авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Компоненты серотонинергической системы и их функциональная взаимосвязь в раннем развитии моллюсков и костистых рыб

На правах рукописи

ИВАШКИН Евгений Геннадьевич

КОМПОНЕНТЫ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ И ИХ

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ В РАННЕМ РАЗВИТИИ

МОЛЛЮСКОВ И КОСТИСТЫХ РЫБ

03.03.01 – физиология

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2013 г.

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии «Институт Федерального государственного бюджетного учреждения науки биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН».

доктор биологических наук,

Научный руководитель:

ведущий научный сотрудник Елена Евгеньевна Воронежская доктор биологических наук,

Официальные оппоненты:

заведующий лабораторией биохимии Шарова Наталья Петровна, ИБР РАН им. Н.К. Кольцова кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мартьянов Андрей Александрович МГУ им. М.В. Ломоносова Кафедра эмбриологии

Ведущая организация:

Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Защита диссертации состоится «» 2013 г. в часов минут на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501.001. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им. М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан 7 сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Умарова Б.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Каждый год выходит огромное количество работ, посвящённых регуляторным функциям моноаминов, ферментов их синтеза и деградации, транспортеров и рецепторов. Была показана роль серотонина и дофамина не только как классических нейромедиаторов, но и как факторов, участвующих в регуляции развития (Voronezhskaya et al., 2004;

Lauder and Krebs, 2010), а также гуморальных факторов, регулирующих течение самых разных процессов, начиная с ранних стадий органогенеза (Pino et al., 2004;

Levin et al., 2006) и заканчивая нормальными и патологическими процессами во взрослых организмах (Berger et al., 2009).

Одним из наиболее изученных моноаминов является серотонин (5 гидрокситриптамин, 5-hydroxytryptamine, 5-HT). Известно, что 5-HT широко распространён среди эукариот. В том числе он выполняет регуляторные функции у растений (Murch et al., 2001), одноклеточных простейших (McGowan et al., 1985) и примитивных многоклеточных животных, не имеющих нервной системы (Czaker, 2006).

Ещё в конце 50-х – начале 60-х годов было впервые обнаружено, что некоторые моноамины и другие низкомолекулярные вещества, являющиеся нейромедиаторами, присутствуют на стадиях раннего развития задолго до появления нервной системы (Numanoi, 1955;

Бузников, Манухин, 1961). В дальнейшем было показано, что 5-HT содержится в ооцитах и дробящихся эмбрионах животных самой разной систематической принадлежности: полихет (Emanuelsson, 1974), немертин, (Buznikov et al., 1964) голожаберных моллюсков (Buznikov et al., 2003);

головохордовых (Candiani et al., 2001), иглокожих, (Buznikov et al., 1964), амфибий (Fukumoto et al., 2005a), птиц (Emanuelsson, 1988) и млекопитающих (Basu et al., 2008).

В экспериментальных работах было продемонстрировано, что 5-HT вовлечён в регуляцию широкого спектра процессов на донервных стадиях развития у самых разных животных (Buznikov et al., 1993;

Cerda et al., 1995;

Dufau et al., 1993;

Stricker and Smythe, 2000;

Buznikov et al., 2003;

Fukumoto et al., 2005a, 2005b;

Lawrence and Soame, 2009;

Fujinoki, 2011;

Beyer et al., 2012).

Несмотря на растущее количество экспериментальных фактов, многие аспекты и механизмы функционирования серотонинергической системы на ранних донервных стадиях развития остаются практически не исследованными.

Большинство работ, посвящённых 5-HT, выполняется преимущественно в рамках парадигмы рецепторного действия моноаминов. Однако в последние десятилетия было показано, что механизмы действия 5-HT также включают в себя сложные многокомпонентные системы, в которых важную роль играет баланс 5-HT внутри и снаружи клеток (Walther, 2006;

Duerschmied and Bode, 2009).

В качестве объектов исследования нами были выбраны удобные для работы и популярные в биологии развития модели: пресноводный брюхоногий моллюск большой прудовик, костистые рыбы данио и обыкновенный вьюн.

Для этих животных хорошо изучены особенности раннего развития, существуют методики эффективной работы в условиях лаборатории. В дополнение, как один из самых легкодоступных объектов среди двустворчатых моллюсков, нами была использована тихоокеанская мидия.

Моллюски являются старейшим объектом для исследования физиологии биогенных аминов. Серотонин на ранних стадиях развития впервые был показан и описан в зародышах голожаберных моллюсков (Бузников, Манухин, 1960). Систематические исследования ранней серотонинергической системы у представителей других групп моллюсков не проводились.

На костистых рыбах был выполнен ряд работ о вовлечении 5-HT в процессы реинициации мейоза и созревания ооцитов (Iwamatsu et al., 1993;

Cerda et al., 1995, 1998;

Chattoraj et al., 2008), а также было показано участие 5 HT в нейро- и органогенезе (Bashammakh, 2007;

Airhart et al., 2012). Однако данные об особенностях ранней серотонинергической системы и её функциях на стадиях, предшествующих нейруляции у костистых рыб в современной научной литературе отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучение роли серотонинергической системы и механизмов её работы в раннем развитии (дроблении) моллюсков и костистых рыб. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Исследование паттернов распределения 5-HT в дроблении моллюсков большого прудовика и тихоокеанской мидии, а также костистой рыбы данио.

• Анализ активности систем синтеза и транспорта 5-HT на последовательных стадиях раннего эмбрионального развития этих животных.

• Изучение экспрессии компонентов серотонинергической системы в развитии костистой рыбы данио.

• Поиск нарушений развития, вызванных фармакологической модуляцией компонентов ранней серотонинергической системы у моллюсков и рыб.

• Анализ компонентов серотонинергической системы и исследование их функциональных взаимосвязей в раннем развитии большого прудовика.

Научная новизна работы.

Впервые с использованием современных методов был проведен детальный анализ присутствия и распределения серотонина (5-НТ) в дроблении костистой рыбы, а также пресноводного брюхоногого моллюска и морского двустворчатого моллюска. Совмещение морфологического и экспериментального подходов позволило проанализировать функциональную активность ферментов синтеза серотонина и его транспортеров на разных стадиях донервного развития исследованных животных. Была разработана экспериментальная модель, позволяющая выявить и оценить взаимосвязь различных компонентов серотонинергической системы у большого прудовика.

Представленные новые данные демонстрируют модуляторную роль серотонина на донервных стадиях эмбрионального развития и позволяют выдвинуть гипотезу о важном значении баланса уровня серотонина внутри и снаружи клетки в развитии. Получены экспериментальные данные, указывающие на модуляторную роль серотонина в регуляции долговременных, отсроченных процессов.

Научно-практическая ценность.

Полученные данные имеют важное теоретическое значение, так как позволяют понять механизмы, лежащие в основе долговременной регуляции процессов развития со стороны донервной серотонинергической системы.

Сравнительные данные, полученные для животных далеко отстоящих систематических групп, дают возможность оценить консервативность обнаруженных механизмов регуляции. Прикладное значение имеет разработанная экспериментальная модель серотонин-индуцированной экзогаструляции у зародышей большого прудовика, которая может быть использована в качестве тест-системы для скрининга биологически активных веществ, способных модулировать работу серотонинергической системы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XVI и XVII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» и «Ломоносов-2010», второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, 6th European Zebrafish Genetics and Development Meeting, 12th International EMBL PhD Symposium. 9th and 10th Gttingen Meeting of the German Neuroscience Society, 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых российских и международных журналах и 21 тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением методов, главы результатов и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице, иллюстрирована 25 рисунками. Список литературы содержит 231 источник.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на зародышах тихоокеанской мидии (Mytilus trossilus), большого прудовика (Lymnaea stagnalis), обыкновенного вьюна (Misgurnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio). Оплодотворённые яйца данио и большого прудовика получали естественным образом. Половые продукты тихоокеанской мидии и обыкновенного вьюна для последующего оплодотворения получали при помощи искусственной стимуляции по стандартным методикам. Экспериментальные процедуры с живыми зародышами большого прудовика проводили после извлечения их из кокона, но без удаления вторичной оболочки. Все манипуляции с зародышами обыкновенного вьюна и данио выполняли после протеолитического извлечения их из оболочек на стадии зиготы с помощью протеиназы К. Метод иммуноцитохимического окрашивания использовали для оценки распределения 5-HT и рецептора 5-HT 1Aa (у данио), а также для полуколичественного анализа изменений внутриклеточной концентрации 5-HT. Использовали антитела против 5-HT, rabbit, Immunostar, разведение 1:1000 - 1:2000;

антитела к рецептору SR-1A, Santa-Cruz Biotech., rabbit, разведение 1:500. Специфический характер окрашивания антителами проверяли окрашиванием после высаждения первичных антител 5-HT-BSA (Immunostar), а также окрашиванием без первичных антител. Обработку конфокальных изображений производили в программах Bitplane Imaris и FIJI, измерения яркостей проводили с помощью программы FIJI. Метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием специфических праймеров, подобранных на основе известных для данио нуклеотидных последовательностей. Метод Вестерн блот анализа применяли для исследования экспрессии рецептора 5-HT 1Aa у данио. Использовали 1-ные антитела к рецептору SR-1A, разведение 1:1000;

2-ные антитела фирмы «Amersham» применяли в разведении 1:2000. Статистическую обработку проводили с помощью программ Statistica и XLStat. Для сравнения средних применяли критерий Стьюдента и однофакторный ANOVA. Из-за выраженной сезонной зависимости, для статистической обработки опытов с экзогаструляцией у большого прудовика применяли модифицированный тест Хи-квадрат - тест Кохрана-Мантеля-Хензеля со стратификацией по повторности эксперимента (эксперименты повторяли 3-5 раз).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Присутствие 5-HT в нормальном развитии 1.

В литературе отсутствует информация о наличии и характере распределения 5-HT в зародышах исследуемых животных. На первом этапе работы было проведено выявление 5-HT с помощью иммунохимического окрашивания с последующей визуализацией на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Были проанализированы от 30 до 50 зародышей каждого вида животного для каждой стадии развития.

1.1 Распределение 5-HT в дробящихся зародышах мидии.

5-HT на ранних стадиях дробления выявлялся в виде ярких точек, распределённых в цитоплазме всех клеток (Рис. 1А, Б). На поздних стадиях дробления 5-НТ распределён более гомогенно в цитоплазме (Рис. 1В). В ядрах яркость окрашивания ниже, или равна таковой в цитоплазме. На стадии гаструлы в районе анимального полюса выявляется единичная клетка, в которой содержание 5-НТ существенно выше, чем в остальных клетках зародыша (Рис. 1Д).

1.2 Распределение 5-HT в дробящихся зародышах большого прудовика.

На ранних стадиях дробления 5-НТ распределён равномерно во всех клетках зародыша. Мы не наблюдали значительных различий в яркости окрашивания между макро- и микромерами. Иногда на более поздних стадиях дробления и очень редко на ранних отмечалось более высокая или более низкая яркость окрашивания в ядрах относительно цитоплазмы. Между отдельными клетками зародыша не отмечено существенных различий в содержании 5-НТ (Рис. 2, А-В).

На стадиях ранней и плоской бластулы, наблюдается некоторое преобладание уровня 5-НТ в отдельных группах клеток, однако определённой закономерности в их расположении нами выявлено не было (Рис. 2 Г, Д).

Рис. 1. Распределение 5-HT в зародышах мидии на последовательных стадиях развития (А-Д). А – бластомера, Б – 8 бластомеров, В – бластула, Г – гаструла, Д – ранняя трохофора. Е – контроль окрашивания.

Иммунохимическое выявление. Зелёный –5-HT, синий – DAPI. Масштаб: 10 мкм.

Рис.2. Распределение 5-HT в зародышах большого прудовика на последовательных стадиях развития (А-Д).

А – 2 бластомера, Б – 4 бластомера, В – 12 бластомеров, Г – ранняя бластула, Д – плоская бластула. Е – контроль окрашивания. Иммунохимическое выявление. Зелёный – 5-HT, синий – DAPI. Масштаб: 20 мкм.

1.3 Распределение 5-HT в дробящихся зародышах данио.

На всех исследованных стадиях дробления содержание 5-НТ в бластодиске и бластодерме существенно выше, чем в желтке (Рис. 3). В желточных гранулах 5-НТ не выявляется.

Рис. 3. Распределение 5-HT в зародышах данио на последовательных стадиях развития (А-Д). А – бластомера, Б – 128 бластомеров, Г – высокая бластула, Д – 50% эпиболии. В – оптический срез отдельной клетки. 5-HT локализован в ярких везикулоподобных структурах в цитоплазме. Е – контроль окрашивания.

Зелёный –5-HT, синий – DAPI. Масштаб: А, Б, Г-Е – мкм, В – 20 мкм.

На ранних стадиях дробления, в зоне перехода цитоплазмы бластомера в желток наблюдается чёткая граница. В бластомерах 5-НТ распределён во всём объёме цитоплазмы. Его содержание в ядре выше, или равно таковому в цитоплазме (Рис. 3А, Б). В цитоплазме 5-НТ локализован в везикулоподобных структурах размером 0,3-0,7 мкм (Рис. 3В). На стадиях 2-8 бластомеров значительной разницы в яркости окрашивания между бластомерами не наблюдается. На стадиях 16-64 бластомеров и позднее отдельные бластомеры окрашиваются ярче, однако определённой закономерности их расположения нами отмечено не было (Рис. 3 Г, Д).

Таким образом, 5-HT присутствует в клетках дробящихся зародышей всех трёх исследованных видов. В зародышах моллюсков он распределён равномерно, т.е. нет видимой разницы в содержании 5-HT между отдельными клетками или частями зародыша. Равномерное распределение 5-HT у исследованных нами моллюсков отличает их от голожаберного моллюска Tritonia diomedea, для которого ранее было показано наличие градиента концентрации 5-HT в направлении от анимального полюса к вегетативному (Buznikov et al., 2003).

У данио 5-HT сконцентрирован в бластодерме и бластодиске. Скорее Рис. 4. Полуколичественная А оценка уровня синтеза и 5-HT захвата на последовательных стадиях (А) развития мидии и большого прудовика (Б).

Иммунохимическое окрашивание антителами против 5-HT, конфокальные изображения, цветовое кодирование яркости.

А. 16 bl. – раннее дробление;

Б 13 hpf –бластула на стадии ч. после оплодотворения.

Б. 12-16 bl. – раннее дробление;

bl-la – плоская бластула.

Ctr – контроль;

Trp – триптофан (1 мМ);

HTP – 5 гидрокситриптофан (1 мМ);

HT – 5-HT (100 мкМ) Cit – ( циталопрам мкМ).

Статистически значимые отличия от контроля: * p0,05. *** - p0,001;

n.s. – нет достоверных отличий.

Полуколичественная 5.

Рис.

оценка уровня синтеза и захвата серотонина в бластодерме на последовательных стадиях развития данио.

Иммунохимическое окрашивание 5-HT, антителами против конфокальные изображения, цветовое кодирование яркости.

16-32 bl. – раннее дробление;

64 128 bl. –дробление;

bl-la – высокая g.sh. – бластула;

стадия зародышевого щитка. Ctr – контроль;

Trp – триптофан ( мМ);

HTP – 5-гидрокситриптофан (1 мМ);

HT – 5-HT (100 мкМ). Для каждого измерения размер выборки – 20-30 зародышей.

Статистически значимые отличия от контроля: *** - p0,001.

всего, это связано с меробластическим характером дробления и разделением зародыша на морфогенетически активную и не активную части. Известно, что у животных с голобластическим дроблением может присутствовать грандиент концентрации 5-HT между анимальным и вегетативным полюсами (Buznikov et al., 2003;

Beyer et al., 2012). У костистых рыб неравномерность распределения 5-HT в зародыше имеет ещё большую неравномерность. Градиента нет, а весь 5-НТ сосредоточен в цитоплазме клеток на анимальном полюсе зародыша.

Синтез и транспорт 5-HT в клетках дробящихся зародышей 2.

2.1 Синтез и транспорт 5-HT в зародышах мидии Инкубация в 5-HTP приводила к существенному повышению уровня 5 НТ во всех клетках зародыша как на стадиях раннего дробления (135,9±33, a.u. против 25,3±2,04 a.u. в контроле, p0,001), так и в бластулах (161,3±28, a.u. против 31,8±4,68 a.u. в контроле, p0,001). Инкубации в триптофане и 5-HT не изменяли содержание 5-НТ внутри клеток зародыша. На стадии поздней бластулы существенное повышение содержания 5-НТ отмечено только в единичной клетке, расположенной на анимальном полюсе. На суммарной диаграмме яркости это отразилось в некотором повышении уровня 5-НТ после инкубации в триптофане (38,8±5,67a.u., против 31,8±4,68 a.u. в контроле, p0,05) и достоверном повышении яркости после инкубации в 5-НТ (57,4±10,05 a.u., против 31,8±4,68 a.u. в контроле, p0,001), которое, тем не менее, было в 3 раза меньше, чем после инкубации в 5-НТР (Рис. 4А).

2.2 Синтез и транспорт 5-HT в зародышах большого прудовика.

Помещение зародышей в 5-HTP в 3-6 раз увеличивало уровень 5-НТ.

Этот эффект был более выражен на стадии плоской бластулы (155,5±8,59 a.u., против 23,4±1,50 a.u. в контроле, p0,001, чем на стадиях раннего дробления (186,0±2,46 a.u. против 59,3±0,77 a.u. в контроле, p0,001). Следует отметить, что после инкубации в 5-HTP 5-HT неравномерно распределён в объёме бластомеров. В отдельных клетках его уровень был существенно выше в ядрах, или даже в веретёнах делений (Рис. 4Б). Инкубация в триптофане несколько увеличивала уровень 5-НТ у зародышей на стадии раннего дробления (86,0±2,21 a.u., по сравнению с 59,3±0,77 a.u. в контроле, p0,001) и не изменяла этот показатель у зародышей на стадии плоской бластулы (26,6±2, a.u. и 23,4±1,50 a.u. в контроле, p0,05). Напротив, инкубация в 5-HT не влияла на содержание 5-НТ в бластомерах у зародышей на стадиях раннего дробления, даже при повышении концентрации 5-НТ в инкубационном растворе до мкМ (55,8±1,75 a.u. и 59,3±0,77 a.u. в контроле, p0,05). Но приводила к значительному повышению уровня 5-НТ во всех клетках бластулы (159,5±8, a.u., по сравнению с 23,4±1,50 a.u. в контроле, p0,001), сходному с эффектом инкубации в 5-НТР. Инкубация в циталопраме приводила к статистически достоверному повышению уровня 5-НТ внутри бластомеров (78,5±3,60 a.u., по сравнению с 59,3±0,77 a.u. в контроле, p0,001) (Рис. 4Б).

2.3 Выброс 5-HT из клеток в зародышах большого прудовика.

Измерение уровня 5-HT в среде показало, что после помещения зародышей большого прудовика, в среде появляется существенное количество 5-HT (2,2±0,49 нг/мл). Инкубация в растворе блокатора мембранного транспортера 5-НТ циталопрама (1 мкМ) незначительно снижает содержание 5 HT в среде (1,7±0,52 нг/мл). После инкубации в растворе 5-HTP (1 мМ) содержание 5-HT в среде повышается в 5 раз (10,4±0,83 нг/мл). Инкубация в 5 HTP вместе с циталопрамом (1 мкМ) приводит к уменьшению количества 5-HT в среде по сравнению с инкубацией только в 5-HTP в 2 раза (5,4±0,99 нг/мл).

2.4 Синтез и транспорт 5-HT в зародышах данио.

Инкубация в триптофане, 5-HTP и 5-HT проводила к статистически достоверному по сравнению с контролем повышению уровня 5-НТ в дробящейся части зародышей на всех исследованных стадиях развития (в 1, раза, в триптофане, в 1,5-2 раза в 5-НТР и 2-2,5 раза в 5-НТ, везде p0,001) (Рис. 5). В желтке в тех же зародышах закономерного повышения уровня 5-НТ не наблюдали. Специфические блокаторы обратного захвата 5-HT флуоксетин (1 мкМ) и циталопрам (1 мкМ) сами никак не влияли на содержание 5-НТ в дробящихся бластомерах данио, однако статистически достоверно снижали яркость окрашивания при совместной инкубации с 5-HT (100 мкМ) (со 150,3±5,47 a.u. до 73,5±3,66 a.u. в флуоксетине и 86,2±4,36 a.u. в циталопраме, везде p0,001). Повышение уровня 5-HT в бластодерме при помещении в 5-HT имеет выраженные временную и концентрационную зависимости, что также подтверждает наличие специфического захвата 5-HT из среды. Инкубация только в блокаторе триптофангидроксилазы парахлорфенилаланине (10 мкМ) не уровень 5-НТ по сравнению с контролем. Однако при совместной инкубации в парахлорфенилаланине и триптофане мы наблюдали снижение уровня 5-НТ по сравнению с инкубацией в триптофане (63,9±1,54 a.u., по сравнению с 81,6±2,31 a.u., p0,001). Инкубация зародышей в блокаторе везикулярного моноаминового транспортера резерпина (10 мкМ) статистически достоверно снижала уровень 5-HT в клетках (46,0±2,01 a.u., по сравнению с 54,3±1,98 a.u. в контроле, p0,001). После инкубации зародышей в 5-HT (10 мкМ) совместно с резерпином (10 мкМ) уровень 5-НТ также был ниже, чем после инкубации только в 5-HT (63,1±1,57 a.u и 81,9±2,53 a.u., соответственно, p0,001).

Экспрессия компонентов серотонинергической системы в 3.

развитии данио.

3.1 Исследование экспрессии компонентов серотонинергической системы на уровне синтеза мРНК.

мРНК продукты генов tph1b, slc6a4a, slc18a2 и maoa (см. расшифровку Рис. 6) мы обнаружили на всех исследованных стадиях развития. Экспрессию tph1a наблюдали на всех стадиях, кроме стадии 1 дня после оплодотворения.

Экспрессию tph2 наблюдали, начиная со стадии бластулы, небольшое количество транскриптов также было отмечено в зародышах на стадиях раннего дробления. Некоторый уровень экспрессии slc6a4b был отмечен, начиная со стадии бластулы. Экспрессию htr1aa наблюдали в дробящихся зародышах и до стадии 30% эпиболии, а затем уже после 1 дня после оплодотворения. В яичнике наблюдали экспрессию всех исследованных генов Рис. 6. Результат ОТ-ПЦР. tph1a и tph1b - соматические формы триптофангидроксилазы - фермента первого этапа синтеза 5-HT, tph2 нейральная форма триптофангидроксилазы;

slc6a4a и slc6a4b - мембранные серотонин специфические транспортеры 5-HT А-типа (SERTa) и B-типа (SERTb);

- неспецифический slc18a везикулярный моноаминовый транспортер 2-го типа (VMAT2);

maoa - фермент деградации 5-HT;

htr1aa - рецептор 5-HT 1Aa;

. rpl5b ген белка L5b 60S субъединицы рибосомы (+ контроль).

Стадии развития: 4-8 bl. – 4-8 бластомеров;

32-64 bl. – 32-64 бластомера;

bl-la – бластула;

ep. 30% - 30% эпиболии;

5 som. – 5 сомитов;

1 и 4 dpf – стадии 1 и 4 дней после оплодотворения;

ovar. – яичник взрослой рыбы.

(Рис. 6).

3.2 Экспрессия рецептора 5-HT 1Aa в развитии данио.

In situ гибридизация с зондом на основе известной нуклеотидной последовательности гена 5-ht1aa на целых зародышах на стадиях дробления показала, что экспрессия данного гена наблюдается во всех бластомерах на исследованных стадиях развития. Иммунохимическое окрашивание с антителами против белка рецептора 5-HT 1A типа выявило точечный сигнал на поверхности всех бластомеров на стадиях раннего дробления, а также в пределах головного мозга у личинок на 2-ой день после оплодотворения.

Вестерн блот анализ с использованием этих же антител выявил несколько полос: в районе 45 и 60 КДа, и на стадиях эпиболии и 25-ти сомитов дополнительную полосу в районе 72 КДа. Полоса в районе 45 КДа соответствует известному для рецептора 5-HT 1Aa данио молекулярному весу (44558 Да).

Таким образом, в дроблении данио присутствует экспрессия триптофангидроксилаз, мембранного и везикулярного моноаминового транспортеров, что подтверждает наши данные о способности зародышей к синтезу 5-HT из триптофана и захвату 5-HT из среды. Наши данные согласуются с известными для других позвоночных (Amireault and Dub, 2005a;

Basu et al., 2008;

Nikishin et al., 2012). Наши данные об экспрессии моноаминоксидазы согласуются существующими свидетельствами о наличии моноаминоксидазной активности в неоплодотворённых яйцах и ранних зародышах костистых рыб (Nicotra and Senatori, 1989). Нами впервые в раннем развитии позвоночных была показана экспрессия 5-HT рецептора 1A типа, хотя в литературе есть свидетельства об экспрессии близких к нему рецепторов группы (Vesela et al., 2003;

Il'kova et al., 2004).

Нарушения развития, вызванные фармакологической 4.

модуляцией компонентов серотонинергической системы 4.1 5-HTP-индуцированная экзогаструляция у большого прудовика.

Инкубация зародышей большого прудовика, начиная со стадии бластомеров, в течение 12 часов в 5-HTP приводит к специфическому нарушению развития на третий день после прохождения первой борозды дробления – экзогаструляции (ЭГ). Через сутки, на стадии сферической бластулы, зародыши, в дальнейшем претерпевающие ЭГ, внешне не отличаются от контроля. На стадии средней и поздней гаструлы от нормы они отличаются угловатой формой, их развитие замедляется. Затем начинается выпячивание энтодермальной части зародыша, которое полностью завершается к 3-му дню развития формированием экзогаструлы (Рис. 7Г‘). К этому моменту, контрольные животные достигают стадии трохофоры (Рис. 7Г). К ЭГ приводила инкубация в 5-НТР в строго определённый период развития: при отмывке зародышей до стадии ранней бластулы, или при начале инкубации после стадии 16 бластомеров ЭГ не наблюдали. Экзогаструлы представляют собой гантелеобразные структуры, хорошо отличимые от нормальных зародышей под стереомикроскопом (Рис. 7).

Процент зародышей с ЭГ зависит от концентрации 5-HTP (Рис. 7Б, Б‘, Б‘‘). Животные, успешно прошедшие гаструляцию при более низких концентрациях 5-HTP (0,5 мМ), развиваются нормально. При более высоких концентрациях 5-HTP среди зародышей, прошедших гаструляцию, повышен процент животных с характерными нарушениями – нечётным (1, 3, 5) количеством глаз и нарушениями закрученности раковины. Случаев изменения направления закрученности раковины отмечено не было. Добавление в среду специфического блокатора синтеза 5-HT из 5-HTP гидроксибензилгидразина (10 мкМ) снимает эффект 5-HTP (Рис. 7В, В‘). 5-HT в концентрациях до 1 мМ не приводит к ЭГ. Более высокие концентрации 5-HT оказывали цитотоксический эффект, не связанный с ЭГ, и приводили к остановке дробления. Однако добавление 5-HT (10 мкМ) совместно с 5-HTP приводит к статистически достоверному увеличению процента ЭГ при тех же самых концентрациях 5-НТР (Рис. 7Д). Триптофан (до 5 мМ) не вызывает ЭГ. Однако добавление вместе с триптофаном (1,75 мМ) 5-HT (100 мкМ) приводило к ЭГ (до 25% от общего числа зародышей при 0,5 М триптофане). Процент ЭГ в таких экспериментах возрастал при увеличении концентрации триптофана.

Мелатонин в любых концентрациях не вызывает ЭГ. Аппликация мелатонина вместе с 5-HTP не приводит к увеличению процента ЭГ. Также ЭГ с частотой, превышающей таковую в контроле, не вызывали агонисты серотониновых рецепторов (5-карбоксамидотриптамин, 5-метокси-N,N диметил триптамин, 8-гидрокси-ДПАТ, альфа-метилсеротонин, Br-LSD, DOI, 5-HTQ, m-CPP в любых концентрациях, ни сами по себе, ни в комбинации друг с другом), также как и биохимический предшественник дофамина L-3,4 дигидроксифенилаланин (L-ДОФА).

4.2 Сезонное изменение чувствительности зародышей большого прудовика к 5-HTP Популяцию больших прудовиков, от которых получали зародышей, содержат в условиях культуры уже на протяжении более чем 40 лет. В лаборатории сравнительной физиологии ИБР РАН животных круглый год содержат в стандартизованных условиях, а все инкубации мы проводили в термостате при 18С. Однако, нами было отмечено, что процент ЭГ в одной и той же концентрации 5-HTP сильно варьирует в зависимости от времени года.

Для того, чтобы проверить это наблюдение, были сведены вместе данные об экспериментах с ЭГ за несколько лет. Было обнаружено, что процент ЭГ рос с осени до конца лета, причём максимальным он был в мае-июне, а минимальным – в октябре. В начале осени наблюдали резкое (в 2,5 раза) падение чувствительности к 5-HTP Рис. 7. Модель 5-HTP-индуцированной ЭГ в зародышах большого прудовика. А-В’ – Внешний вид яиц. А-A’ – контроль на стадии гаструлы (А) и раннего велигера (A’);

Б-Б” – ЭГ в различных концентрациях 5-HTP, 0,1 мМ (Б), 0,8 мМ (Б’), 1,2 мМ (Б”). В-В’ – после инкубации в 5-HTP (1,2 мМ) совместно с NSD-1015 (10 мкМ) на стадии гаструлы (В) и раннего велигера (В’), стрелками помечены экзогаструлы. Г-Г’ – экзогаструла (Г) и нормальный зародыш на стадии ранней гаструлы (Г’) Ect – эктодермальная, Ent – энтодермальная части экзогаструлы. Д – Зависимость процента ЭГ от концентрации 5-HTP.

HTP – инкубация в 5-HTP, HTP+HT – совместная инкубации в 5-HTP с добавлением 5-HT.

Е – Зависимость процента ЭГ от времени года. Инкубация в 5-HTP (0,8 мМ).

(Рис. 7Е). Разница была статистически достоверной (F(3,61)=3,4247, p0,03, однофакторный ANOVA).

4.3 Поиск нарушений развития в дроблении костистых рыб.

Инкубация зародышей данио в растворе антагониста рецепторов 5-НТ широкого спектра действия миансерина (50-100 мкМ) приводила к округлению и выселению отдельных клеток из бластодермы на стадии бластулы в районе анимального полюса. Инкубация в растворе ципрогептадина (10-100 мкМ) приводила к округлению клеток развивающегося зародыша и последующему рассыпанию бластодермы на отдельные клетки после стадии 64 бластомеров.

Инъекции (1 нл, 10 мкМ) ципрогептадина и миансерина в желток зародышей на стадии 2-4 бластомеров не вызывали выраженных нарушений развития.

Инкубация зародышей вьюна в растворе ципрогептадина (1-100 мкМ) приводила к округлению клеток и рассыпанию бластодермы на стадии бластулы (Рис. 20Г-Д). Добавление 5-HT (100 мкМ) не вызывало снятие или снижение эффекта. Инкубация зародышей вьюна в растворе миансерина ( мкМ – 1 мМ) не вызывала видимых нарушений развития.

Нарушения развития у данио и вьюна не вызывали также все остальные из применённых нами для фармакологического анализа модуляторов серотонинергической системы (5-НТ, его биохимические предшественники и блокаторы синтеза, агонисты и антагонисты рецепторов).

4.4 Действие хлорпромазина на организацию мембранного трафика в бластомерах вьюна и большого прудовика.

Хлорпромазин известен как антагонист целого ряда моноаминовых рецепторов и в том числе серотониновых рецепторов 2-го типа. Инкубация в растворе хлорпромазина (1-100 мкМ) дробящихся зародышей прудовика и вьюна вызывает характерные нарушения нормального развития: сокращение контактной поверхности и округление бластомеров у прудовика, и резкое уменьшение поверхности бластодиска относительно поверхности желтка у вьюна. Инкубация зародышей в растворе хлорпромазина (10 мкМ) одновременно с 5-HT (100 мкМ) или дофамином (100 мкМ) не приводит к восстановлению нормального развития.

У вьюна и у прудовика после инкубации в хлорпромазине обнаруживается флуоресценция с характерными для хлорпромазина спектрами возбуждения и испускания (Elferink, 1977). Через 5 мин она локализуется пятнами на поверхности бластомеров, а через 30 мин - в виде сферических везикул по всему объёму клеток. У вьюна включение хлорпромазина в поверхностные мембраны наблюдалось в бластодиске, но не в желтке.

Исследование с помощью электронной микроскопии показало усиление складчатости поверхностной мембраны непосредственно после аппликации хлорпромазина. Инкубация с флуоресцентно-меченым декстраном показала, что хлорпромазин вызывает значительное усиление и изменение характера эндоцитоза.

Выявленное нами действие хлорпромазина на развивающиеся зародыши не связано с его действием на моноаминовые рецепторы. По всей видимости, хлорпромазин связывается с определёнными участками поверхностной мембраны, и вызывает усиление эндоцитоза. Характер включения хлорпромазина в мембраны и его эффект на эндоцитоз схожи у вьюна и большого прудовика.

Таким образом, модуляции серотонинергической системы у моллюсков приводит к выраженным необратимым долговременным (отложенным) нарушениям в развитии. У большого прудовика это происходит только в случае одновременного повышения уровня 5-HT внутри и снаружи клеток зародышей на строго определенных стадиях дробления. На основе этого феномена нами была разработана экспериментальная модель для анализа функционирования компонентов ранней серотонинергической системы.

Следует отметить, что, несмотря на продемонстрированную нами способность зародышей к синтезу и захвату 5-HT, экспрессию целого комплекса генов, связанных с серотонинергической системой, разнообразие применённых фармакологических агентов, нам не удалось выявить специфические нарушения, связанные с модуляцией ранней серотонинергической системы у костистых рыб.

5. Анализ функциональных взаимосвязей между компонентами серотонинергической системы в раннем развитии большого прудовика Мы не выявили нарушений развития, связанных с понижением внутриклеточного уровня серотонина, т.к. инкубация зародышей в растворах специфических блокаторов ферментов синтеза 5-HT парахлорфенилаланина (до 10 мкМ) и гидроксибензилгидразина (он же NSD-1015, до 10 мкМ) не приводила к видимым нарушениям развития. Поэтому дальнейший фармакологический анализ компонентов серотонинергической системы проводили на основе разработанной нами модели 5-HTP-индуцированной экзогаструляции. Для этого зародыши прудовика помещали в раствор 5-HTP c добавлением различных веществ-модуляторов серотонинергической системы.

Специфические блокаторы мембранного серотонинового транспортера циталопрам, кломипрамин и флуоксетин достоверно снижали процент ЭГ.

Имипрамин и десипрамин (до 10 мкМ) не влияли на процент ЭГ. Добавление 5 HT (100 мкМ) на фоне 5-HTP снимало блокирующий ЭГ эффект циталопрама и кломипрамина (Рис.8А). Сами по себе циталопрам, кломипрамин и флуоксетин приводили к остановке делений дробления и гибели зародышей при концентрациях 100 мкМ и выше Антагонисты серотониновых рецепторов миансерин, ципрогептадин, метисергид, ритансерин и спиперон вызывали достоверное и воспроизводимое уменьшение процента экзогаструл.

Кетансерин, SB269970, GR113808, тразодон, тропанил, S-WAY100135, закоприд и метиотепин не оказывали значительного влияния (Рис. 8В).

Добавление агонистов серотониновых рецепторов DOI и mCPP повышало процент ЭГ, тогда как 5-HTQ не оказывал никакого влияния (Рис. 8Б). Таким образом, на процент ЭГ влияют вещества, являющиеся лигандами рецепторов 2-го типа позвоночных. Активатор аденилатциклазы форсколин и проникающий через клеточную мембрану аналог цАМФ дибутирил-цАМФ повышали процент ЭГ, тогда как блокатор аденилатциклазы MDL-12330A и блокатор протеинкиназы А H7 снижали процент ЭГ. Ионофор Ca2+ иономицин снижал процент экзогаструл. Повышение уровня Ca2+ и K+ в среде путём добавления соответствующих хлоридов в инкубационный раствор приводило к увеличению процента ЭГ. Mg2+ и Na+ не оказывали влияния на число ЭГ.

Рис. 8. Процент ЭГ у зародышей большого прудовика при инкубации в различных фармакологических агентах. А – блокаторы мембранного транспортера 5-HT. Б – агонисты рецепторов 5-HT. В – антагонисты рецепторов 5-HT и ингибитор синтеза 5-HT из 5-HTP (NSD-1015). +5-HTP – совместная инкубация в соответствующем веществе и в 5-HTP. n размер выборки. Статистически значимые различия: * - p0,05, ** - p0,01, *** - p0,001;

n.s.

– различия недостоверны.

Добавление вместе с 5-HTP специфических ингибиторов трансглутаминаз монодансилкадаверина (10 мкМ) и цистамина (100 мкМ) статистически достоверно уменьшало процент ЭГ.

Таким образом, проведённый исследование присутствия, синтеза и захвата 5-НТ совместно с фармакологическим анализом позволило нам предположить следующую схему взаимодействия компонентов серотонинергической системы на ранних стадиях развития моллюсков (Рис. 9) Рис. 9. Схематическое представление выявленных функциональных взаимосвязей компонентов серотонинергической системы в раннем развитии брюхоногого TPH – моллюска. триптофан AADC – гидроксилаза;

декарбоксилаза ароматических аминокислот;

SERT – мембранный серотониновый транспортер;

5-HT2 receptor – рецептор 5-HT близкий к рецепторам 2 типа позвоночных;

Adenylate cyclase – аденилат циклаза, PKA – протеин киназа А;

TGAse трансглутаминаза. Подробное описание в тексте.

5-НТ синтезируется в клетках из 5-НТР. Выброс 5-HT во внешнюю среду, скорее всего, связан с инвертированной активностью мембранного серотонинового транспортера на ранних стадиях дробления. Это подтверждают как прямые измерения 5-HT в среде, так и данные фармакологического анализа на основе модели ЭГ. Выброшенный из клеток 5-HT активирует рецепторы, по фармакологическому профилю близкие к 5-HT рецепторам 2-го типа позвоночных. Однако в возникновении ЭГ, скорее всего, задействован не Ca2+, а цАМФ-активируемый путь, что позволяет предположить отличие эмбриональных 5-НТ рецепторов от дефинитивных. Для клонированного ранее рецептора 5-HTR2Lym ранее было показано сопряжение именно с активацией инозитолфосфатазного пути (Gerhardt et al., 1996). Совпадение по времени двух событий: повышение внутриклеточного уровня 5-НТ и активация мембранных 5-НТ рецепторов – возможно, приводит к активации трансглутаминазы, фермента, осуществляющего специфическое ковалентное связывание 5-НТ с белками. Показано, что у млекопитающих серотонилирование задействовано при длительном тоническом сокращении сосудов, циклическом выбросе инсулина из клеток поджелудочной железы, активации агрегации тромбоцитов (Walther et al., 2003, Paulmann et al., 2009). Таким образом, 5-HT участвует в реализации длительных, отставленных эффектов 5-НТ, выполняя в подобных регуляционных системах роль интегратора разнообразных физиологических процессов в организме. При этом существенное значение имеет баланс уровня 5-НТ внутри и снаружи клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Раннее развитие является важнейшей частью жизненного цикла, во время которой определяются координации между многими важными физиологическими процессами, происходящими в организме в течение всей его дальнейшей жизни. Серотонинергическая система (и ранние донервные нейромедиаторные системы в целом) является одним из возможных кандидатов на роль интегративного регулятора. В этом контексте, безусловно, важным является детальное изучение донервного 5-HT в развитии разных животных и дальнейший сравнительный анализ, как путь к пониманию интегративных механизмов в развитии.

В рамках данной работы нами были получены данные о присутствии и распределении 5-HT в дроблении морского двустворчатого моллюска, пресноводного брюхоногого моллюска, а также костистой рыбы. Было проведено исследование функционирования ферментов синтеза 5-HT, мембранного и внутриклеточного транспортера на последовательных стадиях донервного развития исследованных животных. Сравнительный анализ показал наличие значительного разнообразия как в распределении самого 5-HT, так и в функционировании ранних систем синтеза и транспорта 5-HT у разных животных. Подобные детальные исследования ранее не проводились.

Молекулярно-биологическое исследование экспрессии компонентов серотонинергической системы в зародышах костистой рыбы на ранних стадиях развития позволило сделать вывод о сходстве ранней серотонинергической системы рыб с другими позвоночными и беспозвоночными животными. Кроме этого, были обнаружены черты, характерные только для рыб. Эксперименты по фармакологической модуляции серотонинергической системы у костистых рыб показали отсутствие нарушений, сходных с выявленными у других животных при аналогичных воздействиях.

В процессе проведения фармакологического анализа было описано действие амфифильного вещества (хлорпромазина) как активатора эндоцитоза в бластомерах брюхоногого моллюска и костистой рыбы.

У брюхоногих моллюсков была обнаружена чувствительность ранних зародышей к повышению уровня 5-HT на строго определённых стадиях развития, установлен сезонный характер выявленной чувствительности. На основе обнаруженного феномена была разработана экспериментальная модель 5-НТР индуцированной экзогаструляции, давшая возможность исследовать существующие функциональные взаимосвязи между различными компонентами серотонинергической системы у брюхоногого моллюска. Анализ проведённых на основе этой модели экспериментов позволил выдвинуть гипотезу о роли баланса уровня 5-HT внутри и снаружи клеток, как регуляторного механизма на ранних стадиях развития.

В сумме, полученные нами данные о физиологии ранней серотонинергической системы позволяют сделать вывод о её модуляторной (т.е., не критической для морфологического или функционального развития частей зародыша, основных органов и их систем) роли на донервных стадиях эмбрионального развития исследованных животных. Нами была предложена и обоснована физиологическая роль 5-HT, как регулятора долговременных, отсроченных процессов в развитии.

Полученные результаты могут являться основой для дальнейших исследований с целью понимания особенностей функционирования и эволюции ранней донервной серотонинергической системы, её связи с 5-HT в центральной нервной системе, роли биогенных аминов как интеграторов не только на уровне нервной системы, но и жизненного цикла животных.

ВЫВОДЫ 1. 5-HT присутствует в дробящихся зародышах морского двустворчатого моллюска тихоокеанской мидии, пресноводного брюхоногого моллюска большого прудовика, а также костистой рыбы данио. У моллюсков и данио 5 HT равномерно распределён между дробящимися бластомерами в пределах зародыша. У данио 5-HT содержится в дробящейся части зародыша, в желтке 5-HT практиически отсутствует.

2. Все клетки дробящихся зародышей исследованных животных способны синтезировать 5-HT из непосредственного биохимического предшественника 5 HTP. Возможность синтеза 5-HT из триптофана у зародышей значительно варьирует, однако у всех исследованных животных подобный синтез представлен на ранних стадиях развития. У данио синтез 5-HT локализован в дробящейся части зародыша, но не в желтке.

3. Исследованные животные существенно отличаются по способности к захвату 5-HT отдельными клетками зародыша. Однако функционирование мембранного транспортера в большей или меньшей степени представлено на ранних стадиях у всех исследованных животных.

4. Молекулярно-биологические данные по экспрессии генов, кодирующих ферменты синтеза, транспорта и деградации 5-НТ, а также рецептора 5-HT 1Aa подтверждают эксперименты по анализу функциональной активности этих компонентов серотонинергической системы у костистых рыб.

5. Несмотря на активность систем синтеза и транспорта 5-HT, а также экспрессию генов, кодирующих соответствующие белки, нами не были выявлены значительные нарушения в раннем развитии исследованных костистых рыб, связанные со специфическим модулированием компонентов серотонинергической системы.

6. На основе разработанной модели 5-НТР индуцированной экзогаструляции исследованы взаимосвязи между компонентами серотонинергической системы в раннем развитии большого прудовика. Высказана гипотеза о роли баланса уровня 5-НТ внутри и снаружи клеток. Предложен молекулярный механизм, лежащий в основе долговременных отставленных эффектов 5-HT.

7. Анализ полученных нами данных о физиологии ранней серотонинергической системы позволяет сделать вывод о модуляторной роли 5-HT на ранних донервных стадиях развития у исследованных нами моллюсков и костистых рыб.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в журналах из списка ВАК, выделены жирным шрифтом.

1. Воронежская Е. Е., Ивашкин Е. Г. Пионерные нейроны: основа или ограничивающий фактор разнообразия нервных систем Lophotrochozoa? // Онтогенез. 2010. Т. 41(6). C. 403-413.

2. Ивашкин Е.Г., Воронежская Е.Е. Действие хлорпромазина на эндоцитоз в бластомерах зародышей большого прудовика Lymnaea stagnalis L. и вьюна Misgurnus fossilis L. // Биологические мембраны. 2011. Т. 28(4). C. 290-297.

3. Ивашкин Е.Г., Черданцев В.Г. «Морфогенетические последствия частичного удаления цитоплазмы бластомеров в раннем эмбриогенезе вьюна Misgurnus fossilis L. // Онтогенез. 2012. 43(3). 172-180.

4. Ivashkin E., Khabarova M., Voronezhskaya E. Serotonin transport and synthesis systems in invertebrate early development: functional analysis on Bivalve model. // Acta Biologica Hungarica. 2012. V. 63(Suppl. 2). P. 341–344.

5. Vekhova E., Ivashkin E., Yurchenko O., Chaban A., Dyachuk V., Khabarova M., Voronezhskaya E. 2012. Modulation of Mytilus trossilus (Bivalvia: Mollusca) larval survival and growth in culture. // Acta Biologica Hungarica. 2012. V. 63(Suppl. 2). P.

354–358.

6. Voronezhskaya E., Khabarova M., Ivashkin E. Delayed action of serotonin in molluscan development. // Acta Biologica Hungarica. 2012. V. 63(Suppl. 2). P. 336– 340.

7. Ivashkin E.G., Voronezhskaya Е.Е. Serotonergic system and the effects of neurotropic drugs at the early prenervous stages of teleost fish development. // 6th European Zebrafish Genetics and Development Meeting. Rome, Italy, 2009. P. 153.

8. Ivashkin E.G., Voronezhskaya E.E., Simplifying the simple: early development of mollusc and fish as a model for studying serotonergic system. // "Simpler Nervous Systems" (IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology).

St. Petersburg, Russia, 2009. P. 45.

9. Nikishin D.A., Ivashkin E.G., Mikaelyan A.S., Shmukler Yu.B. Expression of serotonin receptors during early embryogenesis. // "Simpler Nervous Systems" (IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology). St. Petersburg, Russia, September 9-13, 2009. P. 70.

10. Ивашкин Е.Г. Серотонинергическая система в раннем развитии костистых рыб. // Сборник материалов XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Секция «Биология», подсекция «Физиология человека и животных». – М.: МАКС Пресс, 2009. С. 256-257.

11. Ивашкин Е.Г. Возможные серотонин-активируемые пути регуляции раннего развития беспозвоночных и низших позвоночных. // Тезисы докладов ежегодной конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2009. Том 40, № 4. С. 309-310.

12. Ivashkin E.G., Khabarova M.Yu., Voronezhskaya E.E. The Early Serotonin: Inside, Outside and Inside Out. 12th International EMBL PhD Symposium. Heidelberg, Germany, 2010. P. 67.

13. Ивашкин Е.Г. Действие хлорпромазина на организацию мембран в дроблении водных животных. // Сборник материалов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Секция «Биология», подсекция «Цитология». – М.: МАКС Пресс, 2010. С. 300-301.

14. Ивашкин Е.Г. Серотонинергическая система в раннем развитии костистых рыб. // Тезисы докладов ежегодной конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез.

2010. Том 41, № 6. С. 469-470.

15. Фофанова Е.Г., Хабарова М.Ю., Ивашкин Е.Г. Развитие Mytilus trossilus при различной солености: изменение темпов роста личинок и уровня нейромедиаторов. // Тезисы докладов ежегодной конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез.

2010. Том 41, № 6. С. 453-454.

16. Ivashkin E.G., Khabarova M.Yu., Voronezhskaya E.E. Transmembrane 5-HT transport during early development of mollusks. // 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology.

Tihany, Hungary. 2011. P. 17. Voronezhskaya E.E., Khabarova M.Yu., Ivashkin E.G. Mechanism of delayed action of serotonin overproduction in early molluscan development. // 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology. Tihany, Hungary. 2011. P. 76.

18. Vekhova E., Ivashkin E., Yurchenko O., Dyachuk V., Khabarova M., Voronezhskaya E.

Neuronal modulation of larval growth in bay mussel Mytilus trossulus developed in various salinities. // 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology. Tihany, Hungary. 2011. P. 75.

19. Voronezhskaya E.E., Dyachuk V.A., Yurchenko O.V., Vekhova E.E., Khabarova M.Yu., Fofanova E.G., Ivashkin E.G. Serotonin and FMRFamide in regulation of development of the bay mussel Mytilus trossilus in various salinity conditions. // 9th Gttingen Meeting of the German Neuroscience Society. Gttingen, Germany, 2011. T19 7C.

20. Ivashkin E.G., Khabarova M.Yu., Voronezhskaya E.E. Transmembrane 5-HT transport during early development of mollusks. // 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology.

Tihany, Hungary, 2011. P. 21. Voronezhskaya E.E., Khabarova M.Yu., Ivashkin E.G. Mechanism of delayed action of serotonin overproduction in early molluscan development. // 12th Symposium on Invertebrate Neurobiology. Tihany, Hungary. 2011. P. 76.

22. Ивашкин Е.Г., 2011. Анцестральные механизмы функционирования ранней серотониновой системы: между мозгом и зародышем. // Сборник материалов второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» Санкт Петербург, Издательство Политехнического университета, Т. 3.С. 124-128.

23. Чабан А.К., Вехова Е.Е., Юрченко О.В., Ивашкин Е.Г., Хабарова М.Ю., Воронежская Е.Е. Онтогенетическая адаптация личинок мидии Mytilus trossilus (Bivalvia: Mytilidae) к широкому диапазону солености: роль нервной системы. // Сборник материалов второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» Санкт-Петербург, Издательство Политехнического университета. 2011. Т.

2. С. 338-340.

24. Фофанова Е.Г., Хабарова М.Ю., Ивашкин Е.Г. Развитие Mytilus trossilus при различной солености: изменение темпов роста личинок и уровня нейромедиаторов // Сборник Материалов IV Международной молодежной научной конференции «ЭКОЛОГИЯ – 2011». Секция «Проблемы изучения биоразнообразия». Архангельск.

2011. С. 78.

25. Ивашкин Е.Г., Хабарова М.Ю., Воронежская Е.Е. Баланс серотонина внутри и снаружи клетки: новый регуляторный механизм в раннем развитии моллюсков? / Тезисы докладов ежегодной конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез.

2011. Том 42, № 5. С. 326.

26. Ivashkin E.G., Adameyko I.I., Kharchenko O.A., Khabarova M.Yu., Voronezhskaya E.E. Serotonin inside and outside the cell during prenervous stages is essential for correct development and juvenile behavior. // 10th Gttingen Meeting of the German Neuroscience Society. Gttingen, Germany, 2013. T4-2A 27. Ивашкин Е.Г., Воронежская Е.Е. Серотонин как интегративный фактор раннего развития водных животных. // Сборник материалов первой международной конференции «Stress and Development: Neurophysiologycal and Neurochemical Aspects».

Баку, Азербайджан. 2013. С.49-50.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5-HT – серотонин, 5-гидрокситриптамин (5-hydroxytryptamine);

5-HTP – 5-гидрокситриптофан (5-hydroxytryptophan), непосредственный биохимический предшественник серотонина;

VMAT – везикулярный моноаминовый транспортер;

SERT – мембранный серотониновый транспортер;

MAO – моноаминоксидаза;

TPH – триптофангидроксилаза;

cAMP, цАМФ – циклический аденозинмонофосфат;

ЭГ – экзогаструляция;

a.u. – arbitrary units, относительные единицы интенсивности флуоресценции.

Благодарности Автор выражает благодарности и сердечную признательность дорогому научному руководителю Елене Евгеньевне Воронежской, а также О. Харченко, А. Микаэляну, Д. Никишину, П. Ерохову, Е. Фофановой, Л. Незлину, М.

Хабаровой (ИБР РАН), М. Костыревой, А.В. Сахаровой, А. Шабалиной (НЦ Неврологии РАМН), Г. Маркевичу, М. Логачёвой, А. Шварцу (МГУ им М.В.

Ломоносова), М. Кулаковой (БиНИИ СПбГУ), I. Battonai, K. Elekes, Z. Fekete (BLKI HAS), В. Дячуку Е. Веховой, О. Юрченко (ИБМ ДВО РАН), И. Адамейко (Karolinska Institute) за советы и неоценимую помощь на разных этапах работы.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.