авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Накопление v, li и co клетками цианобактерий рода spirulina (arthrospira)

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА Светлана Геннадьевна

НАКОПЛЕНИЕ V, Li И Co КЛЕТКАМИ

ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА SPIRULINA (ARTHROSPIRA)

03.03.04

клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА - 2012

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского

государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тамбиев Александр Хапачевич

Официальные оппоненты: Смирнова Елена Александровна, доктор биологических наук, профессор, ка федра клеточной биологии и гистологии Био логического факультета МГУ им. М.В. Ломо носова.

Скальный Анатолий Викторович, доктор медицинских наук, профессор, дирек тор Института биоэлементологии Оренбург ского государственного университета.

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева.

Защита состоится «22» мая 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Калистратова Елена Николаевна ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Цианобактерии и, в частности, представители рода Spirulina (Arthrospira) являются распространенными объектами научных исследова ний (Гусев, Никитина, 1979) и одновременно широко культивируются в настоящее время как объекты фотобиотехнологии (Vonshak, 1987;

Borowitzka et al., 1999;

Тамби ев и др., 2006). Биомасса видов спирулины используется в производстве пищевого белка, лечебно-профилактических препаратов, высококачественных кормов, витами нов, пигментов, пищевых красителей и других полезных продуктов для медицины, животноводства, аквакультуры, косметологии и др. В биомассе спирулины отмечает ся высокое содержание белка - от 55 до 70%, присутствует широкий спектр витами нов группы В, значительное количество – каротина и других биологически актив ных соединений (Ciferri, 1983).

Нужно отметить, что обогащение биомассы исследуемых в данной работе видов рода Spirulina (Spirulina platensis, Spirulina maxima) различными необходимыми для человека (эссенциальными и условно-эссенциальными) микроэлементами придает ей дополнительно высокую полезность.

В литературе известны различные классификации микроэлементов, как по их содержанию в организме человека и животных, так и по степени их необходимости для протекания нормального метаболизма (Авцын и др., 1991;

Скальный и др., 2004).

В данной работе изучалось накопление в клетках цианобактерий рода Spirulina сле дующих микроэлементов.

Ванадий. За последние десятилетия значительно вырос интерес в изучении био логических эффектов соединений ванадия, который до этого считался микроэлемен том с неопределенной биологической ролью, а в настоящее время находится в группе условно-эссенциальных элементов. Это объясняется потенциальной возможностью его использования при лечении диабета, показанной в большом количестве исследо ваний. Многие эффекты инсулина в организме человека имитируются соединениями ванадия, они же способны увеличивать чувствительность человеческого организма к вводимым препаратам инсулина (Poucheret et al., 1998).

Литий – относится к группе условно-эссенциальных микроэлементов. В ряде ис следований показано, что его дефицит может приводить к нарушениям жирового об мена, дисфункциям репродуктивной системы и аномалиям в поведении. Соли лития обладают психотропным действием и используются уже несколько десятилетий при лечении различных психических отклонений. В настоящее время литий используется также при лечении онкологических заболеваний и в дерматологии (Anke et al., 1991).

Кобальт – является необходимым (эссенциальным) микроэлементом, входит в состав молекулы витамина B12 (цианокобаламина) и является кофактором ряда фер ментов. Он необходим в первую очередь для кроветворных тканей костного мозга и нервной ткани, особенно после травм и кровопотерь, для стимуляции образования эритроцитов, а также при заболеваниях нервной системы и анемии, развивающейся при исключительно вегетарианской диете (Скальный, Рудаков, 2004).

В целом ряде работ показано, что органические соединения вышеуказанных элементов более безопасны и эффективны для человека по сравнению с неорганиче скими (Reul et al., 1999;

Dean et al., 1999).

Изучение влияния ванадия, лития, кобальта, введенных в среду культивирова ния, на выход биомассы и накопление этих элементов клетками цианобактерий поз воляет определить их оптимальные концентрации в среде для получения биомассы, обогащенной исследуемыми элементами в органической форме.

Значительное внимание уделялось нами изучению влияния различных концен траций ванадия, лития и кобальта в среде культивирования на изменение элементного состава клеток, который является важнейшей характеристикой биологического объ екта. Для решения этих задач было необходимо правильно подобрать комплекс ана литических методов, позволяющих определять как макро- так и микроэлементный со став клеток цианобактерий. Эти же методы дали возможность определить количество исследованных микроэлементов, связанных с поверхностными структурами клеток и их распределение во фракциях клеточных компонентов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение усло вий максимального накопления эссенциальных и условно-эссенциальных элементов V, Li, Co в клетках культур цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima.

Задачи исследования:

Изучить влияние V, Li, Co на рост культур Spirulina platensis и Spirulina maxima 1.

и исследовать динамику накопления указанных элементов клетками обеих культур.

Определить оптимальные концентрации указанных элементов в среде культи 2.

вирования для получения обогащенной биомассы культур S. platensis и S. maximа.

Изучить влияние различных концентраций V, Li и Co в среде культивирования 3.

на элементный состав клеток культур цианобактерий Определить соотношение между адсорбированным поверхностными структу 4.

рами клетки количеством микроэлементов и их внутриклеточным содержанием.

Изучить распределение перечисленных микроэлементов во фракциях клеточ 5.

ных компонентов.

Научная новизна работы. Впервые установлена возможность значительного накопления V, Li, Co клетками цианобактерий S. platensis, S. maximа и определены оптимальные концентрации вводимых в среду культивирования микроэлементов.

Впервые показано, что накопление ванадия клетками цианобактерий зависело от сте пени его окисления (V+4, V+5) при введении в среду культивирования. Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках был наибольшим для кобальта, значительно превосходя этот показатель для ванадия и лития. Выявлены изменения общего элементного состава клеток культур, вызванные введением ванадия, лития и кобальта в среду. Показано, что значительная часть V, Li, Co адсорбируется поверх ностными структурами клеток. Изучено распределение указанных элементов между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для создания лечебно-профилактических препаратов на основе биомассы цианобак терий S. platensis и S. maxima, обогащенной V, Li, Co, являющимися полезными для человека микроэлементами.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на:

Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы разви тия», Москва, 2009, 2011;

Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 2009;

Международных конфе ренциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Крым, Гурзуф, 2010, 2011;

Съезде аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности», Москва, 2010.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, описания объектов исследования и использованных методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 99 cтраницах и включает 22 рисунка и 6 таблиц. Список литературы содержит ссылки на 209 источников, из которых 170 –зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования использовали термофильную нитчатую циа нобактерию Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Учреждения Российской академии наук Института физиологии рас тений им. К.А. Тимирязева РАН (Семененко, 1991) и нитчатую цианобактерию Spirulina maxima из коллекции Флорентийского университета.

Обе культуры выращивали на среде Заррука (Stanier et al., 1971) при постоян ном качании-120 об/мин и постоянном освещении 1,6 Вт/м2ФАР, температуре 26-280С в течение 21 суток. Соединения ванадия, лития, кобальта в виде солей VOSO43H2O, NaVO3, LiClH2O, CoSO47H2O вводили в среду культивирования од нократно на 7-ые сутки роста, так как в предыдущих работах было показано, что вве дение элементов в середине экспоненциальной фазы роста (7-10 сутки) является оп тимальным. По окончании культивирования клетки отделяли от культуральной жид кости фильтрованием через нейлоновую сетку, тщательно отмывали дистиллирован ной водой и высушивали при 1050С в течение 2-х часов.

Определение биомассы. Биомассу цианобактерий S. platensis и S. maximа опре деляли весовым и нефелометрическим методом (ФЭК-М).

Минерализация. Для полной минерализации биомассы цианобактерий и предотвращения потерь летучих соединений использовали микроволновый минерали затор («Минотавр»). Навеску пробы 10-70 мг помещали во фторопластовую емкость (50 мл) приливали по 3 мл HNO3, 2 мл H2O2 и разлагали в режиме без давления и под давлением в течение 20 мин. После охлаждения, раствор пробы разбавляли дистил лированной водой до 10-20 мл. Конечное содержание HNO3 в растворах не превыша ло 20 %.

Десорбирование элементов, связанных с поверхностными структурами кле ток. Отмытую от среды биомассу S. maximа (0,01-0,07 г) заливали 15 мл 0,03М рас твора ЭДТА и оставляли на 30 мин., после чего центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин., супернатант отделяли. К осадку добавляли 15 мл дистиллированной воды и центрифугировали. Полученный супернатант объединяли с предыдущим.

Осадок высушивали при 1050С в течение 2 часов. Определяли содержание ванадия, лития, кобальта как в осадке, так и в супернатанте.

Фракционирование биомассы. Получение фракций для культуры S.maxima, содержащих гидрофильные, гидрофобные и амфифильные компоненты клеток осу ществляли по методу Фолча (Folch et al., 1957).

Осадок, полученный после обработки биомассы раствором ЭДТА, заливали смесью хлороформа и метанола (в соотношении 2:1) и тщательно растирали смесь в гомогенизаторе, затем переливали смесь в пробирки и оставляли на 1 час при темпе ратуре 3-50С, после чего центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин., су пернатант отделяли, осадок повторно заливали смесью хлороформа и метанола и цен трифугировали, полученный супернатант объединяли с предыдущим. К объединен ному супернатанту добавляли дистиллированную воду, в результате чего смесь раз делялась на фракцию гидрофильных (водно-метанольная) и гидрофобных (хлоро формная) компонентов клеток. Осадок (фракция амфифильных компонентов) высу шивали при температуре 1050С в течение 2 часов и разлагали методом микроволно вой минерализации в смеси HNO3 и H2O2. Для оценки возможных в результате фрак ционирования потерь микроэлементов и определения их суммарного баланса во фракциях, из каждой колбы отбирали инакулят объемом 10-15 мл. Клетки отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, промывали их сначала дистиллированной водой, потом 0,03 М раствором ЭДТА. Осадок высушивали при температуре 1050С в течение 2 часов, затем подвергали микроволновой минерализации в смеси HNO3 и H2 O2.

Аналитические методы исследования. Определение содержания V в клетках, в растворе ЭДТА и во фракциях клеточных компонентов проводилось методом элек тротермической атомно-абсорбционной спектрометрии (ЭТААС) на спектрофотомет ре фирмы Перкин Элмер «Зееман/3030». В работе использовали печь с пиролитиче ским покрытием.

Определение содержания Li в клетках, в растворе ЭДТА, во фракциях клеточных компонентов проводилось методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии (ПААС) на спектрофотометре Перкин-Элмер 603, в пламени «ацетилен-воздух».

Определение содержания Сo в клетках, а также в водно-метанольной и хлоро формной фракции проводили методом ПААС, содержание Co во фракции амфифиль ных компонентов (осадок) и в растворе ЭДТА определяли методом ЭТААС.

Общий элементный состав биомассы цианобактерий (Na, K, Mg, Ca, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, B, V) определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктив но–связанной плазмой (АЭС-ИСП) на 48–канальном спектрометре ICAP-9000 (Ther mo Jarrell Ash).

Полученные растворы исследованных микроэлементов в ЭДТА и фракцию по лярных компонентов (водно-метанольная) непосредственно вводили в пламя ацети лен-воздух и графитовую печь. Растворы сравнения для определения элементов в водно-метанольной фракции и растворе ЭДТА готовили на основе метанола и 0,03 М раствора ЭДТА. Метанол и ЭДТА не влияли на величину аналитического сигнала.

Определение V, Li, Co в хлороформной фракции осуществляли после удаления ука занного растворителя нагреванием в течение 30 мин. при температуре 60 0С. Затем в образовавшийся осадок приливали 2 мл конц. HNO3 и несколько капель H2O2 до пол ного растворения осадка. Раствор охлаждали и разбавляли дистиллированной водой до 10-20 мл.

Микроскопирование. Оптическая микроскопия: морфологию клеток изучали с помощью светового микроскопа Axiophot, фирма Carl Zeiss (Германия) методом фа зово-контрастной микроскопии. Сканирующая электронная микроскопия: обработку образцов биомассы S.maxima проводили, как описано ранее (Звягинцев и др., 2010).

Образцы биомассы после фиксации и обезвоживания высушивали на установке Dryer HCP-2 (“Hitachi”, Япония) и просматривали в сканирующем электронном микроскопе JSM-6380LA (“JEOL”, Япония).

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных осуществлена с использованием программы Excel. По полученным данным рассчитывалось среднее квадратичное отклонение, число повторностей отдельных опытов было не менее 3-х.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение влияние V, Li и Co на рост и выход биомассы S. platensis и S. max ima, определение их оптимальных концентраций в среде. При введении в среду культивирования VOSO43H2O (катионная форма, V+4) ингибирование роста и сниже ние выхода биомассы у S. platensis начиналось при концентрации 20 ммоль/л ванадия в среде, у S. maxima –30 ммоль/л (рис.1). Ингибирование роста и выхода биомассы S. maxima при введении NaVO3 (анионная форма, V+5) начиналось при концентрации 15 ммоль/л (рис.1), а у S. platensis при меньших концентрациях 10 ммоль/л ванадия в среде. Сравнение влияния двух форм ванадия на кинетику роста культур цианобакте рий S. platensis и S. maximа показало, что V+5 вызывал большее подавление роста и снижение выхода биомассы по сравнению с V+4. Сравнивая накопление ванадия клет ками S. platensis и S. maxima, вводимого в среду в виде ванадил-катиона и ванадат аниона мы пришли к выводу, что накопление ванадия более эффективно при добав лении в среду ванадата.

В отношении лития изучение роста обеих культур показало, что ингибирование выхода биомассы S. platensis начиналось при концентрации лития 0,07 моль/л. Для S. maxima ингибирование роста и снижение выхода биомассы начиналось при боль шей, чем для S. maximа концентрации лития в среде равной 0,14 моль/л (рис.1). При одинаковых условиях культивирования накопление лития в клетках S. plаtensis и S. maxima практически не отличалось. Сравнение динамику роста культур S. platensis и S. maxima при введении различных концентраций ванадия и лития в среду культи вирования показало, что клетки S. maxima более устойчивы к высоким концентрациям этих элементов, а значит, эта культура является более перспективным объектом для получения обогащенной ими биомассы. Поэтому изучение накопления кобальта про водили на культуре S. maxima.

Изучение динамики роста S. maxima при введении в среду Co показало, что уже незначительные его концентрации в среде (в сравнении с V и Li) приводят к ингиби рованию роста и выходу биомассы. Так при концентрации кобальта - 25 мкмоль/л выход биомассы S. maxima снижался в среднем на 50% сравнению с контролем (рис.1). Внесение кобальта в концентрации выше 45 мкмоль/л приводило к гибели культуры к 21 суткам роста.

Сравнивая величины концентраций V, Li, Co в среде культивирования, вызы вающих подавление роста и выхода биомассы, мы пришли к выводу, что по степени ингибирующего влияния на скорость роста и выход биомассы цианобактерий S. platensis и S. maxima изучаемы микроэлементы можно расположить в следующем порядке Li+V+4V+5Со+2.

1 + 1, V+4 V 1, 0, Оптическая плотность, отн. ед.

5 0, Co 1, Li 1, 0, 0, 3 6 9 12 15 18 21 3 6 9 12 15 18 Время культивирования, сут.

Концентрация микроэлементов:

(1) - контроль (среда Заррука) (ммоль/л) - (2) – 20, (3) -30, (4) - 40, (5) - 60.

V+ (ммоль/л) - (2) – 20, (3) - 30, (4) - 40, (5) - 60.

V+ (моль/л) - (2) – 0,14, (3) – 0,21, (4) – 0,28, (5) – 0,35.

Li (мкмоль/л)- (2)- 17,0 (3) - 25,0.

Co Рис. 1. Влияние V, Li, Co на рост и выход биомассы S. maxima Исследования накопления ванадия, лития, кобальта клетками культур Spirulina platensis и Spirulina maxima позволили нам определить их оптимальные кон центрации в среде культивирования для получения биомассы цианобактерий обога щенных указанными микроэлементами (табл.1), при которых происходит достаточно высокое накопление микроэлемента в клетках, что не сопровождается заметным сни жением выхода биомассы. Для определения оптимальной концентрации вводимого в среду микроэлемента был предложен критерий, который определяется как произведе ние значений накопления элемента в клетках на выход биомассы. Максимальное зна чение критерия соответствует точке оптимальной концентрации.

Таблица 1. Содержание V, Li и Co в клетках S. platensis и S. maxima при их введении в среду в оптимальных концентрациях.

S. platensis S. maxima Оптимальные Накопление Оптимальные Накопление концентрации в клетках, концентрации в клетках, ммоль/л мкг/г ммоль/л мкг/г V+ 1245±105 1550± 30,0 30, + V 2855±254 2650± 30,0 20, Li 210,0 805±78 210,0 853± Co - - 0,017 320± Мы считаем, что еще одним фактором, который следует учитывать при опре делении оптимальной концентрации, является отсутствие изменений в морфологии клеток цианобактерий, которые могут говорить о серьёзных сдвигах в метаболизме клеток, что нежелательно для получения обогащенной биомассы. Задачей являлось получение максимального накопления исследуемых микроэлементов в клетках при отсутствии в них морфологических изменений.

Таблица 2. Коэффициенты накопления V, Li, Co для культур S. platensis и S. maxima.

С0 С K (ммоль/л) (ммоль/г) Элемент S. platensis S. maxima S. platensis S. maxima S. platensis S. maxima V+4 30 30 0,024 0,030 0,8 1, V +5 30 20 0,056 0,052 1,9 2, 210 210 0,114 0,115 0,5 0, Li - 0,017 - 0,005 - Co По результатам сравнения значений содержания ванадия, лития и кобальта в клетках S. platensis, S. maxima и значений оптимальных концентраций этих элементов в среде были рассчитаны коэффициенты накопления указанных микроэлементов (табл.2). Коэффициент накопления (К) определяется, как соотношение накопления элемента в клетке (С) к оптимальной концентрации данного элемента в среде (С0), то есть К = С/С0 1000. Как видно из таблицы 2, наибольшее значение коэффициента накопления было для кобальта, а наименьшее для Li. Таким образом, можно предпо ложить, что высокая токсичность кобальта для S. maxima, которая проявляется уже при относительно низких концентрациях его в среде, связана с высокой аккумулиру ющей способностью этого металла клетками цианобактерий.

Влияние V, Li и Co на элементный состав клеток S. platensis и S. maxima.

Полученные в нашей работе данные о влиянии различных концентраций V, Li, Co, введенных в среду культивирования в повышенных концентрациях, на элементный состав клеток суммированы в таблице 3.

Таблица 3. Изменение элементного состава клеток S. platensis и S. maxima при введе нии в среду различных концентраций V, Li, Co.

Элемент Концентрация Вид культуры Наблюдаемые изменения в среде, ммоль/л макроэлементы микроэлементы +4 + 30–60 S. platensis V,V Na Fe, Mn, Zn S. maxima 200- Li S. platensis Na, K Fe, Mn S. maxima 0,015-0, Co S. maxima Na Fe, Mn, Zn Было показано, что введение в среду культивирования повышенных концентра ций ванадия, лития и кобальта вызывало схожие изменения элементного состава кле ток как S. maxima, так и S. platensis, что подтверждает данные о физиологическом сходстве обеих культур (Тамбиев, Лукьянов, 2009) (табл. 3).

В литературе имеются данные, указывающие на особую роль ионов Na+ в под держании рН-гомеостаза клеток бактерий, участие этих ионов в транспорте различ ных соединений в клетку и в энергетических процессах клеток алкалофильных бакте рий (Гусев, Минеева, 2003). Известно, что в клетках микроводорослей и цианобакте рий при стрессе, вызванном присутствием токсического металла, наблюдается изме нение цитоплазматического рН (Arunakumara, Xuecheng, 2008). Не исключено, что процессы накопления V, Li, Co в клетках влияют на транспорт ионов натрия через мембраны клеток. Увеличение содержания Mn и Fe может быть связано также с тем, что токсическое действие V, Li, Co отражается в способности к образованию в клет ках активных форм кислорода. Как известно, в клетках цианобактерий ферментами, принимающим участие в детоксикации активных форм кислорода являются Fe- и Mn содержащие супероксиддисмутазы, каталазы и перокисдазы (Priya et al., 2007). Воз можно, увеличение поступления железа и марганца в клетку при введении всех трех элементов в среду культивирования связано с индукцией синтеза указанных фермен тов антиокислительной защиты.

Определение внутриклеточного и связанного с поверхностными структу рами клеток количества микроэлементов. Процесс аккумуляция бактериями ме таллов представляет собой двухстадийный процесс. Первая стадия быстрая - физико химическая адсорбция металла поверхностными структурами клетки. Этот процесс включает связывание металлов клеточной стенкой, цитоплазматической мембраной, а также поверхностными слизистыми структурами (капсулы, чехлы) (Hall, 2002;

Volesky, Holan, 1995;

Soldo et al., 2005). Вторая стадия медленная - проникновение ионов металла в клетку (Бекасова, 2000;

Hall, 2002;

Arunakumara, Xuecheng, 2008).

Металлы легко образуют прочные комплексные соединения за счет взаимодействия ионов с функциональными группами белков, полисахаридов, пептидогликанов, вхо дящих в состав поверхностных структур клеток и поэтому в них могут накапливаться в относительно больших количествах (Битюцкий, 1999).

Для определения количества V, Li и Co, связанного с поверхностными структу рами клеток мы использовали стандартную методику с применением в качестве де сорбента ЭДТА (Volesky, Holan, 1995;

Da Costa, Da Franka, 1998). Полученные дан ные представлены на рис. 2.

содержание V, Li, Co в % V+4 V+5 Co Li содержание элемента адсорбированного поверхностными структурами клеток внутриклеточное содержание элемента Рис. 2 Соотношение внутриклеточного и связанного с поверхностными структу рами клеток S. maxima количества V, Li, Co.

Из рис.2 видно, что значительная часть ванадия и лития (более 70%) адсорбиру ется поверхностными структурами клеток S. maxima. При этом данные по ванадилу и ванадату существенно не отличаются. Внутриклеточное содержание кобальта при близительно равно количеству кобальта, адсорбированного поверхностными структу рами клеток (около 55%).

Адсорбция металлов поверхностными структурами клетки является одним из механизмов устойчивости организмов к высоким концентрациям металлов, так как при этом уменьшается их проникновение в клетку (Kuyucak, Volesky, 1990;

Hall, 2002;

Soldo et al., 2005).

Изучение распределения ванадия, лития и кобальта между полярными, не полярными и амфифильными компонентами клеток S.maxima. С целью изучения распределения V, Li и Co в клетках цианобактерий было проведено разделение с по лучением фракций следующих компонентов: амфифильных (нерастворимые компо ненты), которая включает фрагменты клеточной стенки, амфифильные белки и поли сахариды;

неполярных (хлороформная фракция), которая включает гидрофобные белки и липиды;

полярных (водно-метанольная фракция), которая включает низкомолекулярные полярные соединения, гидрофильные белки цитоплазмы, моно сахариды.

Как видно из рис. 3 меньше всего ванадия, лития и кобальта содержалось во фракции неполярных компонентов.

содержание V, Li, Co в % Li Co +4 + V V амфифильные компоненты полярные компоненты неполярные компоненты Рис. 3 Распределение V, Li, Co между полярными, неполярными и амфифиль ными компонентами клеток S.maxima.

Основными металлсвязывающими агентами соединений, входящих во фракцию неполярных клеточных компонентов, могут быть амино- или фосфатные функцио нальные группы фосфолипидов, липополисахаридов и липопротеинов (Augustoda et al., 1998).

Большая часть ванадия, лития, кобальта, как видно из рис.3, содержалась во фракции полярных компонентов, состоящей в основном из растворимых белков ци топлазмы. Металлотионеины, принимающие участие в детоксикации металлов также входят в эту группу белков. В некоторых работах показано, что S. platensis обладает способностью синтезировать металлотионеины в ответ на стресс, вызванный введе нием различных металлов в среду культивирования (Саванина, 1998, Черникова, 2009). Присутствие ванадия, лития, кобальта в составе нерастворимых клеточных компонентов может быть связано с их включением состав углеводных гранул, а также со связыванием с белками, входящими в состав хлорофилл-белкового комплекса.

Влияние лития и кобальта на морфологию клеток S.maxima. При концен трации лития в среде культивирования - 0,28 моль/л мы начинали наблюдать образо вание сгустков трихомов и первые морфологические изменения в клетках обеих куль тур. Данные эффекты побудили нас к более подробному исследованию влияния лития на морфологию клеток цианобактерий. Эту часть работы мы проводили на культуре S. maxima.

Изучение влияния лития на морфологию клеток S. maxima проводилось c по мощью сканирующей электронной микроскопии. На рис. 4 (А, Б) представлена куль тура S.maxima, выращенная на среде Заррука без добавления лития в среду культиви рования (контроль). Как видно, для трихомов S. maxima характерна полная деспира лизация. На рис. 4 Б видно, что в трихоме выявляются места локализации клеточной перегородки. На рис. 4 (В, Г) представлена культура S.maxima, выращенная на среде Заррука с добавлением лития в концентрации 0,35 моль/л. Как видно в этом случае морфология клеток S. maxima под действием хлористого лития существенно меня лась. Происходило слипание трихомов различной длины, одиночных клеток, имела место деградация содержимого значительного количества клеток. Видны разломы в местах соединения клеток трихома. В отличие от контроля не выявлялись места лока лизации клеточной перегородки в трихомах. Наблюдалось отделение клеточной стен ки от протопласта, на концах трихомов возникали вздутия. Наблюдаемая картина со гласуется с данными, имеющимися в литературе, при этом известно, что хлористый литий может вызывать образования форм несбалансированного роста у некоторых бактерий (Прозоровский и др., 1987), однако механизм его действия плохо изучен.

А Б Б Г А В Г Рис. 4 Общий вид клеток в культуре S.maxima (сканирующая электронная мик роскопия). А, Б – контроль (без Li в среде);

В, Г – концентрация Li в среде 0, моль/л. Стрелками обозначено: Б - место локализации клеточной перегородки в три хоме, В - разлом в месте соединения клеток трихома, Г- отделение клеточной стенки от протопласта, вздутие на конце трихома.

Изучение влияния кобальта на морфологию клеток S. mаxima проводилось с по мощью метода фазово-контрастной оптической микроскопии. Введение кобальта в среду в концентрации 25 мкмоль/л и выше приводило к значительным изменениям в морфологии клеток обеих культур.

На рис. 5 видно, что под действием сульфата кобальта у части клеток в трихоме происходит деструкция протопласта и выброс содержимого через разрывы в поверх ностных структурах. Отмечается утолщение трихомов в среднем на 25-30%.

Б А Рис. 5 Общий вид клеток в культуре S.maxima (фазово-контрастная оптическая микроскопия). А – контроль (без Co в среде), Б – концентрация Co в среде 0, мкмоль/л. Стрелками обозначено: выброс содержимого клетки через разрывы в по верхностных структурах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе изучены условия накопления микроэлементов V, Li, Co клетка ми цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima, которые являются широко распространенными объектами фотобиотехнологии и обладают выраженным физио логическим и морфологическим сходством.

Для исследованных микроэлементов были определены оптимальные концентра ции при введении их в среду культивирования, при которых происходит достаточно высокое накопление микроэлемента в клетках, что не сопровождается заметным сни жением выхода биомассы и отсутствием видимых морфологических изменений кле ток. В качестве предложенного критерия оптимальной концентрации микроэлемента в среде рассматривалось, в первую очередь, его максимальное значение, равное про изведению содержания микроэлемента в клетке на выход биомассы. Значения крите рия в области оптимальных концентраций различались для обеих культур и были выше у S.maxima по сравнению S. platensis.

В работе показано, что накопление ванадия в клетках цианобактерий зависит от формы (анионной, катионной) при введении его в среду культивирования. Большее накопление в клетках обеих культур отмечалось при введении в среду ванадата (V+5) по сравнению с ванадилом (V+4).

Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках, определя емый как отношение количества элемента в клетке к количеству его в среде, был наибольшим для кобальта и наименьшим для лития.

При введении в питательную среду обеих культур указанных микроэлементов наблюдались изменения в общем элементном фоне клеток. Было исследовано соот ношение между количеством микроэлементов, связанных с поверхностными структу рами и находящихся в цитоплазме клеток цианобактерий.

Изучение распределения исследованных микроэлементов между полярными, не полярными и амфифильными компонентами клеток цианобактерий показало, что большая часть микроэлементов содержалась во фракции полярных, а меньшая часть во фракции неполярных компонентов.

ВЫВОДЫ 1. Определены оптимальные концентрации эссенциальных и условно эссенциальных для человека микроэлементов V, Li, Co, вводимых в среду культивирования, при которых наблюдалось их значительное накопление в клетках цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima, сопровождавшее ся небольшим понижением выхода биомассы. По степени ингибирующего вли яния на рост и выход биомассы культур цианобактерий исследованные микро элементы можно расположить в следующий ряд: Li+ V+4V+5Co+2.

2. Показано, что накопление в клетках цианобактерий ванадия, вводимого в среду культивирования, зависит от степени его окисления (V+4, V+5). Введение ва надата натрия (V+5) приводило к большему накоплению ванадия клетками обе их культур, чем при введении сульфата ванадила (V+4).

3. Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках цианобак терий различался и был наибольшим для Co, значительно превосходя этот по казатель для V и Li.

4. Введение V, Li, Co в среду приводило к изменению элементного состава клеток – увеличению содержания Na, Fe, Mn в клетках обеих культур. При введении Li наряду с этим наблюдалось уменьшение содержания K в клетках. При введении V и Co наблюдалось также увеличение содержания Zn.

5. Более 70% V, Li и около 55% Co связывалось с поверхностными структурами клеток S. maxima.

6. Большая часть V, Li и Co обнаруживалась во фракции полярных, а меньшая во фракции неполярных компонентов клеток S. maxima.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васильева С.Г., Лукьянов А.А., Лябушева О.А., Тамбиев А.Х. Изменение эле ментного состава клеток цианобактерий при введении в среду отдельных мик роэлементов. Мат. 5-го Межд.конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», М., 2009, ч.2, стр.148-149.

2. Тамбиев А.Х, Лукьянов А.А., Васильева С.Г. Проявление «памяти среды» при действии миллиметровых волн низкой интенсивности на культуры цианобакте рий. Тез. 5-го Межд.конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», С.Птб., 2009, симп. А, стр.26.

3. Тамбиев А.Х., Васильева С.Г., Лукьянов А.А., Седых Э.М., Банных Л.Н. Вклю чение ванадия и лития клетками некоторых цианобактерий. Труды XVIII Меж дун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фарма кологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2010, стр.103-104.

4. Vasilieva S.G., Tambiev A.Kh., Lukianov A.A., Sedykh E.M., Bannykh L.N. The investigation of the accumulation of vanadium and lithium by Spirulina platensis and Spirulina maxima cyanobacteria’s cells. Trace Elements in Medicine, 2010, v.11, №2, p.48-49.

5. Тамбиев А.Х., Седых Э.М., Лябушева О.А., Банных Л.Н., Васильева С.Г., Лукь янов А.А. Изучение влияния некоторых химических и физических факторов на элементный состав клеток цианобактерий с использованием атомно спектральных методов. Съезд аналит. России «Аналитическая химия – новые методы и возможности», М., 2010, стр.110-111.

6. Васильева С.Г., Тамбиев А.Х., Седых Э.М, Лукьянов А.А. Влияние условий культивирования на обогащение биомассы цианобактерии Spirulina maxima ва надием. Мат. 6-го Межд. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы раз вития», М., 2011, ч.2, стр.224-225.

7. Vasilieva S.G., Tambiev A.Kh., Sedykh I. M, Lukyanov A.A., Bannikh L.N. The en richment of biomass of cyanobacteria with vanadium by using the cation and anion forms of its compounds. J. of Trace Elements in Medicine and Biology, 2011, v. p.109–112.

8. Тамбиев А.Х., Васильева С.Г., Лукьянов А.А., Седых Э.М. Влияние повышен ных концентраций Li на морфологию и соотношение содержания Na и K в клет ках цианобактерий Spirulina maxima и Spirulina platensis. Труды XIX Межд.

конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармаколо гии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф 2011, стр. 150-151.

9. Тамбиев А.Х., Васильева С.Г., Лукьянов А.А. Проявление солетолерантности цианобактерий рода Arthrospira (Spirulina) – Spirulina platensis и Spirulina maxi ma. Вест. моск. универ. сер.16. Биология, 2011, №4. стр. 17-21.

10. Васильева С.Г., Седых Э.М., Лукьянов А.А., Омарова Е.О., Тамбиев А.Х. Изу чение накопления лития клетками цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima. Вопр. биол., медиц. и фармацев. химии, 2011, №11, стр. 50-54.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.