авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Анастасия юрьевна возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина

На правах рукописи

УДК 57.6+57.034:577.175.829

Беспятых Анастасия Юрьевна

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС И ВЛИЯНИЕ НА НИХ МЕЛАТОНИНА

03.03.05 – биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук Голиченков Владимир Александрович Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Антохин Александр Иванович ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва доктор биологических наук Онищенко Галина Евгеньевна Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва

Ведущая организация:

Институт общей генетики РАН, Москва

Защита состоится 21 декабря 2010 года в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан «…» ноября 2010 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Накопленные сведения о природе старения позволяют предположить, что среди старческих изменений существенна потеря интегративных свойств системами организма разного уровня и, прежде всего, клеточными популяциями.

Степень кооперации клеток в популяции является отражением межклеточных взаимодействий составляющих ее клеток. Для изучения межклеточных взаимодействий В.Я.

Бродским с сотрудниками был разработан метод оценки клеточной кооперации по ритму синтеза белка в первичной культуре гепатоцитов крысы (Brodsky et al., 1992, 2000).

Было показано, что синтез белка в такой культуре не происходит хаотически, а представляет собой сложный колебательный процесс с периодом около 30-60 мин околочасовой ритм. Выраженность усредненного ритма в клеточной популяции зависит от степени синхронизации клеток, т.е. от состояния межклеточных взаимодействий в популяции (Brodsky et al., 2004).

Показано, что для синхронизации клеток культуры необходима определенная концентрация синхронизирующих факторов, выделяемых клетками в среду. Такими факторами могут быть ганглиозиды, норадреналин и фенилэфрин (Brodsky, 2006).

Было показано, что одним из основных событий каскада реакций, вызываемого в клетках синхронизаторами, является высвобождение ионов Ca2+ из внутриклеточных депо (Brodsky, 2006). Так как все внутриклеточные синтезы, так или иначе, запускаются за счет изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток, при высокой степени межклеточных взаимодействий можно ожидать синхронности динамики уровня кальция между отдельными клетками. Известно, что с возрастом динамика кальциевых сигналов нарушается (Camello-Almaraz et al., 2008).

При исследовании ритма синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс показано, что амплитуда колебаний синтеза белка в такой культуре вполовину меньше, чем у молодых крыс, что коррелирует с уменьшением количества норадреналина в крови и ганглиозидов в печени с возрастом. Добавление же этих синхронизирующих веществ, а также сыворотки крови молодых крыс в среду вызывает увеличение амплитуды ритма синтеза белка в плотных культурах старых крыс и достижению ею уровня амплитуды ритма молодых крыс (Brodsky et al., 2004, 2005). В связи с этим, для старения как процесса десинхронизации клеток организма первично изменение свойств межклеточного посредника, а поиск различных веществ, усиливающих степень кооперации клеток, представляет особый интерес.

Маркером старения организма может служить не только изменение степени межклеточных взаимодействий, но и возрастное изменение уровня некоторых белков в клетках.

Так, показано, что после наступления половой зрелости самцов крыс в клетках печени начинает прогрессивно снижаться экспрессия эстрогенсульфотрансферазы (фермента, инактивирующего эстрогены в их организме (Chatterjee et al., 1994).

Известным синхронизатором ритмов высокого порядка в организме (суточных и сезонных) является мелатонин, который выступает в качестве ритмоводителя и осуществляет интеграцию организма в целом. Так как все изученные циркадианные ритмы включают в себя околочасовые (Brodsky, 2006), вполне вероятен вклад мелатонина и в регуляцию кооперации индивидуальных клеток. Также показано непосредственное участие мелатонина в межклеточных взаимодействиях путем изменения состояния щелевых контактов (Gall et al., 2000, Blackman et al., 2001, Peters et al., 2005), повышения экспрессии коннексинов и диффузии вторичных мессенджеров по ним (Kojima et al., 1997, Blackman et al., 2001).

Содержание мелатонина в крови с возрастом уменьшается, что коррелирует со снижением межклеточных взаимодействий (Анисимов, 2004). Показано, что пересадка эпифизов от молодых крыс старым вызывает значимое увеличение продолжительности их жизни (средней и максимальной), в то время как обратная пересадка уменьшает соответствующие показатели (Pierpaoli et al, 1994). Также было установлено, что долговременное введение мелатонина старым мышам in vivo нивелирует возрастное снижение секреции и нарушения кальциевого сигнала в клетках поджелудочной железы (Camello-Almaraz et al., 2008). Таким образом, мелатонин способен предотвращать проявления старения, действуя, возможно, через повышение кооперативных свойств клеток.

На мембране гепатоцитов обнаружены рецепторы к мелатонину (Pandi-Perumal et al., 2008), кроме того, показано, что мелатонин как паракринный фактор выделяется энтерохромаффинными клетками пищеварительного тракта и может присутствовать в межклеточной среде пищеварительных желез (Camello-Almaraz et al., 2008). Все это позволяет предположить участие мелатонина в координации работы клеток в клеточной популяции и способность восстанавливать степень их кооперации, снижающуюся с возрастом.

Таким образом, целью нашей работы было исследование влияния мелатонина на возрастные изменения кооперативных свойств и метаболических показателей гепатоцитов. В задачи работы входило исследование: 1) влияния мелатонина на степень синхронизации синтеза белка в первичной культуре гепатоцитов крыс как модели межклеточных взаимодействий;

2) влияния мелатонина на синхронизацию синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс;

3) влияния мелатонина на характер динамики содержания ионов кальция в клетках первичной культуры гепатоцитов молодых и старых крыс;

4) влияния долговременного введения мелатонина старым крысам на динамику ионов кальция в культуре их гепатоцитов;

5) влияния долговременного введения мелатонина на возрастные изменения метаболической активности печени старых крыс (экспрессию эстрогенсульфотрансферазы).

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате исследования впервые показано влияние мелатонина на синхронизацию околочасового ритма синтеза белка в клетках разреженных культур гепатоцитов молодых крыс, то есть в условиях низкого уровня межклеточной коммуникации. Впервые выявлены долговременные флуктуации уровня внутриклеточного Ca2+ в культуре гепатоцитов крыс. Показано, что степень синхронности флуктуаций уровня Ca2+ в клетках снижается при уменьшении концентрации их в культуре, а добавление мелатонина к разреженным культурам восстанавливает синхронность.

Установлено, что при старении крысы и выраженность ритма синтеза белка, и динамика долговременных флуктуаций уровня Ca2+ в культурах гепатоцитов нарушается, как и при разрежении культур молодых клеток, то есть наблюдается снижение коммуникативных свойств. Показана способность мелатонина нивелировать возрастные нарушения степени синхронности гепатоцитов у старых крыс по обоим исследованным параметрам.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и лаборатории цитологии Института биологии развития им.

Н.К.Кольцова РАН, XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008г.), конференции Фундаментальная наука и клиническая медицина (Санкт-Петербург, 2008), I Российском съезде по хронобиологии и хрономедицине с международным участием (Владикавказ, 2008), IX Международном Симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них статей - 2, монография – 1, тезисов конференций – 5.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах и состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы»

и «Приложение». Работа включает 4 таблицы и 29 иллюстраций. Список цитированной литературы содержит 389 наименований, из которых 19 на русском, 370 на иностранных языках.

Список использованных сокращений: ПК – плотные культуры гепатоцитов, РК – разреженные культуры гепатоцитов, М – мелатонин, ОФ – относительная флуоресценция.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили первичные суточные культуры гепатоцитов самцов крыс линии Wistar. Культуры клеток получали из печени молодых (3-4 мес.) и старых крыс (24 мес.).

Для изучения динамики экспрессии эстрогенсульфотрансферазы дополнительно исследовали самцов крыс в возрасте 7 месяцев. Всего было использовано 36 животных. Крыс содержали в виварии в стандартных условиях кормления и содержания. Эксперименты по выделению культур начинали в одно и то же время.

1.Получение культуры гепатоцитов. Крысу наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг веса), вскрывали брюшную полость и перфузировали через воротную вену печени бескальциевым рас твором Хенкса с 0.5 мМ ЭГТА и 0.05%-ным раствором коллагеназы IV в среде 199 по методике (Brodsky et al, 1992, 2000). Для определения экспрессии эстрогенсульфотрансферазы кусочки перфузированной печени массой 30-35 мг помещали в Tri-reagent (Sigma) при -20С для дальнейшей обработки. Количество выделенных клеток подсчитывали при помощи сортера клеток Scepter (Millipore), жизнеспособность их проверяли методом окрашивания клеток трипановым синим (в экспериментах использовали культуры, содержащие около 90% живых клеток). Суспензию разводили средой до концентрации около 106 (ПК) или 105 (РК) кл./мл, разливали в чашки Петри с покровными стеклами, предварительно покрытыми коллагеном, и культивировали клетки в CO2-инкубаторе при 37 0С с 5% CO2. Через сутки инкубации культуры промывали, переносили в свежую среду 199 и исследовали соответствующими методами.

з 2. Исследование кинетики синтеза белка по включению Н-лейцина. Для этих экспериментов было использовано 4 старых и 4 молодых крысы. Пробы для каждой точки инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°С в среде с 3Н-лейцином (92.5 - 110.0 Бк/мл, специфическая молярная активность 259-370 1010 Бк/ммоль). На каждую временную точку (каждые 10 мин) брали по 3 пробы (три стекла) последовательно в течение 2 ч. Культуры промывали холодной средой (физиологический раствор для теплокровных с немеченым лейцином в концентрации около 1 г/л) и обрабатывали холодной (4оС) 5%-ной хлорной кислотой в течение 90 мин (экстракция не включившейся в белки метки). Затем культуры промывали 96%-ным этиловым спиртом (2-3 мин) и клеточные белки растворяли гиамином (Sigma) в течение примерно 12 ч. Радиоактивность лейцина в белках и небелковой кислоторастворимой фракции, т.е. свободного лейцина в клетках, измеряли на каждом стекле, используя сцинтилляционный счетчик LKB 1214 Rackbeta (Швеция). Относительное включение лейцина Icorr, характеризующее интенсивность синтеза белка для каждой пробы, рассчитывали по формуле Icorr = Ii Pv / Pi (импульс / мин), где Ii- включение лейцина в белки в пробе за 10 мин;

Рi - общая радиоактивность определенной пробы, равная Ii + pi, где pi - радиоактивность пула той же пробы (радиоактивность не включившейся в белки метки), и Pv- средняя радиоактивность проб определенного опыта (например, для 2-часового опыта - 36 стекол). Использование относительной величины Icorr исключает влияние на уровень радиоактивности различий пула 3Н-лейцина, варьирующего числа клеток в разных культурах и небольших вариаций температуры и рН среды в течение опыта (Вгоdsку еt аl., 2000). Результаты измерений трех стекол каждой пробы усредняли. Каждый опыт ставили на культурах гепатоцитов одной крысы.

3. Исследование динамики уровня ионов кальция в культуре гепатоцитов. Выявление динамики цитоплазматического кальция проводили на суточных культурах гепатоцитов крыс по методике Rooney et al., 1989 и Wang et al., 2007. В данной части работы было использовано 25 животных, из них 17 молодых и 8 старых, от них были получены 46 и 38 культур, соответственно, в которых исследовали 1855 и 2546 клеток. Клетки культуры витально окрашивали флуоресцентным красителем Fluo-3 AM (Fluka) в концентрации 5 мкМ в течение 20 мин при 37С (в темноте), после чего отмывали и исследовали на конфокальном микроскопе Zeiss Axiovert 200 M с конфокальной приставкой LSM 510 Meta в термостатируемой камере.

Съемки клеток проводили с использованием лазера с длиной волны 488 нм, каждое поле клеток фотографировали через 14 с в течение примерно 20 мин. Параметры съемки были одинаковы для каждого эксперимента. Клетки при этом сохраняли свою морфологию и жизнеспособность (проверялась по окрашиванию культуры клеток йодистым пропидием (Sigma, 1:100) после съемки).

Для каждой культуры проводили съемку нескольких случайно выбранных полей зрения, на которых суммарно регистрировали 50-60 клеток. Данные, описывающие динамику ОФ на единицу площади клетки за время съемки, получали для каждого индивидуального гепатоцита на фотографиях с помощью программы ImageJ. Полученные данные для каждой культуры обрабатывали при помощи программы Stadia, а также средствами Microsoft Excel и определяли коэффициент синхронизации культуры. Для этого рассчитывали коэффициенты корреляции между рядами данных попарно для всех клеток данной культуры, а величину коэффициента синхронизации определяли по формуле Ксинхр = К0,6 / n, где К0,6 - число коэффициентов корреляции выше 0,6, n – число пар сравнений Коэффициенты синхронизации для каждого типа суточных культур, вычисленные в разных экспериментах, усредняли. Синхронными считали культуры с Ксинхр0,6.

4. Влияние мелатонина на синхронизацию ритма синтеза белка и динамику уровня ионов кальция в культуре гепатоцитов. Для обработки клеток использовали раствор синтетического М (Aldrich Chem. Co). Суточные культуры импульсно обрабатывали раствором М на среде в определенных концентрациях. Для исследования геропротекторного влияния М на старых крыс самцы в возрасте 19 месяцев были разделены на 2 группы – контрольную и опытную (по 4 животных в каждой). Опытная группа получала в течение месяцев М с питьевой водой (5 мг/день/кг веса), доступ к воде не ограничивали.

5. Определение метаболической активности печени по уровню экспрессии эстрогенсульфотрансферазы.

Выделение тотРНК проводили из кусочков перфузированной печени молодых (3-4 мес., животных), старых крыс (24 мес., 8 животных), а также крыс в возрасте 7 месяцев (3 крысы), хранившихся при -70С, при помощи смеси TRI® Reagent (Sigma, США) по протоколу, предоставленному производителем.

Получение и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице мРНК печени крыс разного возраста при помощи M-MLV обратной транскриптазы и олиго(дТ)15 праймеров (Силекс М, Россия). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов кДНК были предварительно отнормированы по гену глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы GAPDH. Нуклеотидная последовательность праймеров к GAPDH, размер ПЦР-фрагмента - в таблице 1.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили на матрице кДНК с помощью ColoredTaq полимеразы, дНТФ и реакционного буфера (набор для амплификации ДНК фирмы Силекс М).

Названия анализируемых генов, структуры и положение праймеров, а также размеры соответствующих ПЦР-фрагментов перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Праймеры для ПЦР-анализа.

Размер ПЦР Ген Структура праймеров фрагмента, н.п.

Пр. 5 gagacttctatgcctgaatact 3 (экзон 2) Ste Обр. 5 attagatcttcatttctgcactcc 3 (экзон 3) Пр. 5 gagacttctatgcctgaatact 3 (экзон 2) Ste Обр. 5 attagatcttcatttctgcactcc 3 (экзон 3) Пр. 5 tgcagtgccagcctcgtctcatag 3 (экзон 1) GAPDH Обр. 5cccttttggccccacccttcag 3 (экзон 1) Условия амплификации: 940С – 1 мин, 600С – 45 сек, 720С – 1 мин, 30 циклов. Для анализа ПЦР-продуктов использовали 1.5% агарозный гель в трис-ацетатном буфере.

Статистическую обработку результатов проводили, используя пакеты программ Harwards 6.

Grafic и Microsoft Excel и методы описательной статистики с использованием программы Stadia. Для выявления скрытых периодичностей в кинетике синтеза белка данные обрабатывали с использованием автокорелляционного анализа временных рядов (Мерсер, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние мелатонина на степень синхронизации синтеза белка в первичной культуре гепатоцитов крыс Эту часть работы проводили на ПК и РК молодых крыс. Маркером клеточной синхронизации являлось увеличение амплитуды суммарного синтеза белка клетками культуры и/или появление в ней ритма синтеза белка.

При исследовании влияния М на суточные РК гепатоцитов 3х-месячных крыс, в норме не синхронные, было показано, что 10-минутное воздействие М во всех исследуемых концентрациях (1, 500 или 1000 нМ) приводит к появлению достоверных колебаний уровня включения меченого лейцина в культурах (рис. 7), отражая синхронизацию клеток. Поскольку действие физиологических веществ часто имеет дозовую зависимость, мы исследовали не только влияние концентрации, но и времени действия. Для исследования влияния временной составляющей действия М провели опыт с 5-минутным инкубированием в среде с 1 и 50 нМ М (рис. 8). Контролем служили РК в среде без М. Инкубация в течение 5 мин также приводила к синхронизации клеток в РК даже при значительном снижении концентрации препарата.

Добавление 0,5 нМ М в среду (инкубация в течение 5 мин) не вызывало синхронизации клеток по сравнению с контролем.

Т. о., впервые было показано, что М синхронизует ритм синтеза белка в отдельных клетках РК молодых крыс, а также была выявлена минимальная действующая доза М (1 нМ, 5 мин инкубации), приводящая к синхронизации ритмов синтеза белка в культуре гепатоцитов.

По сравнению с контролем во всех обработанных РК молодых крыс достоверно увеличивался размах амплитуды колебаний синтеза белка, что подтверждает повышение степени синхронности культур. По мере увеличения концентрации М максимальная амплитуда колебаний синтеза белка достоверно повышалась (р0,05), что, вероятно, связано с усилением синхронизующей способности М за счет влияния на большее число клеток (так как на большие концентрации М реагируют клетки с более высоким порогом чувствительности, что подтверждено также для других типов клеток (Gaspers and Thomas, 2005).

Автокорреляционный анализ данных по интенсивности синтеза белка в культурах молодых крыс, обработанных разными дозами М, выявил отчетливый ритм синтеза белка. При этом ритм синтеза белка в культуре, обработанной 1 нМ М, не имел постоянного периода, в культурах, обработанных 50 и 1000 нМ М, имел период 30 мин, а в культуре, обработанной нМ М, - 20 мин. Такую зависимость, вероятно, можно объяснить следующим образом.

Известно, что околочасовые ритмы характеризуются крайней вариабельностью периодов Рис. 7 Влияние 10-минутной инкубации в М на Рис. 8. Влияние 5-минутной инкубации в М на синхронизацию РК молодых крыс синхронизацию РК молодых крыс колебаний (периоды колебаний синтеза белка могут варьировать от 20 до 120 мин) (Brodsky, 2006). Возможно, в нашем случае нерегулярность периодов колебаний объясняется разной чувствительностью клеток к М в популяции гепатоцитов. Если в ритме синтеза белка в данной культуре период колебаний не выявляется (культура, обработанная 1 нМ М), можно предположить, что причиной этого является либо отсутствие синхронности в синтезе белка отдельными клетками, либо наличие в культуре нескольких синхронных внутри себя, но несинхронных между собой популяций или одной небольшой синхронной популяции. Так как примененные методы автокорреляционного анализа достоверно свидетельствуют об усилении суммарного синтеза белка и увеличении амплитуды ритма синтеза белка в данной культуре, а доза гормона очень низкая, вероятнее всего, здесь мы имеем дело именно с последним случаем (одной синхронной популяцией). При этом период колебаний синтеза не выявляется, вероятно, из-за наложения периодов синтеза отдельных клеток на период синтеза белка клеток синхронной популяции. При повышении концентрации М число реагирующих на него клеток растет, в связи с чем, возможно, происходит увеличение числа синхронных популяций.

Синхронизующий эффект М в данном случае проявляется именно в увеличении «кластеризации» клеток, то есть в образовании синхронных кластеров клеток внутри культуры.

При повышении действующей концентрации М увеличивается доля реагирующих на гормон клеток, вследствие чего общая синхронность культуры возрастает, появляется устойчивый период колебаний, а при дальнейшем увеличении действующей концентрации М частота колебаний повышается.

2. Влияние мелатонина на синхронизацию синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс Известно, что клетки ПК молодых крыс обладают большой синхронностью за счет высокой степени межклеточных взаимодействий, а степень синхронности аналогичных культур старых крыс низка. Добавление синхронизаторов в культуру приводит к повышению кооперации клеток и восстановлению их межклеточных взаимодействий, а, следовательно, и повышению степени их синхронности (Brodsky et al., 1997).

После обработки ПК старых крыс раствором М в концентрациях 1 нМ и 50 нМ в течение 5 мин (рис. 9) выявляли значимое усиление синхронизации клеток в культуре и приближение ее к уровню синхронизации культуры молодых крыс.

Автокорреляционный анализ выявил ритм синтеза белка в культурах старых крыс, обработанных М (и 1, и 50 нМ), с периодами, равными 30 мин. В культурах, обработанных нМ М, достоверно повышалась и максимальная амплитуда колебаний синтеза, то есть увеличение концентрации М повышает эффективность его действия. В культурах, Рис. 9. Влияние мелатонина на синхронизацию ПК старых крыс обработанных 1 нМ М, достоверного повышения амплитуды синтеза белка не происходило, но ритм синтеза обнаруживался, т.е. обработка клеток 1 нМ М все же ведет к кластеризации культуры (культура из слабо синхронной превращается в более синхронную, однако синхронно работающих клеток так мало, что суммарного увеличения амплитуды не выявляется).

Таким образом, впервые были продемонстрированы геропротекторные свойства М. При добавлении М к ПК старых крыс уровень кооперации клеток в них приближался к уровню синхронизации ПК молодых крыс.

Известно, что интегративным механизмом, осуществляющим межклеточные взаимодействия в нативной печени, являются щелевые контакты между клетками (Clair et al., 2001). М способен модулировать состояние межклеточных щелевых контактов, а также количество вторичных мессенджеров, в частности, Са2+ и IP3, передающихся по ним (Peters et al., 2005;

Kojima et al., 1997;

Blackman et al., 2001), и, тем самым, менять коммуникативные свойства клеток. Таким образом, для клеток печени существуют, как минимум, два различных уровня регуляции клеточной кооперации (щелевые контакты и состав межклеточной среды), поэтому сложно вычленить непосредственное влияние М в системе объединенных гепатоцитов. В наших экспериментах была использована культура разделенных клеток, лишенных контактов, когда синхронизирующий эффект М мог появляться только через межклеточную среду посредством изменения ее состава.

3. Влияние мелатонина на синхронизацию динамики ионов кальция в культуре гепатоцитов молодых крыс Оценивали организующее действие М по динамике изменения Са2+ прижизненно в отдельных клетках ПК и РК гепатоцитов в норме и под действием М. Известно, что изменение а б в) Рис. 10. Клетки а) РК (объектив 40х), б) ПК (объектив 40х), в) РК, окрашенные флуоресцентным красителем Fluo-3 AM для выявления свободного внутриклеточного кальция (объектив 10х) концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток является универсальным способом передачи разнообразных сигналов. Выявление способности М синхронизовать динамику изменения уровня ионов кальция в отдельных клетках даст ключ к пониманию возможного механизма его действия в качестве универсального интегратора организма.

В данных экспериментах действующая доза М составляла 50 нМ (10 мин инкубации), что приводило к выраженной синхронизации на модели синтеза белка.

Для данных экспериментов использовали первичные суточные культуры клеток молодых крыс (ПК и РК, рис. 10), каждый эксперимент повторяли на 14 животных.

Измерение уровня внутриклеточного кальция проводили по методике, описанной выше.

Из литературы известно, что флуоресцентный краситель Fluo-3 связывается преимущественно с ионами кальция, находящимися в цитоплазме клетки (Paredes et al., 2008). Регистрация ОФ индивидуальных клеток производилась по оптическому срезу, находящемуся в плоскости, равно отстоящей от верхней и нижней поверхности клетки. В предварительных экспериментах мы установили, что динамика ОФ клеток, зарегистрированная таким способом, отражала соответствующую динамику, зарегистрированную по всему объему клетки путем суммирования флуоресценции оптических срезов, сделанных по всей «толщине» клетки (Z стек). В последнем случае, однако, при измерениях клетки подвергались более продолжительному воздействию лазера, что приводило к неблагоприятным последствиям. Поэтому измерение ОФ решено было проводить по центральной плоскости клетки.

Регистрацию ОФ, отражающей Рис. 11. Примеры изменения уровня внутриклеточного динамики изменения кальция, проводили на индивидуальных ОФ интактных РК молодых крыс. клетках культуры каждые 14 секунд в течение приблизительно 20 минут. Примеры графиков изменения ОФ для клеток интактных РК представлены на рис. 11. Форма графиков, полученных для большого числа отдельных клеток всех типов культур, в целом, была сходна. Синхронность динамики изменения уровня ОФ отдельных клеток оценивали по сравнению степени корреляции между парами рядов значений ОФ, полученных для каждой клетки из 50- промеренных клеток одной культуры. Затем для каждой культуры вычисляли коэффициент синхронности (Ксинхр).

Необработанные ПК и РК, а также РК, обработанные М, обладают разной степенью синхронности (рис. 12) - ПК достоверно более синхронны (р0,01) по сравнению с необработанными РК (Ксинхр 0,84±0,16 и 0,21±0,15, соответственно). Действие М на РК приводит к достоверному (р0,05) повышению их Рис. 12 Сравнение средних Ксинхр синхронности (Ксинхр=0,61±0,24), по степени которой для интактных плотных и РК молодых крыс, а также РК, культуры становится практически равной ПК обработанных М (50 нМ, 10 мин). гепатоцитов – их Ксинхр достоверно не различаются.

Здесь и далее на гистограммах Таким образом, как и в модели синтеза белка, ПК указаны стандартные отклонения.

молодых крыс обладают высокой степенью синхронности, РК же несинхронны, а их обработка М приводит к повышению степени синхронности гепатоцитов, при этом уровень ее приближается к уровню синхронности ПК молодых крыс. Синхронизация отдельных клеток при действии М происходит в результате сдвига временной динамики ОФ клеток - изменение их фаз (уменьшение или повышение флуоресценции) происходит одновременно, степень кросскорреляции между рядами данных временной динамики клеток повышается, результатом чего является повышение коэффициента синхронизации культур.

Влияние мелатонина на синхронизацию 4.

динамики ионов кальция в ПК гепатоцитов старых крыс В клетках ПК старых крыс мы наблюдали значительное достоверное (р0,01) снижение синхронности по сравнению с молодыми (Ксинхр Рис. 13. Сравнение средних Ксинхр 0,84±0,16 и 0,47±0,09, соответственно, - рис. 13).

для ПК старых и молодых крыс, а Действие М на ПК старых крыс вызывает также ПК старых крыс, обработанных М (50 нМ, 10 мин). достоверное повышение их синхронизации (р0,01), при этом Ксинхр достоверно не отличается от показателя ПК молодых крыс (0,91±0,02 и 0,84±0,16, соответственно) (рис.

15). Как и при исследованиях на модели синтеза белка, в данном случае М также синхронизует ПК старых крыс, вследствие чего уровень кооперации их клеток приближается к уровню клеток ПК молодых крыс.

5. Исследование влияния долговременного введения мелатонина старым крысам на синхронизацию Рис. 14. Сравнение степени динамики ионов кальция в культурах их гепатоцитов.

синхронизации ПК молодых, Получив синхронизующий эффект М in vitro, мы старых крыс в норме и старых крыс, экзогенно получавших попытались выявить организующую способность М при М. возрастных изменениях свойств клеток in vivo при пероральном введении его в течение 4 месяцев с питьевой водой старым крысам.

При сравнении Ксинхр ПК крыс, получавших экзогенный М, с соответствующими культурами старых крыс в норме, видно, что первые достоверно более синхронизованы (0,88±0,06 и 0,47±0.09, соответственно, р0,01) и по степени кооперации клеток сходны с плотными культурами молодых крыс (Ксинхр..=0,84±0,16) (рис. 14).

Степень синхронизации ПК старых крыс значительно повышалась, более того, они были настолько же синхронны, как и ПК молодых крыс. Таким образом, впервые геропротекторное действие М на печень старых крыс было показано при пероральном получении с питьевой водой (в литературе аналогичные данные встречаются только при воздействии М на поджелудочную железу мышей, Camello-Almaraz et al., 2008). Интересно отметить также и относительно небольшой промежуток времени воздействия, необходимый для достижения эффекта. Полученные данные дают основания для возможности использования М в гериатрии.

Была проведена оценка степени синхронизации ПК и РК старых крыс, получавших экзогенный М в течение 4 месяцев, с ПК и РК молодых и интактных старых крыс (рис. 15). Для всех крыс – молодых, старых интактных и получавших экзогенный М, - соотношение между степенью синхронности клеток первичных культур без и под действием М сохраняется, то есть, ПК, полученные от каждого типа крыс, более синхронны, РК – менее, РК после действия М приближаются по уровню синхронности к ПК. Исключение составляют РК старых интактных крыс – Ксинхр для них составляет всего 0,15 ± 0,01, а после обработки М – 0,17± 0,09, то есть различия между Ксинхр недостоверны, однако для последних культур разброс данных повышается.

Полученные данные свидетельствуют, что динамика уровня цитоплазматического кальция в отдельных гепатоцитах для РК старых крыс значительно отличается от таковой в РК Рис. 15. Сравнение степени синхронизации разных типов культур старых крыс, получавших экзогенный М с культурами молодых и старых крыс в норме. ПЛОТН – ПК, РAЗРЕЖ – РК, РАЗРЕЖ+Mel – РК, обработанные М;

МОЛОД – культуры гепатоцитов интактных молодых крыс, СТАР(Mel) – культуры гепатоцитов старых крыс, получавших экзогенный М, СТАР – культуры гепатоцитов старых интактных крыс.

молодых крыс – появлялись клетки, динамика ОФ в которых выглядела как кратковременные спайки;

в РК старых крыс, получавших экзогенный М, такие спайки длились дольше (рис. б, г), также в РК обоих типов старых крыс появлялись «молчащие» клетки, уровень флуоресценции которых был несопоставимо ниже (рис. 16, а), при этом число таких клеток в культурах старых крыс, получавших экзогенный а М, было больше (доля таких клеток от общего б числа исследованных клеток культур составила 0,5 и 0,58, соответственно). Обработка М и тех, и других культур значительно снижала долю «молчащих» клеток в них (доля «молчащих»

клеток в обоих типах культур после обработки в г их М составляла 0,28 в каждом).

Как видно по результатам сравнения Рис.16. Примеры динамики изменения ОФ в уровня синхронизации разных типов культур клетках РК старых крыс: а) «молчащая»

клетка интактной РК;

б) динамика ОФ со гепатоцитов, полученных от молодых, старых спайками в интактной РК;

в) клетка со крыс, а также крыс, получавших экзогенный М, средним уровнем ОФ;

г) динамика ОФ со спайками в РК старых крыс, получавших степень кооперации их клеток меняется экзогенный мелатонин.

достаточно закономерно. По уровню клеточной кооперации и ПК, и РК, гепатоциты старых крыс, получавших М, достоверно не отличаются от гепатоцитов молодых крыс, в то время как соответствующие культуры старых интактных крыс показывают значительное снижение синхронности. Действие М на РК гепатоцитов старых крыс, получавших М, сходно с действием гормона на РК гепатоцитов молодых крыс по степени повышения синхронизации клеток, однако здесь можно наблюдать и существенное отличие. В случае РК молодых крыс обработка М повышает степень их синхронизации без изменения величины разброса значений – то есть среди исследованных культур такого типа встречаются как относительно слабо синхронизующиеся культуры, так и достаточно сильно синхронизуемые. В случае же РК гепатоцитов старых крыс, получавших М, обработка М повышает степень синхронизации гепатоцитов, однако и значительно снижает разброс значений. Это позволяет предположить механизм синхронизующего действия долговременного введения М на гепатоциты старых крыс. Экзогенный М в интактной печени воздействует только на клетки, еще сохранившие прежний уровень восприимчивости к гормону, поэтому синхронизация гепатоцитов происходит за счет синхронизации только этих клеток, вследствие чего коэффициент синхронизации таких культур примерно одинаков у всех исследованных РК гепатоцитов старых крыс, получавших М. Это предположение косвенно подтверждается наблюдениями над «молчащими» клетками РК старых крыс – в интактных культурах этого типа выявляется меньшее число «молчащих клеток», чем в соответствующих культурах клеток крыс, получавших М, - то есть, введение М снижает необходимость деятельности клетки, направленной на синхронизацию ее с другими клетками, за счет внешнего синхронизующего влияния экзогенного М. При этом клеток, самостоятельно поддерживающих синхронизующую деятельность, становится меньше, что четко выявляется при помещении клеток в условия культуры. Дополнительная обработка М РК от обоих типов крыс нивелирует различия между ними по количеству «молчащих» клеток, так как в данном случае межклеточные взаимодействия регулируются не самими клетками, а внешним синхронизующим агентом.

Кроме того, провели сравнение нормированных графиков ОФ гепатоцитов для каждого типа культур (рис. 17-19) по параметрам, приведенным в таблице 2. Для каждой культуры параллельно оценивали шум прибора по темному полю. Амплитуда колебаний шума во всех случаях была на порядок ниже колебаний ОФ гепатоцитов.

При сравнении нормированных графиков изменения ОФ отдельных клеток, построенных для каждого типа культуры, прослежены интересные закономерности, позволяющие сделать некоторые выводы о процессах, происходящих в клетках при старении и при действии на них М.

Показано, что в ПК молодых, старых крыс, получавших М старых крыс, а также ПК старых крыс после обработки М, амплитуда колебаний ОФ для индивидуальных клеток невелика. Характеристики РК всех типов значительно отличаются. В клетках РК молодых крыс в норме амплитуда колебаний ОФ значительно выше, чем в ПК, а обработка М приводит к снижению амплитуды до величин, сравнимых с ПК. В большей части клеток РК старых крыс Таблица 2. Сравнение нормированных графиков изменения относительной флуоресценции отдельных клеток для каждого типа культур.

Тип культуры Параметры сравнения Синхрон- Разброс амплитуд колебаний Разброс ность флуоресценции для отдельных динамик клеток отдельных клеток внутри большой малый нет культуры ПК нет Молодая + + крыса Обработка M РК нет - + Обработка M нет + + ПК нет Старая - + крыса Обработка M нет + + РК есть - + + Обработка M есть - + + ПК нет Старые + + крысы, Обработка M получавшие РК есть - + экзогенный Обработка M есть - + М амплитуда колебаний ОФ значительно снижается даже по сравнению с соответствующей характеристикой ПК, но в некоторых клетках достоверно повышается - то есть культура «расслаивается» по данному параметру. Обработка такой культуры М приводит к увеличению величины амплитуды колебаний ОФ в той или иной степени во всех клетках. Для РК старых крыс, получавших экзогенный М, по сравнению с РК интактных старых крыс амплитуда колебаний ОФ отдельных клеток выше, но «расслоение» культуры сохраняется. Обработка такой культуры М приводит к значительному снижению амплитуды колебаний ОФ клеток культуры, и культура по этому параметру становится сходной с ПК молодых крыс (рис. 19 г).

Вполне вероятно, что влияние клеток друг на друга в ПК приводит к сужению «коридора»

значений амплитуд колебаний ОФ клеток – работа клеток становится более сходной.

Таким образом, действие М, полученного крысой и непосредственно добавленного к культуре гепатоцитов, проявляется не одинаково. Экзогенный М улучшает характеристики отдельных гепатоцитов старых крыс, еще сохраняющих большую амплитуду колебаний ОФ, и мало действует на «постаревшие» клетки (с малой амплитудой колебаний ОФ), при этом синхронность клеток старых крыс, получавших экзогенный М, повышается за счет улучшения их собственных характеристик. Обработка же М культур действует на все клетки культуры в качестве внешнего синхронизующего агента. Интересно, что комбинация этих воздействий оказывает столь мощный эффект, что старые клетки по своим свойствам становятся похожими на молодые клетки.

а б 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 в г 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 Рис. 17. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток ПК а) культура гепатоцитов молодых крыс;

б) культура гепатоцитов старых крыс;

в) культура гепатоцитов старых крыс, обработанных М;

г) культура гепатоцитов старых крыс, получавших экзогенный М.

а б 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 Рис. 18. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток РК молодых крыс а) интактные РК;

б) РК, обработанные М.

Как уже отмечалось, визуально синхронизация клеток во всех перечисленных случаях выражалась в сдвиге фаз графиков временной динамики ОФ гепатоцитов по сравнению с соответствующими контрольными клетками и повышению числа клеток с синхронно а б 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 в г в г 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 Рис. 19. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток РК старых крыс а) РК старых интактных крыс;

б) РК старых крыс, обработанная М;

в) РК старых крыс, получавших экзогенный М;

г) РК старых крыс, получавших экзогенный М, дополнительно обработанная М.

меняющейся динамикой внутриклеточного уровня ионов кальция. Таким образом, возможно, импульсное воздействие М и вызванные этим осцилляции уровня ионов кальция приводят к сдвигу фазы долговременных колебаний его уровня в гепатоцитах, результатом чего является синхронизация динамики отдельных гепатоцитов, то есть усиление межклеточных взаимодействий.

Результаты экспериментов по изучению динамики уровня внутриклеточного кальция свидетельствуют о том, что, как и в случае с синтезом белка, степень межклеточных взаимодействий снижается с возрастом. Кроме того, на клетках РК крыс разного возраста показано, что с возрастом изменяется профиль внутриклеточной динамики концентрации кальция, то есть ухудшение функционирования самой клетки все же происходит. Тем не менее, это ухудшение несущественно и не является ключевым при снижении степени межклеточных взаимодействий потому, что улучшение качества межклеточной среды (добавление синхронизующего агента М) приводит к восстановлению нормальных межклеточных взаимодействий, выражающихся в синхронизации функций гепатоцитов. Это еще раз доказывает тот факт, что в возрастных нарушениях функционирования клеток и органов в целом первично снижение качества межклеточной среды (сыворотки крови), а не нарушение деятельности отдельных клеток.

Таким образом, данные наших экспериментов свидетельствуют о том, что степень синхронности динамики уровня цитоплазматического кальция в гепатоцитах, как и выраженность ритма синтеза белка в них, может служить адекватной моделью для изучения межклеточных взаимодействий. В гепатоцитах крыс разного возраста были выявлены долговременные колебания (с большим периодом) уровня кальция в цитоплазме, которые наблюдались как после действия кальциевого агониста, М, так и в интактных клетках. При этом действие М вызывало синхронизацию динамики уровня кальция между отдельными гепатоцитами, то есть приводило к тому же результату, что был показан при исследовании синхронизации клеток по ритму синтеза ими белка. Следовательно, и на данной модели межклеточных взаимодействий показана способность М к кооперации клеток.

Анализ литературы показывает, что большинство работ, посвященных исследованию динамики цитоплазматического кальция в клетках, связаны с оценкой изменения концентрации ионов кальция в клетках непосредственно после воздействия различных агонистов.

Необходимо подчеркнуть, что в наших экспериментах мы регистрировали не ответ клеток на стимуляцию их М, а «последействие» гормона, то есть влияние его на активность клеток уже после отмывки гепатоцитов от гормона. Поэтому для объяснения возможного механизма синхронизации гепатоцитов в наших экспериментах данные литературы, касающиеся исследования динамики внутриклеточного кальция, вызванной действием различных стимулов, можно использовать лишь в качестве косвенных доказательств. Тем не менее, можно предположить, что механизм синхронизации динамики кальция в гепатоцитах под действием М сходен с формированием синхронных кальциевых осцилляций в отдельных гепатоцитах в перфузируемой печени (Gaspers and Thomas, 2005) за исключением того, что в нашем случае межклеточная кооперация посредством щелевых контактов отсутствует, а синхронизация происходит только на уровне кондиционирования межклеточной среды. Интересно, что при кратковременном воздействии вазопрессина на культуру гепатоцитов в клетках начинаются осцилляции кальция, однако динамика их в разных клетках отличается, что отражает гетерогенность популяции гепатоцитов по чувствительности их к гормональным воздействиям (Gaspers and Thomas, 2005). Таким образом, само импульсное воздействие гормона в нашем случае вряд ли синхронизует динамику кальция в отдельных гепатоцитах. Для повышения синхронности культуры необходимо насыщение межклеточной среды синхронизующими факторами, продуцируемыми клетками, которое в нашем случае происходит уже после отмывки клеток от стимулирующего выделение кальция М.

Интересно, что при исследовании долговременной динамики изменения уровня кальция в гепатоцитах колебания его были показаны не только в клетках, предварительно обработанных М, но и в интактных клетках. Таким образом, колебания уровня кальция в обработанных М клетках появляются не в результате действия на них гормона и не являются остаточной реакцией на это воздействие, а связаны с периодическими функциями самой клетки.

Показано, что при передаче сигнала от различных агонистов внутри клеток возникают осцилляции концентрации кальция в цитозоле (Clapham, 2007, Gomes-Pinilla et al., 2009). В нашем случае никакие сигналы из внеклеточной среды на гепатоциты не действовали, тем не менее, не исключена возможность того, что в покое внутри клеток также присутствуют осцилляции уровня ионов кальция, необходимые для осуществления внутренних синтезов клетки. Механизм подобных колебаний концентрации внутриклеточного кальция на основе осцилляции количества активной протеинкиназы С описан, например, в статье Bird et al., 1993.

Обнаружение таких колебаний в нашем случае не является неожиданностью, так как физиологическая активность клетки подвержена определенной периодичности, что можно проиллюстрировать даже на примере периодического синтеза белка. Способность М синхронизовывать эти колебания еще раз подтверждает роль данного гормона в качестве организатора ритмов разного порядка. Несмотря на то, что существование околочасовой ритмики доказано для синтеза гепатоцитами белка, выявить околочасовую периодичность изменения концентрации кальция в гепатоцитах в нашем случае не представляется возможным за счет малой продолжительности регистрации динамики уровня кальция (всего 20 мин), связанной с техническими трудностями. Тем не менее, сравнение формы графиков, отражающих динамику изменения уровня кальция в гепатоцитах, позволяет предположить наличие околочасовой ритмики и для этой функции клетки (рис. 11). Следовательно, вполне вероятно, что околочасовой ритм изменения концентрации кальция определяет и регулирует соответствующий ритм остальных функций клетки. В нативной печени этот ритм, являющийся фундаментальным свойством самой клетки, корректируется за счет межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов, разнообразными нервными влияниями, а также различными синхронизаторами, присутствующими в сыворотке крови, в частности, таким известным координатором ритма, как М.

6. Влияние долговременного введения мелатонина на экспрессию эстрогенсульфотрансферазы в печени старых крыс Известно, что высокая активность фермента печени эстрогенсульфотрансферазы (ЭСТ) у взрослых крыс наблюдается только в организме самцов и определяет степень ферментативной деградации эстрогенов и, следовательно, гормональный статус особи. По данным литературы (Chatterjee et al.,1994;

Demyan et al., 1992, Смирнов, 2009), суммарная экспрессия изоформ ЭСТ в печени самцов крыс прогрессивно снижается после наступления половой зрелости, а у старых самцов вообще не выявляется. В данной части работы мы попытались определить, способен ли М нивелировать связанные с возрастом изменения суммарной экспрессии генов, кодирующих ЭСТ (Ste1 и Ste2), в печени самцов крыс и, таким образом, может ли он продлить их «репродуктивный» возраст. Для этих экспериментов экспрессию ЭСТ регистрировали дополнительно у крыс в возрасте 7 месяцев как промежуточном между исследованными в литературе (Chatterjee et al., 1994).

Для изучения суммарной экспрессии генов изоформ эстрогенсульфотрансферазы Ste1 и Ste2 были получены кДНК-библиотеки, синтезированные на мРНК из перфузированной печени молодых, старых крыс и старых крыс, получавших экзогенный М. Исследование проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов кДНК из тканей печени были предварительно отнормированы по гену house-keeping белка GAPDH, количество мРНК которого в клетках различного типа считается одинаковым. кДНК печени считались отнормированными, если уровень экспрессии GAPDH в печени, полученной от разных типов крыс, был одинаков. В случае необходимости изменяли количество кДНК в реакционной смеси.

На основании интенсивности окрашивания полос бромистым этидием были сделаны выводы об уровне суммарной экспрессии исследуемых генов. ОТ-ПЦР не является количественным методом, однако нормирование тканей печени по одному из белков общего метаболизма позволяет сделать выводы об уровне экспрессии исследуемых генов.

Результаты свидетельствуют о наличии мРНК обеих изоформ ЭСТ(Ste1 и Ste2) в печени крыс всех исследованных возрастов (рис.20). При этом уровень суммарной экспрессии изоформ ЭСТ в печени молодых крыс (3 месяца) достоверно выше (р0,01), чем уровень экспрессии изоформ ЭСТ в печени крыс в возрасте 7 и 24 месяцев (рис.21).

Рис. Оценка 20.

1 2 3 суммарного уровня экспрессии генов Ste1и Ste2 в печени крыс Ste1, Ste разного возраста относительно гена GAPDH: 1 – молодая крыса (3 мес.);

2 – молодая крыса (7 мес.);

– старая интактная крыса GAPDH (24 мес.);

4 – старая крыса (24 мес.), получавшая экзогенный М.

Таким образом, результаты данного исследования подтвердили данные литературы (Chatterjee et al.,1994;

суммарная Demyan et al., 1992) экспрессия обеих изоформ ЭСТ у самцов крыс с возрастом снижается, причем снижение ее начинается уже с 7 месяцев.

Долговременное введение М перорально крысам с питьевой водой не вызывало достоверного изменения уровня Рис. 21. Уровень суммарной экспрессии изоформ суммарной экспрессии изоформ фермента эстрогенсульфотрансферазы самцов крыс разного в печени старых крыс по сравнению с возраста (ось Y - интенсивность окрашивания полос бромистым этидием). контролем.

Продемонстрировать геропротекторное действие М на уровне, определяющем функционирование всего организма, в данном случае, по-видимому, не удалось. Это может говорить о том, что М действительно не способен влиять на возрастную экспрессию данного фермента, но также вероятно и то, что времени введения гормона (3 месяца) оказалось недостаточно для проявления его омолаживающего действия. Кроме того, возможно, отсутствие ожидаемого результата связано с тем, что введение М крысам проводили слишком поздно – начиная с 19 месяцев жизни, тогда как снижение суммарной экспрессии изоформ ЭСТ наблюдалось уже с 7 месяцев. Можно предположить, что применение экзогенного М крысам с 7 месяцев позволило бы поддержать и продлить экспрессию фермента на том же уровне, что и у самцов после наступления половой зрелости. В нашем же случае снижение суммарной экспрессии изоформ ЭСТ произошло настолько давно, что, вероятно, резервов для восстановления нормального уровня экспрессии фермента в клетках печени уже не осталось.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мы показали, что кооперативная активность клеток в составе органа закономерно меняется с возрастом. Таким образом, наши результаты подтвердили, что старение можно рассматривать как потерю интеграции между системами организма, а одной из причин возрастных нарушений функционирования систем организма может являться потеря коммуникативных способностей клеток, что связано, в первую очередь, с изменением свойств межклеточного посредника (состава межклеточной жидкости, сыворотки крови). Показано, что М, определяющий циклы сна-бодрствования, сезонную и суточную организацию функционирования различных систем организма - процессы, представляющие собой долговременные ритмы, - также может выступать организатором ритмов с более коротким периодом – околочасовых, проявляющихся, в частности, в функционировании клеток печени.

Воздействие М восстанавливает околочасовую ритмику работы популяции гепатоцитов и нивелирует проявления старения печени. По-видимому, для регуляции на данном уровне требуются возможности М как паракринного регулятора, то есть вещества, действующего на небольших расстояниях порядка диаметра нескольких клеток.

Из литературы известно, что с возрастом претерпевают изменения характеристики печени на всех уровнях – ухудшается микроциркуляция в капиллярах печени (Warren et al., 2008), меняется морфология составляющего их эндотелия (Gouteur et al, 2008), снижается пролиферативная способность гепатоцитов в ответ на повреждающие воздействия (Timchenko, 2009) и способность к глюконеогенезу (Kim et al., 2009), появляются воспалительные изменения органа (Singh et al., 2008). Меняются также и внутренние параметры гепатоцитов – лабильность мембраны (Kitania et al., 1997), способность к эндоцитозу (Gouteur et al, 2008), снижается экспрессия некоторых рецепторов и происходит их перераспределение, вследствие чего уменьшается чувствительность клеток к действию стимулирующих веществ (Kamat et al., 2008), выявляются изменения структуры гистонов в ядре (Kawakami et at, 2009). Возможно, какие-либо из этих изменений приводят к нарушению коммуникативных свойств гепатоцитов в культуре. В наших исследованиях взаимосвязь между снижением кооперативной активности гепатоцитов и какими-либо их морфологическими параметрами не была прослежена, однако данный аспект проблемы представляет определенный интерес и требует подробного изучения в будущем.

ВЫВОДЫ Мелатонин вызывает синхронизацию клеток, которая выражается в появлении 1.

околочасовых ритмов синтеза белка в разреженных, в норме не синхронных культурах гепатоцитов молодых крыс. Выявлены минимальные эффективная концентрация и эффективное время действия мелатонина на гепатоциты первичной культуры крыс (1 нМ, 5 мин инкубации).

В плотных культурах старых крыс, в норме слабо синхронизованных, мелатонин 2.

восстанавливает синхронизацию синтеза белка.

Выявлена долговременная динамика уровня ионов кальция в гепатоцитах крыс. Показана 3.

ее синхронность в гепатоцитах плотных культур молодых крыс и отсутствие синхронности в разреженных культурах. Мелатонин синхронизует динамику изменения уровня ионов кальция в разреженных в норме не синхронных культурах гепатоцитов молодых крыс.

Показано, что у старых крыс степень синхронности гепатоцитов в плотных культурах по 4.

динамике изменения уровня ионов кальция нарушается. Обработка культур мелатонином восстанавливает синхронизацию динамики изменения уровня ионов кальция между гепатоцитами таких культур.

Долговременное пероральное введение мелатонина старым крысам в период дожития 5.

восстанавливает межклеточные взаимодействия в плотных культурах их гепатоцитов, что выражается в значимом повышении степени синхронизации динамики уровня ионов кальция составляющих их клеток.

Показано снижение суммарной экспрессии изоформ фермента 6.

эстрогенсульфотрансферазы (маркер старения) в печени самцов крыс, начиная уже с месяцев. Долговременное пероральное введение мелатонина старым крысам в период дожития не влияет на уровень суммарной экспрессии изоформ эстрогенсульфотрансферазы в их печени.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации Беспятых А.Ю. Влияние мелатонина на динамику ионов кальция в гепатоцитах 1.

крыс // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2008. Секция «Биология». Москва. 2008, с. 207.

Беспятых А.Ю. Мелатонин в регуляции околочасовых ритмов синтеза белка в 2.

культуре гепатоцитов разновозрастных крыс. // Конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург. 2008, с.37.

Бродский В.Я., Голиченков В.А., Звездина Н.Д., Дубовая Т.К., Фатеева В.И., 3.

Мальченко Л.А., Бурлакова О.В., Беспятых А.Ю. Мелатонин усиливает синтез белка и синхронизирует ритм синтеза в культурах гепатоцитов старых крыс.//Онтогенез, 2008, т.

39, № 6, с.443-447.

Беспятых А.Ю., Бурлакова О.В., Голиченков В.А. Мелатонин в регуляции 4.

околочасовых ритмов синтеза белка в культуре гепатоцитов разновозрастных крыс.// Материалы I Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ. 2008, с.106.

Беспятых А.Ю., Бродский В.Я., Бурлакова О.В., Голиченков В.А., Вознесенская 5.

Л.А., Колесников Д.Б., Молчанов А.Ю., Рапопорт С.И. Мелатонин: теория и практика.

(п/р Рапопорта С.И. и Голиченкова В.А.) М.: ИД «Медпрактика-М», 2009, 100с.

Беспятых А. Ю., Бурлакова О. В., Голиченков В.А. Мелатонин как антиоксидант:

6.

основные функции и свойства// Успехи современной биологии, 2010, т. 130, №5, с 487 496.

Беспятых А.Ю., Голиченков В.А., Клюс К.А. Возрастные изменения 7.

межклеточных взаимодействий в первичной культуре гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина// IX Международный Симпозиум «Биологические механизмы старения», Украина, Харьков, 2010, с. 46.

Беспятых А.Ю., В.А. Голиченков. Межклеточные взаимодействия в культуре 8.

гепатоцитов крыс разного возраста в норме и после воздействия мелатонина// VIII Всероссийская конференция по патологии клетки, Москва, 2010, с 35.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н.

В.А. Голиченкову, в.н.с. О.В. Бурлаковой, коллективу кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, д.б.н. В.Я Бродскому, В.И Фатеевой и коллективу лаборатории цитологии ИБР РАН, Ю. Смирновой.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.