авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Эпителио-мезенхимальная пластичность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в норме и патологии (эксперимнтальное исследование)

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

САБУРИНА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЭПИТЕЛИО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ

МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ

КЛЕТОК В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

(ЭКСПЕРИМНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03. – патологическая физиология

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2010 1

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии и патологии развития УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук.

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Репин Вадим Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна Доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Лищук Александр Николаевич Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский Университет

Защита диссертации состоится « _» 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РМАН по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан «» _2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С середины XX века сформировалась концепция, что все органы и ткани млекопитающих и человека способны к физиологической и репаративной регенерации [Полежаев Л.В., 1968;

Саркисов Д.С., 1970]. Поддержание общей численности (физиологический гомеостаз) клеток в здоровом органе является универсальным механизмом. Показано, что каждый орган имеет свой ритм обновлений (около 7 дней для полного обновления кишечного эпителия, несколько месяцев - эндотелия артерий, 4-8 месяцев – миофибрилл в мышечном волокне, 4-6 месяцев – гепатоцитов в ацинусе, несколько лет - гиппокампа головного мозга). Однако, полноценная регенерация поврежденных взрослых тканей при разной патологии часто невозможна. Остатся неизвестным, почему при средних и крупных повреждениях дефинитивных тканей не мобилизуются и не принимают участие в репарации собственные локальные запасы региональных стволовых клеток (РСК), а наблюдается патологическая репарация (фиброз) в ответ на повреждение.

Известно, что атеросклеротическая фиброзная бляшка – характерный пример патологической репарации, запускаемой активированной соединительной тканью сосуда [Versari D. et al., 2007;

Shantsila E. et al., 2007]. Другой пример патологической репарации – это острый или хронический цирроз печени, при котором стромальные клетки синусоидов инициируют фиброз в виде активно пролиферирующей рубцовой ткани из матрикса и миофибробластов.

Это ведет к портальной гипертензии и печеночной недостаточности [Schuppan D., 2008;

Atzori L. et al., 2009]. Различные повреждения миокарда ведут к активации интерстициальных фибробластов, формированию избытка фиброзной ткани, кардиосклерозу, что множественными путями снижает функциональные характеристики миокарда [Weber K. et al., 1989]. Нервная ткань в ответ на повреждение также формирует глиальный рубец. Однако патогистологическое исследование тканей не дает ответа на вопрос о возможности преодоления патологических процессов при репарации.

Изучение репарации повреждений тканей и органов в норме и при патологии требует разработки новых клеточных моделей in vitro.

Сравнительно недавно эксплантаты поврежденной соматической ткани, а также 2D/3D культуры с модельными дефектами стали использовать для изучения вклада локального эпителия и мезенхимы, а также локальных и циркулирующих стволовых клеток в репаративные процессы. Накопленные предварительные данные показали множественные механизмы и пути участия соматических и стволовых клеток в репарации повреждений.

Остается актуальным вопрос, почему эпителио-стромальные резервы тканей и органов взрослых организмов не дают полноценной регенеративной ткани без фиброза.

В последнее время показано, что локальная и системная трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) ускоряет процессы репарации в поврежденных органах и тканях. Например, трансплантация ММСК из костного мозга в зону глубокого кожного повреждения блокирует избыточное образование фиброзной ткани и формирование рубца в очаге повреждения [Smith A.N. et al., 2009;

Falanga V., 2009]. Введение ММСК в кровоток блокирует формирование мелких и средних хронических повреждений эндотелия и способствует реэндотелизации крупных повреждений [Devanesan A.I. et al., 2009]. Кроме того, трансплантация ММСК оказалась эффективной при лечении хронической и подострой печеночной недостаточностии сахарного диабета I и II типа [Онищенко Н.А. с соав., 2009]. Однако, до сих пор остаются не изученными механизмы репарационных эффектов ММСК в органах при разной патологии.

Показано, что ММСК способны направленно находить мелкие и средние повреждения in vivo [Anjos-Afonco F. et al., 2004], что указывает на возможность их участия в клеточной репарации [Kopen J.C. et al., 1999;

Ortiz L.A. et al., 2003]. В зоне повреждения разных соматических тканей ММСК способны пролиферировать и дифференцироваться в разных направлениях под влиянием локальных сигналов микроокружения [Devine S.M. et al., 2003]. Однако, остается неизученным вопрос, могут ли ММСК влиять на равновесие и границы между эпителием и стромой органа, снимать блок реэпителизации и запускать процессы репаративной регенерации, и каков вероятный механизм этого процесса. Первые исследования в этом направлении показали, что циркулирующие в кровотоке ММСК с высокой эффективностью опознают мелкие эпителиальные повреждения, в зоне которых адгезированные ММСК приобретают эпителиальный статус и участвуют в репарации [Prockop D.J., 2009;

Syn W.K. et al., 2009]. В свете изложенного представляется целесообразным разработка новых подходов и создание новых моделей для изучения механизмов репарационного действия ММСК в организме в норме и патологии.

Разрабатываемая в нашей лаборатории концепция пластичности ММСК дала основание предположить, что мультипотентные стромальные клетки in vitro и in vivo могут формировать устойчивые эпителио-мезенхимальные модули, в которых клетки находятся в двух устойчивых эпигенетических состояниях [Репин В.С. и др. 2006;

Сабурина И.Н. и др. 2009;

Zipori D. 2004, 2009]. Возможно, пластичные эпителио-мезенхимальные сфероиды могут одновременно служить донорами эпителия/стромы в зонах повреждения, когда процесс реэпителизации ограничен.

Таким образом исследование условий образования и культивирования стромальных сфероидов позволит создать новую модель для изучения эпителио-мезенхимальной пластичности клеток in vitro и с новых позиций рассмотреть клеточные механизмы регенерации и репарации поврежденных органов и тканей, и поэтому представляется актуальным, научно и практически значимым.

Цель исследования. Изучить условия образования эпителио мезенхимальных сфероидов из ММСК, в первичной культуре диссоциированных клеток и культуре эксплантатов фетальной и взрослой ткани. Изучить эффективность трансплантации ММСК при повреждении эпителио-стромальных тканей в условиях эксперимента.

Обосновать вклад эпителио-мезенхимальной пластичности ММСК и сфероидов в репарацию повреждений в норме и при патологии.

Задачи исследования.

1. Изучить формирование репаративных сфероидов в культуре миниэксплантатов фетальных тканей (головного мозга, миофибрилл, тонкой кишки, сетчатки) и тканей и органов взрослого организма (миофибрилл, тонкой кишки, сетчатки).

2. Получить и изучить сфероиды из первичных культур здоровых органов и тканей (стромальных клеток жировой ткани, пупочного канатика, сетчатки, миобластов, дермальных фибробластов).

Изучить индуктивную роль поврежденных микроэксплантов в 3D агрегации клеток.

3. Изучить эпителио-мезенхимальную пластичность клонов ММСК в 2-D культуре.

4. Разработать воспроизводимую модель 3D культивирования ММСК;

изучить полученные сфероиды ММСК на жизнеспособность, экспрессию мезенхимальных и эпителиальных маркеров;

изучить эпителио-мезенхимальную пластичность клеток in vitro.

5. На известных моделях животных с экспериментальной патологией изучить пути участия ММСК, соматических клеток в репарации повреждений при системном и локальном введении. Параллельно проверить возможность формирования репарационных сфероидов в зонах повреждений.

6. Обобщить полученные результаты и обосновать новые представления о роли сфероидов в репарации взрослых тканей в норме и при патологических процессах.

Научная новизна. Впервые отработана оригинальная методика получения ММСК человека в стабильном эпителио-мезенхимальном статусе в 2-D и 3-D культуре. Эта технология позволяет наращивать стромальные мезенхимальные стволовые клетки человека в виде лабораторных репаративных модулей с регулируемым соотношением эпителий/строма. Прогениторные клетки в сфероидах становятся непосредственными предшественниками эпителия и стромы в зоне повреждений ткани. За счет эпителио-мезенхимальной пластичности сфероиды могут стать донором эпителия, одновременно блокируя фиброз.

Эпителио-мехенхимальные сфероиды были также получены из ферментативно диссоциированных соматических клеток разных органов и тканей (первичные культуры РСК пупочного канатика, подкожной жировой ткани, скелетных мышц, нейральных стволовых клеток).

Подтверждена способность поврежденных нормальных фетальных и взрослых тканей и органов формировать репаративные агрегаты (сфероиды) в культуре изолированных мини-эксплантатов.

Трансплантация ММСК и миобластов (МБ) человека в скелетную мышцу mdx- линии мышей приводила к новообразованию дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения (преимущественно в раневом канале). Миграцию миобластов и ММСК наблюдали в течение первых 6 часов после введения.

При трансплантации нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) и ММСК человека крысам с ишемическим повреждением головного мозга наблюдали ограниченную, в течение первых 6 часов миграцию ММСК на незначительное расстояние с образованием новых капилляров вокруг зоны введения. НСПК при трансплантации сохраняют способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию.

Внутриартериальная трансплантация ММСК человека приводила к частичной репарации островковой ткани поджелудочной железы с улучшением показателей эндокринного статуса. После трансплантации наблюдали восстановление почечных гломерул.

Предложена гипотеза, что эффективность трансплантаций ММСК при повреждении как эпителиальных, так и соединительных тканей объясняется феноменом их эпителио-мезенхимальной пластичности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые описаны лабораторные условия и протокол получения сфероидов из незрелых ММСК с автоматической обратимой конверсией стромальных клеток в эпителий. До сих пор способность к спонтанной обратимой эпителио-мезенхимальной конверсии клеток была описана в трех тканях зародыша: примитивной полоске, узелке и нервном гребне.

Вторым важным источником репаративных сфероидов являются мини-экспланты поврежденных фетальных тканей и органов. Третьим источником репаративных сфероидов могут служить диссоциированные клетки от взрослых тканей и органов.

Добавленные мини-экспланты поврежденной ткани служат «катализаторами» образования репаративных сфероидов со смешанным эпителио-мезенхимальным фенотипом. Клетки в сфероидах формируют интенсивные межклеточные контакты и ограниченно синтезируют фрагменты базальной мембраны. Сфероиды являются первичной регенерационной тканью. Полученные по данной методике сфероиды могут быть использованы как модель многофункциональных модулей для фундаментальных исследований в изучении клеточных механизмов физиологической регенерации и репарации в ответ на повреждения органов и тканей.

Полученные данные имеют также существенное значение для транспланталогии и клинической медицины, подсказывая пути создания более оптимальных «репарационных модулей» на базе первичных сфероидов млекопитающих и человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изолированные ММСК костного мозга, фетальных и взрослых эксплантатов, а также первичных культур взрослых органов и тканей способны формировать сфероиды в 3D культуре с ограниченной способностью к синтезу экстрацеллюлярного матрикса.

2. В формирующихся сфероидах активно идет обратимая мезенхимо эпителиальная конверсия незрелых клеток, сопровождающаяся экспрессией ранних генов гаструлы.

3. Эффективность клеточных трансплантаций мультипотентных мезенхимальных клеток при различных повреждениях объясняется эпителио-мезенхимальной пластичностью 3D -модулей. В патологических тканях формирования репаративных сфероидов.не наблюдается.

Апробация работы проведена на межлабораторной конференции УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Основные положения диссертации были многократно доложены на международных научных конгрессах и конференциях, в том числе на конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, 1998), Международном междисциплинарный семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Словакия, Татры, 2003), II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук» (Москва, 2006), Британско-Российском Конгрессе по проблемам изучения стволовых клеток (Москва, 2007), III и V Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2009), Международном научном симпозиуме «Стволовые клетки, перспективы применения» (Австралия, Сидней, 2007), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Федоровские чтения – 2008» (Москва, 2008), Международном симпозиуме «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки:

экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (Тула, 2009), IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии»

(Санкт-Петербург, 2010), Международном симпозиуме «Стволовые клетки в биологии и медицине» (Португалия, Лиссабон, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 работ ( статей, 1 монография, получено 8 Российских патента и Международных патента, 19 тезисов докладов).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает источников, из них 135 – отечественных и 281 – зарубежных авторов.

Диссертация иллюстрирована 70 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Клеточные культуры Для получения первичной культуры мультипотентных мезенхимальныx стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека мононуклеарную фракцию клеток изолировали из костного мозга здоровых доноров градиентным центрифугированием с фиколлом. ММСК животных выделяли из красного костного мозга большеберцовых и бедренных костей GFP+ и GFP– мышей по стандартному протоколу (Schrepfer et al. 2007). Разрезали кожу, тщательно отсепаровывали большеберцовые и бедренные кости, отрезали эпифизы и инсулиновым шприцем, заполненным средой МЕМ с добавлением L-глутамина 2мМ и гентамицина 50мкг/мл, извлекали строму костного мозга, промывая полость кости.

Полученные суспензии центрифугировали в течение 7 мин при об/мин, после чего супернатанты сливали, осадки ресуспендировали в ростовой среде (-MEM, 17 % FBS, L-глютамина (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин). Клетки высевали с высокой плотностью (1105 клеток/см2) в чашки Петри.

Для получения первичной культуры стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) животных и человека использовали общепринятый метод [P. Zuk., et al. 2001]. Выделенные у животных из области нижней части живота фрагменты ткани подкожного жира и полученные в процессе хирургической операции с добровольного согласия пациентов фрагменты подкожной жировой ткани человека в стерильных условиях механически измельчали до получения суспензии мелких фрагментов, дезагрегировали в растворе коллагеназы I типа (0,07%) и диспазы (0,025%) в течение 25-30 мин. В полученный раствор c ферментами и оставшимися фрагментами ткани добавляли полную ростовую среду и центрифугировали в течение мин при 1000 об/мин, после чего супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12 (1:1), L глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FCS (Fetal Clone Serum) и пропускали через нейлоновый фильтр. Клетки высевали в чашки Петри в высокой плотности.

Для получения первичной культуры стромальных клеток пупочного канатика человека (СКПК) полученные фрагменты пупочных канатиков размером 1-2см тщательно промывали раствором Хенкса с антибиотиками, измельчали механически с помощью ножниц, дезагрегировали в растворе коллагеназ I и IV типа (0,07%) в соотношении 1:1 в течение 6 часов, добавляли среду для культивирования и пропускали через алюминиевую сеточку (размер пор 1мм2). Затем центрифугировали в течение 7 мин при 1000 об/мин, после чего супернатант сливали, осадок ресуспендировали в ростовой среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением L-глютамина (2мМ), гентамицина (50мкг/мл), ИТС (1:100) и 10% FCS и высевали на чашки Петри в конценрации 5104-6104 клеток/см2.

Первичные культуры миобластов (МБ) человека и животных получали по единой методике. Полученные в процессе хирургической операции с добровольного согласия пациентов фрагменты мышечных волокон механически измельчали с помощью ножниц, дезагрегировали с помощью раствора диспазы (0,5%) в течение мин. В полученный раствор добавляли ростовую среду и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, после чего супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12 (1:1), L-глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, 20% FCS (Fetal Clone Serum), FGF (10нг/мл). Клетки высевали в чашки Петрив конценрации 5104- клеток/см2.

Далее все культуры помещали в стандартные условия СО2– инкубатора (5% СО2, 100% влажности), через 24 часа отмывали раствором Хенкса, среду меняли на свежую. В дальнейшем среду меняли через 48 часов, пассируя культуры при достижении 70% конфлюентности. Рост и состояние культивируемых клеток контролировали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах, фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Для проведения экспериментов использовали клетки 2 пассажа.

Для выделения нейральных стволовых и прогениторных клеток (НСПК) животных и человека использовали головной мозг эмбрионов мышей 14 дней развития и головной мозг человека недель развития (обортивный материал). После освобождения от мозговых оболочек головной мозг помещали в ростовую среду, механически дезагрегировали с помощью пипетки до получения однородной клеточной суспензии и центрифугировали в течение мин при 800 об/мин. Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в среде культивирования (DMEM/F12 (1:1), L глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, FGF (10нг/мл), EGF (10нг/мл), B27 (1:100), N2 supplement (1:100), 2% FCS). Клетки высевали в чашки Петри в концентрации 1106-2106 клеток/см2.

Культуру помещали в стандартные условия СО2 –инкубатора (5% СО2, 100% влажности). Через 3 дня суспензию образовавшихся агрегатов центрифугировали 5 мин при 600 об/мин, супернатант осторожно оттягивали пипеткой, добавляли свежую ростовую среду и продолжали культивировать, меняя среду через каждые 48 часов, пассируя культуру при достижении монослоя. Для дальнейших экспериментов использовали клетки 2 пассажа.

Исследование клоногенности клеток. Клеточные культуры высевали с плотностью 1-5 кл/см2. Через 2 недели клетки отмывали и инкубировали в 1% растворе кристаллвиолета в метаноле. После чего чашки промывали водой и подсчитывали колонии с диаметром более 1 мм.

Иммуноцитохимия. Культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Затем инкубировали с антителами к нестину (1:20;

Biogentsis), виментину (1:10;

V2258;

Sigma), десмину (1:100;

Biotrend), -ГМА (1:200;

Chemicon), миозину (1:200;

Chemicon), коллагену I типа, коллагену III типа, коллагену IV типа (1:100;

2003605;

Chemicon), GFAP (1:250;

DAKO), -тубулину (1:100;

Abcam), PODXL (1: 1000;

R&D systems), 6-интегрину (1: 250;

MP4F10;

R&D systems), 4-интегрину (1:200;

44H6;

Abcam), c-Met (1: 250;

clone 95309;

R&D systems), а затем с несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, Alexa-594 or Alexa-488, 1:200, FITC;

Invitrogen).

Проточную цитометрию проводили на цитометре FACScalibur (BD Biosciences) с программным обеспечением CellQuest.

Прибор стандартизовали при помощи микрогранул (7, 10, 15 и микрон Dynosphere Uniform Microspheres;

Bangs Laboratories Inc.;

Fisher scientific). Для исследования клеточные культуры инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 1% бычьего альбумина и первичные антитела, а затем, при необходимости, с вторичными антителами.

Наличие хромосомных обераций в клеточных культурах проверяли методом сравнительной геномной гибридизации, основанном на одновременной гибридизации двух различно меченных библиотек ДНК, одна из которых выделена из анализируемой ткани, а другая – из кариотипически нормальной и является контролем.

Исследования были выполнены на базе лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН под руководством н.с.

Черемных А.Д.

Культивирование миниэксплантатов тканей.

Предоставленные после хирургических операций фрагменты тканей измельчали механически с помощью ножниц до мелких (1 3мм) кусочков, которые помещали в чашки Петри в ростовую среду и культивировали в течение 2 недель. Состав ростовой среды соотвентствовал среде, которую использовали для культивирования диссоциированных первичных культур, полученных из этих тканей.

2. 3D культивирование ММСК, СКЖТ и СКПК Для получения клеточных сфероидов использовали метод «висячая капля». Монослойные клеточные культуры 2 пассажа снимали с чашек отмывая от среды раствором Версена и обрабатывая затем 0,25% раствором трипсина, подсчитывали количество клеток в суспензии в камере Горяева, центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде, чтобы конечная концентрация клеток составляла 5104–6, клеток/мл. Для получения «висячих капель» из полученной суспензии на крышку 90-мм чашки Петри (Corning) наносили капли объемом 30мкл, для предотвращения испарения в чашку добавляли 5-6 мл полной ростовой среды. Клетки культивировали в «висячих каплях» в стандартных условиях СО2 –инкубатора (5% СО2, 100% влажности) в течение 6 суток.

Для изучения динамики включения клеток в состав сфероидов:

1) получали смешанные агрегаты СКЖТ GFP+ и СКЖТ GFP- и ММСК GFP+ и ММСК GFP- в соотношении 1:1;

2) к формирующимся и уже сформированным сфероидам СКЖТ GFP- и ММСК GFP- на 3 и 6 сутки добавляли суспензию клеток ММСК GFP+ в соотношении 1: и продолжали культивирование в течение 3 суток. Отдельные сфероиды после 6 суток культивирования в «висячих каплях»

помещали на пластик, обработанный ламинином, фибронектином, коллагеном I и IV типа, получая вторично прикрепленные культуры.

Для иммуноцитохимического исследования 3D культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Инкубировали с антителами к нестину (1:20;

Biogentsis), виментину (1:10;

V2258;

Sigma), -ГМА (1:200;

Chemicon), коллагену I типа, коллагену IV типа (1:100;

2003605;

Chemicon), ламинину (1:100;

Chemicon), СК18 (1:100;

RAHC44;

ИМТЕК), а затем с несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, Alexa-594 or Alexa-488, 1:200, FITC;

Invitrogen). Докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид (Hoechst 33258, Sigma) 3D культуры анализировали с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) Axiovert 200M с лазерной конфокальной приставкой LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) и Leica TCF SPE (Leica, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах, фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия).

Регистрацию и обработку изображений вели с помощью программ AxioVision, LSM и LAS AF.

Жизнеспособность 2D и 3D культур оценивали c использованием трипанового синего (0,4%, 2-3 мин, 25оС) и иодида пропидия (1,7мкмоль/мл, 15мин, 25оС) по стандартным протоколам.

Трансмиссионное и сканирующее электронномикро скопическое исследование.

Сфероиды фиксировали глютаровым альдегидом (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, pH=7,3;

1-2 часа), дофиксировали OsO (1% раствор на 0,1М какодилатном буфере, 1,5часа), отмыввли от OsO4 в 0,1М чистом какодилатном буфере, вновь помещали агрегаты в глютаровый альдегид (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, pH=7,3) и хранили при 4оС. Отмытые от фиксатора в растворе 0,1М какодилатного буфера (pH=7,3) сфероиды проводили по спиртам (40С, 50С, 70С, 96С, 100С) по 3-5 минут в каждом растворе. После этого осуществляли сушку препаратов в ацетоне в критической точке для дальнейшего исследования на сканирующем электронном микроскопе. Для трансмиссионного исследования сфероиды обезвоживали в ацетоне и сутки инкубировали при комнатной температуре в смеси ацетона и смолы (3:1). На следующий день переносили в чистую эпоновую смолу и оставляли на сутки при 37С и на 2 суток при 58С. Полученные блоки резали на ультратоме «Tesla» серийно (толщина среза 1-2 мкм), до максимального диаметра клеточного агрегата. Полутонкие срезы окрашивали 0,5% раствором толуидинового синего в 1% растворе буры по стандартной методике (Детлаф и др., 1974) и фоторегистрировали в видимом световом диапазоне под микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с помощью цифровой камеры AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия).

Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB- (Швеция), окрашивали в 1% растворе уранилацетата и свинцом по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные препараты изучали с помощью электронного трансмиссионного микроскопа JEM-100B.

3. Исследование поведения ММСК и НСПК при инъекции в органотипическиую культуру сетчатки.

Сетчатку выделяли из энуклеированных глаз новорожденных ( дня) крыс Wistar после декапитации (по протоколу Kretz A., 2007), промывали раствором Хенкса с антибиотиками и помещали в культуральную чашку с полной ростовой средой (DMEM/F12 (1:1), L глутамин (2мМ), 1% пенициллин-стрептомицин, FGF (10нг/мл), EGF (10нг/мл), B27 (1:100), N2 supplement (1:100), 5% FCS), меняя среду через каждые 48 часов Клетки (ММСК GFP+ и НСПК GFP+ ) инъецировали ( 500-1000 клеток/0,1 мкл) на 10 сутки культивирования стеклянным капилляром диаметром 30 мкм при помощи микроинъекционной приставки под бинокуляром Olimpus CZX 20 и продолжали культивировать в течение 6 суток. Для прижизненного наблюдения за поведением инъецированных клеток применяли метод конфокальной микроскопии на микроскопе Lieca TCS SPE с прграммным обспечением Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF). Для иммуногистохимического анализа использовали виментин (1:10;

V2258;

Sigma), GFAP (1:250;

G9269;

Sigma), тубулин (1:100;

MAB1637;

Chemicon) c последующим использованием вторичных антител Texas read, Cy2.

4. Экспериментальные исследования на животных Трансплантацию МВ и ММСК в скелетные мышцы мыши проводили на лабораторных мышах линий ICR (самцы возраста 2-2, мес., n=55) и С57ВL/10J-mdх (muсulаг dystгophy X-chгomosome linked, самцы возраста 4-6 мес., n=29), Для визуализации клетки перед трансплантацией окрашивали флуоресцентным красителем бисбензимид (Hoechst 33258, Sigma). Мышей наркотизировали внутрибрюшинным введением калипсола (500 мг/10мл;

Гедеон Рихтер АО, Венгрия) в расчете 0,004 мл на 1 грамм массы животного. В поверхностную и среднюю ягодичные мышцы (m. glutaeus superficialis, m. glutaeus mеdius) с помощью гамильтоновского шприца вводили МВ и ММСК в разведении 500 тыс. клеток в 1 мкл на глубину 2-3 мм. Проводили 5 инъекций на растоянии3-5 мм друг от друга. Общее количество введенных клеток составило 2, клеток/5мкл. Контрольной группе равный объем 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Через 30 минут, 2, 4, 6 и 18 часов, 21 и суток после проведенной операции мышей умервщляли, диссектировали ягодичную мышцу, замораживали в жидком азоте и готовили серийные криостатные срезы толщиной 10-15 мкм, которые высушивали при комнатной температуре и просматривали под люминесцентным микроскопом. По люминесцентному свечению клеток, окрашенных бисбензимидом, отбирали срезы с трансплантированными клетками, которые инкубировали с моноклональными антителами мыши к дистрофину человека (1:100;

Аbсаm) в течение 2 часов при 370с и с антимышиными иммуноглобулинами козы, конъюгированными с фикоэритрином (1:100;

Аbсаm).

Эксперименты по трансплантации НСПК и ММСК выполняли на крысах самцах линии Wistar 2 месячного возраста с моделью локальной ишемии головного мозга. Моделирование проводилось путем дистальной окклюзии левой средней мозговой артерии (ипсилатеральное полушарие) согласно методике, предложенной Chen (Chen S.T., 1986). Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением калипсола (500 мг/10мл;

Гедеон Рихтер АО, Венгрия) в расчете 0,004 мл на 1 грамм. Клетки, предварительно окрашенные бисбензимидом (Hoechst 33258, Sigma), в концентрации 2105 клеток в 4 мкл стереотаксически трансплантировали в область бокового желудочка противоположного (контралатерального) полушария. Через 6 часов, 10 и 20 суток животных перфузировали транскардиально 4% параформом на 1 М фосфатном буфере рН 7,3, извлекали мозг, помещали на сутки в фиксатор, затем в 30% сахарозу и готовили криостатные срезы (20-40 мкм). Срезы просматривали под люминесцентным микроскопом. По люминесцентному свечению клеток, окрашенных бисбензимидом, отбирали срезы с трансплантированными клеткамии, которые окрашивали крезилвиолетом или иммуногистохимически антителами к нестину (1:20;

Biogentsis), виментину (1:10;

V2258;

Sigma), GFAP (1:250;

-тубулину (1:100;

Abcam),а затем несущими DAKO), флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, Alexa-594 or Alexa-488, 1:200, FITC;

Invitrogen).

Трансплантация ММСК животным с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета проводилась на самцах иммунодефицитных мышей линии NOD/scid (NOD.CB17 Prkdcscid/J;

The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) в возрасте 7- недель. Для моделирования стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета мыши ежедневно с 1 по 4 сут эксперимента получали иньекции 35мг/кг стрептозотоцина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), растворенного в цитратном буфере. Мышей наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, после чего внутриартериально вводили суспензию клеток инсулиновым шприцем в концентрации 1-3* клеток в 150 мкл.

Для гистологического исследования поджелудочная железа фиксировалась формалином, затем раствором сахарозы, образец ткани заливался криопротектором (Tissue-Tek OCT Compound;

Sakura Finetek, Torrance, CA) и подвергался быстрой заморозке в изопентане на сухом льду. Затем на криостате изготовлялись срезы 5-8 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином (H&E, Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA). Образцы почечной ткани фиксировались формалином в нейтральном буфере, затем раствором сахарозы, заливались парафином, и производились срезы толщиной мкм, которые окрашивали реакцией ШИК (PAS, Richard-Allan Scientific). Для иммуногистохимического исследования образцы тканей заливали криопротектором и замораживали в изопентане, на сухом льду. Изготовленные на криостате срезы (5-10 мкм) окрашивали антителами к человеческому 2-микроглобулину (1:200;

Roche, Switzerland), антигенам ядер человеческих клеток (1:200;

clone 235-1;

Chemicon, Temecula, CA, USA), человеческому инсулину (1:40;

clone E2E3C2;

Calbiochem, San Diego, CA, USA), мышиному инсулину (1:50;

clone 182410;

R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), мышиному/человеческому PDX-1 (1:50;

clone 267712;

R&D Systems), мышиному/человеческому CD31 (1:500;

clone MEC 13.3;

BD Biosciences, San Jose, CA, USA), а затем видоспецифическими вторичными антителами (1:1000;

Alexa-594 or Alexa-488;

Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Во всех экспериментах для контроля срезы окрашивали только вторичными антителами.

Препараты исследовали на микроскопе Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) Axiovert 200M с лазерной конфокальной приставкой LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) и Leica TCF SPE (Leica, Германия) в видимом и ультрафиолетовом диапазонах, фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Регистрацию и обработку изображений вели с помощью программ AxioVision, LSM и LAS AF.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика первичных клеточных культур.

Культура стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ).

Суспензия клеток, полученная после выделения, гетерогенна, в ней присутствуют клетки сосудистого эндотелия, фибробласты фибробластоподобные клетки, макрофаги, перициты, гладкомышечные клетки. При культивировании на селективной среде остается фракция стромальных клеток, характеризующаяся высокой жизнеспособностью, пролиферативной активностью и экспрессией маркеров к CD34 (0,31%), CD 45 (0,8%), CD 105 (99,1%), CD49b (1,54%), CD90 (40,69%), CD44 (95%) HLA-ABC (89,18%), CD (0,66%). Кроме того, СКЖТ способны формировать колонии при рассеве клеток в низкой плотности (100 кл. на 1см3), что характеризует их как клоногенную культуру. Иммуноцитохимическое исследование выявило в СКЖТ экспрессию нестина, виментина и актина (рис. 1, цветная вставка 1). Сохранение стабильности кариотипа при культивировании было показано с помощью метода сравнительной геномной гибридизации.

Культура стромальных клеток пупочного канатика (СКПК).

В процессе культивирования визуально идентифицированы два вида клеток: «классические» фибробласты, имеющие крупное, распластанное по пластику культуральной чашки тело и клетки меньшего размера с длинным веретеновидным телом (Рис. 2.А).

Соотношение этих двух типов клеток в культуре менялось в процессе культивирования. В начале культивирования преобладали клетки первого типа, после второго пассажа – второго (Рис. 2Б).

А Б В Рис. 2. Культура СКПК человека: А – СКПК (0 пассаж), треугольные стрелки – клетки I типа, вытянутые;

– клетки II типа;

Б – СКПК (2 пассаж);

В – образование колонии из СКПК. Фазово-контрастная микроскопия.

При рассеве клеток в низкой плотности (5-10 кл. на 1см3) формировались колонии из мелких стромальных клеток (Рис. 2В).

Полученные культуры стромальных клеток экспрессировали CD44, CD105, CD90, виментин, фибронектин, коллагены I и IV типа, не экспрессировали CD34 и CD45 (Рис. 3, цветная вставка 1) и сохраняли высокую пролиферативную активность и жизнеспособность. Методом сравнительной геномной гибридизации было показано отсутсвие хромосомных обераций как на 2, так и на более поздних пассажах.

Культура миобластов человека (МБ).

Выделенные миобласты прикреплялись к пластику культуральной чашки в течение первых 12 часов. Учитывая разную скорость прикрепления клеток к подложке, а также подобранные для культивирования МБ селективные среды уже на втором пассаже получали чистую культуру, содержащую более 90% МВ (рис. 4Б). При рассеве клеток в низкой плотности наблюдалось формирование колоний из мелких стромальных клеток. Культура также характеризовалась высокой жизнеспособность и пролиферативной активностью.

А В Б Рис. 4. Культуры МВ человека: А – непассированная культура, ув 10;

Б – культура МВ (2 пассаж), ув.10;

В - образование симпластов и миотубов, 26 день культивирования, ув.10. Фазово-контрастная микроскопия.

Миобласты экспрессировали десмин и миозин и не экспрессировали коллаген I и коллаген III (рис. 4Г,Д, цветная вставка 1). При длительном культивировании в высокой плотности без пассирования при тех же условиях культивирования миобласты спонтанно формировали симпласты и миотубы (рис. 4В).

Культура нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК).

Первичные суспензии НСПК в селективной среде формировали агрегаты и нейросферы, которые в процессе культивирования постепенно увеличивались в размерах (рис. 5А). На первом пассаже нейросферам давали прикрепиться к подложке культуральных чашек, и дальнейшее культивирование вели в виде адгезивной культуры (рис.

5Б, 5В).

В А Б Рис. 5. Первичная культура НСПК человека (11 нед.): А – первичная суспензионная культура НСПК, 4 день культивирования, ув.4;

Б – НСПК, 1 пассаж, ув.10;

В – адгезивная культура НСПК, 2 пассаж, ув 10.

Фазово-контрастная микроскопия.

Результаты иммуногистохимического исследования показали, что НСПК, формирующие первичные агрегаты и нейросферы более гетерогенны по своему клеточному составу. Наряду с истинно стволовыми клетками (нестинположительными) и прогениторными клетками (виментинположительными), в них находятся дифференцирующиеся клетки, (экспрессирующие GFAP и бета тубулин). Адгезивные культуры менее гетерогенны, 80% культуры представлено нестинположительными клетками, 40%-50% виментинположительными клетками и только 10%-20% приходится на дифференцирующиеся клетки (рис. 5Г, 5Д, цветная вставка 1).

Проведенное исследование первичных культур показало, что подобранные условия выделения и культивирования позволяют получать культуры РСК с высоким содержанием стволовых и прогениторных клеток, которые могут принимать участие в регенерационных и репарационных процессах.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК).

В результате проведенных исследований была модифицирована технология получения ММСК костного мозга. Был разработан оптимальный протокол культивирования ММСК в низкой плотности (нпММСК), направленный на получение максимально возможного количества клеток из одного биоптата костного мозга человека с сохранением высокого качества культуры. При начальной плотности посева – 100 клеток/см2 на 5 сут после пассажа получали культуру нпММСК с конфлюентностью 50%-60% и выходом клеток - 4000 6000 клеток/см2. На 9 сут после пассажа получали культуру с конфлюентностью 100% и выходом клеток - 40000-60000 клеток/см2 ММСК, выращенные в высокой плотности (впММСК). Полученные культуры были исследованы на клоногенность и жизнеспособность.

Показано, что нпММСК имели большую способность к образованию колоний (рис. 6, цветная вставка1), чем впММСК. Также жизнеспособность нпММСК была выше. Исследование на дифференцировочный потенциал показало, что более эффективно дифференцировались в адипоциты и минерализующие клетки нпММСК, по сравнению с культурами впММСК.

Культуры как нпММСК, так и впММСК экспрессировали маркеры к CD 105 (98%), CD90 (79%), CD73 (95%) и не экспресировали к CD34 (1,31%), CD 45 (0,6%), CD 14 (1,1%), CD49b (1,%). Но только для нпММСК отмечен высокий уровень экспрессии белков PODXL, интегрина-6, интегрина-4 и HGFR, который при увеличении срока культивирования без пассирования для впММСК резко понижался.

Таким образом, высокий уровень экспрессии данных белков является критерием оценки качества культуры ММСК, отражающим насыщенность культуры клетками-предшественниками с высокой клоногенной способностью и высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Установленная оптимальная плотность посева (100 клеток/см2) и сроки культивирования нпММСК (не более 7 суток) позволяют получать максимальное число высокоочищенных клеток ММСК в кратчайшее время. Клеточные культуры ММСК, полученные по предлагаемой методике, применялись во всех дальнейших экспериментах.

2. Эпителио-мезенхимальная пластичность 2D культуры ММСК.

При клональном культивировании высокоочищенных ММСК, с первоначальной плотностью посева 5-10 клеток/см2, наблюдалось образование колоний, морфологически отличающихся по фенотипу клеток – классические мезенхимальные, описанные в работах Фриденштейна, и состоящие из фибробластоподобных клеток, эпителиоидные, состоящие из эпителиоподобных клеток, и смешанные, в состав которых входили как фибробластоподобные так и эпителиоидные клетки (рис. 7).

А Б В Рис. 7. Три типа колоний в 2D культуре ММСК:

А - фибробластоподобная колония, ув.10;

Б – эпителиоподобная колония, ув.10;

В – смешанная колония, ув.10. Фазово-контрастная микроскопия.

В фибробластоподобных колониях клетки экспрессировали CD105, N-кадгерин, виментин и альфа-актин. В эпителиоидных колониях клетки экспрессировали Е-кадгерин и нестин. Смешанные колонии состояли из двух перечисленных фенотипов. При дальнейшем клональном культивировании эпителиоидные и смешанные колонии исчезали из культур и только фибробластоподобные колонии оставались в культуре. Объяснить образование колоний с клетками разного фенотипа из изначально однородной популяции клеточной культуры ММСК мы не смогли.

Было предположено, что ММСК в условиях культивирования могут находиться в двух состояниях (статусах). В статусе мезенхимы (стромы) и в статусе эпителия. Т.е. ММСК костного мозга обладают эпителио-мезенхимальной пластичностью. Но функциональное объяснение этому феномену клеток в 2D культуре мы не нашли.

Условия стандартных жестких режимом выделения и культивирования изначально пластичных популяций ММСК в культуру, процедуры многократного пассирования клеток, вероятно, «выравнивают» фенотип клеток за счет подавления региональных генов органогенеза. Кроме того, культивирование в прикрепленных 2Dкультурах сопровождается изменением цитоскелета клеток при прикреплении к пластику культуральных чашек, влиянием вырабатываемого клетками внеклеточного матрикса и запуском процессов дифференцировки, что, вероятно, также приводит к сохранению только одного фенотипа клеток и колоний – стромальных. Переход от 2D к 3D культивированию, при котором минимизируется вклад внеклеточного матрикса и цитодифференцировка клеток, а значит, появляется больше свободы морфологичекого перехода и возможностей для межклеточных Цветная вставка А Б В Рис. 1. Иммуноцитохимический анализ культуры СКЖТ: А - экспрессия нестина (красный), ув.

40Х;

Б – экспрессия виментина (зеленый), ув. 40Х;

ядра окрашены Hoechst 33258 (синий);

В общий вид колонии, окрашивание кристаллвиолетом.

А Б В Рис. 3. Иммуноцитохимический анализ культуры СКПК: А - экспрессия виментина (красный), ув. 40Х;

Б – экспрессия коллагена I типа (зеленый), ув. 10Х;

В - экспрессия коллагена IV типа (зеленый), ув. 40Х, ядра окрашены Hoechst 33258 (синий).

Г Д Рис. 4. Иммуноцитохимический анализ культуры МВ:

Г - экспрессия десмина (зеленый), ув.

40Х;

Д – экспрессия миозина (красный, ув.

40Х, ядра окрашены Hoechst (синий).

Г Д Рис.5. Иммуноцитохимический анализ культуры НСПК:

Г - экспрессия бета-тубулина (красный), ув. 40Х;

Д – экспрессия GFAP (красный), ув.

40Х, ядра окрашены красителем DAPI (синий).

Цветная вставка Клоногенность и жизнеспособность Рис. 6. Общий вид чашек с колониями, окрашенными кристаллвиолетом.

нпММСК впММСК 100 клеток 100 клеток А Б Рис. 12. Иммуноцитохимический анализ 3D культуры ММСК:

А - экспрессия ламинина (зеленый);

Б - экспрессия CD105 (красный) и виментина (зеленый), ядра окрашены Hoechst 33258 (синий).

А Б В Рис. 13. Сфероид ММСК, 6 дней культивирования: А,Б - сканирующая электронная микроскопия;

В - трансмиссионная электронная микроскопия.

А Б Рис. 14. Гибридные сфероиды: А – сокультивирование GFP+ ММСК и GFP- ММСК, 6 дней;

Б - дневные GFP-СКЖТ на третий день сокультивирования с GFP+ ММСК (зеленые), синий – окрашивание Hoechst 33258, красный – окрашивание иодидом пропидия.

Цветная вставка Рис. 15. Динамика миграции ММСК и НСПК в первые 3 суток после инъекции.

Прослеживается наиболее активная миграция НСПК до образования дифференцированных отросчатых клеток и образование агрегатов ММСК с последующей миграцией клеток из них.

Рис 16. Исследование тканей мышцы mdx мыши (иммуногистохимия;

37 сут): окраска антителами к человеческому дистрофину.

А,Б - трансплантация МБ;

В,Г – трансплантация ММСК.

А Б В Г А Б Рис. 17. Головной мозг крысы с ОСМА, мозолистое тело, 10 дней после трансплантации: А – распределение ММСК;

Б – миграция НСПК.

Цветная вставка Рис. 18. Исследование тканей СД + нпММСК Здоровые мыши поджелудочной железы (иммуногистохимия;

32 сут эксперимента) окраска антителами к человеческому инсулину, мышиному инсулину, 2-микроглобулину человека, PDX-1, ядра окрашены DAPI;

толщина среза 5 мкм;

PDX- увеличение Х400.

PDX- мышиный инсулин 2-микроглобулин DAPI DAPI СД + нпММСК Здоровые мыши человеческий инсулин человеческий инсулин 2-микроглобулин мышиный инсулин DAPI DAPI в2- микроглобулин Рис. 19. Исследование тканей поджелудочной железы мышиный инсулин (иммуногистохимия;

32 сут эксперимента;

группа «СД+нпММСК»): окраска антителами к мышиному DAPI инсулину (зеленый), 2-микроглобулину человека (красный), ядра окрашены DAPI;

толщина среза 5 мкм;

увеличение Х400, (вытянутые стрелки – клетки человека, треугольные стрелки – человеческие клетки, экспрессирующие мышиный инсулин).

Рис. 20. Гломерула почки мыши (uммуногuстохuмия, увеличение Х400).

Трехмерная реконструкция изображенuя, полунного при деконволюционной микроскопии среза ткани. Двойное окрашивание антителами к антигенам ядер человеческих клеток и мышиному/человеческому CD31, ядра окрашены DAPI. Стрелками указаны плоскости деконволюции.

взаимодействий помогает сохранить природную пластичность ММСК.

3D культивирование миниэксплантатов пренатальных и дефинитивных тканей.

Образование сфероидов в культуре миниэксплантатов головного мозга 15-дневных зародышей крыс и фетусов человека ( нед развития) наблюдали уже через 1-2 суток культивирования.

Кусочки эксплантатов реорганизовывались в нейросфероиды, которые при дальнейшем культивировании формировали мультиагрегатные модули (рис. 8А). На периферии сфероидов и между растущими агрегатами накапливались клетки округлой формы. Через 5-7 дней культивирования на поверхности неровных поврежденных эксплантатов наблюдалось наблюдали спонтанную сборку новых сфероидов (рис. 8Б). Сформировавшиеся сфероиды содержали нестин+, виментин+, GFAP+ клетки.

Б А Рис.8. Нейросфероиды из миниэксплантатов фетального головного мозга человека (11 нед: А – формирование модуля, ув.10;

Б – формирующийся нейросфероид на поверхности эксплантата, ув. Фазово-контрастная микроскопия.

Формирование организованных многослойных энтеросфероидов из миниэксплантатов мукозы тонкого кишечника человека наблюдалось через 4-5 дней культивирования и состояли из плотно упакованных округлых клеток (рис. 9А).

Некоторые энтеросфероиды при дальнейшем культивировании (7- дней) формировали внутреннюю неолуминальную полость (рис. 9Б) В Б А Рис. 9. А - Многослойный энтеросфероид из диссоциированной мукозы тонкой кишки человека через 4-5 сут культивирования, ув.20;

Б энтеросфероид с полостью, ув.20;

В – розетко-подобный сфероид миниэксплантата сетчатки человека, ув.40. Фазово-контрастная микроскопия.

В ходе роллерного культивирования фетальных и постнатальных миниэксплантов сетчатки наблюдали поэтапное формирование двух типов сфероидов: слоистых (4-5 сутки культивирования) и розетко-подобных (на 5-7 сутки культивирования). Сфероиды при культивировании в течение двух недель сохраняли радиальный каркас и упорядоченное послойное расположение клеток (рис. 9В).

Микроэкспланты скелетных мышц в виде изолированных миофибрилл размером 3-5 мм готовили из биопсийной ткани человека под микроскопом и культивировали в среде в течение 20-25 дней (рис.

10А). Уже на 5-й день культивирования на раневой поверхности фибрилл наблюдали образование сфероидов (рис. 10Б). После прикрепления плавающих миосфероидов к пластику отмечали массовое выселение мелких полигональных клеток с последующим формированием новых миотубов из прикрепившихся миосфероидов через 10-12 дней культивирования (Рис. 10В).

А Б В Рис. 10. А - изолированные миофибриллы скелетной мышечной ткани человека, ув.20;

Б - формирующиеся агрегаты и сформированный миосфероид на краевом поврежденном конце мышечного волокна через дней культивирования, ув.20;

В – миотубы из прикрепившихся миосфероидов, 12 день культивирования, ув.20. Фазово-контрастная микроскопия.

Культивирование миниэксплантатов показало, что механически поврежденные эксплантаты фетальных и дефинитивных тканей проявляют универсальную способность отвечать на повреждение образованием регенерационной ткани, имеющей сфероидную организацию.

4. 3D культивирование диссоциированных первичных культур СКЖТ, СКПК, МБ и ММСК Для всех первичных культур тканей и ММСК костного мозга условия получения сфероидов были одинаковы: 1) метод «висячей капли»;

2) концентрация клеток, позволяющая получать сфероиды размером 100-150 мкм;

3) высокий уровень жизнеспособности клеток сфероида в течение всего периода культивирования;

4) динамика образования сфероидов. На третий день культивирования формировались небольшие (20-30м в диаметре), рыхлые скопления клеток. К шестому дню практически все кластеры и одиночные клетки формировали одиночные агрегаты, достигавшие 100-150м в диаметре (рис. 11).

А Г Б Д В Рис. 11. Формирование сфероида ММСК: А 2D культура (2 пассаж);

Б - образование клеточный агрегат, 3 день культивирования в «висячей капле»;

В - клеточный агрегат, 4 день культивирования;

Г – сфероид ММСК, 6 день 3D культуры, ув.40;

Д- миосфероид, 6 день 3D культуры, ув.40. Фазово-контрастная микроскопия.

Зрелые агрегаты становились плотными, с более гладкой поверхностью, характеризовались высокой жизнеспособностью клеток в сфероиде в течение 2 недель культивирования.

Иммуноцитохимическое исследование позволило выявить экспрессию виментина, CD105 и компонентов базальной мембраны – коллагена IV типа и ламинина в сфероидах (рис. 12, цветная вставка 2). При дальнейшем культивировании отмечали формирование внешнего организованного слоя клеток в сфероидах с одновременным усилением в них синтеза нестина и белков внеклеточного матрикса.

Клетки в сфероидах экспрессировали не только мезенхимальные маркеры – CD105 и виментин, но и маркеры примитивной энтодермы и нейроэктодермы - GATA-6 и нестин. Ламинация сфероидов подтверждена методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии(рис. 13А, 13Б, цветная вставка 2). Ядро сфероидов состоит из плотно упакованных клеток. Вытянутая форма и тесное прилегание клеток поверхностного слоя друг к другу свидетельствуют о протекающей в данный момент поляризации клеточного слоя (рис. 13В, цветная вставка 2).

После 6 дней 3D культивирования сфероиды переносили в чашки Петри и продолжали культивировать в условиях 2D культуры.

Сформированные сфероиды уже через сутки адгезировали к пластику с последующим выселением и миграцией эпителиоподобных клеток, что свидетельствует о стабильном сохранении эпителиального статуса наружнего клеточного слоя.

Ламинин усиливал миграцию клеток в течение первых 10 часов после адгезии сфероидов к пластику. Другие компоненты матрикса (фибронектин, коллаген I, коллаген IV) не влияли на миграцию клеток сфероидов. Ускоренную миграцию клеток на ламинине, вероятно, можно объяснить стимуляцией экспрессии GATA-6 и активацией ROCK/Cdc42 цитоскелета быстро мигрирующих клеток. По видимому, в 2D культуре стромальных клеток происходит однонаправленный эпителио-стромальный переход, что объясняет исчезновение эпителиоподобных и смешанных колоний при клональном культивировании. Образование сфероидов ММСК в 3D культуре индуцирует стабильную стромально-эпителиальную конверсию, сопряженную с активацией экспрессии ранних генов эмбриогенеза.

При 3D сокультивировании клеток СКЖТ и ММСК, экспрессирующих маркер GFP, полученных от мышей линии С57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J и клеток, не экспрессирующих GFP, полученных от мышей линии C57Bl/6J формировались гибридные сфероиды. Причем при помещении GFP-СКЖТ и GFP+СКЖТ, GFP ММСК и GFP+ММСК и GFP-СКЖТ и GFP+ММСК в одну каплю на третий день образовывались гибридные сфероиды, состоящие из беспорядочно лоализованных обоих типов клеток, с высокой жизнеспособностью. Лишь единичные ядра окрашивались иодидом пропидия. (рис. 14А, цветная вставка 2). При добавлении суспензии GFP+ММСК или GFP+СККМ к уже сформированным к шестому дню культивирования в «висячей капле» GFP-СКЖТ сфероидам на третий день совместного культивирования наблюдалось включение GFP+ клеток в состав сфероида с локализацией на его поверхности (рис.

14Б, цветная вставка2).

Таким образом, 3D культивирование стромальных клеток открывает беспрецедентные возможности для изучения механизмов репарации поврежденных тканей и раннего соматического эмбриогенеза млекопитающих и человека.

5. Исследование поведения ММСК и НСПК при инъекции в органотипическую культуру сетчатки.

Прижизненные наблюдения за инъецированными клетками показали, что их миграция начинается уже через 10 мин после инъекции. НСПК активно мигрировали от зоны введения на значительные расстояния за короткий промежуток времени (рис. 15, цветная вставка 3). Через 3 суток они выходили за границы самого эксплантата и продолжали мигрировать по клетках, выселяющимся из эксплантата. Причем миграция НСПК проходила исключительно по распластанным клеткам эксплантата и не наблюдалась на пластике чашек, что, вероятно, указывает на необходимость клеточного окружения для изменения положения НСПК. Через 1 день после инъекции НСПК образовывали короткие неветвящиеся отростки. К дню наблюдалось образование длинных сильноветвящихся тонких отростков, формирующих сети между собой и с клетками эксплантата.

Иммуногитохимическое исследование выявило экспрессию тубулина – диференцировочного маркера нейронов и GFAP – маркера глиальных клеток.

Зона миграции ММСК была значительно меньше, чем у НСПК.

Инъецированные клетки образовывали агрегаты, из которых затем мигрировало незначительное количество клеток в течение 1 суток после инъекции. Причем наибольшей подвижностью обладали клетки небольших размеров (10мкм). На 3 сутки миграции ММСК не наблюдалось. Отдельные клетки в процессе миграции изменяли свою морфологию, но не экспрессировали дифференцировочных маркеров нейронов и глии.

Таким образом, непосредственное взаимодействие между клетками за счет образовывания отростков, связывающих их друг с другом и с клетками микроокружения наблюдалось еще до стадии морфологической дифференцировки при продолжающихся процессах миграции, что подтверждает предположение о необходимости установления функциональных связей и наличия соответствующего микроокружения для нормальных процессов дифференцировки клеток.

6. Трансплантация ММСК животным с экспериментальной патологией.

Трансплантация ММСК и НСПК в мозг крыс с моделью локальной ишемии головного мозга.

Результаты микроскопического исследования показали, что через 6 часов после трансплантации ярко светящиеся ММСК и НСПК локализовывались в треке инъекции и на незначительном расстоянии от него, в коре мозга, мозолистом теле, латеральном желудочке. Через 10 дней после трансплантации НСПК, попавшие в боковой желудочек, мигрировали по эпителиальному слою желудочка и распределялись в его боковой стенке на расстоянии 0,5-1,5 мм. Наиболее интенсивная миграция НСПК обнаружена в области мозолистого тела, где они располагались на расстоянии 2-3 мм от места введения (рис. 17Б, цветная вставка 3) и к 20 суткам достигали противоположного ипсалатерального полушария. В клеточном слое коры миграция НСПК была значительно менее выраженной, и наблюдалась в течение первых 6 часов. Мигрирующие клетки через 10 дней экспрессировали виментин – белок, характерный для ранних, недифференцированных клеток, -тубулин – дифференцировочный маркера нейронов и GFAP – маркер глиальных клеток. Это доказывает, что культивированные НСПК при трансплантации в мозг животных с локальной ишемией до 20 дней сохраняют пул некоммитированных клеток, мигрируют к месту повреждения и могут дифференцироваться по глиальному и нейрональному пути.

При трансплантации ММСК незначительная миграция светящихся клеток наблюдалась только в первые 6 часов и практически не изменялась в более поздние сроки. Причем даже в области мозолистого тела, где отмечалась наиболее интенсивная миграция НСПК, ММСК мигрировали на минимальные расстояния до 0,5 мм (рис. 17А, цветная вставка 3). В основном ММСК располагались в непосредственной близости от кровеносных сосудов.

Через 10 дней после трансплантации в месте локализации ММСК по ходу трека отмечалось образование большого числа новых капилляров. Характер локализации ММСК вблизи сосудов и новообразование капиляров говорит о триггерной роли транплантированных ММСК в процессах ангиогенеза и о возможности диффернцировки в ангиогенном направлении.

Образования репаратиных сфероидов при трансплантации ММСК в зоне введения не наблюдали.

Трансплантация ММСК и МВ животным с повреждением мышечной ткани.

Уже через 0,5 часа после введения вокруг инъекционного трека начинается формирование зоны распространения жизнеспособных трансплантированных клеток, в то время как погибшие клетки располагаются только в зоне повреждения. Спустя несколько часов трансплантированные клетки обнаруживаются в мышечной ткани в стороне от инъекционного трека, а уже через 6 часов формируется достаточно объемная зона распространения клеток (до 5-6 мм вокруг зоны повреждения), которая в дальнейшем практически не увеличивается. Таким образом, зона распределения трансплантированных клеток в основном формируется в течение часов после инъекции за счет активной миграции живых клеток вдоль мышечных волокон и пассивного переноса по сосудам при их попадании в сосуд при инъекции.

Мышечные волокна, положительно окрашенные на дистрофин, были обнаружены у всех мышей, которым инъецировали клетки.

Однако, были выявлены существенные различия в локализации дистрофина в мышечной ткани при трансплантации ММСК и МВ. У мышей нормального фенотипа дистрофин располагается в кортикальной области мышечных волокон и выявляется на препаратах сплошной светящейся линией по периметру срезанных поперек волокон. При трансплантации МВ через 21 и 37 дней после инъекции обнаружены зоны дистрофин-положительных мышечных волокон, располагающихся только вокруг инъекционного трека.

Наряду с волокнами с нормальным расположением дистрофина во внутренней зоне дистрофин-положительной области были обнаружены группы волокон с атипичным расположением дистрофина – кроме более яркого свечения по кортикальной области наблюдалось выраженное диффузное свечение всего мышечного волокна (рис. 16А,Б, цветная вставка 3). У животных с трансплантацией ММСК вокруг места введения клеток в мышечной ткани выявлялись дистрофин-положительные области только с нетипичным распределением флуоресцептной метки. Яркое свечение наблюдалось вдоль крупных соединительно-тканных оболочек мышц, по эпимизию и в основном по перимизию(рис. 16В,Г, цветная вставка 3). Более ярко светились соединительно-тканные оболочки мышечных волокон непосредственно около инъекционного трека, менее ярко по периферии зоны введения. Часто свечение фикоэритрина выявлялось не равномерно вдоль соединительно-тканной оболочки, а в виде дискретных, ярких очагов, соответствующих локализации отдельных дистрофин-положительных клеток. При трансплантации ММСК свечение фикоэритрина наблюдалось на более дальних расстояниях от инъекционного трека по сравнению со свечением при трансплантации миобластов. Но во обоих группах при введении разных клеточных культур дистрофин положительные области, соответствующие зоне расположения трансплантированных клеток занимали локальные ограниченные пространства в мышечной ткани вокруг треков введения.

Вопрос о возможности использования клеток немиогенного фенотипа для регенерации мышечной ткани, фактически является вопросом о репрограммировании этих клеток под воздействием микроокружения. В данном случае представляются возможными все варианты: от отсутствия репрограммирования, до полного морфологического и функционального репрограммирования. В наших исследованиях трансплантированные ММСК в мышцах mdх мышей были обнаружены в составе мышечных волокон с аномальным диффузным распределением дистрофина и морфологией, отличной от окружающей ткани. Положительную реакцию при окраске антителами к дистрофину дали также мелкие клетки, располагающиеся вдоль соединительнотканных оболочек мышечных волокон. Существуют данные, что трансплантированные клетки немиогенных фенотипов даже принимающие участие в восстановлении нормальной морфологии, далеко не всегда демонстрируют экспрессию генов, специфических для мышечной ткани. Так, стволовые клетки костного мозга при пересадке в мышцы мышей с нокаутированным геном дельта-саркогликана сливаются с мышечными клетками реципиента, но не эксперессируют саркогликан (Cossu et al., 2004). В наших экспериментах мы имеем обратную ситуацию - инъецированные в мышцы mdх мышей ММСК в некоторых случаях приобретают специфическую для мышечной ткани способность экспрессировать дистрофин, но при этом не имеют нормальной для мышечных волокон морфологии.

Таким образом, было показано, что трансплантированные ММСК и миобласты участвуют в репарации мышечных волокон за счет образования дистрофин+ мышечных волокон. Однако формирования репаративных сфероидов в очаге повреждения не наблюдали. Вероятно, репаративный сфероидогенез оказался блокированным в патологически измененных скелетных мышцах.

Трансплантация ММСК животным с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Животных разделили на следующие группы: мыши с индуцированным сахарным диабетом, получившие инъекцию ММСК – «СД+ММСК», мыши с индуцированным сахарным диабетом, получившие инъекцию фибробластов – «СД+фибробласты», мыши с индуцированным сахарным диабетом, не получившие клеток – «СД»

и группа здоровых животных. Животным экспериментальной группы вводили суспензию 2,5*106 ММСК на 10 и 17 сут после первой инъекции стрептозотоцина. Известно, что при сахарном диабете первыми повреждаются поджелудочная железа и почки, поэтому при оценке терапевтического эффекта клеток оценивали также гистологию этих органов (животных умервщвляли на 32 сут эксперимента и производили забор тканей для иммуногистохимического исследования).

При иммуногистохимическом исследовании на 32 сут эксперимента установлено, что в тканях поджелудочных желез животных группы «СД» наблюдалась атрофия паренхимы. Размеры и количество островков были уменьшены, клетки в них не дифференцировались на подтипы, некоторые островки гиалинизированы. Часть островков находилась в состоянии гипертрофии. Наблюдался перидуктальный, перилобулярный склероз.

По ходу протоков определялась лимфогистиоцитарная инфильтрация.

В группе «СД+ММСК» также наблюдалось уменьшение количества и размеров островков, но в отличие от группы «СД» сохранные островки находились в состоянии гипертрофии, в них определялись полиморфные клетки (что отражало, по-видимому, начало дифференцировки на подтипы). При иммуногистохимическом исследовании тканей поджелудочной железы мышей в группе «СД+ММСК» по-сравнению с группой «СД» большее количество островков и большая их площадь окрашивались антителами против мышиного инсулина. Также в группе «СД+ММСК» обнаружено достоверно большее количество островков Лангерганса на один срез, чем в группе «СД».

Сравнительно небольшое количество ММСК человека в островках поджелудочных желез животных группы «СД+ММСК»

экспрессировали мышиный инсулин, что выявлено при двойном окрашивании антителами к человеческим клеткам (2 микроглобулину человека) и мышиному инсулину (рис. 18, 19, цветная вставка 4).

При гистологическом исследовании тканей почек на 32 сут эксперимента у животных группы «СД» обнаружены клубочки разного размера, часть клубочков была гиалинизирована и склерозирована, Единичные клубочки гипертрофированы.

Определялось расширение мезангиального матрикса, пролиферация мезангиальных клеток, базальные мембраны капилляров утолщены.

Наблюдалось расширение и полнокровие сосудов всех калибров, определялись небольшие участки периваскулярных кровоизлияний и лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью макрофагов.

Некоторые канальцы были расширены, в просвете их определялись гомогенные эозинофильные массы (гиалиново-капельная дистрофия).

В тканях почек животных группы «СД+ММСК» по сравнению с группой «СД» определялось уменьшение мезангиального матрикса и меньшая пролиферация мезангиальных клеток. Базальные мембраны капилляров утолщены меньше, чем у животных группы «СД».

Капиллярные петли клубочков расширены, полнокровны.

При иммуногистохимическом исследовании было показано, что нпММСК человека в почках локализуются преимущественно в гломерулах (рис. 20, цветная вставка 4),. На некоторых срезах человеческие клетки обнаружены в 20% гломерул. Человеческие клетки не были найдены в канальцах. Большинство гломерул содержало по одной человеческой клетке. Гломерулы с двумя и более человеческими клетками встречались редко, и нпММСК в таких гломерулах находились на большом расстоянии друг от друга.

Следовательно, клетки не делились после того, как приживлялись в почечной ткани.

Иммуногистохимическое исследование с двойным окрашиванием показало, что некоторые клетки человека окрашивались моноклональными антителами к CD31 (РЕСАМ -1, молекула клеточной адгезии тромбоцитов/эндотелия) - белку, экспрессируемому на мембранах эндотелиальных клеток. Также на некоторых срезах видно, что CD31 экспрессирующие нпММСК человека имели вытянутую форму. Продольная форма клеток хорошо видна на трехмерной реконструкции изображений, полученной при проведении деконволюционной микроскопии (рис., цветная вставка 4). Экспрессия CD31 человеческими нпММСК in vivo свидетельствовала, по-видимому, об их дифференцировке в эндотелиальные клетки.

Была подтверждена тропность ММСК к органам-мишеням, поражаемым при сахарном диабете, в первую очередь поджелудочной железе и почкам.

Существует несколько точек зрения относительно поведения ММСК in vivo после трансплантации. Согласно одной из них происходит трансдифференцировка клеток костного мозга в условиях индукции сахарного диабета. В исследовании Ianus А. (Ianus А. et al., 2003) установлено, что 1,7-3% островковых бета-клеток реципиентного животного являются клетками донорского костного мозга. Согласно второй теории происходит химеризация: ММСК донора «сливаются» с клетками реципиента. Результаты нескольких исследований других авторов опровергают возможность трансдифференцировки. Так в исследовании Choi J.B (Choi J.B. et al., 2003) [30] на модели стрептозотоцининдуцированного диабета у мышей с трансплантированными клетками костного мозга, трансфецированными геном GFP, показано отсутствие трансдифференцировки клеток костного мозга в бета-клетки. В то же время отмечено усиление пролиферации островков Лангерганса и стойкая экспрессия клетками поджелудочной железы животных реципиентов гена GFP. Поскольку дифференцировка ММСК в островковые клетки продемонстрирована только in vitro, в настоящее время вопрос о механизмах участия ММСК в репарации после трансплантации остается открытым. Возможно эпителио мезенхимальная пластичность ММСК, проявляющаяся при 3D культивировании и продемонстрированная а нашей работе, вносит свой вклад в процессы репарацииза счет пластичности единичных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение фенотипической, морфологической и функциональной активности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vivo и in vitro было актуальным с момента их открытия А.Я.Фриденштейном. Сам Фриденштейн назвал их мезенхимальными стволовыми клетками, полагая, что они могут иметь только один устойчивый незрелый фенотип. Новый направление изучения пластичности стромальных прогениторных клеток возникло в связи разработкой новых методов 2D и 3D культивирования, позволивших количественно изучать эпителиальный и мезенхимальный статус колоний или отдельных клеток в культуре. Наши исследования показали, что высокочищенные линии стромальных клеток костного мозга формируют эпителиальные, мезенхимальные и смешанные по фенотипу колонии. После этого открытия стало ясным, что стромальные клетки в условиях культуры могут находиться в двух устойчивых эпигенетических состояниях.

Новая технология культивирования ММСК в 3D культуре позволила в деталях изучить эпителио-мезенхимальный статус по мере агрегации и формирования зрелых сфероидов в суспензии.

Было найдено, что эпителиальные клетки возникают в сфероидах на стадии компактизации. Новообразованные нестин+, GATA6+ клетки мигрируют во внешний слой сфер, где происходит синтез компонентов базальной мембраны (ламинин, коллаген IV).

Созревание сфероидов заканчивается ламинацией – перераспределением новообразованных эпителиальных клеток в внешний слой сфероида.

Второе направление наших исследований связано с изучением формирования репаративных клеточных сфероидов на поверхности поврежденных эксплантов фетальных и взрослых тканей.

Образование репаративных сфероидов проходило в идентичных или близких условиях культивирования и имело сходную временную и количественную динамику. Репаративный сфероидогенез был прослежен на фетальной мозговой ткани, миофибриллах, сетчатке.

Третье направление было связано с изучением сфероидогенеза на базе диссоциированных клеток первичной культуры здоровых поврежденных тканей. В присутствии индукторов - кусочков поврежденной ткани- клетки агрегировали в суспензионные сфероиды. Временные и количественные закономерности сфероидогенеза оказались сходными или близкими у клеток всех первичных культур. Новообразованные агрегаты, доставленные в зону повреждения in vitro, соучаствовали в репарации эпителио мезенхимальных повреждений.

В отличие от нормальных тканей, диссоциированные клетки из первичных культур, полученных из патологических органов и тканей, не формировали сфероидов. Таким образом, патологические ткани теряли способность к формированию репаративных сфероидов ин витро.

В работе были прослежены эффекты локального введения ММСК и миобластов в поврежденную дистрофин-дефицитную скелетную мышцу mdx-линии мышей. Было показано, что трансплантированные ММСК и миобласты участвуют в репарации мышечных волокон за счет образования здоровых дистрофин+ мышечных волокон.

Однако формирования репаративных сфероидов в очаге повреждения не наблюдали. Следовательно, репаративный сфероидогенез оказался блокированным в патологически измененных скелетных мышцах. Введение ММСК в патологическую сетчатку, почечную ткань также не приводило к образованию репаративных сфероидов.

На основании полученных и проанализированных экспериментальных данных о путях и сигналах новообразования репаративных сфероидов в культуре клеток ММСК, фетальных и постнатальных эксплантах, диссоциировнных нормальных соматических клеток были сформулирована и предложена новая концепция эпителио-мезенхимальной пластичности ММСК. Согласно этой концепции, поврежденные нормальные ткани органов оказываются триггером, запускающим образование репаративных сфероидов из региональных или системно циркулирующих мультипотентных стромальных клеток. Репарирующие сфероиды являются би-функциональным донором-модулем эпителиальных и стромальных клеток, когда условия репителизации блокированы или ограничены.

Работа имеет большую технологическую перспективу, поскольку сфероиды могут оказаться важным исходным сырьем для получения эпителио-мезенхимальных модулей репарации второго и третьего поколения. В теоретическом медицинском и прикладном плане изучение физиологии и эпигеномики репаративных сфероидов in vitro и in vivo открывает новые направления в разработке новых биомиметических модулей лабораторной регенеративной ткани на базе ММСК-сфероидов ВЫВОДЫ Эксплантаты фетальных и взрослых тканей в культуре 1.

формируют репаративные эпителио-мезенхимальные сфероиды из стромальных мезенхимальных клеток. Эксплантаты взрослой патологической ткани в сходных условиях культивирования сфероидов не формируют.

Впервые описана и изучена эпителио-мезенхимальная 2.

пластичность в 2-D- колониях ММСК костного мозга при культивировании в низких плотностях. Описаны типичные мезенхимальные колонии из CD105, N-кадгерин, виментин, альфа-актин позитивных клеток, эпителиоидные колонии из Е кадгерин, нестин позитивных клеток, а также смешанные колонии из клеток двух перечисленных фенотипов.

Впервые разработана и изучена воспроизводимая методика 3.

получения сфероидов ММСК в условиях 3D суспензионной культуры методом «висячей капли». Прослежена динамика образования сфероидов и проведена характеристика фенотипа исходных изолированных ММСК и сфероидов ММСК.

Впервые изучена эпителио-мезенхимальная пластичность 4.

сфероидов ММСК in vitro. Эпителиоидные нестин+ GATA-6+ клетки примущественно локализованы во внешнем слое сфер (вместе с компонентами базальной пластинки - ламинином, коллагеном IV). Высказано предположение, что сфероиды участвуют в репарации за счет сбалансированной поставки эпителия и стромы в зоне повреждения.

Диссоциированные клетки первичных культур нормальных 5.

органов и тканей, подобно тканевым эксплантатам, формируют 3-D сфероиды. Добавление микрокусочков поврежденной фетальной ткани ускоряет образование клеточных агрегатов в суспензионных культурах. Диссоциированные клетки первичных культур патологически измененных органов не формируют 3D– агрегатов. Высказана гипотеза, что именно агрегаты стромальных клеток или ММСК являются модулем безрубцовой репарации.

На модели дистрофин-дефицитных mdx мышей 6.

продемонстрировано ограниченное образование новых дистрофин+ мышечных волокон в зоне введения как из ММСК, так и нормальных донорских миобластов. Образования репаративных сфер в зоне введения не наблюдали.

Трансплантированные ММСК в патологической ткани не формировали репаративных сфер.

При трансплантации НСПК и ММСК человека крысам с 7.

ишемическим повреждением головного мозга ММСК мигрировали на незначительное расстояние в течение первых часов с образованием новых капилляров вокруг зоны введения.

НСПК при трансплантации сохраняют способность к миграции до 10 дней с последующей дифференцировкой введенных клеток в нейроны и глию.

После системного введения ММСК животным с 8.

индуцированным стрептозотоцином диабетом наблюдали частичное восстановление островковой части поджелудочной железы и восстановление нарушенной эндокринной функции.

Системное введение МММСК животным с модельным повреждением почек приводило к восстановлению функции гломерул.

Проведенные исследования позволили сформулировать 9.

новые представления об участии сфероидов ММСК в репаративном восстановлении поврежденных тканей и органов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи Александрова М.А., Сабурина И.Н., Корочкин Л.И., Ревищин 1.

А.В., Репин B.C., Ржанинова А.А., Сухих Г.Т. Поведение и дифференцировка нейрональных стволовых клеток in vivo. // Известия АН. Серия биологическая. - 2001. - №6. – С. 656-665.

Александрова М.А., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Ревищин 2.

А.В., Сабурина И.Н., Дубровина И.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Трансплантация культивированных нейральных прогениторных клеток человека в мозг крыс: миграция и дифференцировка. // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2001. – Т.

132. - №10. – С. 455-458.

Александрова М.А., Сабурина И.Н., Полтавцева Р.А., Марей 3.

М.В., Дубровина И.В., Ревищин А.В., Корочкин Л.И., Сухих Г.Т. Миграция и развитие нейральных стволовых клеток человека при трансплантации в мозг крыс. // Цитология. - 2001.

– Т. 43. - №9. – С. 838.

Корочкин Л.И., Александрова М.А., Павлова Г.В., Башкиров 4.

В.Н., Ревищин А.В., Муркин Е.Н., Сабурина И.Н., Евгеньев М.Б., Зеленцова Е.Н., Модестова Е.А., Венгрова С.Н.

Использование стволовых клеток дрозофилы для стимуляции развития аллотранстлантатов у крыс. // Цитология. – 2001. – Т.

43. - №9. – С. 867.

Alexandrova М.А., Saburina I.N., Poltavtseva R.A., Revistchin 5.

A.V., Korochkin L.I., Sukhikh G.T.. Behavior of human neural progenitor cells transplanted to rat brain. // Development Brain Research. – 2001. – Vol. 132. – Supp 1.2. – P. 1-3.

Сабурина И.Н., Ревищин А.В., Александрова М.А., 6.

Возникновение и дифференцировка НАДФН-Д - нейронов а онтогенезе коры мозга у крыс. // Онтогенез. - 2002. – Т. 33. №1. - С. 36-42.

Ржанинова А.А., Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В., 7.

Сабурина И.Н., Репин В.С. Мезенхимальные стволовые клетки из фетального и донорского костного мозга человека:

получение и сравнительная характеристика. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. - 2003. – Приложение. - С. 39-43.

Сабурина И.Н., Семенова М.Л., Гольдштейн Д.В., Томм Н.А., 8.

Ржанинова А.А., Голиченков В.А., Репин В.С. Трансплантация эмбриональных миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетную мышцу мышей линии С57BL/10J MDX. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. – 2004. - Т. 137. №5. - С. 593-596.

Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Сабурина И.Н., Ржанинова 9.

А.А., Иванов С.А., Архипов С.Л., Шмырев В.И., Миронов И.Н., Свинов М.М., Голобородько Е.В., Репин В.С. Применение трансплантации нейрональных стволовых клеток для лечения ишемического инсульта. // Кремлевская медицина, клинический вестник. – 2004. – Т. 3. - С. 77-79.

Патент на изобретение № 2242980. Приоритет изобретения 10.

27.12.2004. «Культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека и способ их получения».

Авторы: Гольдштейн Д.В., Репин В.С., Сабурина И.Н., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А., Макаров А.В., Бажанов Н.А., Пулин А.А., Фатхудинов Т.Х.

Патент на изобретение № 2242981. Приоритет изобретения 11.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.