, отмечена восходящая динамика, в целом повторяющая изменения у животных других групп, тогда как число клеток, позитивных к Synptophysin, меняется волнообразно и снижается в поздние сроки наблюдения. Через 4 и 5 месяцев после воздействия в структурах дольки существенно больше CD 68+ макрофагов, тогда как в популяции клеток, экспрессирующих CD30+, отмечена волнообразная динамика с повышением через 1, 2 и 3 месяца и снижением через 4 и 5 месяцев после воздействия. При исследовании экспрессии JgG отмечено достоверное увеличение количества этого белка в клетках мозгового вещества через 2 месяца после воздействия по сравнению со всеми экспериментальными группами. Через 3 и 4 месяца отмечается достоверное увеличение числа JgM+ клеток по сравнению со всеми группами, тогда как количество JgG+ клеток достоверно выше лишь по сравнению с интактными крысами и животными с введением канцерогена. Через 5 месяцев число JgM+ клеток достоверное выше по сравнению со всеми группами, тогда как количество JgG+ клеток возрастает менее значимо.

Динамика экспрессии белка bcl-2 через 1, 2 и 3 месяца после воздействия в целом повторяет изменения в группе с изолированным введением канцерогена, однако через 4 и 5 месяцев после воздействия экспрессия bcl-2 снижается и соответствует значениям у животных со спленэктомией. Определение белка p- выявляет достоверное повышение экспрессии в клетках мозгового вещества через 5 месяцев эксперимента по сравнению со всеми группами, при этом p-53+ клеток в два раза больше чем у интактных крыс и животных с введением полиоксидония и изолированным введением канцерогена. Обработка препаратов антителами к SMA выявляет снижение экспрессии этого антигена в структурах дольки. Через 5 месяцев после воздействия значения SMA в два раза ниже, чем у животных со спленэктомией. Экспрессия МКП Ki-67 в тимусе крыс данной группы имеет негативную динамику уже со 2 месяца эксперимента, при этом наиболее значимо снижается клеточная пролиферация в структурах мозгового вещества (рис. 5).

Интактные (корковое в-во) интенсивность клеточной пролиферации в структурах дольки ( %) Интактные (мозговое в-во) Полиоксидоний (корковое в-во) 40 Полиоксидоний (мозговое в-во) Канцероген (корковое в во) Канцероген (мозговое в во) Спленэктомия (корковое в-во) Спленэктомия (мозговое в-во) Спленэктомия+канцероген (корковое в-во) Спленэктомия+канцероген (мозговое в-во) 5 мес. 6 мес./ 30 7 мес./ 60 8 мес./ 90 9 мес./120 10 мес./ суток суток суток суток суток возраст крыс/срок после воздействия Рисунок 5. Экспрессия Ki-67 в корковом и мозговом веществе дольки тимуса у крыс 5-10 месяцев с возрастной инволюцией и после экспериментальных воздействий Изменения у животных данной модели демонстрируют результат сочетанного токсического влияния на тимус, обусловленного, с одной стороны, избыточным уровнем ГКС и рядом гематологических нарушений вследствие спленэктомии, с другой – влиянием продуктов метаболизма растущей опухоли.

Причем оба этих фактора способны оказывать негативное влияние на поступление в тимус костномозговых предшественников тимопоэза (Киселева Е.М., 2004;

Jeklova E. et al., 2008). Мы установили, что инволюция тимуса у животных данной модели сопровождается снижением клеточной пролиферации в корковом и мозговом веществе, ранним изменением соотношения популяций кортикальных и медуллярных тимоцитов с уменьшением числа зрелых форм, дезорганизацией и атрофией сети TEC и компонентов PVS мозгового вещества, а также усилением фагоцитоза и апоптоза клеток в мозговом веществе тимической дольки.

Таким образом, в нашей работе проведено сравнение морфологических изменений тимуса у крыс 6-10 месяцев на примере пяти экспериментальных моделей. При сопоставлении результатов и многофакторном анализе изменений морфологии и молекулярного фенотипа тимуса в разных моделях мы выявили общие закономерности, а также некоторые различия, которые позволили сформулировать новую концепцию патогенетических изменений с позиций сохранности тимопоэтического и нетимопоэтического компонента и функциональной активности железы.

Несмотря на схожесть светооптической морфологии инволютивных изменений тимуса при разных моделях, в его молекулярном фенотипе нами впервые был выявлен ряд существенных отличий. При этом изменения некоторых признаков имели длительную закономерность и выявлялись на протяжении всего эксперимента, тогда как изменения других носили лишь временный характер в раннем или позднем сроке наблюдения.

Так для моделей возрастной инволюции, введения полиоксидония, а также канцерогенеза общими признаками являлись более высокие показатели клеточной пролиферации в структурах коркового и мозгового вещества, выявляемые на протяжении всего эксперимента, по сравнению с моделями со спленэктомией. Другой особенностью является сохранение сетевой структуры эпителиоцитов, увеличение количества CD30+ клеток в корковом веществе и клеток APUD серии в мозговом веществе дольки на протяжении всего эксперимента.

Для моделей со спленэктомией характерным признаком было более значительное снижение массы железы и всех измеряемых морфометрических показателей дольки, которые на поздних сроках наблюдения сочетались с явлениями дезорганизации сетевой структуры эпителиальных клеток мозгового вещества. При этом наиболее значимые изменения отмечались в группе канцерогенеза на фоне спленэктомии. Другой особенностью инволюции тимуса в моделях со спленэктомией является более значимое, по сравнению с другими моделями, снижение экспрессии актина на поздних сроках воздействия и, следовательно, уменьшение количества сосудов мышечного типа в мозговом веществе дольки, совпадающее с их атрофией и дезорганизацией сетевой структуры эпителиоцитов. Уменьшение показателей клеточной пролиферации в структурах дольки также более выражено в моделях со спленэктомией, при этом у животных с канцерогенезом на фоне спленэктомии экспрессия Ki-67 в мозговом веществе на последнем сроке наблюдения практически отсутствует.

Для всех исследованных моделей общим и закономерным признаком явилось снижение числа CD3+ тимоцитов в корковом веществе с их увеличением в мозговом. Однако степень выраженности этих изменений имела существенные отличия в разных моделях. Наименьшее изменение количественных характеристик CD3+ тимоцитов с сохранением их нормального соотношения зарегистрировано у животных с возрастной инволюцией и введением полиоксидония, тогда как наиболее существенное снижение количества этих клеток и раннее изменение их соотношения зарегистрировано в модели канцерогенеза на фоне спленэктомии.

Более сложные изменения отмечены в распределении антигенов апоптоза.

Повышение экспрессии антиапоптотического белка P-53 на всех сроках наблюдения регистрируется во всех экспериментальных моделях, за исключением изолированного введения канцерогена, при котором динамика экспрессии этого антигена носит волнообразный характер. Изменение экспрессии Bcl-2 в структурах тимуса при разных моделях носит временный и волнообразный характер. При этом повышение этого антигена у крыс с введением канцерогена и спленэктомией регистрируется на поздних сроках эксперимента, а у животных с канцерогенезом на фоне спленэктомии - в раннем сроке после воздействия. В моделях с возрастной инволюцией и введением полиоксидония значимого изменения экспрессии Bcl-2 не зарегистрировано.

На основании вышеизложенного мы предлагаем концептуальную схему патогенетических изменений и морфофункционального состояния вилочковой железы в разных экспериментальных моделях, при этом считаем целесообразным выделить, как минимум, три возможных варианта исхода инволюции с позиций выявленных морфологических изменений и степени сохранности функциональной активности органа (схема 1).

1. Частичная инволюция тимуса с сохранением тимопоэза (возрастная инволюция, введение полиоксидония, введение канцерогена);

2. Выраженная инволюция тимуса с частичным сохранением сетевой структуры эпителиальных клеток и структур PVS, но снижением тимопоэза (спленэктомия);

3. Атрофия железы с дезорганизацией сети эпителиальных, структур нетимопоэтического окружения мозгового вещества и угнетением тимопоэза (спленэктомия с введением канцерогена).

ВЫВОДЫ 1. Инволюция тимуса у интактных крыс 6-10 месяцев, а также у животных соответствующего возраста через 1-5 месяцев после воздействия (введение канцерогена, спленэктомия, введение канцерогена на фоне спленэктомии) сопровождается достоверным снижением морфометрических характеристик долек (толщина коркового вещества, площадь мозгового вещества и площадь дольки), уменьшением относительной массы железы и замещением тимической паренхимы жировой тканью. Эти изменения наиболее выражены в моделях со спленэктомией и введением канцерогена на фоне спленэктомии.

2. Изменение экспрессии маркера клеточной пролиферации (Ki-67) и белков-регуляторов апоптоза (bcl-2 и p-53) при возрастной инволюции и в эксперименте имеет волнообразный и разнонаправленный характер. Наиболее значимо клеточная пролиферация снижается в структурах тимуса крыс с введением канцерогена на фоне спленэктомии (на 44% - в корковом и на 72% - в мозговом веществе дольки), тогда как у животных с изолированным введением канцерогена, напротив, превышает значения у интактных на 23% и 41% соответственно. Экспрессия белков-регуляторов апоптоза возрастает во всех экспериментальных моделях, при этом максимальное повышение bcl- регистрируется в группах животных с введением канцерогена, тогда как увеличение p-53 - в группах со спленэктомией.

3. Курсовое введение иммуномодулятора полиоксидоний сопровождается стимулированием тимопоэтической функции вилочковой железы, что выражается повышением клеточной пролиферации и количества зрелых тимоцитов в корковом веществе, а также увеличением числа CD68+, S-100+, Bcl 2+ клеток в его структурах. Стимулирующий эффект однократного курсового введения полиоксидония на тимус носит временный характер, сохраняется через месяц после введения, нивелируется в более поздние сроки и не изменяет течение возрастной инволюции в динамике.

4. Инволютивные изменения тимуса у крыс со спленэктомией характеризуются увеличением числа и частичным изменением цитоархитектоники эпителиальных клеток коркового и мозгового вещества долек. При введении канцерогена на фоне спленэктомии эти изменения сопровождаются нарушением сетевой структуры эпителиальных клеток и формированием компактных скоплений без лимфоцитов. В модели с изолированным введением канцерогена и у интактных животных сетевая структура эпителиальных клеток сохраняется.

5. Клеточный и антигенный состав нетимопоэтического микроокружения у животных 6-10 месяцев во всех группах исследования изменяется однонаправлено и характеризуется увеличением количества CD68+- макрофагов, JgG+- и JgM+- плазматических клеток, а также снижением экспрессии актина гладких мышц в сосудах мозгового вещества. Максимальное повышение числа JgG+- и JgM+- клеток мозгового вещества дольки зарегистрировано в моделях с введением канцерогена.

6. Инволюция тимопоэтического компонента железы у животных всех групп характеризуется снижением числа CD3+-клеток в мозговом веществе с одновременным повышением их количества в корковом веществе дольки. Уже через 4 месяца после воздействия в группе крыс с введением канцерогена на фоне спленэктомии регистрируется перекрест числа CD3+-клеток коркового и мозгового вещества с их преобладанием в корковой зоне. В других экспериментальных моделях подобные изменения отмечены через 5 месяцев. В группе с возрастной инволюцией изменений в соотношении корковых и мозговых CD3+ - клеток не зарегистрировано.

7. Экспрессия CD30 в структурах дольки тимуса у животных с возрастной инволюцией и всех экспериментальных моделей изменяется волнообразно. Через 5 месяцев после воздействия наибольшее повышение экспрессии этого антигена (на 69%) регистрируется в группе с изолированным введением канцерогена, тогда как максимальное снижение (на 32%) отмечено у животных с введением канцерогена на фоне спленэктомии.

8. Изменения тимопоэтического компонента у крыс 6-10 месяцев во всех экспериментальных моделях и у интактных животных характеризуются однонаправленным увеличением в структурах дольки количества клеток (synaptophysin+) (S-100+) нейроэндокринного и нейроэктодермального происхождения. Наиболее значимо возрастает число этих клеток в моделях с введением канцерогена.

9. Клеточная пролиферация и экспрессия белков-регуляторов апоптоза в структурах тимуса находится в прямой зависимости от степени сохранности компонентов тимопоэтического и нетимопоэтического микроокружения долек.

Интенсивность тимопоэза, оцениваемая по совокупности показателей (соотношение зрелых и незрелых тимоцитов, экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза, количественные и качественные изменения в популяции клеток тимопоэтического микроокружения), ниже в моделях с вторичной иммунной недостаточностью после спленэктомии.

Сравнительный многофакторный анализ инволютивных 10.

изменений различных структур тимуса через пять месяцев после воздействия в указанных экспериментальных моделях показал, что введение канцерогена после спленэктомии сопровождается наиболее выраженной атрофией железы с дезорганизацией эпителиальных клеток, структур нетимопоэтического окружения мозгового вещества и угнетением тимопоэза. Спленэктомия характеризуется выраженными инволютивными изменениями тимуса с частичным сохранением структур TES и PVS коркового и мозгового вещества, но снижением тимопоэза. Возрастные изменения и изолированное введение канцерогена через 5 месяцев сопровождаются инволютивными изменениями тимуса с сохранением тимопоэза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1.Данные о том, что спленэктомия сопровождается компенсаторным повышением активности тимуса в раннем послеоперационном периоде (1 месяц), которое сменяется глубокой инволюцией органа и существенным угнетением тимопоэза в более поздние сроки, следует учитывать при ведении больных и планировании схемы заместительной иммунотерапии на разных сроках после операции.

2. Изменение молекулярного фенотипа антигенпрезентирующих клеток тимуса на стадии предопухолевых изменений следует расценивать как способность иммунной системы реагировать на опухолевый рост уже на начальных этапах канцерогенеза, что может быть полезным для разработки перспективных схем иммунопрофилактики и ранней противоопухолевой иммунотерапии.

3. Курсовое применение иммуномодулятора полиоксидоний оказывает выраженный стимулирующий эффект на функциональную активность тимуса и может быть рекомендовано для коррекции недостаточности клеточного иммунитета.

4. При решении вопроса о применении полиоксидония как иммуномодулирующего препарата в клинике, несомненно, следует учитывать данные, что его иммуностимулирующий эффект на тимус имеет кратковременный характер, который сохраняется через месяц после курсового введения и нивелируется в более поздние сроки.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГКС- глюкокортикостероиды МКП – маркер клеточной пролиферации DAB – diaminobenzidin (диаминобензидин) CD – cluster of differentiation (кластер дифференцировки) PVS – perivascular spaces (периваскулярные пространства) SMA – smooth muscle actin (актин гладких мышц) TEC – thymic epithelial cells (тимические эпителиальные клетки) TES – thymic epithelial spaces (тимические эпителиальные пространства) СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шумилова Е.Б. Биогенные амины как регуляторы апоптоза лимфоцитов в тимусе / Е.Б. Шумилова, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Морфология: Материалы конф. «Колосовские чтения – 2006» – 2006, № 2. – С. 105.

2. Меркулова Л.М. Исследование ангиогенеза и регенерации аутотрансплантата селезенки в раннем послеоперационном периоде / Л.М.

Меркулова, Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко [и др.] // Мат. Всероссийской конф. с межд. участием «Морфология в теории и практике», посв. к 85-летию со дня рождения Д.С. Гордон. – Чебоксары, 2008. – С. 101–103.

3. Стручко Г.Ю. Онкоиммуноморфология – следующий этап изучения патогенеза злокачественного роста / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Мат. Всероссийской конф. с межд. участием «Морфология в теории и практике», посв. к 85-летию со дня рождения Д.С. Гордон. – Чебоксары, 2008. – С. 118–120.

4. Москвичев Е.В. Изменения показателей крови после аутолиенотрансплантации и введения мексидола / Е.В. Москвичев, Е.Б.

Шумилова, Л.М. Меркулова // Морфология, 2008. - Т. 133., № 2. – С. 91.

5. Стручко Г.Ю. Участие дендритных клеток в иммунологии злокачественного роста / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Мат. II съезда физиологов СНГ. – Кишинев, 2008. – С. 156.

6. Москвичев Е.В. Изучение апоптоза и клеточной пролиферации злокачественных опухолей у спленэктомированных крыс / Е.В. Москвичев, Г.Ю.

Стручко, Л.М. Меркулова // Вопросы клинической и экспериментальной медицины: Мат. научно-практ. конф., посв. 90-летию со дня рождения проф.

Амосовой В.В. – Чебоксары, Изд-во Чуваш. ун-та, 2009. – С. 220-224.

7. Меркулова Л.М. Морфогенез рака толстой кишки в условиях вторичного иммунодефицита / Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, Г.Ю.

Стручко // Морфология. – 2009, №4. – С.98.

8. Москвичев Е.В. Морфология рака толстой кишки после применения 1,2 диметилгидразин дигидрохлорида / Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко, Л.М.

Меркулова [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. – 2009, Т. XVI, № Сборник материалов 8-й Всероссийской университетской научно 2. практической конф. молодых ученых по медицине. – Тула, 2009. – С. 121-122.

9. Стручко Г.Ю. Морфофункциональное исследование тимуса через 1- месяца после окончания курса введения канцерогена. / Г.Ю. Стручко, Л.М.

Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. – 2009, Т. XVI, № 2. - Сборник материалов 8-й Всероссийской университетской научно-практической конф. молодых ученых по медицине. – Тула, 2009. – С. 163 164.

Меркулова Л.М. Влияние канцерогенеза на 10.

морфофункциональное состояние тимуса / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В.

Москвичев [и др.] // Вопросы клинической и экспериментальной медицины: Мат.

научно-практ. конф., посв. 90-летию со дня рождения проф. Амосовой В.В. – Чебоксары, Изд-во Чуваш. ун-та, 2009. – С. 215-219.

Стручко Г.Ю. Оценка биологической активности опухолей жкт у 11.

крыс с иммунной недостаточностью / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии: мат. международ. науч. конф., посв. 65-летию ивановской школы лимфологов. – Иваново, 2009. – С. 171-175.

Меркулова Л.М. Развитие акцидентальной инволюции тимуса на 12.

фоне использования канцерогена / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В.

Москвичев [и др.] // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии: мат. международ. науч. конф., посв. 65-летию ивановской школы лимфологов. – Иваново, 2009. – С. 161-166.

Стручко Г.Ю. Морфофункциональное состояние тимуса в 13.

условиях развития опухоли толстой кишки / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Здравоохранение Чувашии, 2009. - № 3. – С. 47-51.

Стручко Г.Ю. Инволюция тимуса как последствие 14.

экспериментального канцерогенеза / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. 2010, вып. 10. С. 84-87.

Меркулова Л.М. Люминесцентно-гистохимическое исследование 15.

биоаминсодержащих структур тимуса при введении канцерогена на фоне вторичного иммунодефицита / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев [и др.] // Клиническая и экспериментальная медицина: сб. науч. тр. к 15-летию Диагностического центра ГУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ и СР ЧР. - Чебоксары, 2010. – С. 130-132.

Москвичев Е.В. Влияние приобретенного иммунодефицита 16.

на апоптоз и клеточную пролиферацию в злокачественных опухолях / Е.В.

Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко // Вестник СПбГУ, 2010-Сер. 11, вып. 4 – С.124-129.

Стручко Г.Ю. Изучение биологической активности опухолей 17.

ЖКТ на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, Л.М.

Меркулова [и др.] // Новые технологии в диагностике и лечении злокачественных новообразований: Мат. Межрегиональной конф., посв. 65-летию Республиканского клинич. онкологич. диспансера. – Чебоксары, 2011. – С. 180 184.

Москвичев Е.В. Морфология и иммуногистохимическая 18.

характеристика метастазов опухоли толстой кишки на фоне вторичного иммунодефицита / Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова, Е.Г. Драндрова // Бюллетень Северного государственного медицинского университета, 2011-№1, (XXVI) С.202-203.

Стручко Г.Ю. Морфологические особенности опухоли толстой 19.

кишки при вторичном иммунодефиците / Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, О.Ю.

Кострова [и др.] // Мат. XVI Всероссийской науч-практ. конф. «Молодые ученые в медицине» (Казань, 22-23 апреля 2011 г.). – Казань, 2011. – С.134.

Меркулова Л.М. Морфофункциональное исследование 20.

тимуса при введении 1,2-диметилгидразина на фоне вторичного иммунодефицита / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев [и др.] // Аллергология и иммунология: Мат. XVI Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Париж, Франция, апреля-3 мая 2011г. Т. 12, № 1. – С. 47.

Стручко Г.Ю. Акцидентальная инволюция тимуса на фоне 21.

развития злокачественной опухоли, осложненной иммунодефицитом / Г.Ю.

Стручко, Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова [и др.] // Мат. II Всероссийской науч. практ. конф. с междунар. участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии», Курск, 17-19 мая 2011. – С. 256-257.

Стручко Г.Ю. Исследование особенностей развития 22.

злокачественной опухоли при различном иммуноэндокринном статусе / Г.Ю.

Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Мат. научно-практ. конф.

«Вопросы клинической медицины». – Вып. 1. - Чебоксары, 2011. – С. 174-177.

Мухаммад Захид Морфофункциональное состояние тимуса 23.

при введении иммуномодулятора «Полиоксидоний» / Захид Мухаммад, Г.Ю Стручко, Е.В. Москвичев [и др.] // Вестник ЧГПУ им. И.Я. Яковлева. – Чебоксары, 2011. №4 (72). Ч.1. – С. 88-93.

Стручко Г.Ю. Морфологические особенности тимуса у 24.

потомства крыс с иммунодефицитной беременностью / Г.Ю. Стручко, Л.М.

Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Мат. научно-практ. конф. «Вопросы клинической медицины». – Вып. 1. - Чебоксары, 2011. – С. 177-179.

Михайлова М.Н. Участие дендритных и нейроэндокринных 25.

клеток тимуса в развитии его инволюции при формировании экспериментальной опухоли толстой кишки / М.Н. Михайлова, Г.Ю.

Стручко, Е.В. Москвичев [и др.] // Вестник Чувашского университета. Чебоксары, 2011. - № 3. - С. 377-383.

Стручко Г.Ю. Морфологическая и иммуногистохимическая 26.

характеристика опухолей желудочно-кишечного тракта на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Вестник Чувашского университета. - Чебоксары, 2011. - № 3.- С. 450-456.

Стручко Г.Ю Иммунологическое и гематологическое 27.

исследование крови животных через 1-4 месяца после окончания курса введения канцерогена / Г.Ю. Стручко Г.Ю, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Научные труды III съезда физиологов СНГ (Ялта, Украина, 1-6 октября 2011). – С.172.

Стручко Г.Ю. Иммуногистохимическое исследование тимуса на 28.

фоне злокачественного роста / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. 2011, вып. 11. С. 25 29.

Стручко Г.Ю. Морфофункциональное состояние тимуса у 29.

потомства крыс с иммунодефицитом / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Мат. IV Всерос. научно-практ. конф. «Цитоморфология в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 19- мая 2011г. – С. 91-93.

Стручко Г.Ю. Морфологические и иммуногистохимические 30.

особенности опухоли толстой кишки при вторичном иммунодефиците / Г.Ю.

Стручко, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова [и др.] // Мат. IV Всерос. научно-практ.

конф. «Цитоморфология в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 19-20 мая 2011г. – С. 93-94.

Москвичев Е.В. Морфологическое подтверждение 31.

акцидентальной инволюции тимуса после удаления селезенки / Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова [и др.] // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке», 2011, №1-Т.13-С. 11-13.

Стручко Г.Ю. Морфологические изменения тимуса после 32.

применения полиоксидония / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В.

Москвичев [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2012. - № 5 (часть 1).

- С. 197-202.

Меркулова Л.М. Иммуногистохимическая характеристика 33.

опухолевого неоангиогенеза при вторичной иммунной недостаточности / Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко // Мат. IV Всероссийской научной конференции с международным участием. «Микроциркуляция в клинической практике», Ангиология и сосудистая хирургия, 2012-Том. 18 С.35-36.

Москвичев Е.В. Иммуногистохимическая характеристика 34.

акцидентальной инволюции тимуса после спленэктомии / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко [и др.] // Вестник Национального медико хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. 2012.- Т. 7.- № 2. -С. 40-43.

Москвичев Е.В. Морфология и иммуногистохимический 35.

фенотип тимуса при вторичной иммунной недостаточности после спленэктомии / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко // Современные проблемы науки и образования, 2012-№3. - URL:

http://www.science-education.ru/103- Меркулова Л.М. Иммунологическое исследование крови 36.

крыс через 1-5 месяцев после окончания введения канцерогена / Л.М.

Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев [и др.] // Мат. XI Конгресса международной ассоциации морфологов. Морфология, 2012. -№3. -С. 102.

Стручко Г.Ю. Морфологическое и иммуногистохимическое 37.

исследование тимуса в норме и после применения полиоксидония (обзор литературы) / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев [и др.] // Вестник Чувашского университета. 2012. -№ 3- С. 525-531.

Москвичев Е.В. Исследование морфологи тимуса через 5 месяцев 38.

после окончания курса введения канцерогена на фоне вторичного иммунодефицита / Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова [и др.] // Журнал злокачественные опухоли, 2012-Том. 2- №2-С 35-36.

Москвичев Е.В. Иммуногистохимическая характеристика 39.

некоторых показателей тимопоэза при экспериментальной опухоли толстой кишки / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко // Фундаментальные исследования, 2012-№8 часть 2. - С.367-371.

Москвичев Е.В. Иммуногистохимическая характеристика 40.

апоптоза и клеточной пролиферации в тимусе при экспериментальной опухоли толстой кишки / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко / Иммунология, 2012-№6-Том 33-С. 303-305.

Москвичев Е.В. Сравнительная характеристика атрофии 41.

тимуса при экспериментальном канцерогенезе и возрастной инволюции (Морфологическое и иммуногистохимическое исследование) // Современные проблемы науки и образования, 2013 - №1 - URL: http://www.science education.ru/107- Москвичев Е.В. Иммуногистохимическая характеристика 42.

тимуса при экспериментальном канцерогенезе на фоне спленэктомии // Фундаментальные исследования, 2013 - №3 часть 2. - С. 346-351.

Москвичев Е.В. Иммуногистохимический анализ некоторых 43.

показателей тимопоэза при канцерогенезе в условиях вторичной иммунной недостаточности // Фундаментальные исследования, 2013- №5, часть 1. С.101-105.

Кострова О.Ю. Тучные клетки тимуса на фоне развития 44.

аденокарциномы толстой кишки / О.Ю. Кострова, Г.Ю. Стручко, Е.В.

Москвичев // Современные проблемы науки и образования, 2013- №2- URL:

http://www.science-education.ru/108- Стручко Г.Ю. Иммуногистохимическая характеристика опухоли 45.

толстой кишки на фоне экспериментального иммунодефицита / Г.Ю. Стручко, Л.М.Меркулова, Е.В.Москвичев др.]// Международный научно [и исследовательский журнал = Research journal of international studies, 2013-№3-4 С.75-77.

Москвичев Е.В. Влияние курсового введения 46.

иммуномодулятора полиоксидоний на течение возрастной инволюции тимуса /Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко [и др.]// Современные проблемы науки и образования, 2013-№3-URL:

http://www.science-education.ru/109- Москвичев Е.В. Морфофункциональная характеристика 47.

центрального органа иммунной системы - вилочковой железы при иммуномодуляции: текст лекции / Е.В.Москвичев, Г.Ю.Стручко, И.Е.Иванова // Чебоксары: АУ Чувашии «ИУВ», 2013- 20с.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.