авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Структурно-функциональный анализ последствий длительной судорожной активности и эффективности нейропротекторов у крыс методом магнитно-резонансной томографии

На правах рукописи

Сулейманова Елена Мирзануровна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДСТВИЙ

ДЛИТЕЛЬНОЙ СУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ И

ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ У КРЫС МЕТОДОМ

МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Нина Евгеньевна кандидат биологических наук, доцент, доцент Чепурнова кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Сергей Алексеевич доктор биологических наук, Титов профессор кафедры дифференциальной психологии и психофизиологии факультета медицинской психологии Института психологии им. Л.С. Выготского РГГУ.

Виктор Ювенальевич доктор биологических наук, Щебланов профессор государственного научного центра – Института биофизики ФГУП ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита диссертации состоится 24 декабря 2012 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан 23 ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова Актуальность работы. В мире насчитывается 50 млн. больных эпилепсией (в России 800 тыс.), и лишь 60-70% пациентов с эпилепсией удается добиться контроля над припадками с помощью монотерапии 1 ряда (Петрухин и др., 2010). Кроме того, многие противоэпилептические препараты (ПЭП) обладают широким спектром побочных эффектов. При эпилепсии существует риск развития эпилептического статуса (ЭС) – состояния, при котором каждый последующий приступ возникает раньше, чем больной выходит из предыдущего, у него остаются выраженные нарушения сознания, гемодинамики, дыхания, гомеостаза на протяжении более 30 минут (Карлов, 2003). ЭС не только угрожает жизни человека, нарушая работу многих жизненно важных систем организма, но, при большой длительности судорог, приводит к запуску процессов, приводящих к апоптозу и некрозу нейронов в различных структурах головного мозга.

Повреждение и гибель нейронов в головном мозге может привести к серьезным отставленным последствиям, таким как нарушение памяти и обучения, когнитивных функций, а также развитие хронической эпилепсии. Морфо-функциональные изменения, развивающиеся в мозге в результате ЭС, могут стать причиной развития эпилепсии височной доли.

Клинические исследования не всегда могут дать возможность изучения механизмов, лежащих в основе отставленных последствий ЭС, так как между событием, являющимся инициирующим фактором развития изменений в мозге, ведущим к патологическим последствиям, могут пройти годы. Также из-за многообразия типов эпилепсии при исследованиях на людях бывает затруднительно определить этиологию заболевания и правильно провести диагностику. Существующие экспериментальные модели ЭС у крыс позволяют исследовать эти механизмы. Однако и в экспериментальных моделях изменения в мозге происходят в течение достаточно длительного времени после ЭС, а возможно, и в течение всей последующей жизни животного. Развитие прижизненных методов визуализации, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), помогают проследить динамику изменений, происходящих в структурах мозга после ЭС. Достаточно много работ посвящено изменениям, выявляемым при МРТ-исследовании мозга после ЭС, однако по прежнему актуально изучение возможности применения различных параметров МРТ как ранних маркеров, предсказывающих отставленные изменения в мозге, развивающиеся через достаточно длительное время после ЭС. Немногочисленны также работы, в которых анализируется корреляция между теми изменениями, которые выявляются с помощью МРТ, и поведенческими нарушениями.

Применение нейропротекторов, предотвращающих патологические процессы, вызываемые повреждением мозга при ЭС, могло бы улучшить прогноз у пациентов, страдающих эпилепсией. Классические и новые ПЭП могут купировать повышенную судорожную активность мозга, но, как правило, не обладают защитными свойствами в отношении нейродегенерации и не предотвращают эпилептогенез. Таким образом, проблема эффективного предотвращения повреждения головного мозга в результате длительных судорог остается нерешенной и целесообразным является поиск кандидатов в нейропротекторы.

Цель работы: Исследовать возможность применения количественных и качественных параметров МРТ в качестве маркеров, предсказывающих отставленные изменения в мозге крыс после ЭС и ассоциированных с ними поведенческих нарушений, а также провести оценку эффективности нейропротекторных эффектов гликозидов женьшеня.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Исследовать динамику повреждений мозга крыс после литий 1.

пилокарпинового ЭС, выявляемых с помощью МРТ на 2, 7 и 30 дни после ЭС.

Исследовать индивидуальную изменчивость выявляемых на МРТ изменений в 2.

различных структурах мозга в ранний и поздний периоды после ЭС.

Исследовать с помощью МРТ зависимость между ранними (2-ой день) и 3.

поздними (30-ый день) изменениями, выявляемыми в мозге крыс после ЭС Исследовать поведение крыс, перенесших ЭС, в тесте «открытое поле» и их 4.

способность к поведенческой адаптации в «открытом поле». Провести анализ зависимости между параметрами повреждения мозга в разные периоды после ЭС, выявленных с помощью МРТ, и поведенческими нарушениями в открытом поле.

Исследовать влияние степени повреждения мозга крыс после ЭС на развитие 5.

признаков депрессивного поведения.

Исследовать влияние экстракта культуры клеток корня женьшеня на степень 6.

повреждения мозга крыс, выявляемую в различные периоды после ЭС.

Научная новизна работы. Впервые был проведен анализ индивидуальных различий крыс линии Вистар по степени и распределению повреждений в различных структурах мозга после литий-пилокарпинового ЭС. Было обнаружено две группы крыс, достоверно различающиеся по интенсивности Т2-сигнала в гиппокампе, пириформной коре и миндалине. Было показано, что ранние обратимые изменения в гиппокампе крыс, выявляемые на МРТ через 2 суток после ЭС, коррелируют с поздними изменениями, выявляемыми через 30 дней после ЭС. Впервые было показано, что время релаксации Т2 в миндалине и ретросплениальной коре на 30 день после ЭС коррелирует с активностью в открытом поле, а время релаксации Т2 в префронтальной коре отрицательно коррелирует с уменьшением локомоторной активности при адаптации в открытом поле. Таким образом, было обнаружено, что время релаксации Т2 может быть маркером процессов, происходящих во время хронической фазы после ЭС и связанных с поведенческими нарушениями. С применением метода МРТ впервые было показано, что введение экстракта культуры корня женьшеня после длительных судорог снижает степень повреждения мозга крыс по сравнению с крысами, получавшими физ-раствор и вальпроат.Хроническое введение экстракта корня женьшеня в течение 4 недель после длительных судорог предотвращает вызванное ими уменьшение объема гиппокампа.

Положения, выносимые на защиту:

Ранние изменения в мозге крыс, выявляемые после ЭС методом МРТ 1.

коррелируют с отставленными повреждениями мозга, вызванными длительными судорогами.

ЭС приводит к поведенческим нарушениям, выявляемым у крыс в тесте 2.

«открытое поле». Степень ранних изменений в мозге крыс, выявляемых при МРТ исследовании, не коррелирует с этими нарушениями.

Поздние изменения в мозге крыс, выявляемых при МРТ-исследовании в 3.

миндалине, ретросплениальной и поясной коре коррелирует с поведенческой активностью в открытом поле в хронический период после ЭС.

Введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 после ЭС 4.

уменьшает степень ранних изменений в мозге, выявляемых при МРТ-исследовании на день после ЭС, но не предотвращает уменьшение объема гиппокампа.

Хроническое предварительное введение экстракта культуры клеток корня 5.

женьшеня ДАН-25 перед инициацией ЭС уменьшает тяжесть судорог во время ЭС.

Хроническое введение экстракта в течение 4 недель после ЭС препятствует уменьшению объема гиппокампа через 30 дней после ЭС.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе проведен анализ ранних и отставленных изменений в ряде структур мозга крысы после ЭС, выявляемых при МРТ-исследовании. Научный интерес представляют данные, свидетельствующие о том, что изменения, выявляемые при МРТ-исследовании мозга, связаны со степенью поведенческих нарушений, развивающихся после ЭС. Показан нейропротекторный эффект экстракта культуры клеток корня женьшеня при ЭС.

Полученные данные могут быть использованы при оценке эффективности применения результатов МРТ для прогнозирования развития отставленных последствий ЭС, а также при исследовании эффективности нейропротекторов.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на международной конференции «Идиопатическая генерализованная эпилепсия» (Анталья, Турция, 2007), 7-й ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2007), II съезде физиологов СНГ (Кишинэу, Молдова, 2008), 10-м международном симпозиуме по женьшеню (Сеул, Корея, 2010), 8-м Всемирном конгрессе Международной Организации Изучения Мозга (IBRO) (Флоренция, Италия, 2011), конференции Словенской Ассоциации Нейронаук 2011 (Любляна, Словения, 2011), 8 м Форуме Европейской Федерации Нейронаук (Барселона, Испания, 2012), 10-м Европейском конгрессе по эпилептологии (Лондон, Великобритания, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи, включая 1 статью в рецензируемом журнале из списка ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 172 источника. Работа иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Работа была проведена на взрослых (3—4 месяца) крысах самцах линии Вистар. Всего было использовано 156 животных.

Литий-пилокарпиновая модель ЭС. LiCl (Lithium Chloride, Acros Organics, мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 24 часа до эксперимента. Для инициации судорог вводили внутрибрюшинно пилокарпина гидрохлорид (Pilocarpine hydrochloride, Acros Organics) из расчета 40 мг/кг. ЭС наблюдали в течение 2 часов. Тяжесть судорог оценивали с помощью модифицированной пятибальной шкалы (табл. 1). Через 2 часа после начала ЭС судороги купировали паральдегидом (Paraldehyde, Acros Organics, 0,6 мл/кг внутрибрюшинно). После купирования ЭС каждому животному внутрибрюшинно вводили по 5 мл 5% раствора глюкозы.

Таблица 1. Шкала для оценки тяжести судорог при ЭС (Racine 1972).

Балл Поведенческие проявления судорог Нормальное поведение животного Абнормальное поведение животного (замирание, затаивание), жевание, отдельные вздрагивания головы Атипичные миоклонические судороги головы Клонические судороги конечностей и тела Сильные клонические судороги конечностей и тела с отрывом 3, обеих конечностей от пола Поза «кенгуру»: клонические судороги конечностей, тонические судороги тела Тяжелые тонико-клонические судороги с потерей позы Магнитно-резонансная томография МРТ-исследование мозга крыс проводили в томографе для малых животных Bruker BioSpec 70/30 (Bruker, Германия) в лаборатории магнитной томографии и спектроскопии факультета фундаментальной медицины МГУ. МРТ-исследование проводили в двух режимах: Т2-RARE для получения Т2-взвешенных изображений с высоким разрешением и T2-map (Т2-карта) для проведения количественного МРТ-исследования. МРТ-исследование мозга крыс проводили до ЭС (день 0), и через 2, 7 и 30 дней после ЭС.

Обработка результатов МРТ-исследования Т2-взвешенные изображения с высоким разрешением. Обработку полученных Т2 взвешенных изображений мозга крыс проводили с использованием программы ImageJ.

Степень повреждения мозга оценивали по площади участков с усиленным сигналом.

Участки с усиленным сигналом выделяли по яркости пикселей, вручную устанавливая пороговое значение яркости. Затем подсчитывали площади выделенных областей. Для оценки степени общего повреждения мозга подсчитывали суммарную площадь выделенных областей на 12 срезах, захватывая область мозга от АР -7,3 до АР +4 от брегмы (Paxinos, Watson, 1998).

Измерение объема гиппокампа. Объем гипокампа оценивали путем измерения площади зон, соответствующих гиппокампу на томографических срезах, полученных в режиме Т2-RARE. Площадь гиппокампа на срезе измеряли в программе ImageJ. При измерении выделяли зоны на срезах, соответствующие гиппокампу, включая субикулюм (Paxinos, Watson, 1998).

Обработка Т2-карт. Для получения значений времени релаксации Т2 в различных структурах мозга полученные Т2-карты обрабатывали с помощью программного обеспечения ParaVision 5.0 (Bruker, Германия). Были выбраны следующие области для исследования: дорсальный и вентральный гиппокамп, теменная кора, энторинальная кора, ретросплениальная кора, поясная кора, пириформная кора, миндалина, таламус. Выбранные зоны выделяли вручную. Затем программа осуществляла подсчет времени релаксации в выбранных зонах на основе полученных Т2-карт мозга крыс. Подсчет времени релаксации Т2 осуществлялся отдельно для правого и левого полушария.

Исследование отставленного эффекта длительной судорожной активности при ЭС: поведенческие нарушения Поведенческие тесты проводили через 5 недель после ЭС, т.е. приблизительно через неделю после последнего МРТ-исследования (на 30 день после ЭС).

Адаптация в открытом поле (ОП). При исследовании поведения в ОП и адаптации к новизне для каждой крысы было проведено три 5-минутные сессии в ОП с интервалом в часа. При оценке поведения в открытом поле отмечали количество и среднюю и суммарную длительность стоек и груминга, количество пересеченных центральных и периферических квадратов, умываний, почесываний, а также болюсов.

Исследование депрессивного поведения. Депрессивное поведение оценивали при помощи теста «принудительное плавание» и теста на вкусовое предпочтение, в котором подсчитывали среднее потребление воды и 1% сахарозы за сутки. Если крыса потребляла приблизительно поровну воды и раствора сахарозы, считали, что у этого животного отсутствует вкусовое предпочтение.

Исследование нейропротекторного эффекта бутанолового экстракта культуры клеток корня женьшеня и конвенционального противоэпилептического препарата вальпроата Препараты. Для исследования возможности оценки протекторного эффекта препаратов был выбран бутаноловый экстракт культуры корня женьшеня Д- (БИОХИММАШ, Москва). В используемом экстракте содержались гинзенозиды Rg1, Re, Rd, Rc, Rb1, Rb2, Rf (50 мг/г сухого экстракта), а также олиго- и полисахариды.

В качестве конвенционального ПЭП использовали вальпроевую кислоту (Конвулекс для внутривенного введения, Gerot Pharmazeutika, Австрия). В предварительных экспериментах мы подобрали дозу вальпроата, которую крысы переносили после ЭС, составившую 150 мг/кг внутрибрюшинно.

Исследование антиконвульсантногои нейропротекторного эффекта экстракта культуры клеток корня женьшеня. В первой серии экспериментов крысам опытной группы вводили экстракт женьшеня (18 мг/кг внутрибрюшинно) ежедневно в течение 4 недель, после чего инициировали ЭС и проводили МРТ исследование головного мозга. Крысы контрольной группы получали эквивалентные объемы физраствора.

Во второй серии экспериментов препараты вводили однократно через 30 мин после прерывания ЭС паральдегидом. Крысам внутрибрюшинно вводили 18 мг/кг или 180 мг/кг бутанолового экстракта женьшеня, либо 150 мг/кг вальпроата Контрольные крысы (группа ЭС) получали физраствор.

Также был исследован эффект хронического введения экстракта женьшеня на мозг крысы после ЭС. В этой серии экспериментов крысам вводили экстракт женьшеня через час после купирования судорог, а затем в течение 4 недель ежедневно в дозе 18 мг/кг.

Крысам контрольной группы вводили эквивалентные объемы физраствора.

Статистическая обработка результатов Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета программ Statistica 6.0. Полученные выборки данных были проверены на нормальность распределения. Применяли t-критерий Стьюдента для связанных и несвязанных выборок, U-критерий Манна-Уитни, критерий Вилкоксона, корреляционный анализ, точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ ранних и поздних последствий ЭС у крыс.

Визуальный анализ Т2-взвешенных МРТ изображений крыс с высоким разрешением.

При визуальном исследовании томографических срезов на 2 день после ЭС желудочки мозга были заметно расширены практически у всех исследованных животных. Участки с повышенным сигналом обнаруживались, в основном, в гиппокампе, энторинальной коре, пириформной коре, и, в некоторых случаях, в неокортексе. На 7 день эти изменения были значительно менее выраженными. В общую площадь зон с повышенным сигналом вошла площадь желудочков мозга, которые в данном режиме выглядят светлыми из-за интенсивного сигнала от ликвора. К 30 дню после ЭС происходило заметное увеличение желудочков по сравнению с 7 днем после ЭС, редукция гиппокампа и образование в нем новых областей с пониженным сигналом. У трех крыс были обнаружены области с усиленным сигналом в пириформной коре.

Изменение объема гиппокампа крыс после ЭС. На 2 день после длительной эпилептической активности объем гиппокампа заметно увеличен по сравнению с исходным гиппокампальным объемом. На 7 день после ЭС объем гиппокампа у крыс, перенесших длительные судороги, не отличался от исходного, измеренного до ЭС. К 30 дню после ЭС происходило уменьшение объема гиппокампа (рис. 1). Редукция гиппокампа составила приблизительно 18% от первоначального объема.

Изменение времени релаксации Т2 в различных структурах мозга крыс после ЭС. На день после ЭС время релаксации Т2 в дорсальном и вентральном гиппокампе достоверно увеличивалось по сравнению со значениями, измеренными до ЭС, и значениями, полученными для контрольных крыс. На 7 день после ЭС время релаксации заметно уменьшилось и не отличалось от значения, полученного до ЭС. На 30 день после ЭС Т ** ## практически не изменилось по сравнению с Т на 7 день после ЭС и не отличалось достоверно от исходного значения, полученного до ЭС. В то ** ## же время, у крыс контрольной группы, которые подвергались тем же манипуляциям, что и крысы, перенесшие ЭС, но не получали пилокарпин и не переносили длительных Рис.1. Изменение объема гиппокампа судорог, время релаксации Т2 практически не крыс после ЭС (n = 20) по сравнению с менялось в период, в который проводились исходным объемом, измеренным до МРТ-исследования (рис.2).

ЭС и объемом гиппокампа здоровых крыс (n = 15). ** - достоверное отличие по сравнению с объемом, измеренным до ЭС, p 0,001;

## ** ## ** ## # # # # А Б Рис.2. Время релаксации Т2 в вентральном (А) и дорсальном (Б) гиппокампе крыс до ЭС и через 2, 7 и 30 дней после ЭС (n = 16) и Т2 в гиппокампе здоровых крыс (n = 14), измеренное в те же дни. ** - достоверное отличие по сравнению со значением, измеренным до ЭС, p 0,001;

# - достоверное отличие от контроля, p 0.05;

## - достоверное отличие от контроля, p 0.001.

** ## ** ## # А Б ** ## ** ## В Г * *# Д Е Рис.3. Время релаксации Т2 в энторинальной коре (А), пириформной коре (Б), миндалине (В), таламусе (Г), префронтальной коре (Д), ретросплениальной коре (Е) крыс, перенесших ЭС (n = 16), до ЭС и через 2, 7 и 30 дней после ЭС, и здоровых крыс (контроль, n = 14) в те же дни. * - достоверное отличие по сравнению со значением, измеренным до ЭС, p 0,05;

** - достоверное отличие по сравнению со значением, измеренным до ЭС, p 0,001;

# - достоверное отличие от контроля, p 0.05;

## - достоверное отличие от контроля, p 0.001.

Как и в гиппокампе, в энторинальной коре, пириформной коре, миндалине и таламусе на 2 день после ЭС было обнаружено значительное увеличение времени релаксации Т2 по сравнению с Т2 в этих структурах, измеренным перед ЭС. На 7 и 30 дни после ЭС Т2 не отличалось от исходных значений, полученных до ЭС, и не отличалось от Т2 в соответствующих структурах контрольных крыс (рис.3 А, Б, В). В таламусе крыс, перенесших ЭС, увеличение Т2 на 2 день после ЭС было менее выраженным, чем в других структурах (рис. 3Г).

В префронтальной коре у крыс, перенесших длительные судороги, на 7 день после ЭС было обнаружено небольшое, но статистически значимое увеличение времени релаксации Т2 по сравнению с исходным значением, измеренным до ЭС. На 30 день после ЭС время релаксации Т2 в префронтальной коре также было больше, чем до ЭС, однако это различие не являлось достоверным. В ретросплениальной коре на 2 день после ЭС наблюдалось достоверное уменьшение времени релаксации Т2 по сравнению с исходными значениями, измеренными до ЭС, и по сравнению с временем релаксации Т2 в ретросплениальной коре контрольных крыс. На 7 и 30 дни у крыс, перенесших ЭС, время релаксации Т2 в данной структуре не отличалось от значений этого параметра, полученных до ЭС, и от его значений у крыс контрольной группы (рис. 3Д, Е).

Индивидуальная вариабельность степени повреждения мозга крыс после ЭС У одних крыс зоны с усиленным сигналом были заметно обширнее, чем у * других. Степень вовлечения структур мозга в патологический процесс * варьировала у разных животных из выборки.

Кластерный анализ выборки, состоящей из крыс, перенесших ЭС и выживших Рис.4. Общая площадь зон с усиленным сигналом на МРТ-изображениях мозга крыс, полученных до ЭС и на в течение 1 месяца после ЭС 2, 7 и 30 дни после ЭС. Кластер 1 – крысы с более (n=20), позволил разделить выраженными повреждениями мозга (n = 10), кластер 2 – выборку, по крайней мере, на крысы с менее выраженными повреждениями мозга (n = две группы: крысы с более 8). * достоверное различие между группами при p 0,05.

выраженными повреждениями (n=10) и с менее выраженными повреждениями (n=8) мозга, выявляемыми после ЭС. Степень повреждения мозга оценивали по площади зон с усиленным сигналом, которые в режиме Т2 RARE выглядят светлее, чем участки нормальной ткани. Общая площадь зон с усиленным сигналом у крыс этих групп достоверно различалась на 2 и 30 дни после ЭС (рис.4). Выраженность последствий ЭС, выявляемая на МРТ, по-видимому, не была связана с различиями по тяжести судорог во время ЭС, так как средний балл судорог, определяемый ежеминутно по шкале Racine у крыс этих групп достоверно не отличался.

Время релаксации Т2 в различных структур мозга крыс с разной степенью повреждения мозга после ЭС.

* * * А Б * В Г * * * Д Е Рис.5. Время релаксации Т2 в дорсальном (А) и вентральном (Б) гиппокампе, энторинальной (В) и пириформной (Г) коре, таламусе (Д) и миндалине (Е) до ЭС, через дня, 7 дней и 30 дне после ЭС у крыс с более выраженными повреждениями мозга (n=9) и у крыс с менее выраженными повреждениями мозга (n=6). *p 0,05.

Анализ Т2-карт с вычислением времени релаксации Т2 в ряде структур мозга выявил, что в вентральном и дорсальном гиппокампе у крыс с более выраженными повреждениями мозга время релаксации Т2 достоверно больше, чем у крыс с менее выраженными повреждениями. Через 30 дней после ЭС было обнаружено, что в дорсальном и вентральном гиппокампе Т2 у крыс с более выраженными повреждениями мозга снова увеличилось по сравнению со значением, полученным до ЭС, в то время как у крыс с менее выраженными повреждениями оно не отличалось от значений, полученных у этих крыс в норме до ЭС (рис.5 А, Б). В пириформной коре и таламусе крыс с более выраженными повреждениями мозга время релаксации Т2 на 2 день было также достоверно больше, чем у крыс с менее выраженными повреждениями (рис. 5 Г, Д). В миндалине достоверные различия по Т2 между группами были обнаружены на 2 и 7 дни после ЭС (рис. 5 Е).

В отличие от гиппокампа, в энторинальной коре время релаксации Т2 на 2, 7 и 30 дни после ЭС было одинаковым у крыс с более выраженными и менее выраженными повреждениями мозга (рис.5 В).

Корреляции между ранними обратимыми изменениями в структурах мозга крысы и более поздними структурными нарушениями, выявляемыми при помощи МРТ Зависимость между временем релаксации Т2 в гиппокампе в острую фазу после ЭС и последующей редукцией гиппокампа. Анализ зависимости между временем релаксации Т2, измеренным на 2 день после ЭС в дорсальном и вентральном гиппокампе, и гиппокампальным объемом на 2 день после ЭС показал, что Т2 в дорсальном гиппокампе положительно коррелирует с объемом гиппокампа (коэффициент Пирсона r = 0,55;

p 0,05), т.е. чем больше выражен отек гиппокампа в острую фазу после ЭС, тем больше время релаксации Т2 в этой структуре.

Время релаксации Т2 в вентральном гиппокампе на 2 день после ЭС положительно коррелирует с временем релаксации Т2 в вентральном гиппокампе, измеренным на 30 день после ЭС (коэффициент Пирсона r = 0,64;

p 0,05). Таким образом, чем сильнее увеличивается время релаксации Т2 в острую фазу после ЭС, тем больше время релаксации Т2, измеренное через 30 дней после ЭС. Аналогичные корреляции были обнаружены для пириформной и поясной коры, коэффициент Пирсона r = 0,82 и 0,81 соответственно;

p 0,05. В энторинальной коре была обнаружена отрицательная корреляция между временем релаксации Т2 на 2 и 30 дни после ЭС, коэффициент Пирсона r = -0,76;

p 0,05.

Время релаксации Т2 в острый период после ЭС (на 2 сутки) в вентральном и дорсальном гиппокампе отрицательно коррелирует с гиппокампальным объемом, измеренным через 30 дней после ЭС (коэффициент Пирсона r = -0,77 и -0, соответственно;

p 0,05).

Таким образом, несмотря на обратимость острого увеличения времени релаксации Т2, значение Т2 в острый период после ЭС может являться маркером, позволяющим оценить степень отставленных повреждений гиппокампа и парагиппокампальных структур, которые можно выявить через 30 дней после ЭС.

Отставленные последствия длительных судорог: поведенческие нарушения у крыс после ЭС Поведение в открытом поле. Адаптация в открытом поле. В первой 5-минутной сессии у крыс, перенесших ЭС, была выявлена повышенная активность по сравнению с контрольными крысами, которые подвергались тем же манипуляциям, что и крысы из опытной группы, но не получали пилокарпин и не переносили длительных судорог. Так, количество пересеченных периферических и центральных секторов у крыс, перенесших ЭС, было достоверно больше, чем у контрольных крыс (рис. 6 А, Б). Общая и средняя длительность стоек у крыс, перенесших ЭС, и контрольных крыс в первой сессии достоверно не различались (рис. 6 В, Г).

Адаптация в новой обстановке. Было обнаружено, что активность контрольных крыс в открытом поле уменьшалась при повторении сессий в открытом поле. Уменьшалось количество пройденных периферических и центральных секторов, т. е. снижалась горизонтальная локомоторная активность (рис.). Также уменьшалась общая длительность стоек, причем в 3 сессии общая длительность стоек была достоверно меньше, чем в 1 сессии (рис.). У крыс, перенесших ЭС, количество пересеченных секторов у стенки и в центре арены не изменялось при повторных помещениях крыс в открытое поле и оставалось достоверно больше, чем у крыс контрольной группы. Общая длительность стоек также не изменялась при повторении сессий в открытом поле. Так как в то же время у контрольных крыс длительность стоек уменьшалась, во второй и третьей сессии в открытом поле общая длительность стоек у крыс после ЭС была достоверно больше, чем у здоровых крыс (рис.).

Кроме того, в третьей сессии у крыс, перенесших ЭС, средняя длительность стоек была меньше, чем у контрольных крыс.

Зависимость между изменениями в структурах мозга крыс, выявляемых на МРТ и поведенческими нарушениями При исследовании зависимости между активностью в новом окружении и временем релаксации Т2 в гиппокампе, энторинальной и пириформной коре на 2, 7 и 30 дни после ЭС, достоверных корреляций обнаружено не было. Таким образом, можно предположить, что раннее изменение Т2 после ЭС в этих структурах не является маркером последующего развития гиперактивности в ОП и нарушения адаптации к новизне. Время релаксации Т2 в этих структурах в хронический период также не связано с поведенческими нарушениями в ОП.

* * * * * * А Б # * * В Г Рис.6. Число пройденных секторов у стенки (А) и в центре арены (Б), общая (В) и средняя (Г) длительность стоек у крыс, перенесших ЭС (ЭС), n = 14, и здоровых крыс (контроль), n = 11, во время трех 5-минутных сессий в открытом поле с интервалом в часа. * достоверное различие между группами при p 0,05;

# достоверное различие между сессиями, p 0,05.

Анализ зависимости между Т2 в миндалине на 30 день после ЭС и суммарной локомоторной активностью в первой сессии в открытом поле показал, что время релаксации Т2, измеренное на 30 день после ЭС, отрицательно коррелирует с суммарной локомоторной активностью в открытом поле (коэффициент Спирмена -0,73;

p 0.05).

Время релаксации Т2 в ретросплениальной коре, как и в миндалине, на 2 и 7 дни после ЭС не коррелировало с параметрами активности в ОП. Однако была обнаружена отрицательная корреляция между временем релаксации Т2 на 30 день после ЭС вертикальной активностью (общей продолжительностью стоек) в ОП (коэффициент Спирмена -0,56;

p 0.05).

Корреляционный анализ зависимости между параметрами активности в ОП и временем релаксации Т2 показал, что значения Т2, полученные на 2 и 7 дни после ЭС не коррелируют ни с одним параметром активности в открытом поле. Однако время релаксации Т2 в префронтальной коре на 30 день после ЭС положительно коррелировало с уменьшением суммарной локомоторной активности в открытом поле (коэффициент Спирмена 0,68;

p 0.05), которое оценивали как разность между суммарным количеством квадратов в центре и у стенки арены, пройденным крысами в третью и в первую сессии в открытом поле.

Развитие депрессивного поведения у крыс после ЭС Тест «принудительное плавание». Крысы, перенесшие ЭС, в тесте принудительного плавания демонстрировали гиперактивность. Общая продолжительность замирания у крыс, перенесших ЭС, была достоверно меньше, чем у крыс контрольной группы. Напротив, продолжительность активного плавания/карабканья у экспериментальных крыс была достоверно больше, чем у контрольных крыс Тест на вкусовое предпочтение. Все животные, которые потребляли приблизительно одинаковые объемы воды и раствора сахарозы, т.е. демонстрировали отсутствие вкусовых предпочтений, или ангедонию, попали в группу с более выраженными повреждениями мозга. В то же время в группе с менее выраженными повреждениями мозга не было ни одной крысы, демонстрирующей отсутствие вкусового предпочтения.

Применение МРТ мозга крыс для оценки эффективности нейропротекторных препаратов Эффект предварительного хронического введения гликозидов женьшеня на тяжесть протекания и ранние последствия ЭС. Сравнение протекания судорожных приступов у крыс, предварительно получавших и не получавших экстракт женьшеня, показало, что тяжесть судорог у крыс, получавших препарат, достоверно ниже, чем у контрольных животных.

суммарная длительность тяжелых судорог (тонические судорог тела, клонус конечностей) и стадий (тяжелые тонико-клонические судороги с потерей позы) была достоверно меньше у крыс, которые предварительно получали экстракт * культуры клеток корня женьшеня, чем у крыс, получавших физраствор (рис. 7).Было обнаружено, что степень повреждения мозга была меньше у Рис. 7. Продолжительность тяжелых крыс, которые предварительно получали тонических судорог с клонусом экстракт женьшеня в течение 4 недель (рис.8).

конечностей (стадия 4) и генерализованных тонико-клонических судорог (стадия 5) у крыс, получавших гинзенозиды (Гин) или физраствор (ЭС) в течение 4 недель.* p 0,05.

Не только степень, но и характер повреждения мозга различался в группах крыс, получавших и не получавших экстракт женьшеня. У крыс, получавших гинзенозиды, наблюдалось расширение желудочков и усиление Рис.8.. Томографические срезы мозга крыс через 2 суток сигнала (режим Т2) в после ЭС, режим Т2 RARE. А, Б – мозг интактной крысы;

В, пириформной и Г – мозг крысы, не получавшей гинзенозиды;

Д, Е – мозг энторинальной коре, у крысы, получавшей гинзенозиды в течение 4 недель. В верхнем ряду представлены срезы, полученные на уровне, некоторых – в гиппокампе, приблизительно соответствующем AP -3,6 мм;

в нижнем однако в других ряду – AP -5,3 мм от брегмы (Paxinos, Watson, 1998). Hip – структурах заметных гиппокамп;

Pir – пириформная кора;

Ent – энторинальная нарушений не обнаружено. У крыс, не получавших гинзенозиды, выявлены поврежденные участки в гиппокампе, таламусе, миндалине, а также значительное расширение 3 желудочка. Таким образом, через 2 суток после ЭС у крыс, получавших экстракт женьшеня, повреждения мозга были менее выраженными, чем у крыс, не получавших препарат, и выявлялись в основном в гиппокампе, пириформной и эторинальной коре, и не обнаруживались в миндалине и таламусе.

Эффект однократного введения различных доз экстракта корня женьшеня и конвенционального противоэпилептического препарата Конвулекса на ранние и отставленные последствия ЭС.

# * # * * * Рис.9. Общая площадь участков с повышенным сигналом на МРТ-изображениях мозга крыс, полученных до ЭС и на 2, 7 и 30 день после ЭС у интактных крыс (контроль, n=14), у крыс, получивших физраствор (ЭС, n=20);

крыс, получивших 18 мг/кг экстракта женьшеня (gin18, n=11);

крыс, получивших 180 мг/кг экстракта женьшеня (gin180, n=3);

крыс, получавших вальпроевую кислоту (VPA, n=7) через 30 мин после купирования ЭС паральдегидом. * достоверное отличие от контроля при p 0,05. # достоверное различие между группами, p 0,05.

Было установлено, что введение экстракта культуры корня женьшеня в дозе 18 мг/кг через 30 мин после купирования ЭС уменьшает острые изменения в мозге крыс, индуцируемые длительной судорожной активностью и выявляемые на МРТ-изображениях через 2 и 7 дней после ЭС. В то же время введение 180 мг/кг экстракта и 150 мг/кг вальпроата не оказывало такого эффекта (рис.9).

Изменение времени релаксации Т2 у крыс, получавших гликозиды женьшеня. При анализе Т2-карт мозга крыс, получивших экстракт женьшеня через 30 мин после купирования ЭС, было обнаружено, что у крыс, получивших 18 или 180 мг/кг экстракта женьшеня, время релаксации Т2 в гиппокампе на 2 день после ЭС было достоверно меньше, чем у крыс, получивших физраствор.

* * * А Б Рис.10. Время релаксации Т2 в дорсальном (А) и вентральном (Б) гиппокампе интактных крыс (контроль, n=14) и крыс, получивших 18 мг/кг (gin18, n=11), 180 мг/кг (gin180, n=3) экстракта культуры клеток корня женьшеня или физраствор (ЭС, n=20) через 30 мин после купирования судорог, измеренное до ЭС, на 2, 7 и 30 день после ЭС. * p 0,05.

В дорсальном гиппокампе крыс, получивших физраствор, увеличенное время релаксации было обнаружено также на 7 день после ЭС, в то время как у крыс, получивших экстракт культуры корня женьшеня Т2 уменьшалось до первоначальных значений. На день после ЭС по времени релаксации Т2 в вентральном гиппокампе достоверных различий между опытными и контрольными крысами обнаружено не было (рис.10). В энторинальной и пириформной коре время релаксации Т2 увеличивалось одинаково у крыс, которым вводили экстракт культуры клеток корня женьшеня или физраствор.

Изменение объема гиппокампа после ЭС. Уменьшение объема гиппокампа у крыс, получавших экстракт женьшеня, и у крыс, получавших физраствор, достоверно не различалось, хотя было менее выражено у крыс, получавших экстракт женьшеня (рис.11).

Наиболее выраженная редукция гиппокампа была выявлена у крыс, получивших вальпроевую кислоту. Объем гиппокампа у этих крыс не отличался от объема гиппокампа животных, получавших физраствор, однако был достоверно меньше, чем у крыс, получивших экстракт женьшеня.

Эффект хронического * * введения экстракта * # корня женьшеня на развитие ** * повреждений головного мозга крысы после ЭС. У крыс, получавших экстракт Рис.11. Объем гиппокампа, измеренный до ЭС и на 2 и 30 дни после женьшеня, ЭС у интактных крыс (контроль, n=14), у крыс, получивших физраствор (ЭС, n=20);

крыс, получивших 18 мг/кг экстракта площадь зон с женьшеня (gin18, n=11);

крыс, получивших 180 мг/кг экстракта усиленным женьшеня (gin180, n=3);

крыс, получавших вальпроевую кислоту (VPA, n=7) через 30 мин после купирования ЭС паральдегидом. * сигналом ни на 7, достоверное отличие от контроля при p 0,05, # достоверное ни на 30 день различие между группами при p 0,05. после ЭС не отличалась от этой величины у крыс, * * * Рис. 12. Общая площадь областей с Рис. 13. Объем гиппокампа крыс, усиленным сигналом в мозге крыс, получавших 18 мг/кг экстракта культуры получавших 18 мг/кг экстракта культуры клеток корня женьшеня (gin18, n = 7) или клеток корня женьшеня (gin18, n = 7) или физраствор (ЭС, n = 7) и интактных крыс физраствор (ЭС, n = 7) и интактных крыс (контроль, n = 5) через 7 и 30 дней после (контроль, n = 5) через 7 и 30 дней после ЭС. ЭС. * достоверное отличие от контроля при которые не получали пилокарпин и не p 0.05.

переносили длительных судорог. В то же время, у крыс, перенесших ЭС и получавших физраствор, общая площадь зон с усиленным сигналом была достоверно больше, чем у крыс из контрольной группы (рис.12). Таким образом, хроническое введение экстракта женьшеня после эпизода ЭС уменьшало степень общего повреждения мозга крыс в результате длительных судорог. Через 30 дней гиппокамп крыс, перенесших ЭС и получавших физраствор, достоверно уменьшился по сравнению с контролем и объемом гиппокампа, измеренным через 7 дней после ЭС. В то же время, объем гиппокампа крыс, получавших экстракт женьшеня, достоверно не изменился по сравнению с объемом гиппокампа, измеренным через 7 дней после ЭС (рис.13). Таким образом, хроническое введение экстракта культуры клеток корня женьшеня, по крайней мере, частично предотвращало развитие склероза гиппокампа, сопровождающееся уменьшением его объема.

ОБСУЖДЕНИЕ В работе исследована динамика происходящих после ЭС изменений в мозге крыс и взаимосвязь между ранними и отставленными изменениями.

Области с увеличенным временем релаксации Т2 в ранний период после ЭС топографически соответствуют областям, в которых выявляются поврежденные в результате длительной судорожной активности нейроны (Turski et al. 1983;

Covolan, Mello, 2000;

Fabene et al., 2003;

Covolan, Mello, 2006), т.е. распределение зон с увеличенным временем релаксации Т2 в мозге на 2 день после ЭС совпадает с зонами, наиболее чувствительными к воздействию длительной судорожной активности, в которых в первую очередь происходит повреждение нейронов.

Согласно полученным в данной работе результатам, время релаксации Т2, измеренное в гиппокампе на 2 день после ЭС, положительно коррелирует с гиппокампальным объемом в этот же период. Увеличение объема гиппокампа у крыс после ЭС по сравнению с исходным объемом и объемом гиппокампа у контрольных крыс, которые не переносили длительных судорог, может быть обусловлено накоплением жидкости в ткани, т.е.

формированием отека. Изменение времени релаксации Т2 связано с изменением микровязкости среды и ее состава и может отражать изменение содержания воды в ткани.

Предполагается, что выявляемые в ранний период после ЭС изменения в различных структурах мозга, в частности, возрастание Т2 в лимбических структурах, обусловлены вызванными ЭС нарушениями микроциркуляции, инициации некроза и апоптоза, воспалением и формированием отека тканей. Все эти процессы являются следствием увеличения содержания воды и ионов в ткани, приводящему к изменению времени релаксации Т2.

Ранние изменения, выявляемые в лимбических структурах, практически исчезали к дню после ЭС. Таким образом, в течение первой недели после ЭС завершаются острые процессы в гиппокампе, энторинальной и пириформной коре, миндалине и таламусе.

Согласно полученным нами данным, в этот период времени уже исчезает отек гиппокампа, но еще не происходит его редукция.

Результаты МРТ-исследования (редукция гиппокампа и увеличение времени релаксации Т2 в гиппокампе на 30 день после ЭС) позволяют предположить развитие склероза гиппокампа у крыс через месяц после ЭС. Большое количество гистологических исследований мозга крыс в хронический период после ЭС подтверждает это предположения. Так, выраженные признаки нейродегенеративных процессов, включая атрофию и глиоз, наблюдались в гиппокампе, энторинальной коре, пириформной коре, некоторых ядрах миндалины и таламуса (Pitkanen, et al. 2002;

Covolan, Mello 2006;

Andre, et al., 2007).

Известно, что гибель нейронов в результате ЭС происходит и в неокортексе крыс (поясной извилине, ретросплениальной коре, соматосенсорной, зрительной и слуховой коре) (Covolan, Mello, 2000;

Fabene et al., 2003;

Andrioli et al., 2009). Отсутствие достоверных изменений времени релаксации Т2 в этих структурах в хронический период после ЭС может объясняться слабо выраженным глиозом в данных структурах, либо большой индивидуальной вариабельностью мозга крыс по чувствительности рассматриваемых структур к повреждению в результате ЭС.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что при помощи МРТ исследования можно выявить различия в чувствительности структур мозга к повреждениям в результате длительного ЭС. Как и ожидалось, наиболее выраженные повреждения мозга крыс, перенесших литий-пилокарпиновый ЭС, наблюдаются в лимбических структурах, которые являются морфологическим субстратом ЭС в этой модели (Mello et al. 2006).

Степень повреждения мозга крыс после ЭС подвержена значительной индивидуальной изменчивости. При этом наиболее ярко выражены различия структурных изменений в тканях мозга, которые были выявлены в острый период после ЭС.

В данной работе было показано, что чем больше время релаксации Т2 в гиппокампе при развитии острых повреждений тканей мозга в результате длительной судорожной активности, тем больше выражена редукция гиппокампа у крыс через месяц после ЭС.

Полученные данные согласуются с результатами, полученными другими авторами (Choy et al. 2010). Эти результаты были дополнены тем, что в гиппокампе, пириформной коре, энторинальной коре и поясной коре крыс, перенесших ЭС, время релаксации Т2 на 2 день после ЭС положительно коррелирует с временем релаксации Т2 на 30 день после ЭС. Таким образом, время релаксации Т2 в гиппокампе крыс можно рассматривать не только как параметр, отражающий текущие изменения в ткани в результате повреждающего воздействия длительной судорожной активности, но и как маркер, предсказывающий степень отставленных структурных изменений, вызванных ЭС.

Поведенческие нарушения у крыс, перенесших ЭС, при тестировании в ОП.

Согласно полученным в работе результатам, крысы, перенесшие ЭС, в хронический период демонстрируют повышенную моторную активность в незнакомой обстановке по сравнению с контрольными крысами. Хорошо известно, что новая обстановка вызывает у крыс активацию исследовательского поведения, а также является стрессирующим фактором (Prut, Belzung, 2003). Более высокая горизонтальная локомоторная активность крыс, перенесших ЭС, по сравнению с крысами контрольной группы, может отражать их более выраженную реакцию на новизну.

Поведенческая адаптация в ОП. Адаптация в ОП является простейшей формой пространственного неассоциативного обучения. У крыс поведенческая адаптация к новизне выражается в снижении исследовательского поведения и эмоциональности (Cerbone, Sadile, 1994). В отличие от крыс контрольной группы, у крыс, перенесших ЭС, не происходило адаптации к новизне.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что ранние изменения в мозге, выявляемые при МРТ-исследовании, в лимбических структурах не являются маркером, предсказывающим развитие поведенческих нарушений в ОП и нарушений адаптации к новизне. Однако чем больше было время релаксации Т2 в миндалине на 30 день после ЭС, тем меньше локомоторная активность в новой обстановке. В ретросплениальной коре время релаксации Т2 на 30 день после ЭС отрицательно коррелировало с длительностью стоек в ОП. Хорошо известно, что миндалина участвует в поведенческих реакциях, связанных с формированием защитных условных рефлексов, связанных со страхом. Предполагается, что миндалина является одной из ключевых структур в оценке непосредственной угрозы и принимает участие в формировании поведенческой реакции на новизну и формировании эмоциональной и пространственной памяти. (Fiddick, 2011).

Ретросплениальная кора играет роль в навигации при пространственном обучении, хотя ее роль в этих процессах остается дискуссионной (Cooper, Mizumori, 2001;

Aggleton, 2004).

Время релаксации Т2 в хронический период после ЭС в миндалине и ретросплениальной коре крыс, перенесших ЭС, может быть маркером структурных изменений в этих областях, которые участвуют в развитии поведенческих нарушений в ОП.

Также нами была обнаружена положительная корреляция времени релаксации Т2 в префронтальной коре на 30 день после ЭС с изменением локомоторной активности в третьей сессии по сравнению с первой. Известно, что поясная кора играет роль в консолидации и извлечении долговременной памяти при формировании реакции избегания, т.е. связанной с проявлениями страха и является одной из ключевых структур при оценке потенциальной угрозы и контроле когнитивных процессов путем модуляции поведенческих процессов, направленных на избегание риска (Frankland et al., 2004;

Liu, et al. 2009;

Brown, Braver, 2007;

Fiddick, 2011).

Адаптация в новой обстановке и связанное с ней снижение исследовательской активности является сложным процессом, в который вовлечена реакция на новизну, включающая такие компоненты, как эмоциональность, активация исследовательского поведения, реакция на стресс. С другой стороны, в процессе поведенческой адаптации участвуют процессы обучения и консолидации памяти. Интересны результаты, свидетельствующие о том, что у крыс, перенесших ЭС, индивидуальные различия по степени структурных изменений в областях мозга, участвующих в этих процессах, коррелируют с поведенческими проявлениями реакции на новизну и способности к неассоциативному пространственному обучению.

Таким образом, хотя острые изменения, выявляемые при МРТ-исследовании после литий-пилокарпинового ЭС, не являются маркерами, предсказывающими степень последующих поведенческих нарушений, связанных с реакцией на новизну и поведенческой адаптацией к ней. Время релаксации Т2 в ряде структур в хронический период после ЭС может отражать структурные изменения в этих областях мозга, лежащие в основе наблюдаемых поведенческих нарушений.

Повреждение мозга в результате ЭС и депрессивное поведение Тест на вкусовое предпочтение показал, что у части крыс, перенесших ЭС, наблюдается отсутствие вкусового предпочтения – ангедония, которая может являться признаком депрессивного поведения (Epps and Weinshenker 2012), однако этот результат оказалось невозможным подтвердить результатами теста на принудительное плавание.

Результаты теста на вкусовое предпочтение позволяют предположить, что крысы с более выраженной степенью повреждений мозга, выявляемых при МРТ-исследовании, больше склонны к развитию депрессивного поведения, чем крысы с менее выраженными повреждениями мозга после ЭС, однако эти данные требуют дальнейшего подтверждения.

Противосудорожный эфффект предварительного хронического введения экстракта женьшеня Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что хроническое предварительное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня снижает тяжесть судорог при ЭС и уменьшает степень повреждения мозга крыс. Наиболее вероятно, что действующими компонентами бутанолового экстракта культуры клеток корня женьшеня являются гинзенозиды, для которых показан большой спектр эффектов на ЦНС. У крыс, получавших гинзенозиды, МРТ-исследование мозга выявило патологические изменения в меньшем числе структур, чем у крыс, не получавших гинзенозиды. Это свидетельствует о том, что хроническое введение экстракта корня женьшеня приводит к ингибированию распространения эпилептической активности при лимбических судорогах, инициируемых литием и пилокарпином.

Возможно несколько механизмов противосудорожного действия гинзенозидов.

Показано, что гинзенозиды способны ингибировать NMDA-рецепторы, взаимодействуют со стероидные рецепторы в цитоплазме и, следовательно, изменяют экспрессию генов, а также модулируют активность ГАМК-ергической системы, связываясь с ГАМКА и ГАМКБ рецепторами (Attele, Wu et al. 1999, Kimura, Saunders et al. 1994). Так как было показано, что на литий-пилокарпиновой модели судорог однократное введение смеси, содержащей Rg1, Re, Rd, Rc, Rb1, Rb2, Rf, гинзенозиды практически не влияют на ЭС (Chepurnov, Chepurnova et al. 2006), можно предположить, что наибольшую роль в ослаблении судорог играют их долговременные эффекты: влияние гинзенозидов на экспрессию генов, распределение рецепторов на мембране нейронов и синапсов, которые могут изменять возбудимость мозга и препятствовать развитию генерализованных судорог.

Влияние однократного введения экстракта культуры клеток корня женьшеня или вальпроата после ЭС на степень повреждения мозга. МРТ-исследование мозга крыс после ЭС показало, что введение экстракта женьшеня через 30 мин после купирования литий-пилокарпинового ЭС уменьшает степень острых изменений в мозге крыс, причем этот эффект пропадает при увеличении дозы. Также из полученных в работе результатов следует, что действующий компонент экстракта женьшеня специфически связывается в гиппокампе с нейронами, подавляя процессы, ведущие к развитию отека ткани, но не воздействуя на другие лимбические структуры.

В отличие от экстракта женьшеня, вальпроат не предотвращал развития отека в гиппокампе и ассоциированных структурах в острый период после ЭС. Редукция гиппокампа через 30 дней после ЭС была даже более выражена у крыс, получивших вальпроат, чем у крыс, получивших 18 мг/кг экстракта женьшеня.

Эффект хронического введения экстракта женьшеня на степень повреждений мозга в результате ЭС. В отличие от однократного введения, при хроническом введении экстракта женьшеня в течение месяца после ЭС, у крыс, получавших экстракт, не только наблюдалось уменьшение ранних изменений в мозге после ЭС по сравнению с крысами, получавшими физраствор, но и была менее выражена атрофия гиппокампа в хронический период после ЭС. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что действующий компонент экстракта женьшеня до некоторой степени ингибирует развитие острых изменений в гиппокампе, но при этом не препятствует запуску патологических процессов, приводящих к отставленной гибели нейронов и атрофии гиппокампа. Однако хроническое введение экстракта женьшеня уменьшает редукцию гиппокампа, по-видимому, препятствуя процессам нейродегенерации, инициированным длительными судорогами.

ВЫВОДЫ 1. Крысы линии Вистар характеризуются большой индивидуальной вариабельностью по степени и распределению повреждений в структурах мозга (гиппокампе, пириформной коре, миндалине, таламусе), выявляемых при МРТ исследовании после литий-пилокарпинового эпилептического статуса.

2. Время релаксации Т2, возрастание которого наблюдается в гиппокампе крыс в острый период после ЭС, является маркером, предсказывающим степень редукции гиппокампа, выявляемой в хронический период после ЭС.

3. В тесте «открытое поле» для крыс, перенесших ЭС, характерна гиперактивность в новой обстановке и нарушение долговременной поведенческой адаптации к новизне. Степень ранних изменений в мозге крыс, выявляемых при МРТ исследовании, не коррелирует с этими нарушениями.

4. Время релаксации Т2 в миндалине, ретросплениальной и поясной коре коррелирует с параметрами поведенческой активности в открытом поле в хронический период после ЭС.

5. Однократное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 после ЭС уменьшает степень ранних изменений в гиппокампе, выявляемых при МРТ исследовании мозга крыс на 2 день после ЭС, но не предотвращает развитие редукции гиппокампального объема.

6. Хроническое предварительное введение экстракта культуры клеток корня женьшеня ДАН-25 перед инициацией ЭС уменьшает тяжесть судорог во время ЭС, а его хроническое введение в течение 4 недель после ЭС достоверно уменьшает степень редукции гиппокампа через 30 дней после ЭС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Чепурнов С.А., Сулейманова Е.М., Гуляев М.В., Аббасова К.Р., Пирогов 1.

Ю.А., Чепурнова Н.Е. Нейропротекторы и эпилепсия // Успехи физиологических наук, 2012, Т. 43. №2. С. 55—71.

2. Mirina A.A., Sulejmanova E.M., Chepurnova D.A. NMR-investigation of rats after severe epileptic convulsions // Progress in chemistry and biochemistry. Nova Science Publishers, 2009, р. 395- Редкозубова О.М., Мирина А.А., Чепурнова Д.А., Сулейманова Е.М., Дубина 3.

А.А. Магнитно-резонансная томография мозга молодых и старых крыс: последствия литий пилокарпинового статуса // ХХ Съезд Физиологического общества имени И.П. Павлова.

Тезисы докладов. Москва, 4-8 июня 2007 г., с. Мирина А.А., Сулейманова Е.М., Чепурнова Д.А. МРТ-исследование крыс 4.

после тяжелых эпилептических судорог. // Труды седьмой ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ-РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 12- ноября 2007 г., с. Сулейманова Е.М., Мирина А.А., Аббасова К.Р., Чепурнова Н.Е.

5.

Противосудорожные эффекты женьшеня и гиперкапнии в условиях литий-пилокарпиновой модели эпилептического статуса у крыс // Научные труды II Съезда физиологов СНГ.

Кишинэу, Молдова, 29-31 октября 2008 г., с. 76.

6. Suleimanova E.M., Redkozubova O.M., Chepurnova N.E., Chepurnov S.A.

Ginsenosides of ginseng influence on rat brain structural changes after status epilepticus. // Idiopatic generalized epilepsies (IGE): Developmental aspects;

Bridging basic science and clinical research. Antalya, October 3-6 2007. Abstracts and program book, р. 64.

7. Suleymanova E.M., Chepurnova N.E., Gulyaev M.V. The chronic administratioin of ginsenosides after status epilepticus attenuates the brain damage caused by severe seizures // Program & Abstracts. The 10th international symposium on ginseng, Seoul, Korea, September – 16, 2010, р.169--170.

8. Suleymanova E, Gulyaev M, Chepurnova N. MRI study of early and late consequences of prolonged seizures and effects of ginsenosides of ginseng on lithium-pilocarpine model of status epilepticus // 8th IBRO World Congress of Neuroscience, Florence, Italy, July 14 18, 2011, Abstracts, В384.

9. Suleymanova E, Gulyaev M, Chepurnova N. Early and late MRI changes in rat brain after prolonged seizures and spatial memory impairment // SiNAPSA Neuroscience Conference 2011, Ljubljana, Slovenia, September 22 – 25, 2011, P.167.

10. Suleymanova E., Gulyaev M., Barkova A. & Chepurnova N. Early MRI changes in rat brain after status epilepticus and later morphological abnormalities and behavioral impairment // 8th FENS Forum of Neuroscience, Barcelona, Spain, July 14—18, 2012, Abstracts, C171.

11. Suleymanova E., Gulyaev M., Barkova A., Chepurnova N.. Early and late MRI changes in rat brain after status epilepticus and behavioral impairment // Abstracts of the 10th European Congress on Epileptology. London, United Kingdom. September 30-October 4, 2012.

Epilepsia, 53(Suppl. 5), p.104, 2012.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.