авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco у drosophila melanogaster

На правах рукописи

ПОТАПОВА МАРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ РАЙОНА ЛОКАЛИЗАЦИИ

ГЕНА flamenco У Drosophila melanogaster

03.03.05 – биология развития, эмбриология

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

КИМ Александр Иннокентьевич доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

КУЗИН Борис Александрович, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН доктор биологических наук МЕЛЕХОВА Ольга Петровна, МГУ имени М.В.Ломоносова Институт молекулярной биологии

Ведущая организация:

им.В.А.Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится «_»_2011 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Ленинские горы д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, Ауд. М-1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ и на сайте Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /Е.Н.Калистратова/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Drosophia melanogaster –модельный объект для исследования как генетики развития, так и структурной и функциональной организации эукариотического генома, в том числе, его мобильного компонента. Мобильные генетические элементы играют важную роль в эмбриональном развитии, их функциональная активность может приводить к гибели особей на ранних стадиях или вести к многочисленным патологиям на поздних стадиях эмбриогенеза. В последние годы особое внимание уделяется изучению мобильного генетического элемента (МГЭ) gypsy (МДГ4). Элемент gypsy относится к ретротранспозонам, перемещающимся с помощью РНК-интермедиата, и имеет три открытые рамки считывания (ОРС), гомологичные ОРС ретровирусов позвоночных. Наличие функциональной третьей ОРС, кодирующей белок оболочки вирусных частиц, способности к инфицированию клеток in vivo и горизонтальному переносу позволило отнести gypsy к настоящим ретровирусам беспозвоночных (Kim et al., 1994), а D. melanogaster использовать в качестве модели для их исследования. Актуальность изучения ретровирусов дрозофилы, и, следовательно, ретротранспозонов обусловлена тем, что к классу ретровирусов относится и вирус иммунодефицита человека. Его структура принципиально не отличается от структуры ретровирусов насекомых. Не исключено, что похожи и механизмы передачи, контроля развития инфекции и защиты организма от нее.

Спонтанные транспозиции МГЭ чрезвычайно редки, но в некоторых случаях перемещения происходят с повышенной частотой, что может стать причиной генных мутаций и приводить к хромосомным перестройкам.

Особенно опасна активность МГЭ в клетках полового пути, поскольку вызываемые ими мутации будут аккумулироваться в следующих поколениях (Brennecke et al., 2007). Частота транспозиций МГЭ gypsy у D. melanogaster повышена в нестабильной мутаторной линии (mutator strain – МS), которая ведет свое происхождение из стабильной лабораторной линии (stable strain - SS) и характеризуется увеличенной частотой спонтанного мутирования (Ким и др., 1989). Оказалось, что в ней содержится мутация в локусе flamenco, который регулирует транспозиции (Prud’homme et al., 1995). С помощью молекулярной конструкции на основе Р-элемента и гена yellow (Р[yellow]) был получен инсерционный мутант D. melanogaster flamenco (Robert et al., 2001), который характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ. В области инсерции, локализованной в районе 20А3-А5 Х-хромосомы, находится кластер из 8 ОРС с неизвестными функциями, которые транскрибируются в одном направлении. На расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции расположен ген DIP1, за ним следуют две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза, а завершает кластер ОРС CG14476. Примечательно, что в кластер входит ген DIP1, принимающий участие в начальных стадиях эмбриогенеза у дрозофилы. Продукт гена DIP1 взаимодействует с белком Ubx, который относится к Hox-белкам, и принимает участие в генетическом контроле сегментации и развитии нервной системы (Bondos et al., 2004). Известно, что форма гена DIP1-c может связывать предшественник miРНК (miR-iab-4-5p), который вовлечен в регуляцию экспрессии гена Ubx, контролирующего сегментацию у D.melanogaster (Catanese, Matthews, 2010). Кроме того, одним из его белков-партнеров выступает белок Disco, который участвует в контроле развития нервной системы D.melanogaster (DeSousa et al., 2003). Также продукт гена DIP1 взаимодействует с белком Su(var)3-9 (Delattre et al., 2000), принимающим участие в регуляции транскрипции генов через модификацию структуры гетерохроматина. Перечисленные свойства свидетельствуют о том, что DIP1 является многофункциональным регуляторным белком, который принимает участие в формировании сложных белковых комплексов, контролирующих транскрипцию жизненно важных генов D. melаnogaster. Не исключено, что в его функцию может входить регуляция транспозиции ретротранспозонов.

С другой стороны от точки инсерции находится область размером около 200 т.п.н., богатая дефектными копиями МГЭ, преимущественно транскрибируемых в одном направлении. Поскольку антисмысловая цепь гена DIP1 кодирует множество piРНК (Brennecke et al., 2007), которые регулируют процессы транспозиции МГЭ, можно предполагать, что продуктом локуса flamenco может быть молекула РНК-предшественника, из которой в результате образуются piРНК.

В локус flamenco могли бы входить любая из 8 обнаруженных в этом районе ОРС или все вместе. Отсюда возникает необходимость исследования структурной организации этого района Х-хромосомы и анализа его экспрессии в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – исследование структуры и экспрессии локуса flamenco, осуществляющего контроль транспозиции ретротранспозона-ретровируса gypsy у Drosophila melanogaster.

В работе представлены следующие задачи:

1. Исследовать структурную организацию генов, входящих в район локуса flamenco в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Исследовать структуру и экспрессию гена DIP1, в линиях 2.

D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Провести анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у видов Drosophila, 3.

родственных D. melanogaster.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии генов, входящих в район локуса flamenco, на уровне транскрипции на разных стадиях развития в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

5. Провести сравнительный анализ экспрессии на уровне транскрипции прицентромерного района Х хромосомы в области локализации локуса flamenco в линиях, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые проведено комплексное исследование структуры и экспрессии района локализации локуса flamenco. Исследована структура и экспрессия кластера генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в район локализации локуса flamenco. Показано, что экспрессия генов CG32500, CG32819 и CG14476 не различается в линиях с генотипами flamenco и flamenco+, в отличие от гена DIP1.

Впервые установлена специфичность транскрипции изучаемых генов на разных стадиях индивидуального развития D. melanogaster: эмбриональной, личинок третьего возраста и имаго.

Различия в структуре и экспрессии установлены только для гена DIP1, расположенного ближе всего к точке инсерции Р[yellow], в линиях мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Показано, что в области локуса flamenco образуется РНК, считывающаяся с промотора дефектного МГЭ HB, который расположен во втором интроне гена DIP1. Вероятно, эта РНК может служить предшественником образования коротких РНК, принимающих участие в процессах РНК-интерференции.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования механизмов контроля транспозиции и сопряженности процессов транспозиций МГЭ и индивидуального развития, и для изучения формирования мутантного генотипа flamenco у D. melanogaster, который характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ, в частности.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором.

Поставленные задачи решены с применением современных биоинформатических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен им. Н. И. Вавилова РАН (Москва, 2006), Международной научной конференции «Current Evolutionary thinking in Biology, Medicine and Sociology», посвященная 90-летию со дня рождения академика Д. К. Беляева. (Новосибирск, 2007), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2008, 2009), на 1-й Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008), на IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на Всероссийской конференции посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы (Уфа, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 9.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит 26 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов:

введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Лабораторные линии D. melanogaster: мутантные по локуcу flamenco – SS, MS (Любомирская и др., 1994), Oregon R (+Y+3), Р[yellow] (Robert et al., 2001), и нормальная по локусу flamenco – с(1)Dx, y f/y v f mal su(f)/Y. Виды Drosophila из коллекции кафедры генетики МГУ: Drosophila sechellia, Drosophila mauritiana, Drosophila simulans, Drosophila erecta, Drosophila yakuba.

Штаммы Escherichia coli C600, JM109.

Условия культивирования лабораторных линий, получение личинок третьего возраста и эмбрионов 0-24 ч. Линии мух поддерживались при стандартных условиях: при температуре 25°С на питательной агаризованной среде.

Самцов и самок исследуемых линий flamenco+, SS, MS, Oregon R (+Y+3) помещали на чашки Петри при температуре 25°С на ночь. Эмбрионы собирали и помещали в пробирки объемом 1,5 мл для последующего выделения РНК.

Для получения личинок третьего возраста самцов и самок по 10 штук помещали в пробирки. Через 3 сут отбирали личинок в пробирки объемом 1, + мл для последующего выделения РНК. В линии flamenco отбирали только самцов.

Сбор семенников и яичников проводили у взрослых половозрелых особей (около 100 штук самцов или самок).

Клетки E. coli культивировали на агаризованной или в жидкой среде LB (Luria-Bertani) с карбенициллином (50 мкг/мл).

Приготовление компетентных клеток и трансформация E. coli.

осуществлялись с помощью стандартных методик (Maniatis et al., 2001).

Выделение хромосомной ДНК и плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора для выделения хромосомной ДНК «Fermentas» по протоколу фирмы.

проводилась рестрикционными Обработка ДНК ферментами эндонуклезами по протоколам фирмы производителя «Fermentas». Лигирование с вектором для клонирования – согласно протоколу «Promega».

Тотальную РНК из эмбрионов, личинок, имаго, яичников и семенников выделяли с помощью набора «Promega» согласно протоколу.

Перед постановкой обратной транскрипции пробы (по 3 мкг тотальной РНК) обрабатывали ДНКазой I («Fermentas») для разрушения ДНК.

Обратная транскрипция (ОТ) проводилась с помощью набора для синтеза кДНК «Fermentas». В качестве матрицы использовали тотальную РНК, выделенную из яичников (семенников) изучаемых линий.

Полимеразная цепная реакции. Приготовление смеси для реакции выполняли по протоколу фирмы «Fermentas». Реакцию проводили в амплификаторе Amply4 («Biokom»). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, выделенную из: D. sechellia, D. mauritiana, D.

simulans, D. erecta, D. yakuba, D. melanogaster (линии flamenco+, SS, MS и Oregon R (+Y+3)). Проводили амплификацию фрагментов ДНК и кДНК генов DIP1, CG32500, CG32819, CG14476, кДНК района локализации локуса flamenco. В качестве контроля амплифицировали фрагменты гена rp49.

ПЦР в реальном времени. Приготовления смеси с использованием набора реагентов фирмы «Fermentas» («Master Mix (SYBR)») проводили по протоколу фирмы производителя. Реакция проводилась в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System производства Bio-Rad Laboratories.

Одновременно ставили отрицательные контроли для каждого образца: пробы, обработанные ДНКазой I и не прошедшие ОТ.

Секвенирование. Клонированные фрагменты ДНК были секвенированы в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН и в фирме «Евроген».

Биоинформатические методы. Использованные программы: GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) и база данных D. melanogaster последовательностей генома FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu/) для поиска нуклеотидных последовательностей;

BLAST (http://flybase.org/blast/) для поиска гомологии генов;

Vector NTI для работы с известными нуклеотидными последовательностями;

ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/) для множественного выравнивания последовательностей;

SoftBerry (linux1.softberry.com) для выявления экзон интронного строения;

Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl) для поиска промоторной области;

для обработки данных ПЦР в режиме реального времени использовали программное обеспечение фирмы «Bio-Rad» – CFX Manager.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование структуры гена DIP1 у D. melanogaster По данным FlyBase в исследуемой области 20А1-5 размером более т.п.н. обнаружено только 8 ОРС, организованных в кластер: ген DIP1, точка начала трансляции которого находится на расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции Р[yellow], две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза (Robert et al., 2001), и завершает кластер ОРС CG14476 (Рис. 1). Функции гена DIP1 и остальных 7 генов кластера неизвестны.

Нами было сделано предположение, что инсерция в линии Р[yellow] может влиять на транскрипцию гена DIP1 или другого гена кластера. Если изменение экспрессии гена DIP1 приводит к генотипу flamenco, то в линиях SS и MS функция гена DIP1 также должна быть нарушена вследствие изменений его структуры и/или экспрессии.

Проведенный рестрикционный анализ показал, что амплифицированный с праймерами DIPd4 и DIPr2 фрагмент в линиях SS и MS, в отличие от линий flamenco+ и Р[yellow], не содержит сайта рестрикции DraI в положении (Рис. 1). Эта мутация определяется мононуклеотидной заменой сайта узнавания ТТТААА на ТТТААG и является трансляционно незначащей.

Рис. 1. Схема области 20А5 локализации локуса flamenco по данным FlyBase. Показано направление транскрипции 8 ОРС и дефектных МГЭ. Треугольником показана инсерция P[yellow]. Обозначены: сайты рестрикции DraI и их координаты;

сайты локализации праймеров;

ATG – предполагаемые сайты инициации трансляции, черным прямоугольником показан альтернативный экзон, стрелкой показано направление и локализация последовательности HB.

Кроме того, ген DIP1 в линиях MS, SS Oregon R (+Y+3), в отличие от линий flamenco+ и Р[yellow], содержит вставку, заключенную между двумя другими сайтами DraI (2297 и 2888) и обозначенную нами IdSS, размером 182 п.н. во втором интроне (Рис. 1). Выявленная вставка была утрачена в линиях Р[yellow] и flamenco+. Согласно Genbank комплементарная цепь последовательности второго интрона гена DIP1 содержит дефектную копию МГЭ HB размером 1300 п.н. Выделенная вставка позволяет продлить область гомологии ОРС HB с генами Tc1-подобных транспозаз на величину последовательности IdSS.

Более того, нами обнаружены структурные отличия линии Oregon R (+Y+3) от линий MS, SS и flamenco+: вставка размером 173 п.н. в промоторной области гена DIP1, которая может влиять на уровень экспрессии гена DIP1, либо соседнего района. Биоинформатический анализ вставки 173 п.н. выявил наличие в ней дополнительной промоторной последовательности.

Эта вставка не обнаружена в промоторной области гена DIP1 у других линий D. melanogaster, но она присутствует в гомологичных областях у более молодых видов D. sechellia и D. simulans. Следовательно, в линиях (flamenco+, D. melanogaster MS, SS) произошла делеция этой последовательности.

Анализ экспрессии гена DIP1 у D. melanogaster Ген DIP1 состоит из четырех экзонов, первый из которых может быть альтернативным (по сведениям из базы данных Flybase). DIP1 кодирует несколько продуктов, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (DeSausa et al., 2003). В базе данных FlyBase приведены два названия одного и того же гена: DIP1 и Klett. Известны три варианта CDS (coding sequence), включающих сайт инициации трансляции ATG1: DIP1-c, она же Klett-c (AF175711), DIP1-b, она же Klett-d (AF182154) и DIP1-d (AY217028), и два варианта CDS c альтернативным первым экзоном (с ATG2): Klett-a (AJ2500866) и Klett-b (AJ2500867). С ATG3, локализованного во втором экзоне, образуется форма DIP1-a (AF175713) (Рис. 1).

Анализ продуктов альтернативного сплайсинга гена DIP1, включающих сайт ATG1/ATG2, методом ОТ-ПЦР с парами праймеров DIP d4-DIP r2, DIP d2 DIP r2 (Рис. 1) подтвердил наличие следующих форм: DIP1-c (1109 п.н.), DIP1-b (1063 п.н.), DIP1-d (713 п.н.), Klett-a (1113 п.н.) и Klett-b (1068 п.н.) (Рис. 2).

Нами исследована экспрессия гена DIP1 на 3-х стадиях индивидуального развития: у эмбрионов, личинок третьего возраста и имаго D. melanogaster. Во всех линиях на стадии имаго и у эмбрионов выявляются формы DIP-c, Dip-b и Dip-d, Klett-a и Klett-b (Рис. 2), уровень экспрессии форм DIP-c и Klett-a повышен. В линиях flamenco +, SS, MS на стадии личинок транскрипции гена не выявлено. Однако в линии Oregon R (+Y+3) уровень транскрипции гена DIP увеличен, что, по-видимому, связано с наличием дополнительного промотора в области начала гена DIP1.

Рис. 2. Экспрессия гена DIP1 на разных стадиях развития мух линий flamenco+ (1), SS (2), MS (3), Oregon R (+Y+3) (4). Использованы пары праймеров: А. DIP d4-DIP r2 для оценки кДНК с ATG1;

Б. DIP d2-DIP r2 для оценки кДНК с ATG2. В. Контрольная амплификация кДНК гена rp49. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты. Маркер размера фрагментов ДНК (п.н.) (дорожка L) – GeneRuler DNA Ladder Mix («Fermentas»).

Обнаруженные нами многочисленные траскрипты свидетельствуют о многофункциональности гена. Но исследование его функции с помощью инактивации невозможно в связи с тем, что ген является жизненно важным (De Felice et al., 2004). Поэтому нами решено было провести сравнительный анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у других видов Drosophila, близкородственных D. melanogaster.

Структурная организация и анализ экспрессии гомологов гена DIP1 в геномах D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba В настоящее время в базе данных FlyBase представлены секвенированные последовательности геномов двенадцати различных видов рода Drosophila.

Наиболее близкими по структуре к гену DIP1 D. melanogaster являются гомологи, обнаруженные у представителей подгруппы melanogaster:

D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba (Рис. 3А).

ПЦР-анализ хромосомной ДНК видов подгруппы melanogaster на наличие копий HB показал, что копии этого МГЭ присутствуют в геномах всех видов подгруппы, но ни в одной из нуклеотидных последовательностей гомологов гена DIP1 копий HB нет. Геном D. mauritiana в настоящее время не секвенирован, в отличие от геномов D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba, поэтому амплифицированные фрагменты были нами клонированы и секвенированы.

Рис. 3 А. Эволюционное древо представителей подгруппы melanogaster, стрелкой показано внедрение НВ в геном D. melanogaster. Б-Е. Амплифицированные фрагменты ДНК и кДНК гена DIP1 и его гомологов видов D. melanogaster (mel), D. sechellia (sec), D. simulans (sim), D. mauritiana (mau), D. yakuba (yak), D. erecta (ere). Использованы пары праймеров: Б. ДНК, амплифицированная с праймерами DIPd1-DIPr1, +HB и –HB обозначено наличие/отсутствие HB внутри гена DIP1 и его гомологов;

В. кДНК, амплифицированная с праймерами DIPd1-DIPr1. Г. ДНК, амплифицированная с праймерами DIPd2-DIPr1;

Д. кДНК, амплифицированная с праймерами DIPd2-DIPr1;

Е. Контрольная амплификация кДНК гена rp49. Маркер молекулярного веса размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L) Анализ секвенированных последовательностей показал, что гомолог DIP у D. mauritiana, также как и гомологи гена у D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba, действительно не содержит HB. Этот мобильный элемент ранее перемещался по геному и попал в ген DIP1 после отделения D. melanogaster от общего эволюционного древа подгруппы melanogaster (Рис. 3А).

В области, соответствующей альтернативному первому экзону, у D. sechellia, D. simulans и D. mauritiana обнаружены делеции, которые приводят к изменению экспрессии гомологов гена DIP1. У D. erecta и D. yakuba организация района совпадает с таковой у D. melanogaster.

Анализ экспрессии форм, образующихся с альтернативного первого экзона, однозначно свидетельствует об экспрессии форм Klett-a/Klett-b у D. erecta (Рис. 3Б-Е). У D. sechellia, D. simulans и D. mauritiana экспрессии с альтернативного первого экзона не обнаружено.

Таким образом, альтернативные формы транскриптов гена DIP1 (Klett a/Klett-b) отсутствуют у более молодых, чем D. melanogaster, видов дрозофилы, и есть у более древних. По-видимому, альтернативные формы, не являясь основными у D. melanogaster, не поддерживались в процессе эволюции отбором, что привело к их утрате более молодыми видами. Отличия, связанные с изменением экспрессии гена DIP1, могут стать причиной формирования генотипа flamenco и быть следствием инсерции в область локализации локуса flamenco. Инсерция в свою очередь может влиять на экспрессию и соседних с DIP1 генов.

Анализ экспрессии кластера генов CG32500, CG32819 и CG14476 у D. melanogaster По данным FlyBase ОРС CG32500, CG32819 и CG14476 содержат в кодируемой ими последовательности высоко консервативные домены. Размеры амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК с парами праймеров совпадали с теоретически ожидаемым.

Мы установили, что экспрессия гена CG32500 на уровне транскрипции происходит на всех стадиях развития D. melanogaster. В результате ПЦР амплификации получен продукт размером ~800 п.н. (Рис. 4А), что соответствует продукту сплайсинга пре-мРНК согласно базе данных (FlyBase).

Мы не обнаружили различий в экспрессии гена CG32500 в линиях flamenco и flamenco+.

Анализ данных по экспрессии гена CG32819 (рис. 4Б), свидетельствует о том, что он транскрибируется только у эмбрионов, а размеры синтезируемой РНК соответствуют данным FlyBase (1803 п.н. и 1560 п.н.). Форма 1560 п.н.

образуется в результате альтернативного сплайсинга (Рис. 4Б). На стадии личинок и имаго продуктов амплификации не выявлено. Таким образом, мы установили, что функция гена CG32819 важна только на ранних этапах развития дрозофилы во всех линиях. Различий в транскрипции между линиями flamenco и flamenco+ не выявлено.

Рис. 4. Амплифицированные фрагменты на стадиях развития: эмбриональной, личинки 3 возраста, имаго. Линии flamenco+ (flam+), SS, MS, Oregon R (+Y+3) (OreR).

Использованы пары праймеров: А. фрагменты гена CG32500;

Б. фрагменты гена CG32819;

В.

фрагменты гена CG14476. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты (в п.н.). Г. фрагменты гена rp49. Маркер молекулярного веса размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L) Выявить различия в экспрессии гена CG14476 в линиях с генотипами flamenco+ и flamenco также не удалось (Рис. 4В). Продукт ОТ-ПЦР обнаружен на стадии имаго и у эмбрионов, у личинок экспрессия этого гена детектируется слабо (Рис. 4В). Размер полученного фрагмента (~2800 т.п.н.) соответствует размеру, представленному в базе данных.

Полученные нами данные по экспрессии генов кластера у D. melanogaster, свидетельствуют о том, что гены CG32500, CG32819 и CG14476 не участвуют в формировании генотипа flamenco.

Эволюционный анализ кластера генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476 у разных видов Drosophila Подобная структурная организация 8 ОРС – трипликация генов CG32500, CG32819 и однонаправленность их транскрипции – может быть следствием геномных перестроек, в которых могли принимать участия МГЭ.

Транспозиции, приведшие к образованию кластера D. melanogaster, можно проследить при сравнительном анализе генов, гомологичных генам DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, у разных видов Drosophila.

Рис. 5. Эволюция кластера генов района локуса flamenco. Показаны гомологи генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476. Вертикальными стрелками – возможные этапы сборки генов в кластер. В круг обведены гены, которые повторены 3 раза у D. melanogaster.

Исследования проводились с помощью биоинформатического анализа секвенированных геномов видов дрозофилы, находящихся в разной степени филогенетического родства. Последовательности геномов разных видов Drosophila секвенированы в конце 2007 года и размещены в базе данных FlyBase, но они еще не аннотированы.

Гомологи исследуемых генов кластера обнаружены в геномах всех исследованных видов.

На основании проведенного биоинформатического анализа построена схема эволюции кластера генов района flamenco (Рис. 5).

Таким образом, гомологи генов кластера района локуса flamenco присутствуют в геномах всех анализируемых видов, но ни в одном из них структурная организация района не повторяет строение кластера у D. melanogaster.

Ген DIP1 консервативен у всех видов, причем у D. sechellia и D. simulans он существует в нескольких структурных вариантах. Таким образом, функция гена DIP1 является консервативной в разных видах дрозофилы.

Поиск РНК-предшественника piРНК в области локализации локуса flamenco В области локуса flamenco обнаружено значительное количество piРНК, участвующих в подавлении транспозиций МГЭ (Brenneckе et al., 2007). Была выдвинута гипотеза, что в этой области транскрибируется длинная молекула предшественник с антисмысловой цепи гена DIP1, дающая начало piРНК (Brennecke et al., 2007). Область локализации ближайшей к гену DIP1 piРНК картирована на расстоянии ~2500 п.н. от начала гена (Рис. 6).

Если предположить, что в линиях с генотипом flamenco+ образуется единый однонитевой РНК-предшественник piРНК, который в результате процессинга дает начало множеству piРНК, то, очевидно, в линиях с генотипом flamenco механизм образования коротких молекул РНК нарушен.

Причин нарушения может быть как минимум две: цельный транскрипт или не образуется в результате нарушения инициации транскрипции, или образуется, но не подвергается дальнейшему процессингу. Поиск единого РНК предшественника piРНК был проведен методом ОТ-ПЦР с подобранными специфическими праймерами на РНК, выделенной из яичников линий flamenco+, MS, SS, Oregon R (+Y+3). Область исследования, праймеры и размер продуктов указаны на Рис. 6.

Анализ ПЦР-продуктов на матрице кДНК подтвердил гипотезу о существовании в исследуемой области продуктов транскрипции. Продукты обнаруживаются как в районе между началом гена DIP1 и первой piРНК, так и внутри гена DIP1. Уровень экспрессии в линиях с генотипом flamenco снижен по сравнению с уровнем в линии flamenco+ (данные не приведены).

Таким образом, общий уровень экспрессии области с генотипом flamenco в линиях SS и Oregon R (+Y+3) ниже, чем в линиях с генотипом flamenco+, что может быть связано со структурными особенностями линий: наличие вставки во втором интроне гена DIP1 в линиях SS и Oregon R (+Y+3) и увеличение области начала гена DIP1 в линии Oregon R (+Y+3) на 173 п.н.

Мы предположили, что молекула РНК-предшественника piРНК может транскрибироваться с промотора МГЭ НВ, локализованного в составе гена DIP1. Этому способствует направление транскрипции МГЭ НВ противоположное транскрипции гена DIP1 (Рис. 6). Биоинформатическим методом определена область предполагаемого промотора в элементе HB (Рис.

7Б), кроме промотора на комплементарной цепи гена DIP1 выявлены и другие промоторы (Рис. 7Б).

Рис. 6. Схема расположения праймеров в области локуса flamenco. Фигурными скобками показаны амплифицированные фрагментов кДНК, указаны их размеры. Обозначен HB внутри второго интрона гена DIP1 и его предполагаемый промотор (Потапова и др., 2009).

Обозначена предполагаемая молекула-предшественник. Треугольником обозначена инсерция (~1,5 т.п.н. от начала гена DIP1), приводящая к генотипу flamenco. Пунктиром показано положение центромеры относительно района локуса flamenco. Вертикальными пронумерованными линиями обозначены точки для анализа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Для установления предполагаемой области начала транскрипции были подобраны несколько праймеров до и после предполагаемой точки начала транскрипции (Рис. 7А). В качестве матрицы для постановки ОТ со специфическим праймером RT1 for1 использовали РНК линий flamenco+, MS и Oregon R (+Y+3), выделенную из яичников.

А Б Рис. 7. Поиск области предполагаемого промотора в последовательности HB. А. Схема локализации праймеров в гене DIP1. Отмечена предполагаемая область промотора, показан размер HB элемента. Штрих-линией обозначены продолжения гена DIP1. Б. Диаграмма с обнаруженными биоинформатически промоторами. По оси Y отложена вероятность нахождения промотора, по оси Х протяжённость DIP1 и прилегающей области в п.н. В круг обведена наиболее вероятная промоторная последовательность (вес (score) 0.8), в скобках указаны некоторые значения веса.

Среди продуктов амплификации выявлены фрагменты нужной длины (соответствуют длине фрагментов, представленных в базе данных) с парами праймеров RT1 for1-RT1 rev1 и RT1 for1-RT1 rev2 (Рис. 7А). ПЦР-продукт с парой праймеров RT1 for1-RT1 rev3 обнаружен не был, что свидетельствует об отсутствии РНК-матрицы в конце второго интрона гена DIP1, левее предполагаемого промотора.

В то же время при наличии амплифицированного фрагмента с праймерами RT1 for1-RT1 rev2 можно утверждать о сдвиге области предполагаемого промотора. Тем более биоинформатический анализ показал возможность такого сдвига в район 3'-конца гена DIP1 (Рис. 7Б).

Таким образом, мы обнаружили, что молекула РНК-предшественника образуется как в линии flamenco, так и flamenco+, но обнаруженные ранее в линиях MS, SS и Oregon R (+Y+3) структурные изменения могут влиять на количество анализируемой матрицы.

Исследование области локуса flamenco методом ПЦР в реальном времени Нами были подобраны пары праймеров в области flamenco (на Рис. вертикальными пронумерованными линиями показаны анализируемые точки).

Для постановки ОТ в качестве затравок использовали 6 пар праймеров, которые отжигались одновременно на одной и той же матрице РНК, выделенной из яичников или семенников. Это позволяло оценить уровень транскрипции РНК исследуемых линий с генотипами flamenco+ и flamenco по шести точкам. На рисунке 8 представлен график, соответственно, экспрессии в яичниках по шести анализируемым точкам в линиях flamenco+, MS и Oregon R (+Y+3).

Линию SS в данных экспериментах не использовали.

Из графика на Рис. 8 видно, что в линии с генотипом flamenco+ экспрессия в районе локализации гена flamenco в целом выше, чем в линии MS и Oregon R (+Y+3), особенно, в точках между началом гена DIP1 и началом скопления МГЭ. Скорее всего, это связано со структурными отличиями линий с генотипом flamenco: наличие вставки в районе HB (линии MS, SS и Oregon R (+Y+3)), вставка в область начала гена DIP1 (линия Oregon R (+Y+3)).

Область между геном DIP1 и первой обнаруженной piРНК, видимо, является регуляторной, поэтому в линии flamenco+, где не нарушена регуляции транспозиции МГЭ, она экспрессируется с большей эффективность и далее происходит снижение экспрессии за счет процессинга однонитевого транскрипта. Причем процессинг начинается только в районе скопления МГЭ, а в районе возможной регуляции остается на высоком уровне.

Рис. 8. РНК-предшественник в яичниках линии flamenco+, MS и Oregon R (+Y+3).

Суммарные данные 7 независимых экспериментов нормализованы относительно референсного гена rp49.

В линии MS снижена экспрессия исследуемого района (Рис. 8).

Уменьшение количества РНК-предшественника выявляется во втором интроне гена DIP1, что связано с наличием вставки в HB. Далее РНК обнаруживается во всех исследуемых точках, в том числе в области скопления дефектных копий МГЭ. Одинаковый уровень РНК в точках 3-5 (Рис. 8) свидетельствует о нарушении функции процессинга РНК-предшественника. Таким образом, можно предполагать, что вставка IdSS влияет на уровень экспрессии РНК предшественника. Его процессинг может быть нарушен вследствие мутаций в генах, кодирующих белки, которые участвуют в биогенезе коротких молекул РНК (Plisson et al., 2007).

Как и в линии MS, в линии Oregon R (+Y+3) наблюдается стабильный сниженный уровень экспрессии РНК. Снижение экспрессии выявлено только в области HB. Не исключено, что вставка внутри гена DIP1 влияет только на количество образованного транскрипта. В результате, полноценная молекула РНК-предшественника подвергается процессингу. В данном случае генотип flamenco не является следствием структурных изменений и обусловлен наличием другого, отличного от линии MS, аллеля flamenco. По-видимому, генотип flamenco в линии Oregon R (+Y+3) обусловлен снижением количества РНК, получающихся в результате процессинга.

Аналогичным образом по 5 точкам был исследован район локализации локуса flamenco на РНК, выделенной из семенников. Экспрессия в данном районе в линиях с генотипом flamenco не проявляет никаких закономерностей.

По-видимому, локус flamenco не принимает участие в сперматогенезе, в отличие от самок, для которых было доказано, что данный локус функционирует во время гаметогенеза. (Brennecke et al., 2007).

ВЫВОДЫ В исследованных линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу 1.

flamenco, внутри дефектного мобильного генетического элемента HВ, расположенного во втором интроне гена DIP1, выявлена инсерция (IdSS) размером 182 п.н., которая принимает участие в экспрессии локуса flamenco.

Анализ экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogaster, отличающихся по 2.

статусу локуса flamenco, на разных стадиях развития показал, что в линии Oregon R (+Y+3), мутантной по локусу flamenco, транскрипция этого гена происходит на всех стадиях развития (эмбрионы, личинки, имаго), тогда как в других линиях этот ген на стадии личинок не транскрибируется. По видимому, в линии Oregon R (+Y+3) экспрессия гена DIP1 видоизменяется под влиянием нуклеотидной вставки размером 173 п.н., расположенной в промоторной области гена.

Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 и его гомологов показал, что у 3.

D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana первый альтернативный экзон представлен только одним структурным вариантом. По-видимому, функционально значимым является лишь один из альтернативных вариантов первого экзона гена DIP1.

Исследована экспрессия генов CG32500, CG32819 и CG14476, образующие 4.

с геном DIP1 единый кластер, на уровне транскрипции. Обнаружено, что транскрипция CG32819 и CG14476 происходит стадиеспецифично.

Показано, что гены CG32500, CG32819 и CG14476 в линиях flamenco и flamenco+ по экспрессии не отличаются. Вероятно, эти гены не принимают участие в регуляции транспозиций мобильных генетических элементов.

Показано, что в линии MS, мутантной по локусу flamenco, транскрипция 5.

этого локуса не снижается в отличие от других линий. По-видимому, в линии MS транскрипт, образующийся в области этого локуса, не подвергается процессингу, что коррелирует с транспозициями мобильного элемента gypsy.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-00693 и частичной поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2011 г.г.).

Список работ опубликованных по теме диссертации Статьи в журналахсоответствующих Перечню ВАК:

1. Нефедова Л.Н., Потапова М.В., Романова Н.И., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco // Генетика. 2009. Т. 45. №2. С. 203-208.

2. Нефедова Л.Н., Коростин Д.О., Потапова М.В., Ким А.И. Молекулярно генетический анализ регуляторного гена DIP1 у разных видов Drosophila // Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №4. С. 8-13.

3. Потапова М.В, Нефедова Л.Н., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии кластера генов Drosophila DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в область гена flamenco // Генетика. 2009. Т. 45. №10. С. 1339-1346.

Тезисы конференций:

1. Ким А.И., Потапова М.В., Нефедова Л.Н. Структурная организация гена DIP1 в генетически нестабильных линиях D. melanogaster. Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию ИОГен им.Н.И.Вавилова РАН. 28 июня-2 июля 2006 г. Москва.

С. 87.

Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование гена DIP1 и его 2.

связи с геном flamenco у Drosophila melanogaster. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 11-14 апреля 2007 г. Секция «Биология». Москва:

Макс-Пресс. С. 59.

3. Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование района гена flamenco у Drosophila melanogaster. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. 8-11 апреля 2008.

Секция «Биология». М.: Макс-Пресс. С. 76-77.

4. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2009». Секция «Биология». 13-18 апреля 2009 г. С. 100.

5. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009. Часть 2. С.

81.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.