авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Исследование механизмов модуляции действия пептидов нейрогипофиза в почке

На правах рукописи

МАРИНА

Анна Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ МОДУЛЯЦИИ ДЕЙСТВИЯ

ПЕПТИДОВ НЕЙРОГИПОФИЗА В ПОЧКЕ

03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2012

2

Работа выполнена в Лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный руководитель академик РАН Наточин Юрий Викторович

Официальные оппоненты:

Орлов Ратмир Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, ИЭФБ РАН, гл.н.с. лаборатории сравнительной физиологии дыхания Смирнов Алексей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова Минздравсоцразвития России, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней с курсом ухода за больными, директор НИИ Нефрологии

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится «10» апреля 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук по адресу: Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44).

Автореферат разослан «28» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Регуляция функций относится к числу центральных проблем физиологии. Влияние на функцию включает триггерное действие (стимуляция или сигнал о прекращении деятельности) и модулирующее влияние (изменение величины ответа на пусковой фактор).

Модуляция обеспечивает адекватное участие функции в реализации потребностей организма, его оптимальную реакцию на внешний стимул. Одна из задач, решаемых физиологическими системами организма человека и многоклеточных животных, состоит в стабилизации физико-химических параметров жидкостей внутренней среды, сохранении в межклеточной жидкости на постоянном и оптимальном уровне концентрации ионов, жизненно необходимых органических веществ, рН и осмоляльности (Баркрофт, 1937;

Орбели, 1939;

Smith, 1953;

Гинецинский, 1963;

Наточин, 2002). Важнейшее значение постоянства осмоляльности плазмы крови в том, что оно способствует поддержанию на неизменном уровне объема каждой клетки организма.

Согласно общепринятой схеме осмотический гомеостаз зависит от эффективности осморегулирующего рефлекса, от концентрации в крови вазопрессина, что определяется осмоляльностью крови и ее объемом (Robertson, 2001). Вазопрессин повышает осмотическую проницаемость плазматических мембран клеток канальцев почек, благодаря чему усиливается всасывание воды в кровь и уменьшается ее потеря из организма (Kovcs, Lichardus, 1989;

Иванова, 2011). Однако в некоторых физиологических ситуациях не наблюдается прямой взаимосвязи между концентрацией вазопрессина в плазме крови и реабсорбцией осмотически свободной воды в почке. Это может быть обусловлено наличием факторов, модулирующих действие вазопрессина. Выяснение физиологических механизмов, способных изменять реакцию почек в организме на вазопрессин, представляет интерес для физиологии и клинической медицины, поскольку вариабельность ответа на вазопрессин зависит от влияния на почку физиологически активных веществ и фармакологических средств.

Цель исследования. Выявление факторов, способных модулировать антидиуретическое действие вазопрессина в почке.

Задачи исследования 1. Исследование триггерных эффектов в почке новых синтезированных аналогов нонапептидов семейства вазопрессина.

2. Изучение влияния миметика инкретинов эксенатида на осморегулирующую функцию почки.

3. Исследование роли подтипов рецепторов вазопрессина и глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП 1) в модуляции антидиуретического эффекта вазопрессина.

4. Исследование роли простагландина Е2 (ПГЕ2), циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в реализации модулирующего влияния эксенатида на антидиуретический эффект вазопрессина.

5. Исследование роли рациона в модуляции эффекта пептидных гормонов в почке.

Научная новизна.

Впервые выявлена высокая селективность новых синтезированных нонапептидов семейства вазопрессина в отношении выведения почкой ионов натрия, калия и реабсорбции осмотически свободной воды.

Впервые показана роль миметика инкретинов эксенатида в модуляции антидиуретического действия вазопрессина;

эффект эксенатида опосредован взаимодействием с рецептором ГПП 1. Установлено участие ПГЕ2 в реализации модулирующего влияния эксенатида на антидиуретический эффект вазопрессина.

Впервые выявлено влияние новых синтезированных аналогов эксенатида на осморегулирующую функцию почек и нормализацию уровня гликемии.

Впервые установлена модулирующая роль стандартных рационов в эффекте вазопрессина и эксенатида.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные результаты указывают на необходимость учета модулирующих влияний рациона и инкретинов в реализации антидиуретического действия вазопрессина.

Новые изученные аналоги эксенатида обладают гипогликемическим эффектом, усиливают мочеотделение и экскрецию осмотически свободной воды;

они могут стать основой создания препаратов для лечения сахарного диабета, получен патент на их структуру и свойства (№ 2422461, 2011).

Результаты диссертации используются в курсе лекций по нормальной физиологии для студентов медицинского факультета СПбГУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Миметик инкретинов эксенатид вызывает образование осмотически свободной воды в почке у крыс при обычном водно-питьевом режиме и снижает антидиуретическое действие эндогенного вазопрессина. В условиях гипергидратации эксенатид резко ускоряет экскрецию почкой осмотически свободной воды и способствует быстрому восстановлению нарушенного водного равновесия за счет избирательного усиления выведения избытка воды из организма.

2. Модулирующее влияние эксенатида в отношении антидиуретического эффекта вазопрессина устраняется антагонистом рецепторов ГПП 1, оно опосредовано вовлечением ПГЕ2. Введение диклофенака, неселективного блокатора циклооксигеназы, ослабляет гидруретический эффект миметика инкретинов.

3. Длительное потребление стандартных рационов с разным содержанием воды, ионов натрия и калия модулирует действие пептидных гормонов, регулирующих баланс воды и натрия.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на VII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2010», посвященной 85-летию А.Л. Поленова (Санкт-Петербург, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), XIV Международном Совещании по эволюционной физиологии памяти академика Л.А. Орбели (Санкт-Петербург, 2011), III Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» памяти П.Г. Костюка (Ялта, Украина, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе статей в отечественных реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 45 отечественных и 248 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 61 рисунком.

Материалы и методы исследования Эксперименты проведены на самках крыс линии Вистар (Rattus norvegicus var. albino) в возрасте 4-6 месяцев массой тела 150-240 г. Опыты выполнены в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Функцию почки крыс исследовали при стандартном водном режиме, на фоне водной нагрузки (ВН, введение с помощью резинового зонда в желудок воды в объеме 5 мл на 100 г массы тела) и после суточной водной депривации. Основная часть опытов выполнена на крысах, получавших стандартный пищевой рацион II - натуральный корм для животных, приготовленный согласно приложению №1 к приказу Минздрава СССР № 163 от 1963 г. Часть экспериментов проведена на крысах, получавших стандартный пищевой рацион I - сухой гранулированный корм, рецепт ПК- для содержания лабораторных животных, изготовлен ООО «Лабораторкорм», г.

Москва. Для изучения солевого состава корма применяли метод озоления.

Сбор мочи проводили у ненаркотизированных крыс в специальных клетках-пеналах при произвольных мочеиспусканиях в течение 2-6 часов. Забор крови проводили у крыс под нембуталовым (0.6 мл смеси 0.75% раствора нембутала и 0.37% раствора хлоралозы внутрибрюшинно) или эфирным наркозом из общей сонной артерии или сосудов хвоста.

В пробах мочи и сыворотки крови осмоляльность определяли на микро осмометре Micro-Osmometer Advanced Instruments Model 3300 (США), концентрацию Na+, K+ - на пламенном фотометре Corning- (Великобритания), концентрацию Mg2+ – на атомном абсорбционном спектрофотометре Hitachi-508 (Япония), креатинина – на автоматическом биохимическом анализаторе EOS Bravo W (Италия) с использованием реактивов, стандартных и контрольных сывороток фирмы Randox (Великобритания). Концентрацию глюкозы определяли в капиллярной крови, взятой из хвоста, с помощью тест-полосок на глюкометре Accu-Сhek Go, Roche (Швейцария). Для измерения концентрации ПГЕ2, цAMФ, цГMФ в моче использовали наборы для иммуноферментного анализа RD Systems (США).

Измерение оптической плотности и расчет концентрации ПГЕ2, цAMФ, цГMФ проводили на автоматическом ридере ELx800 BIO-TEK Instruments (США) по методике соответствующих тест-систем в 96-луночных планшетах.

В работе использованы: аргинин-вазопрессин (AVP), аргинин-вазотоцин (AVT) (Sigma-Aldrich, США), пептидные антагонисты вазопрессиновых рецепторов (Bachem, Швейцария), диклофенак (Hemofarm, Сербия);

эксенатид, 14-норлейцин-39-серинол-эксенатид, 14-норлейцин-35-D-аланин-39-серинол эксенатид, оксинтомодулин, обестатин, пептидный антагонист рецепторов ГПП 1, новые синтезированные аналоги AVP и AVT: 1-дезамино-9-этиламид вазотоцин (1d-Ethylamide9-AVT), 1-дезамино-9-глицинол-вазотоцин (1d Glycinol9-AVT), 1-дезамино-9-дезамидо-вазотоцин (1d-deamido9-AVT), 1 (1d-Leu8-VP), дезамино-8-лейцин-вазопрессин 1-дезамино-8-глутамил вазопрессин (1d-Glu -VP), 1-дезамино-8-глутамил-вазотоцин (1d-Glu8-VT), 1 дезамино-7-пролин-конопрессин Т (1d-Pro7-CP T), 7-пролин-конопрессин Т (Pro7-CP T), 1-дезамино-конопрессин Т (1d-CP T), конопрессин Т (CP T), 1 дезамино-конопрессин S (1d-CP S), 1-дезамино-2-тирозин-конопрессин S (1d Tyr2-CP S) (синтез осуществлен сотрудниками кафедры химии природных соединений химического факультета СПбГУ под руководством проф. М.И.

Титова).

Данные статистически обработаны и представлены в виде M±m. Для сравнения и оценки межгрупповых различий использовали тест ANOVA и непарный t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p0.05. Применяли корреляционный анализ.

Результаты исследования и обсуждение Влияние аналогов нонапептидов семейства вазопрессина на выведение одновалентных катионов и реабсорбцию осмотически свободной воды в почке крыс Вазопрессин оказывает антидиуретическое действие, увеличивая реабсорбцию воды в собирательных трубках почки (Kovcs, Lichardus, 1989), вазотоцин наряду с выраженным антидиуретическим действием вызывает интенсивный натрийурез, калийурез у крыс (Гао Цзе, Наточин, 2004).

Представляло интерес исследование новых синтетических аналогов нонапептидов семейства вазопрессина в попытке выяснить, возможно ли, получить препараты с избирательным влиянием на выведение отдельных ионов и реабсорбцию осмотически свободной воды в почке у крыс. Исследованы группы аналогов нонапептидов семейства вазопрессина млекопитающих, низших позвоночных и моллюсков: 1) аналоги вазотоцина с заменой концевого глицинамида (1d-Ethylamide9-AVT, 1d-Glycinol9-AVT и 1d-deamido9-AVT);

2) аналоги вазотоцина и вазопрессина с заменой аминокислотного остатка в 8-ом положении молекулы нонапептида (1d-Leu8-VP, 1d-Glu8-VP, 1d-Glu8-VT);

3) аналоги нонапептидов семейства вазопрессина яда моллюсков рода Conus (CP T, 1d-CP T, Pro7-CP T, 1d-Pro7-CP T, 1d-CP S, 1d-Tyr2-CP S).

Для изучения антидиуретического действия нонапептидов их инъецировали крысам внутримышечно в дозе 0.001 нмоль пептида на 100 г массы тела на фоне перорального введения 5 мл воды на 100 г массы тела для подавления секреции вазопрессина. Аналоги вазотоцина с заменой концевого глицинамида на этиламид или глицинол снижали экскрецию осмотически свободной воды (рис. 1А), а нонапептиды 1d-Leu8-VP, 1d-Glu8-VP, 1d-Glu8-VT, CP T и 1d-CP T не влияли на реабсорбцию осмотически свободной воды в почке крыс. Замена в 7-ом положении молекулы 1d-CP T лейцина на пролин привела к появлению у нонапептида антидиуретической активности - 1d-Pro7 CP T препятствовал развитию водного диуреза на протяжении 50 мин и снижал экскрецию осмотически свободной воды в 1.4 раза по сравнению с уровнем контроля (рис. 1Б). Инъекция 1d-CP S также приводила к уменьшению выведения осмотически свободной воды. Замена во 2-ом положении изолейцина на тирозин в молекуле 1d-CP S усиливала антидиуретическую активность пептида (рис. 1Б).

Рис. 1. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции аналогов вазотоцина с заменой концевого глицинамида (А) и аналогов конопрессинов Т и S (Б) на фоне ВН. По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела). Стрелка – момент введения воды и нонапептидов А: 1 ВН, 2 - ВН+1d-Ethylamide9-AVT, 3 - ВН+1d-Glycinol9-AVT, 4 - ВН+1d-deamido9-AVT;

Б: 1 ВН, 2 - ВН+CP T, 3 - ВН+1d-CP T, 4 - ВН+Pro7-CP T, 5 - ВН+1d-Pro7-CP T, 6 - ВН+1d-CP S, - ВН+1d-Tyr2-CP S.

Исследование влияния нонапептидов на выведение почкой ионов проводили по ранее разработанной схеме (Наточин и др., 2007) - аналоги инъецировали внутримышечно в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела. Из изученных аналогов только 1d-Glu8-VT селективно увеличивал выведение Na+ (47±7 мкмоль/2ч/100 г массы тела, в контроле - 15±7 мкмоль/2ч/100 г массы тела, p0.05), а 1d-Tyr2-CP S обладал селективной калиуретической активностью (экскреция К+ за 2ч эксперимента - 57±9 мкмоль/100 г массы тела, в контроле - 28±6 мкмоль/100 г массы тела, p0.05).

Таким образом, показана возможность селективного влияния аналогов нонапептидов семейства вазопрессина млекопитающих, низших позвоночных и моллюсков в отношении экскреции отдельных ионов и реабсорбции осмотически свободной воды в почке. Полученные результаты существенны для характеристики химической структуры аналогов нейрогормонов, определяющей взаимодействие с различными типами V-рецепторов.

Влияние инкретинов на осморегулирующую функцию почек крыс Задачей этого этапа работы послужил поиск ответа на вопрос, существуют ли в организме факторы, способные на системном уровне обеспечить быструю коррекцию параметров водно-солевого обмена и стабилизацию осмотического гомеостаза. Был выбран пептид, образующийся в кишке - ГПП 1, который относится к группе инкретинов и участвует в стабилизации концентрации глюкозы в крови (Degn et al., 2004). В наших экспериментах использован его синтетический миметик эксенатид в связи с достаточно коротким периодом полужизни самого ГПП 1 (Neumiller, 2009). Для проверки предположения об участии инкретинов в регуляции водного баланса эксенатид инъецировали крысам в разных условиях водного режима (стандартный водный режим, ВН, водная депривация).

Влияние эксенатида на осморегулирующую функцию почек у крыс при стандартном водном режиме Через 10-15 мин после инъекции 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела у крыс, находящихся на стандартном водном режиме, усиливался диурез и очищение от осмотически активных веществ (рис. 2). Наряду с этим повышалась экскреция осмотически свободной воды, увеличивалось очищение организма от нее (рис. 2), что свидетельствует о снижении осмотической проницаемости стенки собирательных трубок почки. Установлено, что увеличение клиренса осмотически активных веществ наблюдалось после инъекции широкого диапазона доз пептида, а наиболее выраженное образование осмотически свободной воды отмечалось после инъекции 0. нмоль эксенатида на 100 г массы тела (рис. 3).

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – диурез (V, мл/мин на 100 г массы тела), клиренс осмотически активных веществ (COsm, мл/мин на 100 г массы тела) и клиренс осмотически свободной воды (CH2O, мл/мин на 100 г массы тела). Стрелка – инъекция эксенатида.

Рис. 2. Динамика мочеотделения, клиренса осмотически активных веществ и осмотически свободной воды у крыс после инъекции 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела.

По оси абсцисс – доза пептида (нмоль на 100 г массы тела), по оси ординат – клиренс осмотически активных веществ (COsm30мин, мл на 100 г массы тела) и клиренс осмотически свободной воды (CH2O30мин, мл на 100 г массы тела) за первые 30 мин эксперимента.

Рис. 3. Зависимость клиренса осмотически активных веществ и осмотически свободной воды от дозы инъецируемого эксенатида.

Возрастание выведения растворенных в моче веществ при действии эксенатида могло быть следствием повышения скорости гломерулярной фильтрации или торможения реабсорбции профильтровавшихся веществ в канальцах. Расчет экскретируемой фракции осмотически активных веществ показал, что усиление экскреции профильтровавшихся веществ почкой зависело от торможения их реабсорбции в канальцах. Экскретируемая фракция осмотически активных веществ возросла от 1.8±0.2% в контроле до 5.0±0.2% (р0.001) при действии эксенатида на протяжении 2 ч опыта. Осмотически свободная вода образуется в просвете канальца в результате реабсорбции ионов в дистальном сегменте нефрона на фоне снижения проницаемости стенки собирательных трубок для воды. Как видно на рис. 2, объектом воздействия эксенатида являются одновременно всасывание веществ клетками из канальца и проницаемость для воды. Значение каждого из этих параметров обуславливает зависимость скорости образования осмотически свободной воды от дозы эксенатида, что и определяет итоговое состояние почки. Таким образом, введение эксенатида самкам крыс линии Вистар при обычном водно питьевом режиме вызывает образование осмотически свободной воды и выделение ее почкой. Результаты этих опытов свидетельствуют о существовании регуляторного пептида, способного модулировать антидиуретический эффект вазопрессина, менять состояние осмотической проницаемости клеток канальцев собирательных трубок почки - от реабсорбции к экскреции воды.

Влияние эксенатида на осморегулирующую функцию почек крыс при гипергидратации и водной депривации Животным инъецировали эксенатид и одновременно вводили 5 мл воды в желудок на 100 г массы тела, вызывая гипергидратацию. У здоровых крыс после ВН максимум экскреции осмотически свободной воды наблюдался через 50-60 мин, в экспериментах с введением воды и инъекцией эксенатида пик клиренса осмотически свободной воды отмечался раньше - через 35-40 мин (рис. 4). Данные осмоляльности сыворотки крови у крыс после инъекции эксенатида на фоне ВН свидетельствуют о более быстрой стабилизации параметров жидкостей внутренней среды (рис. 5). В то же время в состоянии водной депривации, которое сопровождается высоким уровнем секреции антидиуретического гормона (Morton et al., 1975;

Holmes et al., 2001), гидруретического эффекта эксенатида не наблюдалось (рис. 6).

Рис. 4. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции эксенатида на фоне ВН.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела). Стрелка – внутримышечная инъекция 0.015 нмоль эксенатида на г массы тела одновременно с ВН.

Рис. 5. Осмоляльность сыворотки крови крыс после инъекции эксенатида на фоне ВН.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат - осмоляльность сыворотки крови (мОсм/кг Н2О). Стрелка – внутримышечная инъекция 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела одновременно с ВН. * - p0.05 c ВН.

Рис. 6. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции эксенатида на фоне водной депривации.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела). Стрелка – внутримышечная инъекция 0.015 нмоль эксенатида на г массы тела. ВД – водная депривация.

Таким образом, при гипергидратации эксенатид способствует более быстрому удалению избытка воды из организма, на фоне водной депривации этот пептид не увеличивает экскрецию осмотически свободной воды в почке.

Взаимовлияние эксенатида и AVP на осморегулирующую функцию почек Для анализа механизма модуляции антидиуретического эффекта вазопрессина крысам одновременно инъецировали 0.001 нмоль AVP и 0. нмоль эксенатида на 100 г массы тела. Подавление секреции антидиуретического гормона осуществляли введением 5 мл воды на 100 г массы тела. Антидиуретическое действие инъецированного AVP длилось около 60 мин, после чего начиналось выведение избытка воды. При одновременной инъекции обоих пептидов рост мочеотделения и экскреции осмотически свободной воды также отмечался с конца 1-го часа эксперимента, достигая максимума к 90 мин (рис. 7). Сначала наблюдалась антидиуретическая реакция за счет действия AVP, далее начиналось выведение избытка воды, рост мочеотделения и экскреции осмотически свободной воды. При этом выведение осмотически свободной воды происходило быстрее по сравнению с группой крыс, которым не вводили эксенатид, что свидетельствует о реализации гидруретического эффекта миметика инкретинов.

Рис. 7. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после сочетанного введения эксенатида и AVP на фоне ВН.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела). Стрелка – внутримышечная инъекция 0.001 нмоль AVP на 100 г массы тела, 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела одновременно с ВН.

Полученные результаты указывают на то, что модулирующее влияние миметика ГПП 1 может зависеть от уровня вазопрессина. В экспериментах на крысах in vivo показано, что ГПП 1 при внутривенном введении значительно снижает уровень циркулирующего в кровотоке вазопрессина (Zueco et al., 1999). Рецепторы ГПП 1 обнаружены на нейронах паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса (Zueco et al., 1999), в адено- (Kanse et al., 1988) и нейрогипофизе (Goke et al., 1995) у крыс. Данный факт свидетельствует о возможности участия ГПП 1 в секреции гормонов задней доли гипофиза.

Кроме того, концентрация в крови вазопрессина зависит от скорости его разрушения инсулин-регулируемой аминопептидазой, инсулин повышает деградацию вазопрессина примерно на 30% (Wallis et al., 2007). Согласно данным литературы, эксенатид и ГПП 1 стимулируют секрецию инсулина при гипергликемии (Degn et al., 2004). В наших опытах секреции дополнительных количеств инсулина не должно было происходить, так как глюкоза не вводилась, а ее концентрация в крови сохранялась на стандартном уровне (в контроле – 4.6±0.4 ммоль/л, после введения эксенатида – 4.5±0.3 ммоль/л, p0.05). Таким образом, модулирующий эффект эксенатида может быть связан с влиянием на секрецию вазопрессина либо действием пептида на собирательные трубки почек.

Влияние антагонистов V1a- и V2-рецепторов на гидруретический эффект эксенатида Известно, что гормон, взаимодействуя с разными подтипами собственного рецептора, может реализовать как триггерный, так и модулирующий эффекты (Веселкин, Наточин, 2010). Существует иная возможность, когда стимуляция разных подтипов рецепторов осуществляется не самим гормоном, а модулирующим его действие фактором. Поэтому экспериментально была проанализирована возможность стимуляции V1a- и V2 рецепторов эксенатидом и реализации его модулирующего эффекта через эти подтипы рецепторов. В экспериментах были использованы селективные антагонисты V1a- и V2-рецепторов, дозы которых были подобраны в ранее проведенных опытах. Подавление секреции вазопрессина осуществляли введением воды в объеме 5 мл на 100 г массы тела. Предварительная инъекция селективного антагониста как V1a-, так и V2-рецепторов не устраняла гидруретического эффекта миметика инкретинов (рис. 8). Полученные результаты позволяют исключить реализацию модулирующего эффекта эксенатида через действие на данные подтипы рецепторов.

Рис. 8. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции эксенатида и V1a-антагониста (А) или V2- антагониста (Б) на фоне ВН.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела). Пунктирная стрелка – инъекция 0.1 нмоль V1a-антагониста на 100 г массы тела или 0.5 нмоль V2-антагониста на 100 г массы тела, сплошная стрелка инъекция 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела одновременно с ВН.

Экскреция цАМФ, цГМФ почкой на фоне гидруретического эффекта эксенатида Разные типы вторичных посредников, образующиеся под действием вазопрессина, играют различную роль в регуляции водного транспорта: цАМФ увеличивает водную проницаемость, инозитол 1,4,5-трифосфат и диацилглицерол модулируют его эффект (Наточин, 1992). Показано, что после добавления вазопрессина в клетках мочевого пузыря снижается концентрация цГМФ. Снижение внутриклеточной концентрации цГМФ, вызываемое вазопрессином, уменьшает его гидроосмотический эффект. (Шахматова, Наточин, 1988;

Наточин и др., 1989). Следовательно, образование того или иного посредника, стимулируемое модулирующим фактором, может изменять эффект гормона и, соответственно, реакцию клетки. Поэтому была проанализирована возможность изменения экскреции с мочой цАМФ и цГМФ в реализации модулирующего действия эксенатида. Полученные результаты показали, что инъекция эксенатида на фоне введения воды в желудок не приводила к достоверно значимым изменениям экскреции почкой цАМФ (2.3±0.2 при 2.1±0.2 нмоль/100 г массы тела в контроле за 30 мин эксперимента, р0.05) и цГМФ (0.30±0.03 при 0.40±0.04 нмоль/100 г массы тела в контроле за 30 мин эксперимента, р0.05). Этот факт позволяет предположить, что в модуляции антидиуретического эффекта вазопрессина эксенатидом эти вторичные мессенджеры не принимают участия.

Влияние антагониста рецептора ГПП 1 на гидруретический эффект эксенатида Рецептор ГПП 1 экспрессируется в клетках панкреатических островков (Thorens, 1992), желудке, кишечнике, центральной нервной системе, сердце, легких и почках (Drucker, 2006). Предварительное введение антагониста рецепторов ГПП 1 за 10 мин до ВН и инъекции эксенатида устраняло гидруретический эффект миметика инкретинов (рис. 9).

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела).

Пунктирная стрелка – инъекция 15 нмоль на 100 г массы тела антагониста рецепторов ГПП 1, сплошная стрелка - инъекция 0.015 нмоль на 100 г массы тела эксенатида одновременно с ВН.

Рис. 9. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции эксенатида и антагониста рецепторов ГПП 1 на фоне ВН.

Результаты этих экспериментов позволяют предполагать реализацию модулирующего влияния эксенатида через его собственный рецептор. В почке экспрессия рецептора ГПП 1 выявлена только в клетках проксимального канальца (Schlatter et al., 2007). Однако это не исключает возможности наличия другого подтипа рецептора ГПП 1 в собирательных трубках почки. Другой вариант реализации модулирующего эффекта эксенатида через взаимодействие с рецептором ГПП 1 подразумевает наличие промежуточного фактора Х, обладающего диуретическим эффектом. Введение антагониста рецепторов ГПП 1 будет блокировать выработку диуретического фактора Х и, таким образом, устранять модулирующее влияние миметика ГПП 1. Известно, что в регуляции осмотической проницаемости важную роль играет соотношение двух факторов:

антидиуретического гормона и аутакоидов. ПГЕ2 относится к числу наиболее существенных, локально действующих модуляторов вазопрессина (Наточин, Шахматова, 1995;

Parnova et al., 1997). Была проанализирована секреция ПГЕ2 в ответ на инъекцию 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела на фоне ВН в первые 30 мин эксперимента, когда наблюдается максимальный гидруретический эффект пептида. На фоне сочетанного введения воды в желудок и инъекции эксенатида отмечена положительная корреляция между экскрецией осмотически свободной воды и выведением ПГЕ2 (r=0.93, p0.001), экскреция почкой ПГЕ2 за первые 30 мин эксперимента выше по сравнению с группой после ВН (рис. 10).

По оси ординат – экскреция ПГЕ2 за 30 мин эксперимента (нг на 100 г массы тела). * p0.05 c группой контроля;

# p0.05 с ВН.

Рис. 10. Экскреция ПГЕ2 с мочой за первые 30 мин эксперимента после ВН и инъекции 0. нмоль эксенатида на 100 г массы тела.

Введение неселективного блокатора циклооксигеназы диклофенака в дозе 0.5 мг на 100 г массы тела за 45 мин до ВН и инъекции эксенатида приводила к ослаблению гидруретического эффекта миметика инкретинов, снижению экскреции осмотически свободной воды в первые 30 мин эксперимента (0.06±0.05 при 0.30±0.08 мл/100г массы тела без инъекции диклофенака, p0.05). Таким образом, в реализации модулирующего эффекта эксенатида можно предполагать участие локально образующегося ПГЕ2.

Влияние оксинтомодулина и обестатина на ионо- и осморегулирующую функции почек крыс при стандартном водном режиме и гипергидратации Для решения вопроса о специфичности действия миметика ГПП эксенатида во влиянии на водно-солевой обмен крысам инъецировали некоторые другие физиологически активные пептиды: оксинтомодулин и обестатин. Оксинтомодулин является продуктом того же гена, что и ГПП (Bataille et al., 1982). Обестатин относится к семейству грелина (Zhang et al., 2005). Крысам при стандартном водном режиме инъецировали пептиды в дозах от 0.15 нмоль до 5 нмоль на 100 г массы тела. Экскреция натрия почкой увеличивалась в ~ 2.9 раза в равной степени после инъекции 0.15-1.5 нмоль оксинтомодулина на 100 г массы тела. Инъекция 0.15-5 нмоль обестатина на 100 г массы тела не приводила к значимому изменению экскреции катионов и осмотически свободной воды в почке крыс. На фоне ВН оксинтомодулин и обестатин вводили в дозе, сопоставимой с дозой эксенатида. Инъекция обестатина не изменила кинетики выведения поступившего в организм избытка воды, экскреции осмотически свободной воды по сравнению с группой контроля. Мочеотделение и экскреция осмотически свободной воды после ВН и инъекции оксинтомодулина начинались через 60-90 мин и достигали максимального значения к 120 мин (рис. 11). Нарастание этих показателей происходило с низкой скоростью на протяжении 3 ч.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела).

Стрелка – ВН одновременно с внутрибрюшинной инъекцией пептидов.

Рис. 11. Динамика экскреции осмотически свободной воды у крыс после инъекции оксинтомодулина и обестатина в дозе 0.15 нмоль на 100 г массы тела на фоне ВН.

Таким образом, оксинтомодулин, являющийся продуктом того же гена, что и ГПП 1, обладал антидиуретическим действием, т. е. противоположным эффектом по сравнению с эксенатидом. Обестатин в наших экспериментах не изменял экскрецию ионов и осмотически свободной воды в почке крыс. Эти данные позволяют предположить, что гидруретический эффект миметика ГПП 1 эксенатида является специфичным.

Влияние аналогов эксенатида на осморегулирующую функцию почек и уровень гликемии в условиях нагрузки глюкозой Учитывая физиологическое и клиническое значение эксенатида в терапии сахарного диабета, представлял интерес синтез его новых аналогов и сопоставление их влияния с эффектом эксенатида на уровень гликемии и осморегулирующую функцию почек. Исследованы два аналога эксенатида с заменами аминокислотных остатков в 14-, 35- и 39-ом положениях молекулы пептида. После инъекции крысам эксенатида и его аналогов в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела возрастало мочеотделение, достигая максимума в течение первого получаса. Рост мочеотделения сопровождался увеличением экскреции осмотически свободной воды в почке в равной степени как после инъекции эксенатида, так и его аналогов (рис. 12). У крыс внутрибрюшинное введение 50% раствора глюкозы (0.3 мл на 100 г массы тела) вызывало гипергликемию (10.3±0.4 ммоль/л через 30 мин), к исходному значению уровень глюкозы возвращался к концу 1-го часа (5.4±0.2 ммоль/л). После инъекции 0.05 нмоль на 100 г массы тела эксенатида и 14-норлейцин-39-серинол-эксенатида нормализация концентрации глюкозы в крови происходила быстрее (гликемия на 30 мин – 6.6±0.7 и 6.5±0.3 ммоль/л, соответственно). 14-норлейцин-35-D аланин-39-серинол-эксенатид был менее эффективен в этой дозе, но при введении 0.12 нмоль на 100 г массы тела препятствовал повышению концентрации глюкозы в крови после ее внутрибрюшинного введения (гликемия на 30 мин – 5.4±0.4 ммоль/л).

Рис. 12. Динамика экскреции осмотически свободной воды после инъекции 0.05 нмоль на 100 г массы тела эксенатида и его аналогов.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция осмотически свободной воды (мл/мин на 100 г массы тела).

Стрелка – внутримышечная инъекция эксенатида или его аналогов.

Таким образом, новые синтезированные аналоги 14-норлейцин-39 серинол-эксенатид и 14-норлейцин-35-D-аланин-39-серинол-эксенатид сопоставимы с эксенатидом по гликемическому и гидруретическому эффектам и могут стать основой для создания препаратов для лечения сахарного диабета.

Роль рациона в модуляции эффекта пептидных гормонов в почке крыс Другим подходом в выяснении физиологических механизмов модуляции эффекта пептидных гормонов в почке явилось изучение реакции крыс после длительного применения разных стандартных пищевых рационов. Этот прием позволил получить ответ на вопрос, меняется ли реакция организма на острые нагрузочные пробы, модулируется ли действие пептидных гормонов в зависимости от длительного использования стандартных рационов с разными характеристиками по содержанию воды, Na+, K+. Исследование проводили в 2-х группах животных, получавших разные стандартные пищевые рационы. Рацион I по сравнению с рационом II содержал больше K+ (в 1.4 раза) и меньше воды (в 7.5 раза), а в рационе II — в 3.3 раза было выше содержание Na+. Потребление разных рационов не оказало влияния на осмоляльность сыворотки крови и концентрацию в ней Na+, K+, Mg2+. Следовательно, в параметрах системы регуляции водно-солевого обмена заложены целевые значения ряда гомеостатических показателей, которые удерживаются на стабильном уровне при изменении баланса воды и солей в организме. В поддержании постоянного уровня этих показателей участвуют почки, их состояние исследовано с помощью нагрузочной пробы.

Динамика диуреза у животных на разных рационах была сходной после введения в желудок 5 мл воды на 100 г массы тела. Рост мочеотделения в обеих группах определялся снижением осмотической проницаемости стенки канальцев для воды и повышением экскреции осмотически свободной воды.

Скорость клубочковой фильтрации на протяжении 2 ч эксперимента не изменялась как в группе, получавшей рацион I, так и в группе на рационе II.

Динамика выведения осмотически свободной воды в группах на разных пищевых рационах не отличалась, но пик экскреции осмотически свободной воды был достоверно выше в группе на рационе II (рис. 13). На фоне ВН клиренс осмотически активных веществ в обеих группах практически не менялся по сравнению с контролем (рис. 13). Вместе с тем, у животных, получавших рацион I, экскреция воды, связанной с осмотически активными веществами, на максимуме эффекта была достоверно выше (рис. 13).

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – клиренс осмотически свободной воды (СН2О, мл/мин на 100 г массы тела), клиренс осмотически активных веществ (COsm, мл/мин на 100 г массы тела). * p0.05 с группой, получавшей рацион II. Стрелка - ВН. СН2О – сплошная линия, COsm – пунктир.

Рис. 13. Влияние ВН на динамику клиренса осмотически свободной воды и осмотически активных веществ у крыс, получавших разные рационы.

Полученные результаты позволяют выявить еще один параметр системы регуляции, который при других формах эксперимента не был обнаружен.

Введение в желудок 5 мл воды на 100 г массы тела животного должно было полностью прекратить секрецию вазопрессина, что выразилось в сходстве динамики диуреза у животных на разных рационах. Этот триггерный эффект мог быть модулирован состоянием водно-солевого баланса животных, длительно потреблявших корм с разным содержанием воды и солей. Это нашло отражение в объеме экскретированной осмотически свободной воды. Ее выделение почкой было на 40.2% выше у крыс, получавших рацион с бльшим содержанием воды (рацион II). Эти данные указывают либо на модуляцию эффекта вазопрессина, либо на тончайшую настройку системы, реагирующей одновременно на осмоляльность крови, концентрацию в ней ионов натрия и на объем внеклеточной жидкости.

Физиологически значимым является анализ вопроса, остаются ли количественно и качественно теми же реакции эффекторных органов на секретируемые в кровь гормоны или вводимые извне физиологически активные вещества. Для ответа на вопрос о влиянии рациона на эффект вазопрессина была сопоставлена реакция на внутримышечную инъекцию его одинаковой дозы крысам, получавшим разные рационы. AVP инъецировали животным в дозе 0.001 нмоль на 100 г массы тела на фоне подавления секреции антидиуретического гормона введением в желудок 5 мл воды на 100 г массы тела. Кинетика эффекта инъецированного AVP не отличалась у животных, получавших разные рационы. Действие введенной дозы нонапептида длилось около 60 мин, после чего начиналось выведение избытка воды, нарастали мочеотделение и экскреция осмотически свободной воды. Влияние AVP на реабсорбцию осмотически свободной воды оказалось бльшим при потреблении рациона II (рис. 14). Клиренс осмотически активных веществ достоверно не отличался в двух группах животных (0.8±0.1 мл/ч/100 г массы тела у крыс на рационе I, 0.5±0.1 мл/ч/100 г массы тела – на рационе II, p0.05).

Рис. 14. Экскреция осмотически свободной воды после инъекции AVP крысам, получавшим разные рационы.

По оси ординат - экскреция осмотически свободной воды за 1 ч эксперимента (мл на 100 г массы тела). * - p0.05.

Сопоставление эффекта эксенатида у крыс, потреблявших корм с разным содержанием солей и воды, показало, что диурез после инъекции этого пептида возрастает в большей степени у крыс на рационе II (рис. 15А). У них рост диуреза в первые 15-30 мин эксперимента после инъекции эксенатида был обусловлен усилением экскреции осмотически свободной воды, а у крыс, получавших рацион I, напротив наблюдалась выраженная ее реабсорбция (рис.

15Б). Последующее увеличение мочеотделения у животных обеих групп было связано с возрастанием клиренса ионов натрия c 0.06±0.02 мл/ч в контрольной группе до 0.48±0.08 мл/ч (р0.05) у крыс, получавших рацион I, и с 0.10±0. мл/ч в контроле до 0.94 ± 0.08 мл/ч (р0.05) на 100 г массы тела у животных на рационе II. Натрийуретический и гидруретический эффекты эксенатида были слабее выражены при потреблении рациона I.

Рис. 15. Диурез (А) и экскреция осмотически свободной воды (Б) у крыс, получавших разные рационы, после инъекции эксенатида.

По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – диурез (V, мл/мин на 100 г массы тела), экскреция осмотически свободной воды (СН2О, мл/мин на 100г массы тела). Стрелка – внутримышечная инъекция 0.015 нмоль эксенатида на 100 г массы тела. * - p0.05 с группой, получавшей рацион I.

В проведенных экспериментах показано, что эффект AVP и эксенатида оказался зависимым от исходного, длительно сохраняющегося состояния водно-солевого режима, при том, что физико-химические параметры сыворотки крови не различаются. Эти данные свидетельствуют о модуляции эффекта гормонов, регулирующих баланс воды и натрия в зависимости от состояния организма после длительного потребления того или иного типа пищевого рациона.

ВЫВОДЫ 1. Выявлена высокая селективность влияния на транспорт Na+, K+ и реабсорбцию осмотически свободной воды в почке крыс новых синтезированных аналогов нонапептидов семейства вазопрессина.

Аналоги вазотоцина с заменой концевого глицинамида (1d-Ethylamide9 AVT, 1d-Glycinol9-AVT) и аналоги конопрессинов (1d-Pro7-CP T, Pro7-CP T, 1d-CP S) увеличивают реабсорбцию осмотически свободной воды, 1d Glu8-VT селективно усиливает экскрецию Na+, но не изменяет выделение K+. Аналог конопрессина S 1d-Tyr2-CP S усиливает экскрецию K+, но не влияет на выведение Na+.

2. Миметик инкретинов эксенатид модулирует антидиуретическое действие вазопрессина, что выражается в снижении реабсорбции осмотически свободной воды в почке у крыс.

3. У крыс при гипергидратации эксенатид резко ускоряет экскрецию почкой осмотически свободной воды, что способствует быстрому восстановлению нарушенного осмотического гомеостаза.

4. Влияние эксенатида на антидиуретический эффект вазопрессина устраняется антагонистом рецепторов ГПП 1, но не селективными антагонистами V1а- и V2-рецепторов, что указывает на участие системы инкретинов в реализации модулирующего действия эксенатида.

5. ПГЕ2 принимает участие в реализации модулирующего эффекта эксенатида. Предварительное введение неселективного блокатора циклооксигеназы диклофенака ослабляет гидруретический эффект миметика инкретинов. Экскреция почкой цАМФ и цГМФ на фоне действия эксенатида не изменялась.

6. Новые синтезированные аналоги 14-норлейцин-39-серинол-эксенатид и 14-норлейцин-35-D-аланин-39-серинол-эксенатид сопоставимы с эксенатидом по гликемическому и гидруретическому эффектам и могут стать основой при создании препаратов для лечения сахарного диабета.

7. Длительное потребление стандартных пищевых рационов модулирует эффект пептидных гормонов в регуляции почкой баланса воды и натрия в зависимости от состояния организма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кутина А.В., Марина А.С., Зайцева К.В., Елисеев И.И., Титов М.И., Наточин Ю.В. Влияние на реабсорбцию натрия и воды в почке крыс новых аналогов гормонов нейрогипофиза // Экспер. клин. фармакол. 2010. Т. 73.

№ 10. С. 21-24.

2. Боголепова А.Е., Кутина А.В., Марина А.С., Никольская С.К., Шахматова Е.И., Титов М.И., Наточин Ю.В. Синтез и исследование влияния новых аналогов эксенатида на уровень гликемии и функции почек у крыс // Пробл. эндокринол. 2011. №3. С. 42-47.

3. Кутина А.В., Марина А.С., Наточин Ю.В. Новый фактор регуляции натрийуреза при гиперволемии // ДАН. 2011. Т. 441. № 2. С. 275-277.

4. Марина А.С., Кутина А.В., Наточин Ю.В. Стимуляция эксенатидом выведения осмотически свободной воды почкой крыс при гипергидратации // ДАН. 2011. Т. 437. № 4. С. 568-570.

5. Марина А.С., Кутина А.В., Наточин Ю.В. Усиление калийуреза эксенатидом при гиперкалиемии // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 2011. Т.

152. № 8. С. 137-139.

6. Марина А.С., Кутина А.В., Наточин Ю.В. Физиологический анализ разных типов осмотического диуреза // Рос. физиол. журн. им. И.М.

Сеченова. 2011. Т. 97. №. 12. С. 1309-1318.

7. Наточин Ю.В., Титов М.И., Елисеев И.И., Никольская С.К., Глуздиков И.А., Кутина А.В., Марина А.С. Патент на изобретение № Аналоги эксенатида. 2011.

8. Марина А.С., Елисеев И.И. Влияние новых аналогов гормонов нейрогипофиза на транспорт натрия и воды в почке крыс // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2010».

Санкт-Петербург. 2010. С. 97.

9. Марина А.С., Елисеев И.И. Влияние на транспорт ионов натрия и воды в почке крыс аналогов вазотоцина с заменой концевого глицинамида // Тезисы докладов XXI съезда Физиологического общества им. И.П.

Павлова. Калуга. 2010. С. 381.

10. Марина А.С. Влияние конопрессинов моллюсков на выведение воды почкой крысы // Тезисы докладов XIV Международного Совещания по эволюционной физиологии памяти академика Л.А. Орбели. Санкт Петербург. 2011. С. 125-126.

11. Елисеев И.И., Кутина А.В., Марина А.С., Титов М.И. Синтез и исследование влияния аналогов конопрессина S на экскрецию ионов почкой крысы // Тезисы докладов XIV Международного Совещания по эволюционной физиологии памяти академика Л.А. Орбели. Санкт Петербург. 2011. С. 72-73.

12. Марина А.С., Кутина А.В., Никольская С.К., Титов М.И. Нормализация уровня глюкозы в плазме крови крыс при действии новых синтезированных аналогов эксенатида при гипергликемии // Тезисы докладов III Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека»

памяти П.Г. Костюка. Ялта, Украина. 2011. С. 155.

13. Марина А.С. Влияние рациона на гидруретический эффект миметика глюкагоноподобного пептида 1 у крыс // Тезисы докладов III Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» памяти П.Г.

Костюка. Ялта, Украина. 2011. С. 154.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.