Пептиды и психомоторное развитие детей
доктор биологических наук Кост Наталия Всеволодовна доктор медицинских наук, профессор Михеева Инна Григорьевна Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Дубынин Вячеслав Альбертович.
доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна доктор биологических наук Башкатова Валентина Геннадьевна Ведущая организация – ФГБУ НИИ фармакологии РАМН им.В.В.Закусова Защита диссертации состоится 15 октября 2012 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001. Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова (119 991, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факуль тета МГУ им М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан 15 сентября 2012 г.
Учёный секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук Б.А.Умарова PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Одной из важнейших проблем современной физио логии и педиатрии является проблема гармоничного развития детей, в котором станов ление психомоторных функций является определяющим процессом. Психомоторное раз витие (ПМР) - это поступательное формирование психических (интеллект и темпера мент) и двигательных способностей ребенка, в соответствии с его возрастом (Журба, Мастюкова, 1981;
Алфимова, Трубников, 2000).
К процессам ПМР относят развитие органов чувств, двигательной сферы, станов ление психо-социальных контактов (Журба, Мастюкова, 1981;
Тонкова-Ямпольская, 1984;
Винникот, 1998;
Ильин, 2003). К сожалению, патология ПМР у детей – актуальная медицинская и социальная проблема. По эпидемиологическим данным, стресс индуцированные нарушения ПМР, связанные с поражением мозга в перинатальный пе риод, - ведущая причина дальнейшей биологической и социальной дезадаптации и даже инвалидизации детей (Скворцов, 2000;
Вельтищев, Зелинская, 2000;
Антропов, Шевчен ко, 2002;
Великанова, 2004;
Кешишян, Сахарова, 2011). Таким образом, изучение физио логии ПМР детей, разработка методов его коррекции - важная задача. В этой связи осо бое внимание привлекают регуляторные системы организма, контролирующие процессы развития ЦНС.
Патологию ПМР связывают, среди прочего, с нарушением обмена нейромедиато ров, опиоидных пептидов в том числе. Опиоидные пептиды относят к многочисленной группе регуляторных пептидов, образующих, по определению И.П.Ашмарина, физиоло гически непрерывную систему, функциональный континуум. Эти пептиды координиру ют практически все виды деятельности организма непосредственно или путем модуля ции основных медиаторных систем (глутамат- и ГАМК-ергической, ацетилхолиновой, серотониновой, катехоламиновых и др.). Выраженность и направленность биологиче ских эффектов различных регуляторных пептидов очень и очень разнообразны, но в сумме они исполняют роль буферной системы, поддерживающей гомеостаз в организме (Ашмарин, Каразеева, 1996, 1999).
Предполагается, что система регуляторных пептидов является важным фактором сохранения нормальных темпов всестороннего развития детского организма, а «буфер ная емкость» этой системы определяет предел физиологической выносливости организ ма, его компенсаторно-адаптационные возможности.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Опиоидная система (ОС) – регуляторная система, вырабатывающая более 40 эндо генных пептидов-биорегуляторов. Физиологическая роль ОС связана, в первую очередь, со снижением болевой чувствительности и защитой от стрессорных повреждений (Kehoe, Blass, 1986;
Пшенникова, 1987;
Кинтрая и др., 1988;
Лишманов, Маслов, 1996;
Bodnar, 2011). К настоящему времени ОС взрослого человека изучена относительно под робно (Bodnar, 2003-2011;
Vuong et al., 2010). Однако информация об особенностях ОС детей в научной литературе практически отсутствует. Основные исследования, посвя щенные данной тематике, проводятся на детенышах млекопитающих с экстраполяцией полученных результатов и выводов на человека. Предполагается, что опиоидные пепти ды, как эндо-, так и экзогенного происхождения, действительно могут играть важную роль в процессах ПМР ребенка, влияя на созревание и развитие ЦНС (Kehoe, Blass, 1986;
Hess, Zagon, 1988). Экспериментально показано, что опиоиды способны дозозависимо модулировать нейрогенез (Hauser, Mangoura, 1998;
Hauser et al., 2003;
Curtis et al., 2007;
Sargeant, 2008). Однако конкретные пути данного воздействия на ЦНС ребенка не ясны и их подробное изучение является актуальной задачей.
Наиболее распространенными опиоидными пептидами в ЦНС и на периферии яв ляются энкефалины. Время их функционирования весьма коротко и определяется ак тивностью ферментов деградации, энкефалиназами. Изучение активности этих фермен тов в сыворотке крови детей разного возраста и сопоставление этой активности с уров нем ПМР ранее не проводилось и представляет безусловный интерес. О возможном уча стии энкефалиназ в нейрогенезе свидетельствует тот факт, что введение их ингибиторов влияет на рост нейроэпителия у эмбрионов крыс (Spencer-Dene et al., 1994). Следует от метить, что энкефалиназная активность имеет даже более широкое физиологическое значение, поскольку энкефалиндеградирующие ферменты (ЭДФ) гидролизуют не только опиоидные, но и значительное количество других регуляторных пептидов (Гомазков, 1992;
Marini et al., 2000;
Соколов и др., 2007).
С древних времен известно, что среди ряда факторов, влияющих на развитие но ворождённого (наследственность, социальные условия и пр.), особое место занимает ха рактер вскармливания. В этой связи особое внимание привлекает группа регуляторных пептидов, образующихся при гидролизе казеинов молока, среди которых есть и опиоид ные пептиды казоморфины (КМ) (Lemieux, Amiot, 1990;
Severance et al., 2011;
Niebuhr et al., 2011). В экспериментах на животных установлено, что КМ понижают болевую чув ствительность (Дубынин и др., 1992), регулируют материнское и детское поведение у PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com крыс (Дубынин и др., 2001), обладают анксиолитическим (Маклакова и др., 1993) и кар диотропным действием (Mentz P., 1988, 1990). Высказывается предположение о возмож ном влиянии КМ на созревание различных систем организма новорожденного, в том числе ЦНС, и, следовательно, на темпы ПМР. Однако само наличие КМ в крови детей первого года жизни установлено до сих пор не было. В этой связи изучение содержания КМ в крови детей и его сопоставление с уровнем ПМР весьма актуально. Требует раз решения и другой фундаментальный вопрос – могут ли КМ быть причиной нарушений ПМР, таких, например, как аутизм?
Итак, предполагается, что опиоидные пептиды, как эндогенные, так и экзогенные пищевого происхождения, могут играть важную роль в процессах ПМР детей. При этом, механизмы их влияния до конца не ясны. Так, например, ряд биологических эффектов КМ трудно объяснить их взаимодействием только с опиоидной системой (Ruthrich et al., 1993). Поэтому остается актуальным поиск новых молекулярных механизмов действия КМ.
Цель данной работы - определить роль и возможные механизмы влияния опио идных пептидов на психомоторное развитие (ПМР) детей в норме и при его нарушениях.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
1. Исследовать зависимость активности полиферментной системы деградации опиоидных пептидов в сыворотке крови здоровых детей первого года жизни от пола, возраста, вида вскармливания, выявить ее взаимосвязь с уровнем ПМР, характеристика ми темперамента.
2. Изучить скорость гидролиза лей-энкефалина у детей первого года жизни при ряде патологических состояний: при гипоксически-ишемическом поражении (ГИП) ЦНС новорождённых, при задержке внутриутробного развития (ЗВУР), при негармоничном физическом развитии (гипотрофии) и при задержке ПМР у грудных детей.
3. Определить возможную взаимосвязь скорости гидролиза энкефалинов в крови с психологическими особенностями у детей младшего школьного возраста (7-12 лет) в ус ловиях хронического стресса на примере детей с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря (НДМП).
4. Разработать метод радиоиммунного и иммуноферментного анализа содержания экзогенных опиоидных пептидов казоморфинов-7 (КМ-7) быка и человека в биологиче ских жидкостях.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 5. Исследовать взаимосвязь содержания КМ-7-иммунореактивного материала (ирКМ-7) в плазме крови детей первого года жизни, находящихся на разных видах вскармливания, с уровнем их ПМР.
6. Установить возможную связь содержания ирКМ-7 быка в моче с тяжестью за болевания при различных формах аутистических расстройств у детей 5-7 лет.
7. Исследовать in vitro новые молекулярные механизмы биологического действия КМ-7: способность ингибировать энкефалиндеградирующие ферменты (ЭДФ), а также взаимодействовать с 5-НТ2-серотониновыми и D2-дофаминовыми рецепторами головно го мозга крыс.
8. Изучить способность КМ-7 быка и человека блокировать серотонин индуцированную агрегацию тромбоцитов крови человека ex vivo. Определить способ ность КМ-7 снижать поведенческие проявления гиперфункции серотониновой системы у животных.
Новизна и практическое значение:
Впервые выявлены физиологические механизмы, определяющие роль ОС в фор мировании конституционально-личностных характеристик детей разного возраста в норме и при различных функциональных состояниях, связанных с воздействием стрес совых факторов. Впервые показана взаимосвязь активности ЭДФ в плазме крови детей с их полом, возрастом, видом вскармливания. Раскрыт ранее неизвестный физиологиче ский механизм влияния вида вскармливания на ОС ребенка, - установлено, что при ис кусственном вскармливании скорость ферментативного гидролиза опиоидных пептидов в крови детей первого года жизни снижена. Впервые выявлена взаимосвязь скорости гидролиза лей-энкефалина в крови с уровнем ПМР, гармоничностью развития, характе ристиками темперамента, уровнем тревожности, как в норме, так и при ряде патологи ческих состояний – при ГИП ЦНС у новорожденных, у грудных детей с задержкой ПМР и у детей младшего школьного возраста с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря.
Впервые показано, что при различных стресс-индуцированных нарушениях ПМР реак ция опиоидной системы ребенка однонаправлена и выражается в увеличении времени функционирования опиоидных пептидов в крови. Скорость распада опиоидных пептидов в крови может являться биохимическим маркером физиологического состояния ОС, по зволяет оценивать ее адаптационные возможности.
Разработан высокочувствительный метод радиоиммунного и иммуноферментного анализа содержания КМ-7 быка и человека в биологических жидкостях с помощью кото PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com рого впервые показано наличие ирКМ-7 быка и человека в крови детей первого года жизни, находящихся, соответственно, на искусственном и естественном видах вскармли вания, и ее повышение в результате кормления. Обнаружено, что высокое содержание человеческого КМ-7 в крови детей соответствует нормальному уровню ПМР и физиоло гическому мышечному тонусу. Напротив, повышенное содержание КМ-7 быка наблюда ется у грудных детей с задержкой ПМР и нарушенным мышечным тонусом. Таким обра зом, показано, что естественное вскармливание создает оптимальные физиологические условия функционирования ОС ребенка и, соответственно, нормального ПМР. Это под тверждает целесообразность продолжительного грудного вскармливания до года вклю чительно. Искусственные смеси должны быть максимально приближены к «золотому стандарту» грудного молока и не содержать большого количества казеина коровьего мо лока, поскольку попадание в кровь избыточного количества чужеродных регуляторных пептидов приводит к нарушению в функционировании ОС, и может служить причиной задержки темпов ПМР. Проведенное пилотное клинико-биологическое исследование подтвердило возможное участие бычьего КМ-7 в патогенезе аутистических расстройств выявлена положительная корреляционная связь содержания КМ-7 быка в моче с тяже стью заболевания по Childhood Autism Rating Scale. Предполагается, что повышенное содержание КМ-7 быка в моче может являться дополнительным показателем тяжести со стояния и служить критерием для назначения фармако- и/или диетотерапии больным аутизмом. Раскрыт новый молекулярный механизм биологического действия КМ. Мето дом радиорецепторного анализа и серотонининдуцированной агрегации тромбоцитов ус тановлена способность КМ-7 взаимодействовать с 5НТ2-серотониновыми рецепторами, причем впервые показано, что КМ-7 обладают свойствами антагонистов 5НТ2 серотониновых рецепторов. Данный эффект КМ подтвержден в поведенческих экспери ментах на мышах. Таким образом, впервые различными методами продемонстрирована важная физиологическая роль эндо- и экзогенных опиоидных пептидов в регуляции пси хомоторного развития детей разного возраста.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Эндогенные опиоидные пептиды задействованы в механизмах психомоторного развития детей и их адаптации к стрессу, причем как в первые годы жизни, так и в более старшем возрасте. При нарушениях ПМР различного генеза стресс протективная реакция опиоидной системы ребенка однонаправлена и выражается в увеличении времени циркуляции опиоидных пептидов в крови.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2. В организме детей циркулируют экзогенные опиоидные пептиды пищевого про исхождения казоморфины (КМ). КМ грудного женского молока обеспечивают оп тимальное психомоторное развитие детей первого года жизни. Повышенное со держание чужеродного бычьего КМ в организме ребенка может приводить к на рушению ПМР, вплоть до развития расстройств аутистического спектра.
3. Опиоидные пептиды обладают множественностью механизмов действия, участ вуют в регуляции других нейрохимических систем. Молекулярной мишенью КМ, помимо опиоидной, является серотониновая система.
Апробация работы. Основные результаты работа были представлены на: 13-м съезде психиатров России, Москва, 2000;
3-ей международной конференции «Биологи ческие основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», г.Суздаль, 2001;
9-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Моск ва, 2002;
5-ом международном симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Мо сква, 2002;
3-м съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002;
VII Конгрессе педиатров России «Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее», Москва, 2002;
1 м Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирур гии», Москва, 2003;
сессии «Актуальные проблемы психоэндокринологии» Всероссий ской конференции памяти А.И.Белкина», Москва 2004;
2nd World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Paris, 2004;
14-м съезде психиатров России Москва - 2005;
IХ конгрессе педиатров России, Москва, 2005;
4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотроп ным средствам». Д/о «Подмосковье», 2006г;
Научно-практической конференции педиат ров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии», Москва, 2007;
III российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007;
6-ом Российском конгрессе по детской нефрологии, Москва, 2007;
XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы пе диатрии» Москва, 2008;
4-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Казань, 2009;
Всероссийской научно-практической конференции «Биологическая психиатрия – клини ческой психиатрии», Москва, 2010;
4-й международной конференции «Биологические основы чувствительности к психотропным препаратам», д/о «Подмосковье», 2010;
Кон ференции памяти И.П.Ашмарина, Москва, 2010;
заседании кафедры физиологии чело века и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, 2012.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Диссертация была апробирована на межлабораторной конференции ФГБУ НЦПЗ РАМН. По теме диссертации опубликовано 42 печатные работы, в том числе 24 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 18 докладов в материалах всероссийских и международных конференций. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 06-04 08257-офи и 10-04-01781-а.
Диссертация изложена на 172 страницах, содержит 11 таблиц, 25 рисунков. Спи сок литературы включает 717 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика обследованных детей Клиническое обследование детей проводили в Измайловской ДГКБ г.Москвы: в грудном, I терапевтическом и нефрологическом отделениях, являющихся клинической базой кафедры пропедевтики детских болезней РГМУ;
а также в Центре психолого педагогической реабилитации и коррекции «Тверской» г. Москвы. Предварительно по лучали информированное согласие матерей. Было обследовано:
46 новорождённых детей (11 практически здоровых и 35 детей с ГИП ЦНС - 20 до ношенных и 15 недоношенных). Клиническое обследование проводила врач-неонатолог, к.м.н. Е.Н.Рюкерт. У 20 обследованных новорождённых с ГИП ЦНС в возрасте 3 месяцев исследовали показатели темперамента по Кельмансону. У всех новорождённых определя ли скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови.
98 детей в возрасте от 1 до 12 месяцев жизни. Все дети поступили под наблюдение в грудное отделение с направляющим диагнозом ОРВИ, легкое течение. Клиническое об следование проводила врач-педиатр, к.м.н. О.Б.Курасова. У 20 грудных детей в возрасте 3-х месяцев исследовали показатели темперамента по Кельмансону (2000 г.).
При плановом исследовании биохимических параметров перед выпиской из стацио нара у всех 98 детей утром, после 6-ти часового ночного перерыва в кормлении, исследо вали скорость гидролиза лей-энкефалина и содержание ирКМ-7 в плазме крови. У 55 де тей содержание ирКМ-7 определяли также через 3 часа после первого утреннего кормле ния грудным молоком или адаптированной молочной смесью.
Оценка уровня ПМР детей первого года жизни проводилась с использованием коли чественного метода, позволяющего дифференцировано оценить становление двигатель ных, речевых и психических функций (Журба, Мастюкова, 1981). По результатам кли нического обследования выделили 3 группы детей. Первая (27-30 баллов) – возрастная PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com норма ПМР. Вторая (23-26 баллов) – группа риска по формированию нервно-психической патологии (запаздывание двигательных и/или психических функций не сочетанных с па тологическими неврологическими симптомами и синдромами). Третья (22 балла и ниже) - дети со специфической задержкой ПМР, носящей патологический характер и связанной с поражением ЦНС. Оценка ПМР недоношенных детей велась с поправкой на степень недоношенности с использованием так называемого «скорректированного возраста» (Лу ковцева, 2002).
20 детей 4-7 лет (10 здоровых и 10 с расстройствами аутистического спектра). Кли ническое обследование больных проводила врач-психиатр О.О.Андреева. Тяжесть со стояния оценивалась по Childhood Autism Rating Scale в баллах. Отбор здоровых доноров того же возраста осуществляла врач-педиатр, к.м.н. Е.В.Корнеева. У всех детей оценива ли содержание КМ-7 быка в моче.
60 детей 7-12 лет, (11 здоровых и 49 с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря, НДМП). Клиническое обследование проводила врач-педиатр, к.м.н. Н.И.Кузнецова. У всех детей определяли скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови. Выборка детей была разделена на 2 под группы в зависимости от наличия или отсутствия клинических проявлений в виде недержания мочи (обосновано с психологической точки зрения). Комплекс ное психологическое обследование детей с НДМП и их матерей проводили сотрудники кафедры нейро-патопсихологии факультета психологии МГУ им. М.В.Ломоносова под руководством проф. В.В.Николаевой: уровень явной тревожности определяли по мето ду CMAS в адаптации А.Прихожан;
межличностные отношения и характеристики пове дения детей - по тесту Рене Жиля;
отношение ребенка к болезни оценивали по рисуноч ному тесту «Когда я болен»;
исследование самооценок детей, ожидаемых ими оценок со стороны матерей и экспертных оценок матерей проводилось по методике Т.Дембо С.Рубинштейн в адаптации А.Прихожан;
определение стиля родительского воспитания по методике А.Варга и В.Столина «Опросник родительского отношения».
Экспериментальные животные Поведенческое исследование проводилось на 70 беспородных белых мышах самцах (22 ± 0.2г) из питомника РАМН «Крюково-Центральное». Для получения мем бранной фракции головного мозга использовали 20 белых беспородных крыс-самцов, вес 200-250 г, из питомника РАМН «Столбовая». В течение двух недель до начала экспе риментов все животные адаптировались к условиям вивария: температура + 20-22 С, световой режим 12:12 (с 8 до 20 часов), пищевой и питьевой режим ad libitum.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Тест «встряхивание головой» Влияние КМ-7 на серотониновую систему мышей исследовали в тесте «встряхи вание головой» (Хабриев, 2005). Предварительно животные были распределены на го могенные группы (по 10 мышей) в соответствии с их исходной двигательной активно стью в системе Rat-o-Matic (Adea Elektronik AB, Sweden). Гиперфункцию серотониновой системы индуцировали внутрибрюшинным введением предшественника серотонина 5 гидрокситриптофана (5-НТР) в дозе 300 мг/кг. Количество встряхиваний головой у каж дой мыши подсчитывали в течение 1 мин через каждые 10 мин на протяжении часа по сле введения 5-НТР. КМ-7 человека (Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-Pro-Ile) и быка (Tyr-Pro-Phe Pro-Gly-Pro-Ile) в дозах от 0,01 до 1,00 мг/кг и/или налоксон (10 мг/кг) вводили внутри брюшинно за 30 минут до тестирования.
Определение скорости гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови Энкефалиназную активность оценивали по скорости гидролиза равномерномечен ного 3Н-лей-энкефалина ферментами сыворотки крови при «малых» концентрациях суб страта, соответствующих природным концентрациям энкефалинов в биологических жид костях и тканях, и выражали параметром время полужизни лей-энкефалина – t1/2 в мину тах. Продукты гидролиза 3Н-лей-энкефалина разделяли методом тонкослойной хромато графии, как описано (Соколов и др., 2000г). Способность КМ-7 быка ингибировать энке фалиназную активность сыворотки крови оценивали по способности пептида дозозави симо снижать скорость распада 3Н-лей-энкефалина в сыворотке крови in vitro.
Определение содержания КМ-7 человека и быка в плазме крови и моче детей Получение плазмы крови детей и экстракция КМ: кровь с антикоагулянтом (1: 3% ЭДТА, бацитрацин 150 мкг/мл) центрифугировали 10 мин, 1000 g, при +4С. Плазму замораживали и хранили при -20С. Экстракцию пептидов проводили 0,25 М уксусной ки слотой (15 минут;
100°С;
1:10). Пробы замораживали, лиофилизировали и хранили при 70С.
Получение мочи и экстракция КМ-7 быка. Утренняя моча (средняя порция, 30 мл) смешивалась 1:10 с ледяной уксусной кислотой и замораживалась при – 20 С. Выделение и очистку пептидов проводили на картриджах Sep-Рaсk С-18 (Waters, США) с последую щей экстракцией метанолом. Полученные пробы замораживали, лиофилизировали на ро торном испарителе SpeedVak (США) и хранили при -70 С не более месяца.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Радиоиммунный анализ (РИА) Содержание КМ-7-иммунореактивного материала (ирКМ-7) быка и человека в плазме крови грудных детей определяли специально разработанным методом РИА (Со колов и др., 2007).
Получение антисыворотки к казоморфинам. Иммунизацию кроликов для получе ния антисыворотки к исследуемым пептидам проводили по методу Дмитриева и др.
(1982). Бычий и человеческий КМ-7 конъюгировали с высокомолекулярными белками:
БСА, РНКазой, хемотрипсином, тиреоглобулином, овальбумином, иммуноглобулинами крупного рогатого скота, каталазой. К смеси добавляли 200 мкл 0,15М NaCl и 1 мл мас ляного раствора адъюванта Фрейнда. Полученную эмульсию подкожно вводили кроли кам 7 раз через 2-3 недели, причем каждый раз пептиды конъюгировали с новым белком для повышения специфичности антисыворотки к казоморфину.
По достижении высокого титра антител, из ушной вены кроликов забирали кровь, выдерживали 25 минут при 370С. Сыворотку получали центрифугированием (1000g, мин, при комнатной температуре), разливали на аликвоты, замораживали и хранили при температуре -200С.
Йодирование пептидов Введение йодной метки в КМ-7 проводили по модифициро ванному методу R.J.Miller (1978). Очистку йодированных пептидов от свободной метки проводили методом ионообменной хроматографии на QAE-Sephadex А-25 в 50мМ уксус ной кислоте с 0,5% бычьим сывороточным альбумином.
Постановка РИА. Лиофилизированные образцы и стандарты растворяли в 25 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащим 0,5% БСА, 0,15 М NaCl и 0.1% твин-20, до бавляли полученные ранее антисыворотки в разведении 1:750 для КМ быка и 1:500 для КМ человека. Реакцию проводили при 4°С. Через сутки вносили по 100 мкл (30пг) соот ветствующих йодированных КМ-7. На 4-е сутки инкубации в среду добавляли козью ан тикроличью антисыворотку, через 2 часа - нейтральную сыворотку кролика и 15% рас твор ПЭГ-6000. Пробы центрифугировали (2000g, 30 мин при +4 С), супернатант удаляли, радиоактивность осадка измеряли на гамма-счетчике (Gamma Track, эффективность счета 70%).
Чувствительность метода составила: для КМ-7 быка - 6 фмоль, человека - 25 фмоль.
Перекрест в иммунореактивности гептапептидов был менее 5%.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Иммуноферментный анализ (ИФА) Содержание КМ-7-иммунореактивного материала (ирКМ-7) быка в хроматографи ческих фракциях экстрактов плазмы крови грудных детей, а также в экстрактах мочи де тей 4-7 лет с аутистическими расстройствами определяли с помощью специально разрабо танного конкурентного твердофазного ИФА, как описано Kost et al., (2009).
Постановка ИФА. В постановке ИФА использовали антитела из тех же антисыво роток, что и в РИА. Очистку антител проводили методом аффинной хроматографии на колонке с ВгСN-сефарозой-4В, коньюгированной с КМ-7 быка (Sigma, США).
Очищенные антитела 3 суток сорбировали в 96-луночных плашках (Nunc, Den mark). Образцы, хроматографические фракции или стандартные растворы КМ в ELISA буфере (0.15 М NaCl, 25 мМ Na2HP04 (рН 7.5), 0.2% БСА, 0.05% Твин 20) вносили по мкл в лунку, затем вносили по 50 мкл раствора биотин-КМ-7 (10 фмоль) в том же буфере и инкубировали 1.5 часа при +37С. Вносили по 250 мкл коньюгата стрептавидина с перок сидазой (100 нг/мл, Imtek Ltd, Russia) в ELISA-буфере и инкубировали 30 мин при +37°С. Затем вносили по 250 мкл 2.5% раствора тетраметилбензидина (Биосервис, Rus sia). Через 15 минут реакцию останавливали 50 мкл 1М H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм на плашечном ридере «Униплан» (Россия). Неспецифическое связывание (составляло около 10%) определяли в лунках не содержащих сорбированных антител.
Чувствительность метода составило 25 фмоль КМ-7 быка. В данных условиях КМ 7 человека и бета-казеин (Sigma, USA) в 100-кратном избытке не влияли на связывание антител с меченным КМ-7 быка.
Хроматографическая верификация КМ-7-иммунореактивного материала Гель-фильтрационная ВЭЖХ. Молекулярную массу бычьего КМ-7 иммунореактивного материала в экстрактах плазмы крови детей первого года жизни оце нивали методом гель-фильтрационной ВЭЖХ, как описано Kost et al., (2009). Колонка Protein Pak 60 7.8x300 мм, элюция 0.7 мл/мин, детекция при 226 нм. Препаратами срав нения и стандартами служили гексапептид даларгин, бета-казеин быка и бычий КМ- (Sigma, США).
Обратнофазная ВЭЖХ. Оценку соответствия времени удержания КМ-7 иммунореактивного материала экстрактов плазмы крови детей реальному бычьему КМ 7 проводили методом обратно-фазной ВЭЖХ, как описано Kost et al., (2009). Колонка ProntoSIL-120-5-C18 (2.0x75 мм). Элюция в градиенте ацетонитрила (0-60%) в 0.1% ТФУ, 0.2 мл/мин, детекция при 206 нм.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Радиорецепторный анализ (РРА) Сродство КМ-7 человека к 5-НТ2-серотониновым и Д2-дофаминовым рецепторам определяли in vitro по его конкуренции с 3Н-спипероном за связывание с рецепторами мембранной фракции фронтальной коры (5-НТ2-рецепторы) и стриатума (Д2-рецепторы) головного мозга крыс как описано Sokolov et al., (2004). Отделение связавшейся и несвя завшейся метки проводили на харвестере Skatron (Швеция) на стекловолокнистых фильтрах GF-B (Whatman, США). Радиоактивность проб измеряли на счетчике "Mini beta" (LKB-Wallac, Финляндия).
Концентрацию белка в инкубационной смеси определяли по методу Лоури с ис пользованием реагентов фирмы «Sigma» (США) на спектрофотометре фирмы «Perkin Elmer» (ФРГ).
Серотонин-индуцированная агрегация тромбоцитов Способность КМ-7 человека и быка влиять на серотонин-индуцированную агрега цию тромбоцитов человека изучали ex vivo на лазерном оптическом агрегометре «Биола» (Россия) по методу Борна-О'Браена, как описано (Соколов и др., 2005). Спонтанная и ин дуцированная агрегация определялась при 37°С. В качестве индуктора использовали се ротонин (Sigma) в конечной концентрации 10 мкМ. Кетансерин (0,01-1 мкМ) или иссле дуемые пептиды (0.1-100 мкМ) добавляли в инкубационную среду за 2 минуты до вве дения серотонина. При обработке полученных результатов использовали программу Prism 3.0 (GraphPad, США).
Определение уровня микроальбуминурии Уровень микроальбуминурии у детей с НДМП определяли как описано (Соколов и др., 2010) пирогаллоловым методом с помощью наборов фирмы «Вектор-бест» (Россия) на спектрофотометре «Ultrospec 1100» (Amersham, США) при длине волны 598 нм.
Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета про грамм «Statistica 6.0 for Windows». Сравнение межгрупповых различий проводили с ис пользованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия Манни-Уитни (U test), а также дисперсионного анализа (one-way ANOVA). На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего (Mean+SEM). При изучении гендерных отличий применяли факторный анализ. Для определения корреляционных связей параметрических данных использовали коэффициент линейной корреляции Пирсо на (г), непараметрических данных - коэффициент корреляций Спирмана (R).
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ЭНДОГЕННЫЕ ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ И ПМР ДЕТЕЙ 1.1 Зависимость скорости гидролиза лей–энкефалина в сыворотке крови от возраста и пола Среднее значение t1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови новорождённых соста вило 2,21+0,05 мин. У детей 1-12 месяцев жизни это значение было выше, чем у ново рожденных (р0,05) и составило 2,37+0,05 мин. У детей 7-12 лет этот параметр достигал значений 2,54+0,13 мин и был выше, чем у новорождённых и детей 1-12 месяцев жизни.
При этом значения t1/2 лей-энкефалина во всех 3 исследованных группах детей оказа лись ниже, чем у взрослых доноров (3,10+0,05 мин, р 0,01).
Таким образом, впервые показано, что активность ЭДФ и, следовательно, время функционирования эндогенных опиоидных пептидов в сыворотке крови человека зави сит от возраста. Скорость гидролиза лей-энкефалина максимальна у новорожденных, и постепенно снижается, достигая в возрасте 35-ти лет минимальных значений (рис.1).
* 3, *# *# # 2, 1, новорожденные 1 - 18 мес 7-12 лет 18-45 лет Рис.1 Зависимость времени полужизни лей-энкефалина в сыворотке крови (мин) от возраста человека. * - отличие от новорожденных, # - отличие от взрослых, р0. Высокую скорость гидролиза лей-энкефалина в крови новорождённых и грудных детей можно объяснить более высоким уровнем метаболизма, необходимым для интен PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com сивного развития в этот период. Действительно, низкое содержание таких регуляторных пептидов, как бета-эндорфин и субстанция Р, в ликворе маленьких детей и его постепен ное повышение с возрастом было обнаружено в работе Nagamitsu et al. (1998). Постепен ное возрастное падение активности пептидаз в крови людей можно объяснить как общим снижением обменных процессов (Хавинсон и др., 2001), так и возможным увеличением концентрации эндогенных ингибиторов ферментных систем, энкефалиндеградирующей, в частности (Marini et al., 1999;
Соколов и др., 2000).
Исследования Marini et al., (1999) обнаружили зависимость времени полужизни лей-энкефалина в плазме крови взрослых от пола: у женщин это значение достоверно выше, чем у мужчин. Нами установлено, что t1/2 лей-энкефалина в крови мальчиков и девочек в периоде новорождённости не отличаются и составляют 2,24+0,07 и 2,20+0, мин, соответственно. В отличие от новорождённых, в группе детей 1-12 месяцев отличия уже наблюдаются - t1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови девочек составило 2,51+0, мин. и было выше, чем у мальчиков - 2,26±0,06 мин (р0,01). Гендерные отличия в ак тивности ЭДФ обнаружены нами и в младшем школьном возрасте: 2.65±0,09 и 2,46±0, мин, у девочек и мальчиков, соответственно, р0,05 (табл.12).
Таким образом, гендерные отличия в активности ЭДФ начинают, по-видимому, проявляться уже на первом году жизни. Полученные результаты позволяют предполо жить, что не только половые гормоны, но и опиоидные пептиды принимают участие в процессах половой дифференцировки ЦНС.
Табл.1. Гендерные различия скорости распада лей-энкефалина в сыворотке крови людей разного возраста Новорождённые мальчики = девочки (1 месяц жизни) p = 0. n= Грудные мальчики девочки (1-12 месяц) p 0. n= Младшие школьники мальчики девочки (7-12 лет) p 0. n= Взрослые мужчины женщины (18-45 лет) p 0. (данные Marini et al., 2001) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 1.2 Скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови и показатели темперамента детей первого года жизни Предполагается, что активность различных нейрохимических систем организма, в том числе опиоидной, зависит от врожденных, конституциональных особенностей чело века, таких как темперамент. Темперамент ребенка является важным фактором, опреде ляющим его способ реагирования на окружающий мир, это «стиль поведения, отличаю щийся от содержания и успешности деятельности, с одной стороны, и от мотивации, с другой» (Thomas, Chess, 1977).
Обследовано 20 здоровых детей (10 мальчиков и 10 девочек). Показатели характе ристик темперамента обследованных не отличались от референтных величин здоровых детей первого года жизни московской популяции. В результате обнаружена положитель ная корреляция (р0,05) времени полужизни лей-энкефалина в сыворотке крови детей с такими характеристиками темперамента как «Активность», «Приятие», «Интенсивность» и «Порог» (табл.2).
Таблица 2. Связь между показателями темперамента детей первого года жизни и t1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови (n=20).
Коэффициент корреляции Показатель темперамента и его краткая характеристика Спирмана Степень физической и R = 0,47,* Активность двигательной активности p = 0, Регулярность периодов сна, R = - 0,07, Регулярность бодрствования, режим кормлений p = 0, Первоначальная реакция на новые R = 0,48,* Приятие внешние стимулы p = 0, Легкость, с которой ребенок R = 0,16, Адаптивность приспосабливается к изменениям среды p = 0, Сила реакции, вне зависимости от R = 0,44, * Интенсивность Ее качества и направления p = 0, Общее соотношение поведенческих R = 0,17, Настроение реакций в течение суток p = 0, Длительность какой-либо деятельности и R = -0,07, Настойчивость способность ее продолжать вопреки помехам p = 0, Легкость изменения поведения в ответ R = 0,29, Отвлекаемость На новые ситуации p = 0, Минимальная сила внешних воздействий, R = 0,56,* Порог необходимая для реакции ребенка p = 0, PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Показано, что чем выше время полужизни лей-энкефалина в сыворотке крови, тем выше степень физической активности и больше движений совершает ребенок во время кормлений, пеленаний, переодеваний, игр и т.п. Положительная корреляция между «Ак тивностью» и t1/2 соответствует экспериментальным данным о способности опиоидных пептидов влиять на двигательную активность (Baamonde et al., 1992;
Perrine et al., 2006).
«Приятие» в определенной степени соответствует экстравертированности у взрос лых. Нами обнаружено, что чем ниже активность ЭДФ, тем доброжелательнее и спокой нее реагируют дети на новые стимулы.
«Порог» - это уровень интенсивности внешних воздействий, необходимый чтобы вызвать какую-либо реакцию у ребенка на сенсорную стимуляцию. Корреляция показате лей шкалы «Порог» с t1/2 лей-энкефалина подтверждает данные о способности опиоидов влиять не только на ноцицецию, но и на реактивность нервной системы в целом (Baamonde et al., 1992).
Интересно, что никаких достоверных корреляционных связей между характеристи ками темперамента и уровнем ПМР детей не было выявлено. Это еще раз подтверждает данные литературы о том, что темперамент не отражает уровень развития психики и мо торики ребенка, а отражает генетически-заданные особенности поведения детей, подвер женные при этом несомненному влиянию внешней среды (Matheny, 1984;
Кельмансон, 2000).
1.3 Влияние вида вскармливания на скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови детей первого года жизни Вопрос о влиянии характера вскармливания на формирование и особенности функционирования ОС практически не изучен. Нами впервые выявлена зависимость между активностью ЭДФ в сыворотке крови детей первого года жизни и видом вскарм ливания. У детей на естественном вскармливании t1/2 лей-энкефалина ниже, чем на ис кусственном (2,15+0,07 мин. и 2,48+0,06 мин., соответственно р0,01) (рис.3). Снижение скорости гидролиза пептида при искусственном вскармливании можно объяснить влия нием экзогенных веществ-ингибиторов ферментов - известно, например, что бычий ка зоморфин-9 способен ингибировать один из ЭДФ – ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) (Fitzgerald et al., 2004). С другой стороны, поскольку ранний перевод на искусст венное вскармливание, по мнению ряда авторов, является для ребенка метаболическим стрессом (Воронцов и др., 1997, 1998), то увеличение t1/2 лей-энкефалина может быть также отражением компенсаторной роли ОС в условиях данного стресса. Данное пред PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com положение подтвердилось в последующем анализе изменений энкефалиназной активно сти при стресс-индуцированных нарушениях ПМР у детей разных возрастных групп.
3, * 2, 1, Естесственное, 33 чел Искусственное, 60 чел Рис.2 Т1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови детей, находящихся на разных ви дах вскармливания. * - р0,01.
1.4 Скорость гидролиза опиоидных пептидов в крови детей первого года жизни при нарушениях развития 1.4.1 Влияние ГИП ЦНС на активность ЭДФ у новорождённых Гипоксически-ишемическое поражение ЦНС – одно из распространенных причин нарушения нормального развития детей первого года жизни. Для оценки роли ОС при данной патологии мы исследовали активность ЭДФ у новорожденных с ГИП ЦНС в за висимости от тяжести состояния. Установлено, что у детей с ГИП ЦНС, находившихся в тяжелом состоянии (выраженное угнетение рефлексов, брадикардия, мышечная гипото ния), значение t1/2 составило 2,48+0,17 мин, что достоверно выше (p0,05) значений у новорожденных в состоянии легкой и средней тяжести (2,12+0,09 мин) и у здорового контроля (2,21+0,05 мин). Увеличение этого показателя у новорождённых с тяжелой це ребральной ишемией, перенесших тяжелую гипоксию в родах, можно расценивать как адаптационную реакцию ОС, связанную, возможно, с выбросом в кровь эндогенных ин гибиторов пептидаз (Yamamoto et al., 2002).
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 1.4.2 Влияние задержки внутриутробного развития (ЗВУР) на активность ЭДФ у доношенных детей первого года жизни Нарушение роста и развития у новорождённых могут возникать на различных эта пах внутриутробной жизни под влиянием таких неблагоприятных факторов, как тяже лый ранний токсикоз, гестоз, плацентарная недостаточность и др. Следствием этого яв ляется рождение детей с ЗВУР (дети рождены в срок, но со сниженной массой тела). У детей с ЗВУР чаще встречаются отклонения психомоторного развития (Шабалов, 1997;
Дементьева, 2000). Более того, перинатальная смертность доношенных детей с ЗВУР в 3-8 раз выше, чем у детей с нормальной массой при рождении (Дементьева, 2000). Пред полагается, что возникающие пренатально изменения в формирующейся нейроэндок ринной системе ребенка сохраняются на протяжении первого года жизни, а также опре деляют особенности его адаптации в дальнейшей жизни. Так, по данным Дементьевой и др., (2004), у детей с ЗВУР наблюдается отставание в физическом развитии и чаще встречаются эндокринные заболевания и дисфункции на протяжении всей жизни. По скольку отдаленное влияние ЗВУР на функционирование ОС у детей ранее не изучалось, мы сравнили показатели активности ЭДФ доношенных детей первого года жизни в зави симости от наличия ЗВУР при рождении. Показано, что у здоровых доношенных ново рожденных с массой тела, соответствующей гестационному возрасту, время полужизни лей-энкефалина ниже чем у доношенных детей, родившихся с ЗВУР по гипотрофиче скому типу, t1/2 составило 2,34+0,06 мин и 2,70+0,10 мин, соответственно, р0, (табл.3). Повышение t1/2 лей-энкефалина у детей с ЗВУР, можно рассматривать в каче стве компенсаторной реакции ОС на стресс, который плод испытывал внутриутробно.
1.4.3 Зависимость активности ЭДФ от гармоничности физического развития и уровня ПМР детей первого года жизни Гармоничное физическое развитие является одним из основных критериев здоро вья ребенка. Оно отражает не только динамику увеличения размеров и массы тела, но и сопровождающие эти процессы качественные изменения функциональной активности организма, темпы биологического созревания. Предполагается, что дети с отклонениями в физическом развитии имеют особенности обмена веществ, активности ферментатив ных систем (Неудахин, 1992;
Мухина, Конь, 2010). У детей первого года жизни среди отклонений физического развития наиболее часто встречается гипотрофия. Многие сто PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com роны патогенеза неблагоприятного воздействия гипотрофии на организм ребенка, в том числе особенности нейроэндокринной регуляции этого процесса не изучены.
Некоторые авторы (Неудахин, 1992) рассматривают гипотрофию как проявление хронической стрессовой реакции. Нами обнаружено, что у детей с гармоничным физиче ским развитием t1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови было ниже, чем у детей, имею щих негармоничное физическое развитие за счет дефицита массы тела (гипотрофии) и составило 2,29+0,05 мин и 2,67+0,08 мин., соответственно, р0,05 (табл.3).
Таблица 3. Т1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови детей первого года жизни при различных нарушениях развития Патология Здоровый контроль Тяжелое ГИП ЦНС 2.48±0.17 * 2.21±0. новорождённых n= n= Задержка внутриутробного 2.70±0.1 * 2.34±0. развития (ЗВУР) n= n= Негармоничное физическое 2.67±0.08 * 2.29±0. развитие (Гипотрофия) n= n= Задержка ПМР 2.83±0.2 * 2.39±0. (у доношенных детей) n= n= * - отличие от нормы, р0, Статистически значимые различия в выделенных группах сохраняются на разных видах вскармливания, а также у детей разного пола. Таким образом, впервые показано, что при негармоничном физическом развитии уровень метаболизма опиоидных пептидов снижен.
Психомоторное развитие ребенка представляет собой сложный процесс. В его ос нове лежит генетическая программа, которая реализуется в условиях постоянной смены факторов окружающей среды. Проведенный нами анализ данных по всей генеральной выборке не выявил корреляционных связей между скоростью распада энкефалинов и уровнем ПМР детей, выраженным в баллах. Не выявлено статистически значимых раз личий t1/2 в выделенных по психомоторному развитию группах детей (возрастая норма, группа риска, задержка ПМР). Интересно влияние такого фактора как доношен PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ность/недоношенность на функционирование ОС при задержке ПМР у детей на первом году их жизни. Оказалось, что у доношенных детей при задержке ПМР на первом году жизни активность ЭДФ достоверно снижена по сравнению с нормой ПМР, то есть нали цо протективная реакция ОС, приводящая к увеличению времени жизни опиоидных пеп тидов в крови. У детей, родившихся недоношенными, при задержке ПМР на первом го ду жизни данная реакция ОС не происходит, то есть существует некий отсроченный эф фект стресса преждевременных родов на функционирование ОС ребенка.
Обобщая полученную информацию, можно сделать заключение, что нормальное сбалансированное развитие детей первого года жизни характеризуется высоким уровнем активности ЭДФ, а любое нарушение развития, будь-то задержка внутриутробного раз вития (ЗВУР), гипоксически-ишемическое поражение ЦНС, задержка ПМР или гипо трофия (негармоничное физическое развитие) – сопровождается снижением активности ЭДФ в крови. Следует отметить, что снижение скорости гидролиза опиоидов зафиксиро вана также у детей, испытывающих метаболический стресс искусственного вскармлива ния (рис.2). Интересно, что аналогичная реакция ОС наблюдается у взрослых людях при тяжелых соматических травмах (переломах) (Babst et al., 1999).
Можно предположить, что падение активности энкефалиназ при данных патоло гиях является общей, универсальной реакцией опиоидной системы человека, направ ленной на поддержание гомеостаза, выведенного из равновесия. Молекулярный меха низм снижения энкефалиназной активности может быть связан со стресс индуцированным выбросом значительного количества опиоидных и других регулятор ных пептидов (по принципу «ингибирования субстратом») и/или низкомолекулярных эндогенных инибиторов ЭДФ, существование которых в крови взрослого человека уста новлено Marini et al., (1990, 1996, 2000).
Учитывая, что эндогенные опиоидные пептиды обладают адаптогенной, стресс протективной активностью, участвуют в регуляции эмоциональной сферы, влияют на обучение и память (Olson et al., 1990;
Ашмарин, Каразеева, 1996;
Зозуля и др., 1999), представленные данные позволяют предположить их несомненное участие во всесто роннем развитии ребенка уже в раннем постнатальном периоде. При этом активность ЭДФ в сыворотке крови отражает состояние ОС ребенка, ее адаптационную реакцию при нарушениях развития. Для подтверждения данной гипотезы мы исследовали реакцию ОС у детей 7-12 лет при хроническим стресс-индуцированном нарушении развития, свя занным с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря (НДМП).
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 1.5. Скорость гидролиза лей-энкефалина в крови детей 7-12 лет с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря (НДМП) Детский организм чрезвычайно резко реагирует на неблагоприятные внешние влияния в переходные, «узловые» возрастные периоды. Одним из таких периодов яв ляется младший школьный возраст. Физиологическая роль ОС детей при стресс индуцированных расстройствах, свойственных данному возрасту, до сих пор мало изученна. Поэтому мы исследовали взаимосвязь активности ЭДФ с клинико психологическими характеристиками детей с НДМП, своеобразной моделью стрес сового расстройства центральной и вегетативной нервной систем, не связанного с серьезной органической патологией.
тревожность, баллы 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3, время полужизни, мин Рис.4 Взаимосвязь t1/2 лей-энкефалина в сыворотке крови и уровня тревожно сти у детей с НДМП. R=0,731, * - p0,01.
Т1/2 лей-энкефалина в крови у детей с НДМП не отличалось от группы кон троля (2,46+0,05 мин и 2,54+0,13 мин, соответственно). Активность ЭДФ у детей с очень высокой тревожностью была ниже, чем у детей с нормальным уровнем тревож ности (2,65±0,12 мин и 2,34±0,07 мин, соответственно p0,05). Уровень тревожности детей с НДМП прямо коррелировал с t1/2 лей-энкефалина, R=0,731, p0,01 (рис.4).
Ранее нами было показана аналогичная взаимосвязь скорости гидролиза лей PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com энкефалина в крови и уровнем тревожности у взрослых людей при стрессе (Зозуля и др. 2006).
Таким образом, впервые показано, что реакция ОС на стресс у детей 7-12 лет сходна с таковой у взрослых и также проявляется в увеличении времени циркулиро вания опиоидных пептидов в крови при росте уровня тревожности.
При исследовании психологических особенностей детей с НДМП с дневным недержанием мочи (n=33), установлена обратная зависимость между величиной t1/ и замкнутостью (отгороженностью) по тесту Рене Жиля (R=- 0,42, p0,05) (рис.5). У детей, страдающих энурезом (ночное недержание мочи, n=23) и комбинированным расстройством мочеиспускания (энурез + дневное недержание, n=9) время полужиз ни лей-энкефалина в крови прямо коррелирует с «общительностью» и «отношением к сверстникам» (R=0,48 и R=0,49, p0,01). То есть, чем медленнее идет гидролиз энке фалинов в крови, тем более общителен и открыт ребенок, даже в условиях болезни.
Интересно, что аналогичная взаимосвязь скорости распада энкефалинов в кро ви и уровня экстравертированности личности была ранее обнаружена нами у взрос лых, причем как в норме (Соколов и др., 2001), так и при тревожно-фобических рас стройствах (Зозуля и др. 2006).
отгороженность, баллы - 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3, время полужизни, мин Рис.5 Взаимосвязь t1/2 лей-энкефалина и замкнутости (отгороженности) у де тей с недержанием мочи, R = -0,42, p0,05, n=32.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com На следующем этапе была выявлена зависимость t1/2 энкефалина от анозогнозии (отношению к болезни). По данному параметру оценивают степень психологической адаптации ребенка к стрессовым условиям данного заболевания. Оказалось, что у де тей, отвергающих болезнь (вариант своеобразной адаптации к стрессу), t1/2 энкефа лина в сыворотке крови был выше, чем у ее признающих, n=11;
2,69+0,07 мин и n=38;
2,40+0,04 мин, соответственно, p0,05.
Необходимо отметить, что сходная реакция ОС отмечалась нами ранее у взрос лых больных с тревожно-фобическими расстройствами - при их адаптации к стрессо вым условиям скорость гидролиза лей-энкефалина в крови также падала (Зозуля и др., 2006). Об участии ОС в адаптации детей к стрессу говорит также тот факт, что в отдельной группе больных НДМП с таким отягощающим симптомом, как дневное недержание мочи, выявлена обратная зависимость между величиной t1/2 и оценкой по шкале «Маленький неудачник» (R= - 0,45, p0,05).
Суммируя полученные данные, можно заключить, что показатели ОС детей 7- лет связаны с личностными характеристиками ребенка, а ее реакция на стресс анало гична взрослой.
*** На основании представленных результатов можно заключить, что эндогенные опиоидные пептиды действительно задействованы в механизмах психомоторного развития детей и их адаптации к стрессу, причем как в первые годы жизни, так и в более старшем возрасте. На основании вышеизложенного может создастся впечатле ние, будто физиологическое действие опиоидных пептидов всегда благотворно и од нозначно полезно для развивающегося организма ребенка. Так ли это на самом деле?
Могут ли опиоидные пептиды быть причиной задержки развития? Существует гипо теза о возможном патологическом влиянии на ребенка экзогенных опиоидных пепти дов пищевого происхождения. В ней предполагается, что при нарушении метаболиз ма экзогенных опиоидных пептидов, процессов их деградации и выведения из орга низма, данные вещества могут негативно влиять на созревание различных систем детского организма, в частности ЦНС, и быть причиной таких тяжелых патологий, как аутизм. Проверке гипотезы о возможном негативном влиянии опиоидных пепти дов пищевого происхождения (на примере казоморфинов) была посвящена вторая часть нашего исследования.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2. ЭКЗОГЕННЫЕ ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ И ПМР ДЕТЕЙ Казоморфины (КМ), продукты гидролиза белков-казеинов молока, считаются воз можными экзогенными биорегуляторами психомоторного развития детей. Эксперимен тальные работы, проведенные на детенышах млекопитающих, подтверждают эту пред положение (Дубынин и др., 2000-2009), но полная экстраполяция экспериментальных данных на людей не совсем корректна. Непосредственное влияние КМ на развитие де тей, прежде всего грудного возраста, до сих пор не установлено. Более того, само суще ствование этих пептидов в крови детей до сих пор не было доказано. Поэтому мы иссле довали содержание КМ-7 быка и человека в плазме крови детей первого года жизни, по пытались выявить его возможную взаимосвязь с уровнем ПМР, а также изучили содер жание КМ-7 быка в моче детей 5-7 лет в норме и при аутистических расстройствах.
2.1. Разработка радиоимунного и иммуноферментного методов определения КМ- В процессе исследования был разработан высокочувствительный метод радио имунного и иммуноферментного анализа содержания ирКМ-7 быка и человека в биоло гических жидкостях. Чувствительность ИФА к КМ-7 быка составила 20 фмоль. Чувстви тельность РИА составила: для КМ-7 быка: 6 фмоль (10 пг), КМ-7 человека: 25 фмоль ( пг), она была на порядок выше, чем у масс-спектрометрических методов определения КМ (Dettmer et al., 2007) и сравнима с методом Singh et al. (1989), исследовавшим ирКМ 7 быка у щенков (20 пг). Далее с помощью обратно-фазной и гель-фильтрационной ВЭЖХ было доказано соответствие молекулярной массы и других физико-химических свойств определяемого в РИА и ИФА иммунореактивного материала показателям КМ- быка. Отработанные РИА и ИФА были использованы в дальнейшей работе.
2.2 Казоморфины и ПМР детей грудного возраста 2.2.1 Содержание ирКМ-7 быка в плазме крови детей первого года жизни Впервые показано, что в крови детей, находящихся на вскармливании искусственной молочной смесью на основе коровьего молока, циркулируют вещества с иммунореак тивностью КМ-7 быка. При этом, базовый уровень ирКМ-7 быка в плазме крови грудных детей на искусственном вскармливании в течение всего первого года жизни достоверно не изменяется. Показано, что через три часа после кормления адаптированной молочной смесью у детей 1-3 месяцев жизни ирКМ-7 быка возрастает от 67±19 до 146± PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 200 * * ирКМ -7 быка (фмоль/мл) 1-3 месяц 4-6 месяц 7-10 месяц.
Рис.6 ИрКМ-7 быка в плазме крови детей до и после кормления адаптированной молочной смесью (M ± m), * - результат кормления, р0,05.
фмоль/мл, р0,05, а у детей второго полугодия жизни статистически значимо (р0,05) возрастают от 90±14 до 160±29 фмоль/мл (рис.6). У детей 4-6 месяцев жизни средние значения ирКМ-7 быка в плазме крови также увеличиваются, но не достоверно (с 52± до 82±29 фмоль/мл).
Таким образом, у детей на искусственном вскармливании после кормления адап тированной молочной смесью отмечен достоверный рост ирКМ-7 быка как в первые три месяца жизни, так и старше 6 месяцев. Известно, что дети 6-12 месяцев получают мо лочные смеси с относительно большим содержанием белка, чем в первом полугодии. По видимому, этот факт отражается на динамике показателя после кормления у детей стар ше 6 месяцев жизни при искусственном вскармливании.
2.2.2 Содержание ирКМ-7 человека в плазме крови детей первого года жизни Показано, что в крови детей, получающих женское молоко, постоянно циркули руют вещества, обладающие иммунореактивностью КМ-7 человека (ирКМ-7). В пробах, взятых до кормления после 6 часового ночного перерыва, «базовый» уровень ирКМ-7 у детей от 1 до 3 месяцев жизни составил 208±23 фмоль/мл и достоверно не отличался от детей 4-9 месяцев жизни - 197±30 фмоль/мл. Через 3 часа после кормления грудным мо локом, у детей 1-3 месяцев жизни ирКМ-7 человека возрастает от 208±23 фмоль/мл до 296±56 фмоль/мл (р0,05), а у детей 4-9 месяцев достоверно не изменяется (рис.7).
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com * ирКМ-7 человека (фмоль/мл) до кормления после кормления дети 1 - 3 мес дети 4-9 мес Рис. 7. ИрКМ-7 человека в плазме крови детей до и после кормления грудным мо локом, * - результат кормления, р 0,05.
Повышение ирКМ-7 человека в плазме крови через три часа после кормления на блюдается преимущественно у детей первых трех месяцев жизни. Можно предположить, что это связанно с повышенной проницаемостью кишечного барьера, характерной для данного возраста (Стаченкова, 1997;
Яцык, 2001;
Андрусенко, 2005). При изучении базо вого уровня ирКМ-7 человека в плазме крови детей в зависимости от разных вариантов грудного вскармливания (исключительно грудное, смешанное с преобладанием грудного молока, дополненное) различий в группах не выявлено. У детей, получающих исключи тельно грудное молоко, базовый уровень ирКМ-7 составил 200±32 фмоль/мл. У детей, получающих дополненное грудное и смешанное вскармливание с преобладанием груд ного молока, - 204+24 фмоль/мл. По-видимому, введение в рацион детей, получающих грудное молоко, небольшого количества адаптированных молочных смесей и блюд при корма существенно не влияет на базовый уровень КМ-7 человека.
При анализе индивидуальных спаренных показателей в выборке детей при естест венном вскармливании (17 чел), выявлены как рост, так и снижение ирКМ-7 человека через 3 часа после кормления. Можно предположить, что полученные отличия связаны с индивидуальной динамикой всасывания в ЖКТ и уровнем метаболизма КМ в организме в целом. По-видимому, есть механизмы, регулирующие скорость поступления и выведе ния из организма пептидов. Возможно, одним из регуляторов (по принципу обратной связи) выступает непосредственно исходный уровень казеина или казоморфина. Так, в высоких концентрациях он замедляет процессы всасывания, что обуславливает сниже PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ние ирКМ-7 в плазме крови через 3 часа после кормления. И, напротив, недостаток КМ интенсифицирует процесс всасывания. Нельзя исключить также и различную динамику деградации КМ, связанную с индивидуальными особенностями функционирования пеп тидаз в организме детей.
2.2.3. ПМР детей первого года жизни и содержание КМ-7 человека и быка в крови Известно, что КМ и их предшественники, могут преодолевать гематоэнцефалический барьер. Подтверждением могут служить данные об обнаружении ирКМ-8 в 19-ти раз личных зонах среднего мозга, моста и продолговатого мозга новорожденных детей (Pasi et al., 1993). Таким образом, взаимодействуя с различными структурами мозга, КМ могут оказывать определенное влияние на становление и развитие ЦНС. Для проверки этого предположения мы изучали возможную взаимосвязь между уровнем ПМР детей и со держанием ирКМ-7 человека или быка в их крови. В результате нами выявлена взаимо связь между уровнем ПМР, состоянием мышечного тонуса и ирКМ-7 как человека, так и быка, причем связь между этими параметрами оказалась разнонаправленной. Так, при естественном вскармливании задержка темпов ПМР соответствует низкому базовому уровню ирКМ-7 человека. При искусственном вскармливании у детей с задержкой тем пов психомоторного развития наблюдается повышенный базовый уровень ирКМ-7 быка.
Аналогичная закономерность выявлена при анализе взаимосвязи состояния мышечного тонуса и базового уровня ирКМ-7 человека и быка в плазме крови детей, получающих грудь матери или адаптированную молочную смесь, соответственно. Дети с физиологи ческим мышечным тонусом, при грудном вскармливании, имеют самые высокие значе ния ирКМ-7 человека. У детей, получающих адаптированные молочные смеси, самые высокие значения ирКМ-7 быка в плазме крови выявлены при нарушении мышечного тонуса (сниженный, повышенный) (рис.9).
Обнаруженный разнонаправленный биологический эффект КМ-7 женского и коровь его молока, связан, по-видимому, с видоспецифичностью указанных пептидов. Так, пер вичная структура -казеина, молекулы-предшественника казоморфинов, человека и ко ровы идентичны между собой всего на 47%. И, как следствие, аминокислотный состав молекулы казоморфина человека (Tyr-Pro-Phe-Val-Gly-Pro-Ile) и казоморфина быка (Tyr Pro-Phe-Pro-Glu-Pro-Ile) различаются двумя аминокислотными остатками в четвертом и пятом положениях. Можно предположить, что структурное отличие молекул КМ-7 чело века и быка, предполагает различие в спектре их биологической активности. Так, напри PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com мер, КМ-7 человека обладает более низкой аффинностью к опиоидным рецепторам моз га крысы и подвздошной кишки морской свинки, чем КМ-7 быка (Koch et al., 1990).
Кроме того, третий пролин в структуре бычьего КМ делает его молекулу более устойчи вой к действию пептидаз и продлевает время функционирования в организме. Не вызы вает сомнения тот факт, что КМ человека, поступающий с молоком матери, как и все прочие составляющие женского молока, более естественен и физиологичен для ребенка.
По-видимому, важна именно первоначальная структура пептидов, поступающих с пи щей. Попав в организм, экзогенные опиоидные пептиды производят значимый биологи ческий эффект, и только затем разрушаются вплоть до отдельных аминокислот.
Естественное вскармливание Искусственное вскармливание (ирКМ-7 человека, фмоль/мл) (ирКМ-7 быка, фмоль/мл) Психомоторное развитие * * 50 возрастная ЗПМР возрастная риск ЗПМР норма ПМР норма ПМР Мышечный тонус * 200 * 50 физиологический тонус сниженный тонус повышенный тонус Рис.9 Психомоторное развитие, мышечный тонус и ирКМ-7 человека и быка в плазме крови у детей при разных видах вскармливания. * - отличия от нормы p0,05.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Не случайно высокий уровень КМ-7 человека у детей при естественном вскармли вании соответствует хорошим темпам ПМР и физиологическому мышечному тонусу. И наоборот, низкие значения бычьего КМ-7 у детей при искусственном вскармливании со четаются с нормальным уровнем ПМР и физиологическим мышечным тонусом, а высо кие значения – с задержкой темпов ПМР. По-видимому, для гармоничного развития ре бенка важно поступление регуляторных пептидов именно из женского молока. Влияние же бычьего КМ-7 на развитие ребенка неоднозначно. Анализ взаимосвязи оценки ПМР и ирКМ-7 быка в группе детей с ПМР в рамках возрастной нормы выявил прямую корре ляционную связь (R=0,43;
р0,05). Кроме того, выявлена особенность динамики ирКМ- быка в плазме крови у детей с различным ПМР. Оказалось, что через 3 часа после корм ления этот параметр достоверно повышается только в группе детей с нормальным ПМР, причем значения базового уровня в этой группе остаются самыми низкими. У детей с риском и задержками темпов ПМР после кормления ирКМ-7 быка достоверно не изме няется и остается на прежнем более высоком уровне по сравнению с нормой (рис.10).
* # ирКМ-7 быка (фмоль/мл) 140 # до кормления 80 после кормления нормальное ПМР риск ПМР задержка ПМР Рис.10. ИрКМ-7 быка в плазме крови детей из разных групп ПМР до и после кормления адаптированной молочной смесью, * - результат кормления, р 0,05.
# - отличие базового уровня от показателя детей с нормальным ПМР, р 0,05.
Складывается впечатление, что высокий базовый уровень бычьего КМ у детей с риском и задержкой темпов ПМР обусловлен недостаточно слаженной системой катабо лизма и выведения изучаемого пептида. Напротив, при нормально функционирующей PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com системе выведения, поступление в организм ребенка экзогенных опиоидных пептидов (даже в повышенном количестве) не приводит к нарушению ПМР.
2.3 Содержание КМ-7 быка в моче детей с аутистическими расстройствами Одной из серьезных патологий ПМР являются аутистические расстройства, свя занные с расстройствами речи, моторики и приводящими к социальной дезадаптации (Тиганов, 2005). Наряду с несколькими теориями возникновения аутизма, существует «опиоидная теория», объясняющая патогенез заболевания влиянием опиоидных пепти дов пищевого происхождения (Panksepp, 1979). Повышенное содержание пептидов, в том числе КМ, в крови и моче детей с аутизмом подтверждено методом ВЭЖХ (Reichelt et al., 1981;
Shattock, Whiteley. 2002). Для подтверждения данной теории более специ фичным способом, мы разработали метод иммуноферментного определения КМ-7 быка в экстрактах мочи и применили его в пилотном скрининге 20 детей 4-7 лет –10 здоровых и 10 с аутистическими расстройствами. Абсолютно неожиданным явилось наличие в моче здоровых детей бычьего КМ-7. По-видимому, в норме сквозь слизистую ЖКТ мо гут проходить не только ди- и трипептиды, но и несколько более крупные пептидные молекулы. Содержание бычьего КМ-7 в моче больных составила 91±10 пг/мл и была достоверно выше, чем у здоровых детей (58±7 пг/мл). В группе больных более высокий уровень КМ-7 отмечался у детей с детским аутизмом (синдром Каннера), чем у детей с синдромом Аспергера: 104±10 и 75±18 пг/мл соответственно, p0.05.
пг/мл *# норма синдром Аспергера детский аутизм Рис.11 Содержание бычьего КМ-7 в моче детей в норме и при аутизме.
* - отличие от нормы, р0.05, # - отличие от детского аутизма, р0. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Итак, подтверждено повышенное содержание КМ-7 быка в моче детей с аутисти ческими расстройствами. Более того, нами обнаружена прямая корреляции между кон центрацией бычьего КМ-7 и тяжестью заболевания, оцениваемой в баллах по CARS, R = 0.85, p0,01 (рис.12).
KM бычий, пг/мл мочи 25 30 35 40 45 50 55 Childhood Autism Rating Scale (CARS) Рис.12 Взаимосвязь содержания ирКМ-7 быка в моче и тяжести аутистической патологии у детей. Коэффициент ранговых корреляций Спирмана R = 0.85, p0,01.
Таким образом, учитывая полученные данные, а также представленные выше дан ные о связи больших концентраций бычьего КМ-7 с нарушением ПМР в грудном возрас те, можно предположить, что повышенное содержание КМ-7 быка негативно влияет на организм ребенка и способствует нарушению в развитии, вплоть до появления аутисти ческой патологии.
2.4 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАЗОМОРФИНОВ 2.4.1 Влияние КМ на активность ЭДФ сыворотки крови человека В данной работе впервые продемонстрировано, что у детей, находящихся на ис кусственном вскармливании, скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови ни же, у детей, получающих грудное женское молоко. Это может быть связано с влиянием веществ-ингибиторов, содержащихся в искусственных смесях на основе коровьего мо PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com лока. Действительно, бычий КМ-9, как и ряд других пептидов из белков коровьего моло ка, ингибирует один из ЭДФ – ангиотензинпревращающий фермент (Saito et al, 2000).
Мы исследовали влияние бычьего КМ-7 на активность ЭДФ сыворотки крови детей пер вого года жизни и взрослых доноров. Установлено, что бычий КМ-7 ингибирует ЭДФ сыворотки крови как взрослых, так и детей первого года жизни – IС50 составило 350 мкМ и 1мМ, соответственно (рис.13).
остаточная активность, % Дети 1-го года жизни Взрослые 0,1 1 10 100 1000 ингибитор, мкМ Рис.13 Влияние бычьего КМ-7 на скорость гидролиза лей-энкефалина в сыворотке крови взрослых (n=5 чел) и детей 1-го года жизни (n=6 чел).
Необходимо отметить, что обнаруженный нами in vitro ингибирующий эффект КМ маловероятен in vivo, поскольку накопление таких больших концентрациях пептида (0,1 – 1 мМ) в тканях в норме невозможно (за исключением, может быть, ЖКТ).
Косвенным подтверждением этого является отсутствие какой-либо корреляции между ирКМ-7 и общей энкефалиназной активностью сыворотки крови, как по обеим генеральным выборкам (естественное вскармливание, искусственное вскармливание), так и в отдельных возрастных группах детей.
Таким образом, снижение активности ЭДФ у детей на искусственном вскармлива нии, по-видимому, не связано с ингибирующим эффектом КМ-7 на энкефалиназы крови, но, возможно, определяется либо другими экзогенными пептидами, поступающими из коровьего молока, либо выбросом эндогенных регуляторных пептидов, взаимодейст вующих с ЭДФ по принципу субстратного ингибирования.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2.4.2 Влияние КМ на связывание 3Н-спиперона с дофаминовыми и серотониновыми рецепторами Поскольку патогенез аутизма связывают прежде всего с серотониновой и дофами новой системами, мы исследовали способность КМ влиять на эти системы. Сродство КМ-7 человека к серотониновым и дофаминовым рецепторам определяли in vitro по их конкуренции с 3Н-спипероном за связывание c мембранной фракцией фронтальной коры и стриатума мозга крыс, характеризующихся высокой плотностью 5-НТ2-серотониновых и Д2-дофаминовых рецепторов, соответственно. Взаимодействия КМ-7 человека с Д2 рецепторами обнаружено не было – гептапептид не влиял на связывание 3Н-спиперона с рецепторами стриатума (преимущественно дофаминовыми), EC5080 мкМ. С другой сто роны, способность КМ-7 взаимодействовать с серотониновыми рецепторами была выяв лена. Показано, что, начиная с концентрации 500 нМ, КМ-7 человека способен вытес нять 3Н-спиперон из рецепторов фронтальной коры (рис.14). Кривые вытеснения иссле дуемого пептида и кетансерина параллельны и выходят на одно плато, что косвенно сви детельствует о конкурентном характере взаимодействия данных веществ с местами свя зывания спиперона. Предполагается, что это 5НТ2-рецепторы. Поэтому при расчете зна чений Ki использовали 5-НТ2-компоненту специфического связывания спиперона. Ki КМ-7 человека составило 4±1 мкМ. Известно, что КМ способны взаимодействовать с опиоидными рецепторами мю- и дельта типа. При этом, величины Кi КМ-7 при взаимо действии с опиоидными рецепторами составляют от 5 мкМ для мю- до 20 мкМ для дель та-рецепторов (Koch et al., 1990). Полученные нами показатели сродства КМ-7 человека к 5НТ2-рецепторам находятся в этом же диапазоне.
100 спиперон % SB кетансерин КМ-7 человека мкМ 0.001 0.01 0.1 1 10 100 Рис.14 Влияние кетансерина и КМ-7 человека на специфическое связывание Н-спиперона с рецепторами фронтальной коры головного мозга крыс.
Ось ординат - % специфического связывания, ось абсцисс – логарифмическая шкала.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2.4.3 Влияние КМ на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов Для подтверждения способности КМ-7 взаимодействовать с 5-НТ2 серотониновыми рецепторами и установления агонист/антагонистического характера этого взаимодействия, изучали влияние человеческого и бычьего КМ-7 на агрегацию тромбоцитов человека ex vivo. Установлено, что в исследованном диапазоне концентра ций оба пептида сами по себе не вызывают агрегацию, то есть не являются агонистами серотониновых, а также других рецепторов тромбоцитов, активация которых приводит к агрегации. Вместе с тем, оба КМ-7 дозозависимо блокируют серотонин-индуцированную агрегацию (рис.15), то есть являются антагонистами 5-НТ2-рецепторов.
кетансерин -КМ-7 человека -КМ-7 быка % 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1 10 мкМ Рис.15 Влияние КМ-7 быка и человека на серотонин-индуцированную (10 мкМ) агрегацию тромбоцитов человека. По ординате – снижение агрегации в % от контроля.
IC50 КМ-7 человека и быка в этом тесте составило, соответственно, 5±1 и 20± мкМ. При этом ингибирующая активность пептидов оказалась значительно слабее, чем у кетансерина (IC50 10±2 нМ).
2.4.4 Влияние КМ-7 человека и быка на поведенческие проявления гиперфункции серотониновой системы мышей Возможное влияние КМ на серотониновую систему исследовали также in vivo на мышах линии Balb/c в тесте «встряхивание головой». Показано, что КМ-7 обладают сравнимой способностью блокировать индуцированную 5-гидрокситриптофаном гипер функцию серотониновой системы. Этот эффект является дозозависимым, проявляется в виде тенденции при использовании пептидов в дозах 0,01 и 0,10 мг/кг (p0.2) и стано PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com вится достоверным при введении пептидов в дозе 1 мг/кг. В этой дозе КМ-7 человека и быка одинаково снижали выраженность гиперкинеза на 50% (рис.16). Введение блока тора опиоидных рецепторов налоксона само по себе не приводило к изменению поведе ния животных в используемом тесте. Вместе с тем, при одновременном введении с пеп тидами, налоксон полностью блокировал эффекты КМ. Эффекты КМ-7, зарегистриро ванные в данном тесте, можно объяснить продемонстрированными in vitro у этих пепти дов свойствами антагонистов серотониновых рецепторов. Вместе с тем, блокада эффек тов КМ-7 налоксоном свидетельствует об участии опиоидзависимого этапа в цепи собы тий, индуцированных КМ и приводящих к снижению поведенческих проявлений фарма кологически индуцированной гиперфункции серотониновой системы.
Таким образом, тремя независимыми методами установлена способность казо морфинов быка и человека влиять на серотониновую систему.
КМ-7 быка * * КМ + Nal 0.01 0.1 КМ-7 человека * КМ + Nal 0.01 0.1 Рис.16 Влияние КМ-7 быка и человека на гиперфункцию серотониновой системы у мышей Balb/c в тесте «Встряхивание головой».
По оси ординат – % от контроля. * - эффект пептида, р0,01.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ данных литературы показывает существенный недостаток информации об особенностях функционирования ОС детей в норме и при стресс-индуцированных нару шениях развития. В проведенной нами работе впервые показано, что опиоидная система (ОС) действительно задействована в физиологических процессах развития ребенка в раз личные возрастные периоды, оказывает защитное и адаптогенное действие в разных стрессовых ситуациях.
Использование равномерномеченного тритием лей-энкефалина позволило с высо кой чувствительностью протестировать суммарную энкефалиназную активность в ми нимальном объеме сыворотки крови детей. С помощью данного микрометода впервые продемонстрирована взаимосвязь времени полужизни эндогенных опиоидных пептидов энкефалинов с конституционально-личностными особенностями детей разного возраста, их темпераментом, полом, показателями развития. Таким образом, удалось расширить представления о биохимическом базисе, лежащем в основе поведенческих особенностей человека.
Установлено, что при нарушениях психомоторного развития различного генеза существует «универсальная» реакция ОС, выражающаяся в падении активности пепти даз и увеличении времени циркуляции опиоидных пептидов в крови ребенка (рис.17).
Задержка внутриутробного развития Задержка Снижение Задержка физического активности психомоторного развития. развития ЭДФ (Гипотрофия) Гипоксически ишемическое поражение ЦНС Рис. 17. Универсальная реакция ОС при нарушениях развития детей различного генеза.
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Данный механизм реагирования обнаружен у новорожденных с гипоксически ишемическим поражением ЦНС, при задержке внутриутробного развития, у грудных де тей с задержкой психомоторного развития и при гипотрофии.
Полученные нами данные о состоянии ОС у младших школьников в условиях стресс-индуцированного расстройства при НДМП говорят о необходимости учитывать индивидуальные особенности ребенка при формировании условий его окружения и мик роклимата в семье.
Установлено, что, помимо эндогенных опиоидных пептидов, существенным фак тором в обеспечении гармоничного развития детей, особенно на первом году жизни, яв ляются экзогенные опиоидные пептиды пищевого происхождения. С помощью специ ально разработанных высокочувствительных методов радио- и иммуноферментного ана лиза экспериментально доказано, что в организме ребенка действительно циркулируют экзогенные опиоидные пептиды казоморфины. Впервые установлены индивидуальные различия в метаболизме КМ-7 быка и человека в крови, а также взаимосвязь содержания этих пептидов в крови с уровнем психомоторного развития детей. Оказалось, что высо кие концентрации человеческого КМ-7 в крови ребенка соответствует нормальному уровню ПМР, а повышенное содержание бычьего казоморфина, попадающего в орга низм при вскармливании искусственными смесями на основе коровьего молока, наобо рот, обнаружено у грудных детей с задержкой темпов развития.
Таким образом, показано, что естественное вскармливание создает оптимальные физиологические условия формирования ОС ребенка и, соответственно, нормального ПМР. Доказана необходимость длительного, до года включительно, естественного вскармливания детей и это особенно важно для детей с патологией ПМР.
По-видимому, в норме здоровый организм грудного ребенка способен справиться с метаболическим стрессом искусственного вскармливания без ущерба для своего разви тия. Однако, при стресс-индуцированном срыве адаптационных возможностей организм ребенка теряет способность «регулировать» поступление и выведение экзогенных опио идных пептидов, что приводит к их накоплению и ведет к дисбалансу регуляторных пеп тидергических систем, что, в конечном итоге, негативно отражается на развитии ЦНС.
Действительно, снижение активности энкефалиназ в сыворотке крови и замедленное вы ведение казоморфина быка было обнаружено нами у детей первого года жизни с задерж кой ПМР. В моче детей 5-7 летнего возраста с аутистическими расстройствами также обнаружено повышенное содержание казоморфина быка по сравнению с нормой. При PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com чем содержание бычьего КМ-7 в моче прямо коррелирует с тяжестью аутистической па тологии. Полученные данные подтверждают известную «опиоидную» теорию патогенеза аутизма.
Наши данные позволяют предположить, что у грудных детей с нарушениями ПМР следует по возможности избегать искусственного вскармливания или крайне осторожно подбирать молочные смеси, отдавая предпочтение альбуминдоминирующим составам над казеиндоминирующими. У детей более старшего возраста, например при аутистиче ских расстройствах, могут быть полезны безказеиновые диеты или ферментные препа раты, улучшающие белковый метаболизм и снижающие пептидную «нагрузку».
Сложно объяснить эффекты КМ на процессы ПМР только их влиянием на опио идную систему. В наших исследованиях проводилось изучение других возможных моле кулярных механизмов биологического действия этих пептидов. Здесь в качестве воз можных мишеней действия мы рассматривали дофаминовую и серотониновую нейроме диаторные системы, участие которых в развитии ЦНС детей многократно продемонст рировано. В результате, тремя независимыми методами была определена способность казоморфинов быка и человека взаимодействовать с серотониновой системой. Нами впервые показано, что КМ-7 проявляют свойства антагонистов 5-НТ2-рецепторов и, сле довательно, способны влиять не только на нейрональную активность через опиоидные рецепторы, но и контролировать через серотониновые рецепторы тонус кровеносных микрососудов, причем как в ЦНС, так и на периферии.