авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки

На правах рукописи

Хряпенкова Татьяна Геннадьевна

Межклеточные взаимодействия мезенхимальных

мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных

клеток сердца и почки

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА 2010 3

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова.

Доктор биологических наук, профессор Научные руководители Зоров Дмитрий Борисович Доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты Воробьёв Иван Андреевич, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, ка федра клеточной биологии и гистологии Кандидат биологических наук Белоусов Всеволод Вадимович, Учрежде ние Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академика М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, отдел геномики и постгеномных техноло гий, лаборатория молекулярных технологий Учреждение Российской академии наук Ин

Ведущая организация:

ститут биологии развития им. Н.К. Коль цова РАН

Защита состоится «_» _ 2010 г. в _ часов на заседании диссер тационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологи ческий факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факуль тета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Регенеративная клеточная терапия – современное направление медицины, вызывающее немалый интерес как врачей, так и учёных, и получившее большое развитие в последние годы. Сегодня клеточная терапия имеет весьма широкое применение в самых различных областях современной клинической практики.

Особенно оправданным является использование этой терапии в борьбе с ишеми ческой болезнью сердца (ИБС), последствиями инфаркта миокарда (ИМ) и други ми функциональными и структурными изменениями сердечной ткани, так как па томорфология миокарда человека не сопровождается органной регенерацией.

Обычно при этих патологиях происходит гипертрофия кардиомиоцитов при ми нимальной пролиферативной способности миокарда. Часто единственным спосо бом сохранить больному жизнь является трансплантация сердца – дорогостоящая и опасная операция, вынужденно применяемая на сегодняшний день достаточно широко (Taylor et al., 2009). Сердечно-сосудистые заболевания занимают, в на стоящее время, ведущее место среди причин смертности больных в развитых странах. Аналогичные проблемы существуют и для почки, содержащей в основ ном постмитотические клетки (Humes et al., 2004;

Amiel et al., 1999). Для этого ор гана проблемой также является поиск подходов к лечению острой почечной не достаточности (ОПН) и терминальных стадий хронической почечной недостаточ ности (ХПН). На сегодняшний день диализ (Чупрасов, 2001) и трансплантация единственно возможные варианты борьбы с этими патологиями. Оба эти подхода сложны для реализации и имеют массу осложнений и противопоказаний. Несмот ря на значительный прогресс в лечении ХПН, по-прежнему регистрируется высокая смертность от этого заболевания. Диализ распространен в большей сте пени, чем трансплантация, но он продлевает жизнь, не восстанавливая функцию почек у больных с терминальными стадиями ХПН, и не дает шансов на выздоров ление. Трансплантация может дать полное восстановление функций почки, но связана с массой сложностей из-за дефицита доноров и реакций иммунологиче ской несовместимости, а также высокой стоимости операции.

В приведённых выше случаях заместительная клеточная терапия могла бы стать самым оптимальным способом восстановления утраченных функций органа.

Но прежде чем начинать применение заместительной клеточной терапии в кли нической практике, необходимо убедиться в её безопасности, а также определить механизмы положительных эффектов на клеточном уровне. К сожалению, на се годняшний день клиническое использование в этой области наверно серьезно превышает количество фундаментальных исследований возможностей клеточных технологий. В данной работе предпринята попытка восполнить этот пробел и расширить знание фундаментальных основ клеточной терапии. В современной литературе идет противоборство двух взглядов на взаимодействие донорских стволовых клеток с организмом реципиента. Согласно одной концепции основу эффекта вводимых клеток составляет их направленная дифференцировка в клетки органа-мишени, согласно второй – положительное действие связано, в первую очередь, с выделением стволовыми клетками неких паракринных факторов, кото рые оказывают стимулирующее воздействие на окружающую ткань. Кроме того, особое внимание к себе привлекают некоторые типы межклеточных взаимодейст вий, характерные, в частности, для стволовых клеток. В первую очередь, это кон такты, описанные совсем недавно и названные туннельными нанотрубочками (Rustom et al., 2004). Эти структуры способны осуществлять передачу различных внутриклеточных компонентов между клетками, расположенными на достаточ ном удалении друг от друга, что отличает их от всех известных клеточных кон тактов (Onfelt et al., 2004).

В работе были исследованы механизмы, которые могут обеспечивать тера певтические эффекты клеточной трансплантации, наблюдаемые в клинической практике. В частности, изучено поведение стволовых клеток при взаимодействии с дифференцированными соматическими клетками: кардиомиоцитами и клетками эпителия почечных канальцев. Исследованы межклеточные взаимодействия этих клеток, в частности, межклеточные контакты и межклеточный транспорт.

Цель и задачи исследования Целью работы являлось исследование механизмов интеграции мезенхи мальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) с дифференцированны ми соматическими клетками (кардиомиоцитами, эпителиоцитами почки крысы);

изучение влияния межклеточных контактов на определение пути дифференци ровки ММСК.

Задачи 1. Исследовать образование межклеточных контактов при совместном культивировании ММСК человека с эмбриональными кардиомиоци тами или эпителиоцитами почки крысы.

2. Определить возможность межклеточного транспорта клеточных ком партментов между сокультивируемыми клетками.

3. Исследовать возможность дифференцировки ММСК человека в кар диомиоциты или эпителиоциты почки в условиях сокультивирования.

4. Исследовать возможность интеграции ММСК в орган in vivo при раз личных патологиях, приводящих к структурно-функциональным из менениям.

Научная новизна работы Было показано, что в совместной культуре между ММСК человека и диф ференцированными соматическими клетками крысы образуются межклеточные контакты, в частности щелевые контакты и туннельные нанотрубочки. По этим контактам осуществляется межклеточный перенос цитоплазматических и мем бранных компонентов и органелл, в частности митохондрий. В ММСК в условиях сокультивирования с соматическими клетками запускается дифференцировка по кардио- или нефроспецифическому пути, и эта дифференцировка в значительной мере зависит от наличия специфических контактов между клетками.

Научно-практическое значение работы Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление о возможностях заместительной терапии повреждений почки и сердца. Получены новые данные о механизмах взаимодействия донорских клеток с клетками орга низма реципиента (на уровне культуры клеток и на уровне организма). Получен ный материал может использоваться для дальнейшего клинического внедрения клеточных технологий для предотвращения патологических изменений при по чечной недостаточности или патологиях сердца и улучшения терапевтических эффектов заместительной клеточной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту 1. ММСК человека могут при совместном культивировании образовы вать контакты с дифференцированными соматическими клетками крысы, такими как кардиомиоциты и клетки почечного эпителия.

2. Между контактирующими клетками происходит обмен клеточным содержимым.

3. Следствием образования межклеточных контактов в совместной культуре клеток становится дифференцировка ММСК по ткане специфичному пути.

4. ММСК человека при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой почечной недостаточ ности.

Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н.

Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной Пироговской Студенческой научной конференции (Москва, 2007);

конференции «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 2007);

международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009);

Междуна родном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007);

XV Меж дународной конференции «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010);

15-ой Европейской Биоэнергетической Конференции EBEC (Дублин, 2008);

Международном симпо зиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной меди цине» (Судак, 2008);

Всероссийской научно-практической конференции студен тов и молодых учёных “Актуальные вопросы медицинской науки” (Ярославль, 2009);

Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируе мые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации Основные положения диссертации опубликованы в 18 печатных работах. Из них 6 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём работы Диссертация написана на 120 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Вы воды», «Благодарности» и «Список литературы». Список литературы включает отечественных и 202 иностранных источника.

Материалы и методы исследования Первичная культура кардиомиоцитов была получена из сердца эмбрионов крыс 15-17 дней гестации. Сердечная ткань подвергалась механическому измель чению (до кусочков размером приблизительно 1-1,5 мм). Кусочки ткани помеща ли в раствор Хенкса, отмывали от крови. После этого ткань подвергали воздейст вию 0,1% коллагеназы 2 типа. После ферментативной обработки суспензия цен трифугировались при 100g в течение 1 мин. Раствор, содержащий фермент, отби рался. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM-F12(4:1) с 15% содержа нием сыворотки крупного рогатого скота. Аналогичным образом выделялись эпи телиоциты почек 1-3-дневных крысят. Клетки ресуспендировали в среде DMEM F12(1:1) с 10% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки культи вировали в инкубатор при температуре 37С и 5% СО2. Культура ММСК, полу ченная из аутопсийного материала плодов 11-13 недель гестации, была предос тавлена НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова. Фено тип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45.

Митохондриальный трансмембранный потенциал оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США).

Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окраши вались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохонд рий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invi trogen,США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2, мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США).

Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном ска нирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображе ния обрабатывались программным пакетом ImageJ.

Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цито метра CyFlow (Partec GmbH, Германия).

Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в услови ях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение эксперименталь ного исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р у животных под хлоралгидрат ным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым за жимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для даль нейшего анализа, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза.

Иммуноцитохимия. Клетки фиксировали 4% раствором формалина;

пер меабилизировали 0,2% Triton X-100. Организация цитоскелета клеток оценива лась при помощи флуоресцентного красителя ТРИТЦ-фаллоидин (Sigma, США), а также моноклональных антител против тяжелой цепи кардиоспецифического миозина человека, после чего клетки инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с ФИТЦ. Для визуализации митохондрий использовали ан титела к цитохромС-оксидазе человека. Также в работе использовались антитела к ядрам человеческих клеток (Human Nuclei);

к белку Тамма Хорсфаля (THF) – специфическому белку почечных канальцев.

Вестерн-блоттинг. Содержание белка определяли с помощью бицинхонино вой кислоты. Электрофорез белков проводили по Лэммли (Laemmli, 1970). Для проведения электрофореза использовали 12,5% разделяющий гель и Трис глициновый электродный буфер. По окончании электрофореза белки переносили на PVDF мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Rainham, UK) согласно методи ке, описанной ранее (Towbin et al., 1992). Мембраны обрабатывали 5% раствором обезжиренного сухого молока, инкубировали с первичными антителами, промы вали три раза по 15 мин, и инкубировали 1 ч со вторичными антителами, конъю гированными с пероксидазой хрена. Искомые белковые локусы на мембране де тектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (Еnhanced chemiluminescence system, Amersham Pharmacia Biotech) с последующей детекци ей хемилюминесценции на фотопленке Kodak (США). Изображение оцифровыва ли и анализировали с помощью программы ImageJ.

Магнитно-резонансная томография (МРТ). Для исследования методом МРТ животных анестезировали хлоралгидратом и помещали в устройство позициони рования с системой стереотаксиса и терморегуляции томографа BioSpec 70/30.

Трансплантируемые клетки для данного метода предварительно инкубировали с препаратом железа (Мальтофер, Vifor, Швейцария) в течение 12 часов. После это го клетки промывали, трипсинизировали и отмывали от диссоциирующих аген тов. Полученный осадок клеток разводили физиологическим раствором до кон центрации, необходимой для введения животным и вводили непосредственно в почку. Во время МРТ проводился мониторинг с помощью прибора для контроля жизнедеятельности Small Animal Monitoring and Gating System, (SA Instruments Inc., USA). Анализ МР-изображений проводился в программе ImageJ.

Результаты и обсуждение Характеристика культуры клеток сердца эмбрионов крысы. Гетерогенность культуры Тщательной отработкой методов выделения и подбором оптимальных усло вий для содержания данной культуры было достигнуто образование клеточных ассоциатов, способных к самопроизвольному сокращению и обладающих призна ками сердечной ткани уже через 24 часа. В зависимости от плотности культуры сокращались как отдельные прикреплённые к пластику клетки, так и многокле точные островки, сокращение клеток в которых было согласованным и периодич ным. Выделенная культура являлась гетерогенной - помимо клеток, способных к сокращению, она содержала также и высокий процент недифференцированных кардиофибробластов. Данная культура была охарактеризована по ряду признаков:

1. Дифференцированные кардиомиоциты способны к самопроизвольно му сокращению.

2. Флуоресценция TMRE в этих клетках почти в 4 раза превышает дан ный показатель в кардиофибробластах.

3. Миофибриллы расположены в этих клетках упорядоченно и имеют поперечную исчерченность.

4. Дифференцированные кардиомиоциты имеют повышенное содержа ние внутриклеточного кальция;

способны к циклическим колебаниям концентрации ионов кальция во внутриклеточных депо.

5. Таких клеток в культуре около 50%.

В дальнейшем эти признаки использовались для наблюдения только за кар диомиоцитами в экспериментах по сокультивированию их с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК), поскольку нас интересова ло взаимодействие ММСК именно с сократительными элементами миокарда.

Формирование межклеточных контактов в смешанной культуре клеток различного происхождения В работе использовалась модель совместного культивирования двух раз личных типов кле ток с целью изуче В А ния поведения стволовых клеток в ткани после транс плантации. Нами выявлено, что в процессе культи вирования ММСК Г Б с кардиомиоцита ми или клетками почечного эпите лия в обоих типах клеток наблюдает ся образование Рис.1. Образование нанотрубочек при сокультивировании множества протя ММСК и других типов клеток. А, фазовый контраст, видны женных межкле нанотрубочки различной толщины, соединяющие кардиомио- точных структур, циты и ММСК. Шкала 20 мкм. Б, сканирующая электронная причем длина та микроскопия, нанотрубочки соединяющие клетки. Шкала 3 ких цитоплазмати мкм. В,Г, трансмиссионная микроскопия;

нанотрубочки, со- ческих выростов в единяющие кардиомиоциты и ММСК (указаны маленькими ряде случаев была чёрными стрелками);

наличие в нанотрубочках визикулярных структур (большая чёрная стрелка);

структура концевого уча- сопоставима с раз мерами клетки стка нанотрубочки (длинная чёрная стрелка). Шкала 5 мкм.

(рис.1). Первоот крыватели этих структур назвали их туннельными нанотрубочками, ТНТ (Rustom et al., 2004). В данной работе было показано, что нанотрубочки и более крупные по диаметру тяжи цитоплазмы достаточно активно образуются в культуре кар диомиоцитов и при культивировании их в монокультуре без соседствующих ММСК. Вероятно, это отражает фенотипическую предрасположенность кардио миоцитов к образованию единого многоклеточного синцития, как это происходит в ткани сердца. Напротив, в монокультуре клеток почечного эпителия такие кон такты практически не наблюдались. Однако в условиях сокультивирования обра зование нанотрубочек значительно усиливалось, причем как со стороны ММСК, так и клеток сердца (и, возможно, почки, так как в ряде случаев сложно опреде лить, какая из контактирующих клеток являлась ТНТ-образующей). ММСК в ус ловиях монокультуры также образовывали ТНТ. Причём, если сравнивать коли чество ТНТ-образующих клеток в монокультурах ММСК и кардиомиоцитов, оно будет сопоставимым;

тогда как в монокультуре клеток почки таких клеток крайне мало. Полученные данные подтвердили образование между клетками совместной культуры межклеточных контактов по типу ТНТ (~ 0,1 мкм в диаметре) наряду с другими типами цитоплазматических тяжей, соединяющих клетки (~ 3 мкм). На электронных микрофотографиях видно, что клетки образуют множество выростов цитоплазмы по типу филлоподий, которые могут как перемещаться вдоль суб страта так и выпячиваться перпендикулярно клеточной мембране (рис.1В). Обра зовавшиеся ТНТ, соединяющие клетки, имеют вид натянутых нитей и не имеют контактов с подложкой (рис.1А,Б), что является признаком, отличающим их от обычных филлоподий. Из данных просвечивающей микроскопии следует, что ТНТ представляют собой достаточно эластичные структуры, способные рас тягиваться в поперечнике в 2-4 раза, что может обеспе чить транспорт объемных структур - везикул, мито хондрий (рис.1Г).

Помимо ТНТ в совме стной культуре клеток на А Б Рис.2. Образование щелевых контактов между клет- блюдается формирование и ками различного происхождения – человеческих щелевых контактов. Их на ММСК и крысиных клеток почки. Конфокальная личие подтвердилось рядом микроскопия;

А, иммуноцитохимическое окрашива- экспериментов. В частно ние. Зелёная флуоресценция – АТ на Human Nuclei – сти, фиксированные клетки маркер человеческих клеток;

красная флуоресценция окрашивали антителами к – АТ на коннексин 43 – маркер щелевых контактов. коннексину 43 – маркеру Коннексин обнаруживается в том числе в области щелевых контактов. Также контакта ММСК и клеток почки. Б, фазовый кон- культуру подвергали окра траст. Шкала 20 мкм.

ске антителами на Human Nuclei, чтобы визуализиро вать популяцию человеческих клеток. На изображении (рис.2) хорошо видно, что клетки различного происхождения (человеческие ММСК с зеленым ядром;

сосед ние клетки почки крысы – с неокрашенными ядрами) находятся в плотном кон такте друг с другом. В зоне их непосредственного контакта наблюдаются частицы с красной флуоресценцией – коннексин 43, что свидетельствует о наличии между этими клетками щелевых контактов. Оценка функциональности таких контактов показала, что в режиме реального времени посредством щелевых контактов про исходит межклеточная передача цитоплазматического содержимого.

Исследование возможности раз личных клеток образовывать Число ТНТ на клетку контакты по типу туннельных нанотрубочек в условиях моно- и совместной культуры Было замечено, что в услови ях монокультуры практически все ММСК в полумонослойной культу ре образуют ТНТ. В культуре кар Кард-ы ММСК Кард-ы + ММСК диомиоцитов и ММСК число кле Рис.3. Количество ТНТ на клетку в чистой ток, образующих ТНТ, возрастало в культуре клеток сердца эмбрионов крыс, чистой культуре ММСК и смешанной куль- условиях совместного культивиро туре кардиомиоцитов и ММСК;

наблюдается вания (относительно монокультуры увеличение количества ТНТ на клетку в кардиомиоцитов). В условиях мо нокультуры кардиомиоцитов таких смешанной культуре.

клеток было на 12% меньше. В случае ММСК процент ТНТ образующих клеток, напротив, не Число ТНТ на клетку сколько снижался в совместной культуре относительно монокуль туры ММСК. Однако более объек тивным является подсчет количест ва ТНТ на клетку. Оценив количе ство ТНТ на ТНТ-образующую клетку, мы обнаружили, что число ММСК Эпителий ММСК + ММСК + ММСК + GA эпителий эпителий ТНТ значимо увеличивается в со + GA Рис.4. Количество ТНТ на клетку в чистой вместной культуре (относительно культуре ММСК, чистой культуре почечных монокультуры) (рис.3). Увеличение эпителиоцитов крыс и смешанной культуре ТНТ-образующих клеток в совме почечных клеток и ММСК;

а также в культу- стной культуре, в сочетании с дан рах, инкубированных с ингибитором щеле- ными о меньшем проценте таких вых контактов 18-GA – монокультуре клеток в монокультуре кардиомио ММСК и смешанной культуре эпителиоци- цитов и большим проценте их в тов и ММСК. Среднее количество ТНТ на монокультуре ММСК, позволяет клетку больше в смешанной культуре и у- предположить, что основной вклад меньшается в присутствии 18-GA.

в формирование ТНТ в совместной культуре делают именно ММСК. Аналогично проводили исследования совмест ной культуры, в состав которой входили клетки почечного эпителия. Было отме чено, что в условиях монокультуры практически все ММСК в полумонослойной культуре образуют ТНТ, а в монокультуре почечного эпителия процент клеток, образующих ТНТ, составлял около 10%. В то же время, в совместной культуре число клеток, имеющих ТНТ, составляло около 30%. В экспериментах с клетками почки, сокультивируемыми с ММСК, мы также оценивали влияние на формиро вание ТНТ ингибитора щелевых контактов - 18- глицирретиновой кислоты (18 GA). Было показано, что в ее присутствии процент ТНТ-образующих клеток уменьшается практически в 2 раза как в монокультуре ММСК, так и в совместной культуре ММСК и клеток почечного эпителия, по отношению к аналогичным опытам без добавления ингибитора. Также нами было обнаружено, что число ТНТ на клетку значительно возрастает в условиях совместной культуры и снижа ется в присутствии 18- GA, как в монокультуре ММСК, так и в совместной куль туре ММСК и клеток почки (рис.4).

Обмен цитоплазмой в смешанной культуре мезенхимальных мультипотент ных стромальных и соматических клеток Контактирование клеток, описанное выше, открывает потенциальные воз можности межклеточного обмена. Для выявления транспорта цитоплазмы ис пользовали флуоресцентный краситель Calcein-Green AM.

ММСК костного мозга или со матические клетки окрашивали Calcein и пересаживали на чаш ки с неокрашенными клетками.

Клетки были проанализированы на конфокальном микроскопе через 24 часа сокультивирова А Б Рис.5. Транспорт цитоплазматического содер- ния. Было обнаружено образова жимого из ММСК в клетки почечного эпителия ние многочисленных нанотрубо после 24 часов сокультивирования. А, конфо- чек, однако из-за увеличения кальное изображение. Перед сокультивировани- плотности культуры в результате ем ММСК окрашены флуоресцентным зондом пролиферации многие клетки Calcein-AM – зелёная флуоресценция;

клетки контактировали уже поверхно почечного эпителия окрашены флуоресцентным стями плазматических мембран, мембранным красителем Dil – красная флуорес- с возможным образованием ще ценция. Через 24 часа флуоресценция Calcein левых контактов. Во многих наблюдается не только в ММСК, но и в контак- кардиомиоцитах, контактирую тирующих с ними эпителиоцитах, а в ММСК щих с ММСК, нагруженных Cal обнаруживается флуоресценция Dil. Передача cein-AM (с высокой интенсивно красителей наблюдается в клетках, несущих на стью флуоресценции Calcein в нотрубочки или имеющих щелевые контакты с гетерологическими клетками. Б, фазовый кон- цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако траст. Шкала 50 мкм.

более низкой интенсивности.

Это свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в ци тозоль соседних кардиомицитов. В части клеток-реципиентов наблюдалось появ ление окрашенных клеточных компартментов. Исходя из природы красителя, бы ло сделано предположение, что эти окрашенные Calcein компартменты являются органеллами из клеток-доноров А Б 3ч 24ч (ММСК), окрашенных Calcein. Ана логично исследовали передачу цито плазматического содержимого в смешанной культуре клеток почки и ММСК. В данном случае клетки почки предварительно окрашивали мембранным красителем Dil – крас В Г 3ч 24ч ная флуоресценция (рис.5). В экспе риментах было отмечено, что обмен является ненаправленным – в куль туре обнаруживались клетки с двой ным окрашиванием с преимущест венным содержанием как цитоплаз матического, так и мембранного 24ч, в условиях вибрации Д красителя (рис.5).

Образование межклеточных контактов и обмен содержимым ци топлазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. В одной се Рис.6. Передача между кардиомиоцитами и рии экспериментов Calcein-AM ок ММСК цитоплазматического красителя рашивали ММСК, которые затем пе Calcein, исследованная по изменению соот- ресевали на культуральные флаконы ношения окрашенной и неокрашенной по- с неокрашенными кардиомиоцитами.

пуляций клеток в совместной культуре. Во второй серии Calcein-AM окра Цитофлуориметрия. Окрашена культура шивали кардиомиоциты крысы, а за ММСК (А,Б,Д);

или культура кардиомио- тем к ним подсаживали неокрашен цитов (В,Г). Показано образование единой ные ММСК. Было обнаружено, что популяции через 24 часа совместного куль- через 3 часа смешанная культура тивирования (Б,Г);

а также отсутствие объ- клеток в обеих сериях опытов четко единения популяций в условиях вибрации разделялась на 2 субпопуляции по (Д), препятствующей образованию ТНТ.

интенсивности флуоресценции Cal cein (рис.6А,В). После 24 часов сокультивирования деление клеток на 2 субпопу ляции исчезало. В клеточной суспензии наблюдалось равномерное распределение по интенсивности с одним пиком (рис.6Б). Во второй серии экспериментов при сокультивировании кардиомиоцитов, окрашенных Calcein-AM, и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 субпопуляции, наблюдавшееся через 3 часа совмест ного культивирования (рис.6В), также исчезало через 24 часа (рис.6Г). В качестве контроля смешанную культуру клеток содержали в условиях вибрации в течение 24 часов: сразу после прикрепления клеток флакон с культурой помещали на шейкер (50 колебаний в минуту). В данном случае сохранялось разделение клеток на окрашенные и неокрашенные, то есть физическое препятствие формирования межклеточных контактов предотвращало межклеточный обмен.

Аналогичное исследование проводили и с клетками почки в составе совме стной культуры. Также было показано образование между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного Calcein цитоплазматического содержимого была передана в неокрашенные клетки почки. При контрольном со культивировании в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах, клетки разделялись на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной ок раски ММСК. Чтобы оценить вклад щелевых контактов в обмен, мы инкубирова ли совместную культуру с ингибитором щелевых контактов – 18- GA – и также не наблюдали слияния пиков;

происходило незначительное сближение пиков и образование небольшой промежуточной популяции.

Транспорт митохондрий из мезенхимальных мультипотентных стромаль ных клеток в клетки сердца или почки При окраске смешанной культуры митохондриальным красителем TMRE внутри ТНТ, образую А Б щихся между клетками, обнаруживались струк туры окрашенные этим зондом. В смешанной В культуре клеток почки и ММСК мы восполь зовались другим мито Г хондриальным красите лем – JC-1 и также по казали наличие окра Д шенных им митохонд рий внутри ТНТ (рис.7А).

Также мы под Рис.7. Наличие в туннельных нанотрубочках митохонд рий и других везикулярных структур. А, наложение фа- твердили наличие ми зового контраста и флуоресцентного изображения;

совме- тохондрий внутри ТНТ стная культура эпителиальных клеток почки и ММСК. посредством электрон Красная флуоресценция – JC-1 – визуализация митохон- ной трансмиссионной дрий. Шкала 10 мкм. Б-Д, электронная трансмиссионная микроскопии. Было по микроскопия;

совместная культура кардиомиоцитов и казано, что в ТНТ на ММСК;

большими стрелками показаны структуры с 2-мя ходятся двумембран мембранами – митохондрии, а также одномембранные ные образования, кото везикулы – длинными стрелками;

шкала 0,5 мкм. рые по размерам и морфологическим осо бенностям соответствовали именно митохондриям (рис.7Б-Д).

Обмен митохондриями в смешанной культуре клеток почки и ММСК был также исследован с помощью А 0ч Б 24ч проточной цитофлуориметрии (рис.8). При исследовании на разных сроках сокультивирова ния было обнаружено, что сразу после смешивания культура раз деляется на две популяции с раз В 48ч Г 48ч, раздельные Д 24ч ной интенсивностью флуорес стёкла ценции митохондриального зон да (рис.8А). Уже через 3 часа наблюдался сдвиг популяции, нагруженной Mitotraсker, в сто Рис.8 Передача между почечными клетками и рону уменьшения интенсивности красителя флуоресценции. Эта тенденция ММСК митохондриального Mitotracker, исследованная по изменению соот- продолжала развиваться к 24 ча ношения окрашенной и неокрашенной популя- сам (рис.8Б);

к 48 часам сокуль ций клеток в совместной культуре. Цитофлуо- тивирования пики обеих популя риметрия. A-Г, ММСК окрашены Mitotracker ций практически сливались Green;

Д, клетки почки окрашены Mitotracker (рис.8В). Таким образом, проис Green. Показано, что со временем пики в совме- ходит транспорт митохондри стной культуре заметно сближаются (Б,В), или ального красителя, то есть даже сливаются (Д);

тогда как при культивиро ММСК передают окрашенные вании на разных культуральных стёклах сбли жение значимо слабее, а слияния пиков не на- Mitotraсker митохондрии в клет ки почки. При сокультивирова блюдается даже через 48 часов (Г).

нии окрашенных почечных эпи телиоцитов и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 суб популяции, наблюдавшееся сра зу после смешивания, исчезало уже через 24 часа (рис.8Д), что указывает на более эффектив ный транспорт митохондрий из А почечных клеток в ММСК.

Ещё одним методом, под Б Рис.9. Обмен митохондриями в совместной тверждающим обмен митохонд культуре клеток почечного эпителия и ММСК. риями между клетками в совме А, иммуноцитохимическое окрашивание анти- стной культуре, стала иммуно телами к цитохром С-оксидазе человека (зелёная цитохимия. Фиксированные флуоресценция);

красная флуоресценция – ядра клетки окрашивали антителами человеческих ММСК. Показано, что в клетке к цитохром С-оксидазе человека, почки (стрелка), находящейся в контакте с а также к ядрам человеческих ММСК (окрашенное ядро), выявляются мито- клеток (Human Nuclei). Было по хондрии из ММСК. Б, фазовый контраст. Шка казано, что человеческие ММСК ла – 20 мкм.

имеют положительную окраску на цитохром С-оксидазу и Human Nuclei, а клетки почки крысы – отрицательны по обоим маркерам. Почечные клетки, лежащие в зоне непосредственного кон такта с ММСК имеют положительную окраску на цитохром С-оксидазу, но отри цательную по Human Nuclei. Очевидно, что это клетки эпителия почки, получив шие митохондрии от ММСК (рис.9). Такие клетки появляются уже через 1 сут со вместного культивирования, а через 4 сут их количество возрастает.

Обмен мембранными компонентами в совместной культуре клеток почки и мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками Для исследования обмена между клетками мембранными компонентами мы также использовали проточную цитометрию. Предварительно, липофильным кра сителем окрашивалась одна из культур - либо культура ММСК, либо клеток поч ки (рис.10). Было обнаружено, что сразу после смешивания в культуре выделяют ся две популяции с разной интенсивностью флуоресценции DiO (липидный кра ситель) (рис.10А). При А 0ч Б 24ч В 48ч Г 48ч,раздельные сокультивировании стёкла происходит уменьше ние обеих начальных популяций и появление большого числа клеток Д 24ч Е 48ч, раздельные Ж 24ч, инкубация с с промежуточными зна 18 -GA стёкла чениями интенсивности флуоресценции, то есть клеток почки, в кото рые транслоцировался Рис.10. Передача между клетками почечного эпителия и зонд из ММСК ММСК мембранного флуоресцентного красителя DiO, ис- (рис.10Б,В). При со следованная по изменению соотношения окрашенной и культивировании по неокрашенной популяций клеток в совместной культуре.

чечных эпителиоцитов, Цитофлуориметрия. А-Г,Ж, окрашена культура ММСК;

окрашенных DiO, и не Д,Е, окрашена культура эпителиоцитов. Ж, смешання культура инкубировалась с ингибитором щелевых контак- окрашенных ММСК тов 18- GA. Наблюдается заметное сближение пиков или также происходила пе даже их слияние через 24 - 48 часа совместного культиви- редача мембранного рования (Б,В,Д), а также отсутствие объединения популя- красителя из эпителио ций в условиях культивирования на раздельных стёклах цитов в неокрашенные даже через 48 часов (Г,Е). Показано также, что в условиях ММСК (рис.10Д). При инкубирования с 18- GA (Ж) сохраняется разделение сокультивировании в культуры на 2 популяции. одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах, что предотвращает контактирование, клетки оставались раз деленными на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной окраски ММСК (рис.10Г,Е). Можно заключить, что именно непосредственный контакт клеток в совместной культуре является обязательным условием передачи клеточных ком партментов. Как уже показано выше, основными контактами, участвующими в таком транспорте, являются ТНТ и щелевые контакты. Чтобы оценить вклад ще левых контактов в обмен, мы инкубировали совместную культуру с ингибитором щелевых контактов, 18- GA, что приводило к уменьшению эффективности пере дачи красителя, но не отменяло его полностью (рис.10Ж).

Дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по ткане-специфичному пути Особенно важным результатом сокультивирования является запуск диффе ренцировки стромальных клеток по специфическому пути после их контактиро вания с дифференцированными соматическими клетками. В данной работе было показано, что уже через 1 сут после сокультивирования ММСК челове ка и кардиомиоцитов крысы, в ММСК выявляются гранулы, по ложительно окрашивающиеся ан тителами на кардиоспецифический -миозин человека. При использо А Б В Почка Почка вании антител в чистой культуре ММСК 7сут 3сут человека крысы ММСК подобной окраски на миозин в клетках обнаружено не было, то есть сами по себе стволо вые клетки не экспрессируют кар диоспецифический -миозин. Нами Сокультивирование использовались высокоспецифич Г Рис.11. Появление специфичных для почки ные антитела к тяжелой цепи чело белков в ММСК на разных сроках сокульти- веческого -миозина, что исключа вирования ММСК и клеток почечного эпите- ет возможность транспорта донор лия. А-В, конфокальная микроскопия. Им- ского миозина из кардиомиоцитов в муноцитохимическое окрашивание антите- ММСК, а также окраску миозина в лами к THF – красная флуоресценция;

к Hu- кардиомиоцитах крысы, что было man Nuclei - зелёная флуоресценция. А, чис подтверждено отдельными экспе тая культура ММСК;

Б, смешанная культура риментами.

на 4 сутки совместного культивирования;

В, Что касается смешанной смешанная культура на 4 сутки совместного культивирования в условиях, препятствую- культуры клеток почки и ММСК, щим контактированию клеток. Шкала 50 то в данном случае для оценки мкм. Г, иммуноблотинг. Антитела к цитоке- дифференцировки использовались антитела к цитокератину (при им ратину 5,6,18.

муноблоттинге), специфичному для эпителиальных клеток почки или к белку Тамма Хорсфаля (THF) – специфиче скому белку почечных канальцев (при иммуноцитохимии) (рис.11). В первом случае мы наблюдали высокий процент содержания цитокератина в контрольных образцах человеческой почки, а также отсутствие его в чистых ММСК человека.

Образцы крысиной почки также не окрашивались антителами к цитокератину в виду высокой видоспецифичности этих антител к человеческому белку. В образ цах сокультвированых клеток уже через 3 сут мы наблюдали появление полосы цитокератина, которая через 7 сут становится более интенсивной. Это говорит о том, что в смешанной культуре клеток ММСК начинали синтезировать видоспе цифичный человеческий цитокератин, то есть человеческие ММСК начали диф ференцироваться в эпителий. С увеличением срока совместного культивирования увеличивалось число дифференцировавшихся клеток и/или концентрация данного белка в клетках. О том, что ММСК начинали дифференцироваться именно в эпи телий почечных канальцев, говорят и эксперименты по выявлению в этих же ММСК почечного белка THF, вырабатывающегося в почечных канальцах. Мы использовали антитела к THF, не обладающие видоспецифичностью, поэтому этот белок выявляется и в клетках крысиной почки. В этом случае для визуализа ции ММСК мы дополнительно окрашивали смешанную культуру антителами к Human Nuсlei. Было обнаружено, что в чистой культуре ММСК данный белок не синтезируется, тогда как на четвёртые сутки сокультиврования появлялись клетки с положительной окраской и на Human Nuclei, и на THF – то есть человеческие ММСК, в которых появился специфический почечный белок. Также мы обнару жили, что в условиях, препятствующих возникновению межклеточных контактов, синтез THF в ММСК на четвёртые сутки практически отсутствовал. Это позволя ет сделать вывод, что для запуска дифференцировки ММСК в клетки того же ти па, с которыми они сокультивируются, необходимо наличие непосредственных физических контактов между этими клетками.

Влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при введе нии в почку in vivo Для того чтобы оценить физиологические последствия введения ММСК на уровне целого организма, был проведён ряд экспериментов на животных с ис пользованием модели острой почечной недостаточности (ОПН). Крысе, после 90 минутной тепловой ишемии левой почки, в повреждённую почку интрапаренхи матозно вводили суспензию ММСК. После этого оценивались биохимические по казатели: креатинин, мочевина, клиренс креатинина, реабсорбция натрия. Все животные, не получившие лечения после 90-минутной тепловой ишемии единст венной почки, погибли от ОПН (на 2-4 сутки). После введения ММСК от ОПН не погибла ни одна крыса. Показатели функции почки у выживших крыс восстанав ливались до нормальных значений через 1-2 месяца, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 недели.

Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с встраиванием пересаженных клеток в почечные струк туры, или же оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, меченые флуоресцентным красителем Calcein. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие меченых ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис.12А), однако только в интерстициальном пространстве ткани почки. Двойное окрашивание прижизненных срезов почки митохондриальным красителем TMRE и Calcein-AM показало, что введенные ММСК сохраняют митохондриальный трансмембранный потенциал, то есть большая часть трансплантированных клеток остается неповрежденной и функ ционально активной (рис.12Б).

Учитывая приведённые данные, можно полагать, что встраивания ММСК в эпителиальную выстилку повре жденных канальцев не происхо дит, по крайней мере, на ранних сроках после введения, и что ос новной терапевтический эффект достигается, вероятно, за счет паракринного действия. При ана лизе распределения меченых ММСК в почке в более отдален А Б Рис.12. Распределение ММСК, введенных в ные сроки (7 сут) после транс почку, по ткани. Конфокальная микроскопия плантации, число клеток выяв витальных срезов почки после 90-минутной ляемых на одном срезе было зна тепловой ишемии почки и интрапаренхима- чительно меньше, чем в первые тозного введения ММСК, меченых Calcein- сутки, что может объясняться AM;

дополнительная окраска срезов флуорес- возможной гибелью клеток. Од центным зондом TMRE. А, флуоресцентная новременно с этим происходила микроскопия витальных срезов почки через 1 миграция единичных ММСК на сутки после введения ММСК. Видно распро- большие расстояния от места странение введенных клеток (зеленая флуо- инъекции практически по всей ресценция) по интерстицию почки между по- паренхиме почки, что подтвер чечными канальцами (красная флуоресцен ждалось серийными срезами поч ция). Большой стрелкой указано место введе ния клеток. Шкала – 50 мкм. Б, окраска жизне- ки. Было также показано, что при способных ММСК обоими красителями дает окраске фиксированных срезов желтую окраска (клетки помечены стрелками). почки антителами к Human Nuclei через 7 сут после трансплантации Шкала – 20 мкм.

клетки в основном локализуются в интерстиции.

Чтобы обнаружить трансплантированные клетки в почке на отдалённых сроках мы использова ли метод МРТ для от слеживания меченных препаратом железа кле ток. На МР изображении клетки были видны в виде за темнённой области (рис.13). Эта область А Б В Рис.13. ММСК, введённые в почку. МР-изображения по- практически не изменя чек крыс после 90-минутной тепловой ишемии почки и ет своих размеров и по интрапаренхиматозного введения ММСК, меченых пре- ложения в течение двух паратом железа. Клетки, меченные железом, видны в виде недель. Это может го затемнённой области (стрелка). A, 3 суток после введе- ворить о том, что ос ния;

Б, 2 недели после введения;

В, интактные почки.

новная масса транс плантированных клеток если и мигрирует в ткани почки, то на незначительное расстояние;

высокая элиминационная способность почечной ткани исключает возможность накопления препарата железа в клетках почечного эпителия.

Выводы 1. Показана возможность образования межклеточных контактов между чело веческими мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками и кардиомиоцитами или клетками почки крысы. Клетки разного происхожде ния контактируют как через щелевые контакты, так и через туннельные на нотрубочки.

2. После сокультивирования с кардиомиоцитами в мезенхимальных мультипо тентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в кардиомиоциты: экспрессия человеческого кардиоспецифического миозина.

3. После сокультивирования с клетками почки в мезенхимальных мультипо тентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в почечный эпителий: синтез цитокератина и белка Тамма Хорсфаля.

4. Показана возможность межклеточного транспорта различных клеточных компартментов в совместной культуре;

показана зависимость этого транс порта от щелевых контактов и туннельных нанотрубочек.

5. При введении мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в по врежденную почку показана интеграция клеток в ткань почки, сохранение их жизнеспособности. При этом отмечено улучшение показателей функции почки после ишемии/реперфузии.

Список публикаций по теме диссертации 1. Khryapenkova TG, Plotnikov EY, Galkina SI, Sukhikh GT, Zorov DB, Cyto plasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. FEBS J, 2010, 277(S1), 2. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Galkina S.I., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromalcells and renal tubular cells in co-culture. Experimental Cell Re search, 2010, 316, p2447 – 3. Хряпенкова Т.Г. Механизмы взаимодействия мультпотентных мезенхи мальных стромальных клеток с клетками почечных канальцев в условиях совместного культивирования. Материалы Международной конференции “Ломоносов-2010”, 2010, с. 4. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Роль туннельных нанотру бочек в транспорте клеточных структур между мультипотентными мезен химальными стромальными клетками и клетками эпителия почечных ка нальцев. Материалы Всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий», Цитология, 2009, 51(9), с.790- 5. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Сухих Г.Т, Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт клеточных структур посредством туннельных нанотрубочек в совместной культуре мультпотентных мезенхимальных стромальных кле ток и клеток почечных канальцев. Материалы Международной конферен ции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”, 2009, с.105- 6. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.. Транспорт различных кле точных структур между мультпотентными мезенхимальными стромаль ными клетками и клетками почечных канальцев при совместном культи вировании. Материалы Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных “Актуальные вопросы медицинской науки”, 2009, с.101- 7. Кудрявцев Ю.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Марей М.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Морфоло гические изменения в почках крыс с острой постишемической почеч ной недостаточностью после внутрипочечного введения фетальных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека. Клеточ ные технологии в биологии и медицине, 2009, 1, с. 3- 8. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Коротецкая М.В., Сухих Г.Т., Зо ров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Клеточные тех нологии в биологии и медицине, 2008, 4, с.188- 9. Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Куд рявцев Ю.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Восстановление функций почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности. Материалы международного симпозиума «От экспери ментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.68- 10. Khryapenkova T.G., Plotnikov E.Y., Korotetskaya M.V., Vasileva A.K., Marey M.V., Sukhikh G.T., Zorov D.B.;

Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes: the role of mitochondria.

Abstract

Book: 15th European Bioenergetics Conference 2008, 2008, 1777, Supplement to BBA Bioenergetics. S53- 11. Исаев Н.К., Е.В. Стельмашук, Е.Ю. Плотников, Т.Г. Хряпенкова, Е.Р.

Лозиер, Ю.В. Долудин, Д.Н. Силачев, Д.Б. Зоров. Роль ацитода, NMDA-подтипа глутаматных рецепторров и кислоточувствительных ионных каналов (ASIC1a) в развитии нейрональной гибели при ише мии. Биохимия, 2008, 73(11), 1461- 12. Хряпенкова Т.Г., Коротецкая М.В., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Гетеро.

генность митохондриального потенциала как маркер для выделения чис той популяции кардиомиобластов. Материалы XV Международной кон ференции «Ломоносов-2008», 2008, с. 248- 13. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Vasileva A.K., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B.

Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J. Cell. Mol. Med., 2008, 12(5A), pp. 1622- 14. Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б.

Обмен цитоплазмой между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Роль туннельных нанотрубочек. Материалы 11-ой Пущинской конференции молодых уче ных “Биология — наука 21-го века”, 2007, с.163- 15. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б.

Исследование путей взаимодействия кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток в совместной культуре. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 54- 16. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.A., Хряпенкова Т.Г. Митохон дрия как многоликий Янус. Биохимия, 2007, 72(10), с. 1371 – 17. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт цитоплазмы и органелл между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совме стном культивировании. Материалы международной конференции «Ре цепция и внутриклеточная сигнализация», 2007, с.278- 18. Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Функциональная гетероген ность первичной культуры кардиомиоцитов крысы. Материалы второй Международной Пироговской Студенческой научной конференции.

Вестник РГМУ, 2007, 2(55), с.323-

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.