авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека

На правах рукописи

ГУТНИКОВА

Людмила Валерьевна

Исследование прогностических биохимических

и молекулярно-генетических маркеров

эмбриогенеза человека

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ставрополь – 2010

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Шкурат Татьяна Павловна.

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Водолажская Маргарита Геннадьевна;

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичович.

ГОУ ВПО «Ростовский государственный

Ведущая организация:

медицинский университет» Росздрава РФ.

Защита диссертации состоится 2010 г.

в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставро поль, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского госу дарственного университета.

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной проблемой понимания процессов эм брионального развития человека являются вопросы прогностического значения.

Высокая пластичность организма в раннем периоде делает эмбрион более чув ствительным к различным факторам среды, с другой стороны, существует воз можность воздействия на него в целях коррекции. Существующие биохимиче ские маркеры развития плода, такие как альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и свободный эстриол, достоверны в прогнозе синдрома Дауна и пороков развития нервной трубки, и малоэффективны в прогнозе врожденных пороков развития других соматических органов и наследственных заболеваний, а также в прогнозе развития гипоксии и гипотрофии плода. История разработки биохимических маркеров развития плода насчитывает более 40 лет, тем не ме нее, большинство современных исследований направлено на изучение узкого круга патологий – хромосомных анеуплоидий, грубых врожденных пороков развития. В то же время существует необходимость дальнейшего углубленного изучения механизмов развития ранних этапов эмбриогенеза и разработки мето дов прогноза течения беременности на основе индивидуальных особенностей генотипов родителей.

Успехи молекулярной генетики, достигнутые в последние годы, сделали воз можным изучение генной природы и молекулярных механизмов многофактор ной патологии. Например, все метаболические процессы инактивации токсич ных веществ контролируются генотипом и зависят от его индивидуальных осо бенностей (Van Lieshout, e.a., 1998;

Баранов В.C., 2007;

Coto, e.a., 2010). В группу генов предрасположенности к невынашиванию беременности, относят гены системы биотрансформации ксенобиотиков – любых чужеродных токсич ных веществ, поступающих в организм. Повреждающее действие ксенобиоти ков может реализоваться как в ходе гаметогенеза, так и при оплодотворении, имплантации, синцитилизации, плацентации и последующих стадиях эмбрио генеза.

Дальнейшая оптимизация программы пренатальной диагностики плода мо жет быть направлена как на поиск новых маркеров, так и на повышение чувст вительности уже используемых маркеров.

Актуальность проблемы, стремление теоретически и практически обосновать применение новых маркеров для оценки состояния плода с позиций современ ной эмбриологии, используя новые биохимические и молекулярно – генетиче ские подходы, обусловило выполнение настоящей работы.

Цель работы: проведение исследований по оценке эффективности сущест вующего биохимического пренатального скрининга, разработка способов его оптимизации, поиск новых биохимических и молекулярно-генетических марке ров крови беременных женщин для оценки развития плода.

Задачи исследования.

1. Провести ретроспективный и проспективный анализ биохимического пренатального скрининга у беременных Ростовской области в период с 2006 по 2009 гг. Исследовать региональные медианы понедельного развития плода по сывороточным маркерам, определяемым иммуноферментным и иммунофлуо ресцентным методами, с целью оптимизации существующего пренатального скрининга.

2. Исследовать прогностическую значимость биохимических показателей эмбрионспецифических белков и гормонов (АФП, ХГЧ, св. эстриола, ТБГ, про гестерона, тестостерона, кортизола, ДГЭА-С, 17-ОН-прогестерона) в сыворотке матерей, родивших детей с низкой массой тела.

3. Исследовать прогностическую значимость показателей окислительного статуса крови матерей, родивших детей с низкой массой тела.

4. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы гемостаза в процессе эмбриональных потерь.

5. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы детоксикации (первой и второй фазы) в процессе эмбриональных потерь.

Научная новизна работы. Впервые, опираясь на большой статистический материал (более 30000 беременностей и их исходов), доказана целесообраз ность внедрения в существующий пренатальный скрининг региональных меди ан для сывороточных маркеров крови независимо от их метода исследования.

Введение региональных медиан сывороточных маркеров для беременных Рос товской области увеличивает чувствительность пренатального скрининга в среднем на 10%. Впервые показано, что увеличение уровня прогестерона, тес тостерона, кортизола, хорионического гонадотропина человека и снижение концентрации свободного эстриола в крови матери во втором триместре досто верно ассоциировано с рождением детей с низким весом. Впервые показано, что снижение уровня антиоксидантных ферментов во втором триместре бере менности может служить прогностическим маркером рождения ребенка с низ кой массой тела. Впервые показано, что сочетание материнского и эмбриональ ного гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутати он-S-трансферазы Р1 ассоциировано с увеличением риска эмбриональной гибе ли плода. Впервые показано, что суммарное носительство в супружеской паре более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков приводит к достоверному увеличению риска эмбриональных потерь.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Введение региональных норм для медиан альфа-фетопротеина, свободного эстриола и хорионического гормона человека повышает эффективность прена тального скрининга независимо от метода определения – иммуноферментного или иммунофлуоресцентного анализа.

2. Определение повышенного уровня хорионического гонадотропина челове ка во втором триместре беременности в сочетании с увеличением уровня кор тизола, прогестерона, тестостерона и снижением уровня свободно эстриола яв ляется прогностическим алгоритмом для оценки риска развития гипотрофии плода.

3. Снижение уровня супероксиддисмутазы в сыворотке крови женщин во втором триместре беременности более чем на 35% ассоциировано с низкой массой тела новорожденного.

4. Риск ранних эмбриональных потерь увеличивается при гетерозиготном но сительстве как матерью, так и эмбрионом полиморфного аллеля A114V гена глутатион-S-трансферазы Р1.

5. Риск гибели эмбриона увеличивается при наличии у него более трех поли морфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков.

Теоретическое и практическое значение работы. В общетеоретическом плане, полученные результаты расширяют представления о патобиохимических процессах эмбрионального развития человека и открывают новые перспективы их практического применения в пренатальной диагностике плода. Выполненная работа расширяет существующие представления о прогностических биохими ческих и молекулярно-генетических маркерах эмбриогенеза человека.

В результате проведения комплексных исследований по поиску биохимиче ских и молекулярно-генетических прогностических маркеров эмбриогенеза че ловека получены новые данные, позволяющие существенно оптимизировать существующий пренатальный скрининг, расширить спектр выявляемых нару шений развития плода и прогнозировать раннюю летальность эмбриона по ге нотипам родителей. Разработан алгоритм прогноза рождения детей с низким весом по уровню гормонов (хорионический гонадотропин, кортизол, прогесте рон, тестостерон, свободный эстриол) и уровню антиоксидантов в крови матери во втором триместре беременности. Доказана целесообразность определения носительства аллеля глутатионтрасферазы GSTP1 Ala114Val у обоих супругов с целью прогноза эмбриональной гибели плода. Предложен и внедрен способ оп тимизации существующего биохимического пренатального скрининга в Рос товской области на основе расчета региональных медиан. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкур сах «Эмбриология человека», «Медико-генетическое консультирование», «Свободные радикалы в живых системах», «Предиктивная медицина».

Работа выполнена в рамках научной тематики НИИ биологии ЮФУ «Изуче ние механизмов окислительного стресса», и в рамках ФЦП «Научные и науч но-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Разра ботка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государ ственный контракт № 02.740.11.0501, в рамках АВЦП «Развитие научного по тенциала высшей школы (2009-2020 гг)» проект № 2.2.3.3/2370, а также в рам ках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Создание и апробация нового способа FIAV для быстрой идентификации аллельных вариантов генов» № 02.740.11.5015 и ФЦП МОН РФ ЦКП научным оборудованием «Высокие технологии» № 02552.11.7072.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (2005, 2008, 2009);

на междис циплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Судак-2006);

на II международной научно практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008);

на заседании Ростовского отделения об щества ВОГиС (2009);

на VI съезде Российского общества медицинских гене тиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 11 ра бот, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих ре цензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образова ния и науки России и рекомендованных для публикации основных научных ре зультатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 59 отечественных и 101 зарубеж ных источника, приложения. Работа содержит 23 таблицы, иллюстрирована рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования Материалом для исследования сывороточных маркеров АФП, ХГЧ и св. эст риола послужили образцы крови 33792 беременных, обратившихся в клинико диагностические лаборатории города Ростова-на-Дону и Ростовской области (КДЛ «Наука» и КДЛ Ростовской областной больницы) с целью проведения пренатального скрининга, в период с 2006-2009 гг. (табл. 1).

Таблица 1 – Количество обследованных беременных (n) на разных сроках гестации в зависимости от метода определения сывороточных маркеров Иммуноферментный Иммунофлуоресцентный Срок гестации метод метод (недели, дни) 1 группа (n) 2 группа (n) 14-14,6 169 15-15,6 928 16-16,6 2088 17-17,6 1518 18-18,6 822 19-19,6 404 20-20,6 153 Итого: 6082 Для оценки эмбрионспецифических белков и гормонов и показателей окис лительного статуса было обследовано 86 беременных на сроке 15-18 недель ( женщин составили контрольную группу и 29 женщин родивших детей с низкой массой тела).

Методом иммуноферментного анализа определяли уровень альфа фетопротеина, хорионического гормона человека, прогестерона, тестостерона, кортизола с использованием тест-систем «Алкор Био» (СПб), свободного эст риола, 17-ОН-прогестерона с использованием тест-систем «DRG» (Германия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе «ALISEI QS» (Италия).

Уровень трофобластический бета-гликопротеин определяли с использованием тест систем «Вектор Бест» (Новосибирск), супероксиддисмутазу – «Bender MedSystems» (Австрия). Иммунофлуоресцентным методом определяли АФП, -free-ХГЧ, свободного эстриола с использованием тест-систем «Delfia» (Фин ляндия) на многофункциональном анализаторе «Victor». Колориметрическим методом определяли МДА (Стальная И.Д., 1977), общую концентрацию пере кисей с использованием тест-системы OxyStat «Biomedica» (Вена).

Материалом для исследования полиморфизма генов детоксикации и генов коагуляции служила ДНК, выделенная из тканей плода (хорион) и матери (эн дометрий) стандартными методами. Было проанализировано 56 образцов полу ченных от женщин с неразвивающийся беременностью и самопроизвольным абортом. Полиморфизм генов определяли с использованием реагентов фирмы «Литех» методом ПЦР, детекцию продуктов амплификации проводили в ага розном геле методом горизонтального электрофореза. Анализ электрофоре грамм проводили под УФ на трансиллюминаторе GelDoc «BioRad» (США).

Статистический анализ результатов проводили с использованием программ ного пакета Excel 2007 и Statistica v.6.0. Сравнение различных данных проведе но с использованием критерия Стъюдента и Пирсона ( 2). Различия признаков считались достоверными при 95% уровне значимости (p0,05). Для определе ния взаимосвязи явлений применялся корреляционный анализ по Спирмену с вычислением коэффициента корреляции (r).

Результаты и обсуждения Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода с целью оптимизации существующего пренатального скрининга Пренатальная диагностики в России проводится для беременных женщин с целью профилактики наследственных и врожденных заболеваний у детей. По данным разных авторов, информативность «тройного теста», включающего оп ределение альфа-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина (ХГЧ) и св. эстриола в сыворотке крови беременной во втором триместре в выявлении синдрома Дауна у плода составляет 60-70% (Золотухина Т.В., 2006;

Кащеева Т.К., 2007). Для совершенствования метода и повышения его чувствительности мы сравнили два основных метода исследования пренатального скрининга – иммуноферментный и иммунофлуоресцентный, рассчитали региональные по недельные медианы.

Как видно из данных представленных на рисунках 1-3 значения региональ ных медиан для АФП, ХГЧ и св. эстриола, независимо от метода исследования, отличались от медиан производителя на всех сроках гестации. При этом обра щено внимание, что на 16 и 17 неделях беременности зарегистрированы макси мальные различия. Так, значение медианы для АФП, полученное методом им муноферментного анализа, для беременных на 16 неделе, выше на 22%, а на – на 24%. Значения медиан содержания АФП, полученные с использование им мунофлуоресцентного метода (рис. 1) также достоверно отличались от медианы производителя.

Понедельные региональные медианы ХГЧ у беременных Ростовской облас ти, определяемые иммуноферментным анализом, ниже медиан производителей на 12-38%. Различия значений медиан -free ХГЧ, выполненного с использова нием иммунофлуоресцентного метода (рис. 2), составили менее 10% и также смещены в сторону низких значений относительно медиан производителя. Ис ключение составили значения, полученные на 19-20-ой неделе, где наблюда лось повышение уровня региональной медианы до 38%.

МЛ 80,0 МЛ МП 80, МП 70, 70, 60, 60, 50, МЕ/мл 50, МЕ/мл 40, 40, 30, 30, 20,0 20, 10,0 10, 0,0 0, 14- 15- 16- 17- 18- 19- 20 4, 5, 6, 7, 8, 9, 0, - - - - - - - 14,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20, срок гестации: недели, дни срок гестации: недели, дни а б Рисунок 1 – Медианы уровня АФП в сыворотке беременных на разных сро ках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод 25, 60000 МЛ МП МЛ МП 20, 15, нг/мл МЕ/л 10, 5, 0 0, 14- 15- 16- 17- 18- 19- 20 14- 15- 16- 17- 18- 19- 20 14,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20, 14,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20, срок гестации: недели, дни срок гестации: недели, дни а б Рисунок 2 – Медианы уровня ХГЧ в сыворотке беременных на разных сроках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод Определение понедельных региональных медиан св. эстриола у беременных Ростовской области, выявило различия значений на 15-20 неделях, которые бы ли направлены в сторону снижения региональных медиан по сравнению с нор мами, предлагаемыми производителями иммуноферментных тест-систем (рис.

3). Региональные медианы для св. эстриола для иммунофлуоресцентного мето да, превышают значения медиан, представленных производителем на всех сро ках гестации на 6-40%.

7,0 МЛ МП МЛ МП 12, 6, 10, 5, 8, нмоль/л нг/мл 4, 6, 3, 4, 2, 1,0 2, 0, 0, 14- 15- 16- 17- 18- 19- 20 14- 15- 16- 17- 18- 19- 20 14,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20, 14,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20, срок гестации: недели, дни срок гестации: недели, дни а б Рисунок 3 – Медианы уровня св. эстриола в сыворотке беременных на раз ных сроках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод Проведенный анализ полученных результатов показал наиболее значимые различия региональных медиан сывороточных маркеров у беременных Ростов ской области при сроке гестации 15-18 недель от представленных производите лями тест-систем.

Исследование гормонов плода и плаценты как прогностических маркеров эмбриогенеза Известно, что адаптационные механизмы, которые обеспечивают оптималь ные условия для роста и развития плода, реализуются в условиях адекватной интеграции всех систем, участвующих в этом процессе. Одно из главенствую щих мест в интегральной схеме занимает эндокринная система. В соответствии с изменяющимися потребностями плода в течение беременности происходят изменения гормонального гомеостаза (Савельева Г.М., 2000;

Лысенков С.П. и др., 2002).

В таблице 2 представлены уровни содержания в сыворотке крови беремен ных женщин – гормонов и эмбрионспецифических белков: кортизола, прогес терона, тестостерона, свободного эстриола, дигидроэпиадростерона сульфат (ДГЭА-С), 17 гидроксипрогестерона (17-ОН-прогестерон), хорионического го надотропина (ХГЧ), альфа-фетопротеина (АФП), трофобластического бета гликопротеина (ТБГ) в случаях рождения детей с нормальной массой тела (группа 1) и с низкой массой тела (группа 2).

Во время беременности плацента, снабжаемая предшественниками гормонов, за счет работы системы мать-плацента-плод синтезирует в больших количест вах стероидные гормоны, а также различные белковые и пептидные гормоны, и в свою очередь секретирует эти продукты в кровоток матери и плода. Кроме то го, белковые и пептидные гормоны, продуцируемые плацентой, действуют по средством паракринного механизма, регулируя секрецию стероидных гормонов плаценты (Гриффин Дж., Охеды С., 2008). При анализе концентрации прогесте рона в сыворотке крови контрольной группы и группы женщин, родивших де тей с низкой массой тела были получены достоверные различия (рис. 4). Уро вень прогестерона в группе женщин, родивших детей с низкой массой тела был увеличен в среднем на 22%, по сравнению с контрольной группой. Так, среднее значения прогестерона в группе 4 составило 232,31 нмоль/л, максимальное зна чение составило 358,0 нмоль/л. В контрольной группе средняя концентрация гормона составила 190,41 нмоль/л. Синтезу прогестерона принадлежит одно из важных мест в эндокринной функции плаценты (Gellersen, Fernandes, Brosens, 2009;

Hil et al., 2010;

Feinshtein, 2010). Прогестерон синтезируется с ранних сроков беременности. В первые три месяца основная роль в продукции этого гормона принадлежит желтому телу беременности, а затем плаценте (Савелье ва, 2000;

Гриффин Дж., Охеды С., 2008). Увеличение концентрации прогесте рона в сыворотке крови женщин с низкой массой тела может быть связано с на рушением функционирования фето-плацентарного комплекса, а также с пато логическими изменениями, происходящими в плаценте.

Таблица 2 – Содержание уровня гормонов и эмбрионспецифичных белков в сыворотке крови беременных женщин, в случаях рождения ими детей с нор мальной (группа 3) и низкой массой тела (группа 4) Содержание аналитов в группах беременных Наименование гормонов и р Единицы из эмбрионспецифичных Группа 3 Группа 4 (t-крите мерения белков рий) (n= 57) (n=29) М±m М±m ХГЧ МЕ/л 27502±1947 40369±6885 0, АФП МЕ/мл 51,27±3,94 54,15±3,86 0, Эстриол свободный нг/мл 3,47±0,18 2,18±0,18 0, ТБГ нг/мл 36602±2411 36999±3310 0, Прогестерон нмоль/л 190,41±8,52 232,31±11,26 0, Тестостерон нмоль/л 2,95±0,14 3,81±0,22 0, Кортизол нмоль/л 570,21±20,24 677,21±42,71 0, ДГЭА-С мкг/мл 1,45±0,09 1,56±0,18 0, нг/мл 3,32±0,18 3,27±0, 17-ОН-прогестерон 0, Анализ содержания кортизола в сыворотке крови выявил достоверные отли чия между контрольной группой и группой женщин, родивших детей с низкой массой тела. По результатам наших исследований в группе с нормально проте кающей беременностью уровень гормона колебался в пределах от 210, нмоль/л до 969,73 нмоль/л во втором триместре беременности. Однако уровень кортизола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела, достоверно выше по отношению к контрольной группе (группа 3). В группе женщин, родивших детей с низкой массой тела уровень кортизола в крови ко лебался от 407,54 нмоль/л и до 1383,2 нмоль/л. Как известно глюкокортикости роиды оказывают как анаболические, так и катаболические эффекты, причем катаболические преобладают. Кортизол снижает утилизацию аминокислот для белкового синтеза везде, кроме печени, т.о. избыток кортизола связан с про грессирующей потерей белка, атрофией и слабостью мышц, утончением кожи и потерей костного матрикса и массы (Гриффин Дж., Охеды С., 2008).

Несмотря на отсутствие достоверных отличий в уровнях ДГЭА-С и 17 ОН прогестерона уровень тестостерона в сыворотке крови женщин, родивших де тей с низкой массой тела достоверно отличался от контроля и превышал его концентрацию в 1,3 раза. Среднее значение в группе 4 составило 3,81 нмоль/л, в группе 3 - 2,95 нмоль/л. Уровень тестостерона у беременных повышается при заболеваниях трофобласта (Кишкун А.А., 2007), что может быть и имело место в наших исследованиях.

Известно, что во время беременности скорость продукции эстрогенов в пла центе заметно возрастает. Эстриол – представитель эстрогенов – является глав ным стероидным гормоном, синтезируемым плацентой. По данным литературы показано, что снижение уровня свободного эстриола может приводить к за держке роста и развития плода (Кишкун А.А., 2007). Известно также, что эстро гены повышают кровоток в матке и могут играть роль в созревании и развитии фетальных органов (Гриффин Дж., Охеды С., 2008).В наших исследованиях уровень свободного эстриола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела был достоверно снижен по отношению к уровню гормона в контрольной группе. Средняя концентрация свободного эстриола во второй группе составила 2,18 нг/мл, в первой группе 3,47 нг/мл.

46,78* % 40 29,15*** 18,76** 22** 5, 20 7, 1, -10 -1, - - -40 -37,18*** - ол он ГЧ -н Г С н П.Э г ТБ ЭА Ф ог из ер Х ро А св пр рт т ДГ -п ос ко Н ст О те Рисунок 4 – Относительное содержание (%) уровня гормонов и эмбрионспеци фичных белков в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела по отношению к группе женщин с нормально протекающей беременности Примечание (здесь и далее по тексту): *** - достоверное отличие по сравнению с II тримест ром при р 0,001;

** - достоверное отличие по сравнению с II триместром при р 0,01;

* достоверное отличие по сравнению со II триместром при р 0,05.

В наших исследованиях не было получено достоверных различий в уровне ТБГ в сыворотке крови женщин с нормально протекающей беременностью и женщин, родивших детей с низкой массой тела. Средняя концентрация ТБГ со ставила 36998 нг/мл в 4 группе и 36602 нг/мл – в третьей группе. Средняя кон центрация АФП в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела составила 54,14 МЕ/л, в группе женщин при нормально протекающей бе ременности – 51,27 МЕ/л.

Исследование уровня хорионического гонадотропина выявило достоверные отличия между двумя группами. В ходе изучения динамики уровня ХГЧ сред няя концентрация гормона в сыворотке крови при нормально протекающей бе ременности составила 27501 МЕ/л. Средняя концентрация ХГЧ в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела, превышала уровень кон троля почти в полтора раза и составила 40369 МЕ/л. Повышение уровня ХГЧ в сыворотке крови беременных свидетельствует о нарушении гемодинамики в функциональной системе мать – плацента – плод (Николаева Ю.А., 2007).

Таким образом, в результате наших исследований были получены достовер ные изменения уровня стероидных гормонов - прогестерона, кортизола, св. эст риола, тестостерона, а также хорионического гонадотропина, что может указы вать на влияние данных маркеров на рост и развитие плода.

Показатели окислительного статуса беременных, родивших детей с низкой массой тела Результаты исследования показателей системы окислительного стресса при физиологическом течении беременности приведены в таблице 3. Как видно из данных таблицы при физиологически протекающей беременности интенсив ность свободно-радикальных процессов во втором триместре достаточно высо кая, что отражается в высоте быстрой вспышки хемилюминесценции. Однако активность антиоксидантной системы находится на высоком уровне, что обес печивает контролируемый уровень интенсивности свободно-радикальных ре акций и не допускает развития неконтролируемых реакций перекисного окис ления липидов, приводящих к деструкции клеточных мембран. Это подтвер ждается низким уровнем внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ). В третьем триместре при физиологически протекающей беременности происходит стати стически значимое снижение интенсивности свободно-радикальных реакций, что зафиксировано по снижению показателей хемилюминесценции. В то же время зафиксировано снижение уровня супероксиддисмутазы при одновремен ном повышении активности каталазы. В третьем триместре повышается и уро вень мочевины. Однако, несмотря на это уровень ВЭГ в третьем триместре в раз превышает этот показатель для второго триместра. Увеличение его концен трации говорит об увеличении деструкции и проницаемости мембран эритро цитов (Внуков В.В., 1989;

Слюсарева И.В., 2007).

Увеличение уровня свободных радикалов в кровотоке матери в середине бе ременности регистрируется при любых вариантах течения беременности. При различных осложнениях и патологиях беременности повышение уровня сво бодных радикалов в крови матери – более значительное, чем при физиологиче ском течении беременности (Lash G.E. et al., 2008).

Нами были исследованы следующие показатели окислительного статуса ма терей, родивших детей с низкой массой тела: общий уровень перекисей;

уро вень супероксиддисмутазы (СОД);

уровень малонового диальдегида (МДА). У женщин, родивших детей с нормальной массой тела, уровень СОД в сыворотке крови на 16-18 неделях беременности соответствует показателям для физиоло гически протекающей беременности. Суммарное содержание перекисей в раза выше по сравнению с нормой для небеременных, что согласуется с данны ми о повышении интенсивности свободно-радикальных реакций во втором триместре нормально протекающей беременности. Уровень промежуточного продукта ПОЛ малонового диальдегида не превышает показатели для небере менных (табл. 3, табл. 4).

Таблица 3 – Показатели окислительного статуса при физиологическом тече нии беременности Физиологически протекающая беременность Показатель II триместр III триместр Быстрая вспышка ХЛ, о.е.1 434,1±72,2 167,1±14,61*** Светосумма ХЛ, о.е. 1 128,1±15,53 65,0±7,10*** Каталаза, у.е. 2 53,1±3,99 68,3±3,17** СОД, нг/мл 91,4±7,59 66,4±5,65* Мочевина, мг/100 мл 21,0±0,95* 17,4±1, Церулоплазмин, у.е. 2 13,6±1,19 15,3±0, ВЭГ, г/л 0,2±0,07 2,2±0,58*** Таблица 4 – Показатели окислительного статуса крови матерей (16-18 недели беременности), родивших детей с низкой (группа 3) и нормальной массой тела (группа 4) Показатель окислительного Группа 3 Группа 4 р статуса Х±m (n=57) Х±m (n=29) (t-критерий) СОД (нг/мл) 89,35±9,19 54,8±3,87 0,007** Суммарные перекиси 1142±33,0 1235±48,0 0, (мкмоль/л) МДА (нмоль/л) 6,1±0,14 6,63±0,18 0,02* У женщин, родивших детей с низкой массой тела, в сыворотке крови во вто ром триместре беременности суммарное содержание перекисей не отличается от третьей группы (табл. 4) В то же время уровень МДА несколько выше по сравнению с группой контроля, а уровень СОД практически на 40% ниже. Та ким образом, при изучении показателей окислительного статуса матери во вто ром триместре беременности выявлен дисбаланс в системе оксиданты – анти оксиданты у женщин, родивших детей с низкой массой тела.

Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови ассоциированных с эмбриональными потерями Одной из ведущих причин невынашивания беременности, особенно на ран них сроках, являются генетические факторы. В настоящее время установлено, что синдром потери плода обуславливается не только хромосомными анома лиями, но и генными мутациями, а также наличием полиморфных аллелей ге нов, активно функционирующих в период гестации.

Нами был проведен анализ частот полиморфных аллелей некоторых генов факторов свертывающей системы крови (3-субъединицы тромбоцитарного ре цептора фибриногена – ITGB3 Leu33Pro, 2-субъединицы тромбоцитарного ре цептора фибриногена – ITGA2 C807T, ингибитора тканевого активатора плаз миногена тип 1 – PAI 1-675 5G/4G, фактора VII – F VII-323 ins10bp, фибриноге на – FGB-455G-A) у женщин из двух групп: контрольной и группы женщин с синдромом потери плода. Носительство полиморфных аллелей генов фибрино литической системы может сопровождаться гиперкоагуляцией, тромбообразо ванием в ранних сосудах плаценты, приводить к нарушению жизнедеятельно сти имплантировавшегося плодного яйца.

Проведенный анализ частот полиморфных аллелей по каждому отдельному гену показал, что распределение частот аллелей у эмбрионов сходно с таковым у матерей. Количество полиморфных аллелей в группе женщин с синдромом потери плода выше по сравнению с контрольной, однако выявленные различия не являются статистически достоверными.

При сочетанном анализе носительства полиморфных аллелей установлено, что как среди матерей, так и среди эмбрионов в контрольной группе преобла дают носители 1-3 полиморфных аллелей пяти исследуемых генов (рис. 5). При невынашивании беременности как среди женщин, так и среди эмбрионов сни жается доля носителей одного полиморфного аллеля. Среди женщин 28,6% со ставляют носители 4 полиморфных аллелей. Среди погибших эмбрионов 21,4% были носителями 4 полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови.

Рисунок 5 – Частота распределения (%) по количеству исследуемых поли морфных аллелей в генотипе женщин и эмбрионов Можно предположить, что в данном случае происходит чрезмерное тромбо образование, нарушение имплантации и кровоснабжения формирующейся пла центы.

Исследование частот полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков ассоциированных с эмбриональными потерями Нами были исследованы частоты полиморфных аллелей ряда генов первой фазы (цитохрома Р-450 CYP1A1, цитохрома CYP2E1, алкогольдегидрогеназы ADH1B, альдегиддегидрогеназы ALDH2) и второй фазы системы детоксикации ксенобиотиков (ацетилтрансферазы 2 NAT2 и глутатион-S-трансферазы GSTP1) у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе и в контрольной группе.

Анализ сочетанного носительства полиморфных аллелей генов системы де токсикации ксенобиотиков матери и эмбриона выявил, что достоверно чаще по сравнению с контролем при невынашивании беременности выявляется сочета ние материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморф ного аллеля A114V гена глутатион-S-трансферазы.

Полиморфные аллели исследуемых генов в гомозиготном состоянии не вы явлены в обеих группах женщин. Большая часть женщин, как в контрольной группе, так и с невынашиванием беременности являются гомозиготами по нор мальному аллелю генов первой фазы системы детоксикации ксенобиотиков.

Степень увеличения риска зависит от количества полиморфных аллелей в ге нотипе. В контрольной группе, как женщин, так и эмбрионов более чем в 83% случаев в генотипе присутствует не более двух полиморфных аллелей из 9 ис следуемых мутаций. Среди женщин с невынашиванием беременности в еди ничных случаях выявлено по одному полиморфному аллелю генов N ацетилтрансферазы 2 и глутатион-S-трансферазы. Значительно снижается по сравнению с контрольной группой доля лиц с двумя полиморфными аллелями;

в то же время количество носительниц трех полиморфных аллелей увеличива ется более чем в 2 раза;

17,9% приходится на женщин, имеющих сразу 4 одно нуклеотидных полиморфизма в исследуемых генах. Среди погибших эмбрио нов 86% являются носителями трх и более полиморфных аллелей генов систе мы детоксикации ксенобиотиков, тогда как среди эмбрионов, развивавшихся при физиологически протекающей беременности, доля носителей трх и более полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков составляет 25% (табл. 5).

Таблица 5 – Частота распределения (%) по количеству исследуемых поли морфных аллелей генов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиоти ков в генотипе женщин и эмбрионов Кол-во поли- Мать Эмбрион морфных аллелей контроль НБ контроль НБ 0 0 0 0 12,5 ± 11,69 3,4 ± 3, 1 0 33,6 ± 19,2 25,0 ± 5,68 62,5 ± 17,1 10,3 ± 5,64 ** 33,4 ± 19,2 35,7 ± 9,0 12,5 ± 11,69 34,5 ± 8, 33,0 ± 19,2 17,9 ± 7,2 12,5 ± 11,69 37,9 ± 9,0 * 14,3 ± 6,6 6,9 ± 4, 5 0 7,1 ± 4,85 6,9 ± 4, 6 0 Снижение активности ферментов второй фазы системы детоксикации ксено биотиков нарушает метаболизм эндогенных и экзогенных химических соедине ний, способствует длительному сохранению в клетках промежуточных токси ческих веществ, в том числе и продуктов перекисного окисления липидов, что может провоцировать активацию свободно-радикальных реакций и развитие патологического процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время ранняя оценка отдаленных эмбриональных нарушений проводится с помощью биохимического скрининга беременных в первом и вто ром триместре, и включает выявление лишь узкого круга патологий, таких как синдром Дауна, синдром Эдвардса, дефекты заращения нервной трубки (ДЗНТ), на долю которых приходится менее 1% от всех врожденных пороков развития, регистрируемых в популяции. При этом эффективность выявления данных патологий составляет около 70% (от общего числа детей с синдромом Дауна и ВПР), а ложноположительные результаты (когда риск рассчитан, как высокий- а ребенок рождается здоровым) встречаются в 5% случаев от общего числа обследованных (Золотухина Т.В., 2003;

Кащеева Т.К., 2009). При введе нии, рассчитанных нами, региональных медиан для сывороточных белков кро ви женщин Ростовской области во втором триместре беременности, снизилось количество ложноположительных результатов по риску рождения ребенка с синдромом Эдвардса и ДЗНТ, при этом не было выявлено ложноотрицательных результатов для этих патологий. Можно сказать, что эффективность скрининга на синдром Эдвардса и ДЗНТ при переходе на региональные медианы повыси лась, однако, что касается скрининга на синдром Дауна – это не так: с одной стороны повысилась чувствительность скрининга на синдром Дауна, с другой – увеличилось количество ложноположительных результатов, относящих бере менных в группу риска по данной патологии плода. Все это лишний раз демон стрирует низкую специфичность маркеров, используемых в современной пре натальной диагностике, и необходимость поиска новых, более специфичных маркеров. Кроме того, пока идет поиск новых, возможно более высокотехноло гичных, маркеров ВПР и ХА, необходимо анализировать вклад других факто ров, приводящих к изменению уровней сывороточных маркеров, с целью ис ключать из группы риска по ВПР и ХА женщин, у которых данные факторы привели к изменению уровня сывороточных маркеров.

Нами впервые была показана высокая прогностическая ценность определе ния на ранних сроках гестации панели эмбрионспецифических белков и гормо нов, а также показателей окислительного статуса в сыворотке беременных с це лью оценки низкой массы плода при рождении. Сочетанное определение хо рионического гонадотропина, прогестерона, кортизола, тестостерона и св. эст риола, а также супероксиддисмутазы и малонового альдегида позволяет про гнозировать рождение ребенка с низким весом уже во втором триместре бере менности (таблица 6). Мы полагаем, что полученная динамика биохимических показателей у беременных женщин, родивших детей с низкой массой тела, обу словлена патологическими изменениями непосредственно в плаценте, в частно сти нарушением е гемодинамики. С 16 недели беременности начинается пери од интенсивного роста плода и плаценты, которые зависят от функционирова ния системы мать-плацента-плод (Данилов Р.К., Боровая Т.Г., 2003;

Сидорова И.С., Макаров И.О., 2007). Таким образом, нарушение гемодинамики плаценты, обуславливающая недостаточность е трофической функции, ведт к наруше нию процессов роста и развития плода. В таблице 6 показаны профили динами ки прогностических маркеров в ранней оценке эмбриональных потерь и гипо трофии новорожденных.

Таблица 6 – Динамика прогностических маркеров в ранней оценке долго срочных состояний эмбриона Динамика прогностических маркеров, Срок обследования Состояние ассоциированных с состояниями эмбриона эмбриона 15-18 недель АФП (), ХГЧ (), св. Эз () ДЗНТ беременности 15-18 недель с. Дауна АФП (), ХГЧ (), св. Эз () беременности 15-18 недель АФП (), ХГЧ (), св. Эз () с. Эдвардса беременности ХГЧ (), прогестерон (), кортизол (), тестостерон (), св. Эз (), 15-18 недель Гипотрофия плода АФП (), ТБГ (), ДГЭА-С (), беременности 17-ОН-прогестерон () 15-18 недель СОД (), МДА (), суммарные перекиси() Гипотрофия плода беременности Наличие полиморфных аллелей в генах систе 8-12 недель мы свертывания крови: ITGB3(-), ITGA2(-), F Гибель эмбриона беременности VII(-), PAI 1(-), FGВ(-) Наличие полиморфных аллелей в генах систе 8-12 недель мы детоксикации ксенобиотиков первой фазы: Гибель эмбриона беременности CYP2E1(-), CYP1A1(-), ADH1В(-), ALDH2(-) Наличие полиморфных аллелей в генах систе 8-12 недель мы детоксикации ксенобиотиков второй фазы: Гибель эмбриона беременности NAT2(-), GSTP1(++) Количество полиморфных аллелей в генах сис 8-12 недель темы детоксикации ксенобиотиков: 3(+), 4(++), Гибель эмбриона беременности 5(+++), 6(+++) Примечание: (-), () – отсутствует ассоциация данного маркера с исследуемым состоянием эмбриона;

(+), (++), (+++) – данный маркер ассоциирован с исследуемым состоянием эм бриона;

(), или () – уровень данного маркера повышен, или понижен, при исследуемом со стоянии эмбриона.

Большое значение в понимании механизмов, нарушающих нормальное тече ние беременности, имеет изучение не только материнского генотипа, но и гено типа эмбриона. Наши исследования показали, что носительство как матерью, так и эмбрионом отдельного полиморфного аллеля генов системы свертывания крови и генов системы детоксикации ксенобиотиков слабо ассоциировано с ранними эмбриональными потерями. Однако анализ сочетанного носительства полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков матери и эмбриона выявил, что достоверно чаще по сравнению с контролем при невы нашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионально го гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутатион S-трансферазы. Большая часть женщин с невынашиванием беременности явля ется носителем 3-4 исследуемых полиморфных аллелей, что фенотипически может приводить к повышению степени агрегации тромбоцитов при одновре менном снижении активности процессов фибринолиза. В нашем исследовании выявлены статистически значимые отличия по количеству полиморфных алле лей генов второй фазы детоксикации ксенобиотиков для эмбриональных тка ней. Таким образом, можно заключить, что риск развития мультифакторной па тологии повышается не столько при наличии полиморфного варианта отдель ного гена системы биотрансформации, сколько при сочетании нескольких по лиморфных маркеров, относящихся как к первой, так и ко второй фазе детокси кации ксенобиотиков как в материнском генотипе, так и генотипе эмбриона.

Таким образом, с целью профилактики ранних эмбриональных потерь, необхо димо проводить как можно раньше (лучше до зачатия) анализ уровня полимор физма генов системы детоксикации одновременно и у матери и отца будущего ребенка.

ВЫВОДЫ 1. Введение в Ростовской области региональных норм для АФП, ХГЧ и св.

эстриола повышает на 8% чувствительность пренатального скрининга по сыво роточным маркерам крови матери во втором триместре независимо от метода их определения (иммуноферментый или иммунофлуоресцентый).

2. Сочетанное определение хорионического гонадотропина, прогестерона, кортизола, тестостерона и св. эстриола позволяет прогнозировать рождение ре бенка с низким весом.

3. У женщин, родивших детей с низкой массой тела на 38-40 неделях, в сы воротке крови во втором триместре беременности регистрируется активность супероксиддисмутазы на 38,6% ниже по сравнению с референсными значения ми.

4. Частоты генотипов полиморфных аллелей генов системы гемостаза (ITGB3, ITGA2, F VII, FGB, PAI 1) среди женщин с эмбриональными потерями и женщин с физиологической протекающей беременностью практически оди наковы.

5. При невынашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутатион-S-трансферазы Р1.

6. Среди погибших эмбрионов 86% являются носителями трх и более по лиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков, тогда как среди эмбрионов, развивавшихся при физиологически протекающей беремен ности, доля носителей трх и более полиморфных аллелей генов системы де токсикации ксенобиотиков составляет 25%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Гутникова, Л.В. Региональные нормы сывороточных маркеров крови, ис пользуемых в пренатальной диагностике плода / Л.В. Гутникова// Труды аспи рантов и соискателей Ростовского государственного университета: сб. науч. тр.

– Ростов-на-Дону: Изд-во Рост. ун-та, 2005. – Т. XI – С. 63-64.

2. Гутникова, Л.В. Маркеры окислительного стресса в мониторинге бере менности/ Л.В. Гутникова// От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине: мат-лы междунар. междисциплинарного симпозиума (г. Судак, 17-27 сентября 2006 г.). – Судак, 2006. – С. 23-24.

3. Гутникова, Л.В. Динамика содержания альфа-фетопротеина и хориониче скгого гонадотропина в крови беременных женщин в зависимости от времени года / Л.В. Гутникова // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине: мат-лы I междунар. науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 10-12 ок тября 2007 г.). – Ростов-на-Дону: Изд-во «ЦВВР», 2007. – С. 15-16.

4. Данько, Е.А. Пренатальный скрининг врожденных пороков развития пло да / Е.А. Данько, Л.В. Гутникова, Е.В. Машкина, А.А. Александрова, Т.П. Шку рат // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: мат-лы II междунар. науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008 г.). – Рос тов-на-Дону, 2008. – С. 94-95.

5. Ломтева, С.В. Аллантоин и нормальная беременность / С.В. Ломтева, Л.В.

Гутникова, В.Н. Прокофьев, Е.П. Гуськов // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.). – Новосибирск: Изд-во Арта, 2008. – С. 402. – ISBN 5-9027-0011-6.

6. Гутникова, Л.В. Анализ результатов пренатального биохимического скрининга у беременных женщин Ростовской области / Л.В. Гутникова // Глав ный врач юга России. – 2009. – № 2 – С. 25-26.

7. Гутникова, Л.В. Исследование эффективности пренатального скрининга в первом триместре беременности / Л.В. Гутникова, А.А. Александрова, С.В.

Ломтева, Е.А. Данько, Е.В. Машкина, Т.П. Шкурат // Валеология. – 2009. – № 3.

– С. 28-34.

8. Гутникова, Л. В. Динамика отклонений биохимических маркеров в пер вом триместре беременности у жительниц Ростовской области в зависимости возраста / Л.В. Гутникова // Ранние сроки беременности. Профилактика репро дуктивных потерь: мат-лы науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 20 ноября 2009 г.). – Ростов-на-Дону: Изд-во ГОУ ВПО РостГМУ, 2009. – С. 28-29.

9. Александрова, А.А., Исследование референсных региональных норм био химических маркеров пренатального скрининга второго триместра у жительниц г. Ростова-на-Дону / А.А. Александрова, Л.В. Гутникова, С.С. Амелина // Ме дицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского общества медицинских ге нетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). – М.: Изд-во Гениус Медиа, 2010. – С. 6.

Гутникова, Л.В. Полиморфизм генов интегринов и невынашивание 10.

беременности / Л.В. Гутникова, К.А. Коваленко, И.О. Покудина, И.О. Бушты рева, Е.В. Машкина // Медицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского общества медицинских генетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). – М.:

Изд-во Гениус Медиа, 2010. – С. 50.

Коваленко, К.А. Гены системы детоксикации и невынашивание бе 11.

ременности / К.А. Коваленко, Л.В. Гутникова, А.А. Родионов, А.А. Александ рова, Т.П. Шкурат // Медицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского об щества медицинских генетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). – М.:

Изд-во Гениус Медиа, 2010. – С. 86.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.