авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Мария николаевна разработка технологии получения хондроитинсульфата из гидробионтов баренцева моря и изучение его физико-химических свойств

На правах рукописи

УДК 544:664.959(043.3) ПОРЦЕЛЬ МАРИЯ НИКОЛАЕВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА ИЗ ГИДРОБИОНТОВ БАРЕНЦЕВА МОРЯ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 02.00.04 – Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Мурманск – 2011 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Мурманский государственный технический университет» Научные руководители:

Кандидат химических наук, Новиков Виталий Юрьевич Кандидат технических наук, профессор Коновалова Ирина Никандровна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Зарембо Виктор Иосифович Кандидат технических наук, доцент Бражная Инна Эдуардовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится «3» ноября 2011 г. в 10 час. 00 мин.

на заседании диссертационного совета Д 307.009.02. в Мурманском Государственном техническом университете по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мурманского государственного технического университета по адресу: 183010, г.

Мурманск, ул. Спортивная, д. Отзывы на автореферат направлять по адресу: 183010, г. Мурманск, ул.

Спортивная, д. 13, ФГБОУВПО «МГТУ»

Автореферат размещен на сайте www.mstu.edu.ru «26» сентября 2011 г.

Автореферат разослан «» сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. техн. наук, профессор И. Н. Коновалова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Разработка современных технологий переработки гидробионтов является актуальной задачей рыбной отрасли. Создание технологий производства обогащенных пищевых продуктов, профилактических и медицинских препаратов, полученных из морских гидробионтов, включает в себя исследование состава сырья, идентификацию и количественный анализ его компонентов, изучение физико-химических свойств биологически активных компонентов сырья.

Природный полисахарид хондроитинсульфат (ХС), содержащийся в хрящевой ткани, представляет собой сульфатированный гликозаминогликан, макромолекулы которого состоят из чередующихся мономерных звеньев сульфатированного N-ацетил-D-галактозамина (АцГалА) и D-глюкуроновой кислоты (ГлУ).

Линейные макромолекулы ХС помогают сделать хрящ более устойчивым к давлению, которое оказывает на него вес тела, принимают участие в формировании костной ткани, связок, а также в поддержании упругости и эластичности стенок кровеносных сосудов. ХС является широко используемой пищевой добавкой для лечения дегенеративно дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, например, артроза и остеохондроза. В настоящее время коммерческие препараты ХС получают главным образом из хрящевой ткани млекопитающих. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов.

Проблемами выделения ХС из различных природных объектов и его применения в медицине и биотехнологии занимаются такие зарубежные ученые как A. Kinoshita,. H. R. Morris, K. Sugahara, M. J. Miller, C. E Costello.;

H. Takai,. T. Kono, C. Amornrut, A. B. Khare, S. A. Houliston, F. Abdel и российские исследователи Т. Н. Шкарина, И. М. Сорокоумов и другие.

Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки. Следует отметить, что физико-химические свойства ХС из гидробионтов, методы их идентификации и количественного анализа, количественные закономерности химического гидролиза практически не изучены. В связи с этим, разработка новых и совершенствование известных технологий выделения ХС из морских гидробионтов, изучение их физико химических свойств, методов идентификации и количественного анализа являются актуальными задачами.

Цели работы: изучение содержания и физико-химических свойств ХС гидробионтов Баренцева моря;

разработка и совершенствование методов их идентификации и количественного анализа. Разработка технологии получения ХС из гидробионтов.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Изучение содержания ХС в гидробионтах Баренцева моря: сёмге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле (Deania calceus), полярной акуле (Somniosus microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa).

2. Разработка методики идентификации и количественного анализа ХС из морских гидробионтов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе солей ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Совершенствование методик спектрофотометрического определения D-галактозамина (ГалА), АцГалА и ГлУ.

3. Изучение кинетики кислотного гидролиза ХС. Выбор математической модели, адекватно описывающей процесс кислотного гидролиза.

4. Изучение физико-химических свойств водных растворов ХС.

5. Разработка технологии получения ХС с использованием ультрафильтрационных мембран;

выбор математической модели, адекватно описывающей технологию получения ХС.

6. Разработка нормативной документации, оценка экономической эффективности технологии получения ХС.



Научная новизна Впервые разработана мембранная технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря: сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската, морского огурца.

Разработана методика идентификации и количественного анализа ХС с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Методика включает определение ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС.

Усовершенствованы методики спектрофотометрического определения ГалА, АцГалА и ГлУ.

Определены спектральные характеристики, фракционный состав, среднемассовая молекулярная масса, поверхностная и оптическая активность ХС из морских гидробионтов;

показано влияние концентрации электролита на процесс полиэлектролитного набухания макромолекул полисахарида.

Рассчитаны константы скоростей гидролиза ХС в хлороводородной и серной кислотах. Разработана математическая модель кинетики гидролиза ХС. Предложена методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.

Впервые показана возможность использования системы ХС ферментный препарат в качестве биомаркера.

Практическая значимость Разработана технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря с применением ультрафильтрации.

Выделены ХС из хрящевой ткани сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската, а так же кожных покровов морского огурца.

На основании испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана и утверждена технологическая инструкция по получению ХС методом ультрафильтрационного разделения, разработаны Технические условия (ТУ) на «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».

На базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ» изготовлена опытная партия ХС, произведенная в соответствии с разработанной технологической инструкцией.

Подана заявка на патент «Способ получения ХС из тканей морских гидробионтов».

Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Разработанная технология получения ХС из тканей морских гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различные молекулярно-массовые пределы задерживания.

2. Разработанные и усовершенствованные методики идентификации и количественного анализа ХС.

3. Результаты изучения закономерностей кислотного гидролиза ХС.

4. Математическая модель кинетики гидролиза ХС, методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС.

5. Результаты изучения физико-химических свойств растворов ХС из тканей морских гидробионтов;

возможность применения системы ХС фермент в качестве биомаркера.

6. Технологическая инструкция на полуфабрикат ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «ХС из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».

7. Оценка экономической эффективности разработанной технологии.

Внедрение результатов исследований На основании проведенных опытно-промышленных испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана технологическая инструкция на производство полуфабриката ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».

Результаты изучения кинетических закономерностей кислотного гидролиза ХС, методики их идентификации и количественного анализа внедрены в учебный процесс для студентов направлений 020100.62 «Химия» и 260100.62 «Технология продуктов питания», специальности 260302. «Технология рыбы и рыбных продуктов» и аспирантов, обучающихся по специальности 02.00.04 «Физическая химия».

Апробация работы Основные положения диссертационной работы представлены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава, аспирантов, научных и инженерных работников МГТУ «Наука и образование» (г. Мурманск, 2008-2011), Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании» КГТУ (г. Калининград, 2009-2010), 10-ой международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» на базе Казанского государственного технологического университета (г. Казань, 2009), Всероссийской научно технической конференции «Современные проблемы экологии» (г. Тула, 2008), международной научно-практической конференции «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья» МГТУ (г. Мурманск, 2008), VIII Всероссийской конференции с международным участием. «Химия и медицина» (Уфа, 2010), 24-th Conference of the European Colloid and Interface Society (Prague, 2010), The 10 th International Conference of the European Chitin Society (г. Санкт-Петербург, 2011).

Экспериментальная часть работы выполнена в Мурманском государственном техническом университете в рамках научно исследовательской работы по госбюджетной теме «Химический и электрохимический гидролиз гидробионтов различной природы» (ГР 01200603803) и Госконтракта № П744.

Публикации По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, подана заявка на получение патента (№ 2010153884 (077891)).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (161 наименование) и 4 приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 36 рисунков.





СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель исследования, научная новизна, защищаемые положения. Показана практическая значимость результатов работы.

В первой главе «Обзор литературы» приведен анализ отечественной и зарубежной литературы по вопросам строения, свойств, идентификации и применения ХС. Изложены современные технологии получения ХС из тканей млекопитающих и гидробионтов.

Во второй главе «Объекты и методы исследования» определены объекты исследования, методы анализа, и порядок статистической обработки экспериментальных данных.

ХС получали по описанной в литературе технологии и по разработанной технологии с использованием ультрафильтрации.

В качестве сырья были выбраны ткани следующих гидробионтов: сёмга, черноротая акула, длиннорылая акула, полярная акула, северный скат, морской огурец.

Спектры поглощения образцов ХС в таблетках KBr регистрировали на инфракрасном спектрофотометре IR-420 (Shimadzu Corp., Япония) в диапазоне частот от 4000 до 400 см-1.

Спектры ЯМР получали на спектрометрах Bruker Avance 600 и DRX 500 при 303-306 К после однократной лиофилизации образцов из D2O и последующего растворения их в 99,96 % D2O. Анализ проводился в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук.

Количество АцГалА определяли спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплекса АцГалА с п диметиламинобензальдегидом. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре UV-3101PC (Shimadzu Corp., Япония) при длине волны 585 нм. Содержание восстанавливающих сахаров определяли спектрофотометрическим методом с гексацианоферратом калия.

Количество азота определяли методом Кьельдаля на автоматической системе определения общего азота/белка Kjeltec Auto System 1043 (Tecator, Швеция).

Количественное определение ХС проводили усовершенствованными методами: спектрофотометрическим методом определения уроновых кислот (расчёт значения оптической плотности по трем точкам) и спектрофотометрическим методом определения ГалА с использованием п диметиламино-бензальдегида. ГалА, образующийся при полном кислотном гидролизе ХС, определяли разработанным методом с использованием ВЭЖХ на обращенной фазе.

Для изучения фракционного состава полученных ХС использовали эксклюзионную ВЭЖХ. Хроматографирование растворов образцов проводили на жидкостном хроматографе LC-10AVP (Shimadzu Corp., Япония) с использованием эксклюзионной колонки TSK-gel Alpha-4000 (300,78 см) с предколонкой TSK-guardcolumn Alpha (60,4 см) (TOSOH, Япония).

Анализ выполняли в лаборатории биохимии и технологии ПИНРО (г.

Мурманск).

Содержание сульфатов определяли титриметрическим методом (определение неорганического сульфата по ГОСТ 28478-90).

Среднемассовую молекулярную массу ХС определяли нефелометрическим методом.

Гидродинамический радиус макромолекул оценивали методом дисперсии светорассеяния.

Оптическую активность растворов оценивали по углу вращения плоскости поляризации плоско поляризованного света, который измеряли на поляриметре СП-3 (Россия) на длине волны излучения паров натрия.

Поверхностную активность водных растворов ХС на границе с воздухом определяли по кривой зависимости поверхностное натяжение концентрация. Поверхностное натяжение водных растворов определяли методом Вильгельми.

Экзогликозидазную активность рассчитывали по выходу восстанавливающих сахаров, образующихся при гидролизе ХС. Содержание восстанавливающих сахаров определяли по реакции с гексацианоферратом калия.

В третьей главе «Результаты и их обсуждение» приведены результаты исследований и их обсуждение и разработанная технология получения ХС из гидробионтов методом ультрафильтрации.

1. Разработка и совершенствование методов идентификации ХС По описанной в литературе технологии получения ХС из гидробионтов были выделены ХС из сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската и морского огурца. Полученные ХС были идентифицированы следующими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и разработанным методом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

1.1. Идентификация ХС методом инфракрасной спектроскопии На рис. 1 приведены инфракрасные спектры поглощения ХС, полученных из морских гидробионтов Баренцева моря (кривые 1-5), в сравнении с литературными данными (кривая 6). На кривой 6 имеются три характерных пика, которым соответствуют частоты 1550, 1350-1300, 1160 1120 см-1, что свидетельствует о соответствии спектров полученных препаратов приведенным в литературе. ИКС даёт возможность определить источник получения ХС по специфическим полосам поглощения – 850 см- (ХС-4, преобладающий в сырье из тканей млекопитающих и птиц) или см-1 (ХС-6, характерный для хрящей рыб).

Рис. 1 – Инфракрасные спектры ХС из хрящей: 1 - черноротой акулы;

2 - длиннорылой акулы;

3 - северного ската;

4 - сёмги;

5 - из покровов морского огурца;

6 - литературные данные (сёмга) 1.2. Идентификация ХС методом ЯМР Для образцов ХС были зарегистрированы спектры ЯМР 1Н и 13С. Эти спектры были идентичны для разных образцов по положению сигналов, однако отличались интегральной интенсивностью последних. На рис. приведены спектры ХС из семги, полярной акулы, черноносой акулы, длиннорылой акулы, северного ската.

Рис. 2 – 1Н ЯМР спектры ХС (303-306 K) из (А) семги, (Б) полярной акулы, (В) черноносой акулы, (Г) длиннорылой акулы, (Д) северного ската На основании данных по химическим сдвигам 1Н и 13С ЯМР моносахаридных остатков и внутрициклических КССВ между протонами было установлено, что первая группа сигналов ( 4,57/102,4 м.д.) в аномерной области HSQC спектра отвечает остаткам -ГалА, а вторая группа ( 4,48/105,4 м.д.) – остаткам ГлУ. Химические сдвиги 1Н и 13С в остатках ГалА свидетельствовали о том, что они полностью N-ацетилированы и сульфатированы по положениям С6 (большинство остатков) или С (минорное количество остатков), что характерно для ХС, полученных из рыб.

ЯМР анализ образцов ХС, полученных из исследованных гидробионтов, выявил в их структуре три дисахаридных блока (А, Б и С), которые помимо ацетильной группы могут содержать аминокислотные заместители (в основном глицин), связанные с атомом азота -ГалА. На рис.

3 приведены соответствующие схемы строения.

Рис. 3 – Дисахаридные блоки ХС, полученных из гидробионтов Баренцева моря 1.3. Физико-химические свойства растворов ХС В образцах ХС, полученных из морских гидробионтов, были определены среднемассовая молекулярная масса (ММ), поверхностная (G) и оптическая активность ([]20D) (табл. 1).

Таблица Среднемассовая молекулярная масса, оптическая и поверхностная активность ХС []20D, 0 G, Джм/моль Источник ММ, Da сёмга ~60000 -30,4 55, черноротая акула ~65000 -62,4 61, длиннорылая акула ~80000 -19,2 66, полярная акула ~85000 -73,6 56, северный скат ~50000 -40 94, морской огурец ~120000 -16 136, Из данных, приведенных в таблице, следует, что свойства полученных по описанной в литературе технологии препаратов ХС зависят от вида сырья и, по всей видимости, наличия остаточных примесей, например, веществ белковой природы.

Изучена экзогликозидазная активность ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба с использованием ХС как субстрата.

Активность фермента на чистом ХС составляет 7,0110-4 мкмоль/мин·мг, на загрязнённом нефтью - 3,6510-4, ПАВ - 5,3710-4, при комплексном загрязнении - 2,2810-4. Полученные результаты показали, что систему ХС (субстрат) - фермент можно использовать в качестве биомаркера. Состояние системы, которое определяется и факторами окружающей среды, может использоваться в качестве показателя биологического состояния организма.

1.4. Идентификация ХС разработанным методом с помощью ВЭЖХ Для качественного определения ХС часто применяется спектрофотометрический метод Дише, основанный на цветной реакции уроновых кислот с карбазолом. ГлУ, входящая в состав ХС, реагирует с карбазолом, образуется розовое окрашивание. Так как почти все виды гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, дерматансульфат, ХС) содержат в своём составе уроновые кислоты, метод Дише не является избирательным, а показывает суммарное содержание гликозаминогликанов.

Поэтому для избирательного определения ХС использовали разработанный метод идентификации и количественного анализа ГалА, образующегося при кислотном гидролизе ХС. С помощью ВЭЖХ на обращенной фазе разделяли пики производных ГалА и D-глюкозамина, полученных восстановлением с NaBH4 и последующей реакцией с ортофталевым альдегидом (OPA). Были подобраны соответствующие градиенты и состав буферных растворов.

На рис. 4 приведены хроматограммы гидролизата ХС из хрящей сёмги в сравнении с хроматограммами гидролизата хитина, содержащего D глюкозамин, и смеси аминокислот. Как видно из рис. 4, хроматограммы гидролизатов ХС содержат четкий пик ГалА, что идентифицирует полученный полисахарид как ХС.

Рис. 4 – Хроматограммы гидролизатов полисахаридов: гидролизат хитина (1), гидролизат ХС (2) и смесь аминокислот (3) Подобранные условия хроматографирования позволили полностью разделить пики OPA-производных восстановленных ГалА и D-глюкозамина.

Из приведённого графика так же следует, что пики аминокислот не накладываются на пики изучаемых углеводов, что позволяет проводить идентификацию продуктов гидролиза полисахаридов. Количество ГалА в пробе пропорционально площади соответствующего пика на хроматограмме.

Таким образом, разработанный метод позволяет определить количество ХС в анализируемой пробе.

Разработанный метод может быть применен для анализа других гликозаминогликанов (например, гиалуроновой кислоты), полисахаридов (например, хитина) и сырья, содержащего ХС. Содержание ХС (масса ХС/ масса сухого сырья, %) в изучаемых гидробионтах приведено в таблице 2.

Таблица Содержание ХС в сухой обезжиренной хрящевой ткани гидробионтов Баренцева моря Сырье ХС, (%) Семга 10, Полярная акула 13, Черноносая акула 7, Длиннорылая акула 6, Северный скат 15, Из данных таблицы следует, что наиболее перспективными видами для получения ХС являются полярная акула и северный скат.

Разработанным методом были проанализированы новые пищевые продукты из северного ската (разработка кафедры «Технологий пищевых производств» МГТУ – заливное, запеканка и бульон).

Поскольку количественный анализ ХС с помощью разработанного метода ВЭЖХ основан на определении мономерных фрагментов ГалА, были изучены закономерности кислотного гидролиза ХС, полученного из хрящей сёмги.

2. Кинетика кислотного гидролиза ХС Кислотный гидролиз гликозидных связей в ХС в зависимости от концентрации кислоты, времени гидролиза и температуры сопровождается образованием олигомеров с различной молекулярной массой, дисахарида хондрозина и мономеров ГлУ и АцГалА.

Сульфатированный АцГалА, входящий в состав ХС, в условиях кислотного гидролиза десульфатируется и деацетилируется с образованием ГалА.

На рис. 5 приведены кинетические кривые гидролиза ХС из хрящей семги с образованием ГалА при концентрации HCl 4-12 моль/дм3.

Концентрацию ГалА определяли разработанным методом с использованием ВЭЖХ.

  Рис. 5 – Кинетика кислотного гидролиза ХС с образованием ГалА.

Концентрация HCl: 1 – 12 моль/дм3;

2 – 6 моль/дм3;

3 – 4 моль/дм3;

сплошная линия – кинетическая кривая, рассчитанная с помощью константы гидролиза, маркеры – экспериментальные значения Из данных, приведенных на рис. 5, следует, что при концентрации HCl 12 моль/дм3 через 100-120 минут после начала гидролиза происходит уменьшение концентрации ГалА в гидролизате (кривая 1). По всей видимости, в условиях гидролиза происходит разрушение ГалА. При концентрации HCl 4 и 6 моль/дм3 концентрация ГалА возрастает, достигая практически постоянных значений за время гидролиза 100-120 минут (кривые 2, 3), при этом разрушения ГалА не наблюдается.

Анализ кинетических кривых образования ГалА показал, что реакция может быть описана кинетическим уравнением первого (псевдопервого) порядка. В реакциях псевдопервого порядка истинный второй порядок снижен благодаря значительному избытку одного из реагентов, концентрация которого практически не меняется в ходе реакции и порядок реакции вследствие этого равен порядку по одному из реагентов.

В условиях эксперимента соотношение раствор кислоты : ХС было 100:1. Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС с образованием ГалА использовали кинетическое уравнение первого порядка :

b(t) = A0 ( 1 e kt ), где t – время;

b – концентрация ГалА;

А0 – начальная концентрация ХС;

k – константа скорости реакции.

Гидролиз гликозидных связей в ХС начинается с протонирования гликозидного атома кислорода. При этом образуется оксониевый катион, который затем нуклеофильно атакуется гидролизующим агентом.

Рассчитанные константы гидролиза гликозидных связей в ХС зависят от концентрации катализатора – кислоты и гидролизующего агента – воды.

Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС использовали программное обеспечение Microsoft Excel.

Для определения содержания ХС в исходных образцах предложена методика расчета с использованием констант скоростей реакции гидролиза гликозидных связей в молекуле ХС. Так, для гидролиза ХС в HCl с концентрацией 12 моль/дм3, константа скорости гидролиза равна K = 136,910-4 с–1, А0 – исходная навеска в пересчете с ХС составляет 1, ммоль/дм3, А0-расч. – расчетное содержание ХС составляет 1,02 ммоль/дм3. Для других концентраций HCl получены аналогичные результаты.

Кинетика гидролиза ХС по изменению концентрации ГлУ в гидролизатах при различной концентрации HCl приведена на рис. 6.

Концентрацию ГлУ определяли усовершенствованным методом Дише.

D-глюкуроновая кислота после гидролиза гликозидных связей практически сразу начинает разрушаться и ее концентрация уменьшается.

Для расчета константы скорости реакции гидролиза ХС с разрушением ГлУ использовали кинетическое уравнение первого порядка c(t) = C0 e k t, где t – время, C – концентрация ГлУ, С0 – начальная концентрация ГлУ;

k2 – константа скорости реакции.

    Рис. 6 – Изменение концентрации ГлУ во времени при кислотном гидролизе ХС.

Сплошная линия – кинетическая кривая, рассчитанная с помощью константы гидролиза, маркеры –экспериментальные значения. Концентрация HCl: 1. – моль/дм3;

2. – 6 моль/дм3, 3. - 12 моль/дм На основе кинетических кривых рассчитаны константы скоростей реакции разрушения ГлУ в ХС. Как следует из кинетических кривых, приведенных на рис. 6, экспериментальные данные практически совпадают с кривыми, рассчитанными с помощью констант гидролиза.

С использованием констант разрушения ГлУ были рассчитаны начальные концентрации ХС в исходных образцах. Так, при концентрации HCl = 12 моль/дм3, константа скорости гидролиза равна K = 24,210-3 с–1, начальная концентрация ГлУ С0 (навеска в пересчете с ХС) составляет 0, ммоль/ дм3, а расчётная концентрация ГлУ составляет С0-расч. 0,40 ммоль/дм3.

Таким образом, оценить содержание ХС в исходном образце можно с помощью кинетических кривых образования ГалА и разрушения ГлУ в процессе гидролиза ХС. При использовании кинетических кривых гидролиза с разрушением ГлУ, полученных методом Дише, результат может быть завышен за счет ГлУ, входящей в состав других гликозаминогликанов, например, гиалуроновой кислоты и дерматан сульфата. При использовании кинетики образования ГалА, содержание которого определяется методом ВЭЖХ, полученный результат характеризует содержание только ХС в исследуемом препарате.

3. Фракционный состав ХС Фракционный состав ХС изучали с использованием эксклюзионной ВЭЖХ. На рис. 7 представлены хроматограммы образцов ХС из хрящей семги в зависимости от концентрации NaCl в элюенте.

Рис. 7 – Хроматограммы образцов ХС в зависимости от концентрации NaCl в элюенте: 1 – 0 моль/дм3, 2 – 0,001 моль/дм3, 3 – 0,005 моль/дм3, 4 – 0, моль/дм При хроматографировании растворов, содержащих ХС, было обнаружено смещение пиков одной хроматограммы относительно другой.

Было показано, что на положение пиков влияет ионная сила раствора элюента – хлорида натрия. С увеличением ионной силы пики сдвигаются вправо. При уменьшении ионной силы раствора более выгодными являются развернутые конформации макромолекул полиэлектролитов (так называемое полиэлектролитное набухание). Среднестатистические размеры молекул растут, и это приводит к уменьшению удерживаемых объемов в эксклюзионной ВЭЖХ. Избежать полиэлектролитного набухания можно добавлением в раствор нейтрального электролита, экранирующего ионные группы. В этом случае хроматограмма образцов будет соответствовать их молекулярно-массовому распределению. Было установлено, что полное подавление полиэлектролитного набухания наблюдается при концентрации NaCl, превышающей 0,05 моль/дм3 (ионная сила раствора равна 0, моль/дм3). При меньшей ионной силе раствора наблюдается несколько пиков на хроматограммах, обусловленных различными конформациями молекул ХС. При концентрации хлорида натрия больше 0,05 моль/дм3 наблюдаются два основных перекрывающихся пика с удерживаемыми объемами 10 и 10, мл, соответствующими двум фракциям полисахарида. Явление полиэлектролитного набухания ХС может быть использовано при его получении и очистке с помощью ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания.

4. Выделение ХС из морских гидробионтов с использованием ультрафильтрации Разработанный метод выделения ХС из морских гидробионтов с использованием мембран заключается в том, что для разделения смеси солей, аминокислот, низкомолекулярных пептидов и целевого полисахарида – ХС, содержащихся в гидролизате хрящевой ткани, используется разделение на ультрафильтрационных мембранах.

С помощью таких мембран повышается степень очистки ХС. Это объясняется тем, что макромолекулы ХС в значительной степени способны изменять гидродинамический радиус при изменении ионной силы раствора.

Степень очистки ХС повышается путем последовательного пропускания гидролизата, полученного из хрящевой ткани морских гидробионтов, через мембраны с различным молекулярно-массовый пределом задерживания.

В качестве сырья для получения ХС с помощью мембран использовали хрящевую ткань сёмги. Подготовленное сырье измельчали и загружали в реакционную емкость, в которой проводили щелочной, затем ферментативный гидролиз. Использовали ферментный препарат (ФП), полученный из гепатопанкреаса камчатского краба, по технологии, разработанной в ПИНРО (г. Мурманск) Гидролизат хрящевой ткани, полученный после щелочной и ферментативной обработки сырья содержит продукты расщепления белков, соли, высокомолекулярные полисахариды (ХС, гиалуроновую кислоту, дерматан сульфат, кератан сульфат). Данный раствор направляли на стадию мембранной очистки, которая заключается в следующем.

Раствор сначала пропускали через ультрафильтрационную мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания менее 50 кДа для отделения оставшихся после гидролиза высокомолекулярных белков и взвешенных частиц. После этого полученный раствор ХС, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей разделяли на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа, обеспечивающей задержание молекул ХС и отделение молекул солей, аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

Методом дисперсии светорассеяния был определен гидродинамический радиус макромолекул ХС из хрящей сёмги. Было установлено, что при концентрации NaCl 0,001 моль/дм3 молекулы ХС разворачиваются. Максимальный гидродинамический радиус молекул ХС наблюдается в дистиллированной воде, поэтому удержанный на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа раствор ХС промывали дистиллированной водой. В результате этой операции концентрация соли снижается и значительно увеличивается гидродинамический радиус молекулы ХС. Далее этот раствор переносили на мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания 50 кДа, где высокомолекулярные фракции ХС концентрировались, а низкомолекулярные пептиды и аминокислоты проходили без задерживания.

Сконцентрированный на этой мембране раствор ХС далее использовали для выделения сухого препарата ХС. Выделение сухого ходроитин сульфата из концентрированного раствора проводили методом осаждения при добавлении к раствору избытка осадителя – этилового спирта с концентрацией 96 %.

На рис. 8 приведены молекулярно-массовые распределения ХС, полученного по известной технологии и по разработанной ультрафильтрационной технологии.

Рис.8 - Молекулярно-массовое распределение ХС;

1 - ХС получен по известной технологии, 2 - ХС получен по разработанной технологии Полученный по технологии с использованием ультрафильтрации ХС характеризуется более узким молекулярно-массовым распределением и более высокой степенью очистки.

В четвертой главе «Разработка технологии получения ХС из морских гидробионтов с использованием мембран» определены близкие к оптимальным технологические параметры стадии осаждения ХС из раствора очищенного гидролизата.

При моделировании процесса осаждения ХС из гидролизата было использовано центральное ортогональное композиционное планирование. В качестве функции отклика Y было выбрано содержание ХС, в качестве влияющих факторов: количество этанола в растворе x1, %, и продолжительность процесса x2, час. Математическая модель, описывающая процесс выпадения полисахаридов из раствора ферментного гидролизата хрящевой ткани была получена с помощью компьютерной программы Statistica 8.0, позволяющей получать уравнение регрессии, связывающее функцию отклика с выбранным количеством влияющих факторов.

Поверхность функции отклика Y в зависимости от влияющих факторов при осаждении полисахарида представлены на рис. 9.

Рис. 9 – Поверхность функции отклика Y – выход ХС Уравнение регрессии процесса осаждения ХС:

Y = -28,16+ 0,355х1 - 0,007х12 + 1,055 х2 - 0,008 х22.

Расчетные значения влияющих факторов, наиболее близкие к оптимальным: при х1=75 %;

х2=20 часов.

Анализ полученных данных показал, что продолжительность процесса осаждения ХС из раствора имеет оптимум на поверхности функции отклика, для получения максимального количества ХС достаточно 20 часов. Поэтому, рациональными условиями протекания процесса осаждения ХС являются:

соотношение гидролизат:спирт – 1:3, продолжительность – 20 часов.

Технологическая схема процесса получения ХС из гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания, представлена на рис. 10.

Приём сырья Хранение сырья Размораживание сырья Измельчение влажного хряща Приготовление 0,8 %- Загрузка ного раствора гидроксида натрия Растворение щелочерастворимых веществ Приготовление 0,5 % ного раствора Нейтрализация уксусной кислоты Осадок Отделение фильтрата Ферментативный гидролиз Подготовка фермента Отделение фильтрата Осадок Приготовление 0,6 % ного раствора хлорида Мембранная обработка натрия Осаждение хондроитина Этанол сульфата из раствора Отделение осадка Фильтрат Сушка осадка Подготовка упаковочных Упаковывание материалов Подготовка Маркирование маркировки Хранение Рис. 10 – Технологическая схема получения ХС из гидробионтов с использованием мембран.

Полученные данные оптимизации были использованы при разработке технологической инструкции «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат» и Технических условий «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат».

В таблице 3 приведена характеристика ХС, на соответствие требованиям ТУ «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов.

Полуфабрикат».

Таблица Характеристика ХС Наименование показателя Требования Значение показателя ТУ 928013-00472182- Массовая доля воды, % не более: 10 9±0, Массовая доля ХС, % не менее 70 75± Массовая доля сульфатов, % не 15 17± менее Экономический эффект разработанной технологии ожидается за счет уменьшения количества спирта на стадии осаждения ХС из раствора, так как гидролизат концентрируется на мембране до конечного объема 1,5-2 дм3.

Кроме того, на выходе получается продукт с заданным диапазоном средней молекулярной массы, очищенный от солей, что позволяет исключить из технологического процесса стадию длительного диализа, присутствующую в известных технологиях.

ВЫВОДЫ 1. Впервые изучено содержание ХС в гидробионтах Баренцева моря: сёмге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле (Deania calceus), полярной акуле (Somniosus microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa). Показано, что наиболее перспективными видами для получения ХС являются полярная акула, северный скат и сёмга. Содержание ХС в этих гидробионтах соответственно составляет 13,96 %, 15,51 % и 10, % (масса ХС /масса сухого сырья).

2. Разработан метод идентификации и количественного анализа ХС из морских гидробионтов с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе по содержанию ГалА в продуктах кислотного гидролиза ХС.

Усовершенствованы спектрофотометрические методики анализа ГалА, АцГалА и ГлУ. Предложены методы количественного определения ХС в исходном сырье, конечном продукте и пищевых продуктах.

3. Рассчитаны константы скорости реакции гидролиза ХС с образованием ГалА и разрушения глюкуроновой кислоты при концентрациях HCl 4, 6, 12 моль/дм3. Выбрана математическая модель, адекватно описывающая процесс кислотного гидролиза ХС.

4. Определены среднемассовые молекулярные массы ХС из гидробионтов Баренцева моря, поверхностная и оптическая активность их водных растворов. Показано, что при добавлении NaCl с концентрацией 0, моль/дм3 полиэлектролитное набухание макромолекул ХС подавляется.

Установлена возможность использования системы ХС-фермент в качестве биомаркера.

5. Разработана технология получения ХС из гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различный молекулярно-массовый предел задерживания. Определены близкие к оптимальным параметры стадии осаждения ХС из раствора. Показано, что ХС, полученный по технологии с использованием ультрафильтрационных мембран, характеризуется высокой степенью очистки и более узким молекулярно-массовым распределением по сравнению с ХС, полученным по известной технологии.

6. Разработана технологическая инструкция для получения ХС из гидробионтов, и технические условия на полуфабрикат «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов». Оценена экономическая эффективность разработанной технологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Порцель, М. Н. Мембранное разделение полисахаридов и белков при извлечении хондроитинсульфата из морских гидробионтов / М. Н.

Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Рыбное хоз-во. – 2009. – № 4. – С. 116-118.

2. Порцель, М. Н. Хондроитинсульфаты морских гидробионтов Баренцева моря / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Рыбное хоз-во. – 2010. – № 3. – С. 78.

3. Порцель, М. Н. Кинетика кислотной деполимеризации хондроитинсульфата / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Изв. вузов. Сер. Химия и хим. технол. – 2010. – Т. 53, № 6. – С. 67-70.

4. Крылов, В. Б. Предварительная структурная характеристика, противовоспалительная и антикоагулянтная активности хондроитинсульфатов из хрящей морских рыб / В. Б. Крылов, А. А. Грачев, Н. Е. Устюжанина, Н. А. Ушакова, М. Е. Преображенская, Н. И. Козлова, М.

Н. Порцель, И. Н. Коновалова, В. Ю. Новиков, Х. Х. Зиеберт, A. C. Шашков, Н. Э. Нифантьев // Изв. Акад. наук. Сер. Хим. – 2011. - № 4. – С. 731-738.

Статьи в журналахи материалы конференций:

1. Снегерева, М. Н. Выделение хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб и изучение его физико-химических свойств / М. Н. Снегерева, В.

Ю. Новиков, К. В. Реут, И. Н. Коновалова // Всерос. науч.-техн. конф.

«Современные проблемы экологии», 30 июня 2008 г. - Тула, 2008. – С. 20-21.

2. Снегерева, М. Н. Изучение физико-химических свойств хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб / М. Н. Снегерева, В. Ю.

Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы Мурман. науч.-практ. конф.

«Техника и технология переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья», 24-25 апр. 2008 г. – Мурманск, 2008. – С. 56.

3. Снегерева, М. Н. Физико-химические свойства хондроитин сульфата, полученного из хрящевой ткани семги / М. Н. Снегерева, В. Ю.

Новиков, К. В. Реут, И. Н. Коновалова // Материалы науч. сессии «Применение ПАВ в пищевой промышленности», 15-17 сентября 2008 г. – Мурманск, 2008. – С. 111.

4. Снегерева, М. Н. Получение хондроитина сульфата из хрящевой ткани рыб и изучение его свойств / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н.

Коновалова // Материалы Междунар. науч.-техн. конф. «Наука и образование 2008», г. Мурманск, 1-9 апр. 2008 г. / МГТУ. – Мурманск, 2008. – С. 311-313.

5. Снегерева, М. Н. Фракционирование полисахаридов и белков из хрящей семги / М. Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Сборник 10-ой междунар. конф. молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», г. Казань, 12-15 мая 2009 / Казанский гос. технолог. ун-т. – Казань, 2009. – С. 338.

6. Снегерева, М. Н. Кислотный гидролиз хондроитинсульфата / М.

Н. Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы Междунар.

науч.-техн. конф. «Наука и образование 2009», г. Мурманск, 1-9 апр. 2009 г. / МГТУ. – Мурманск, 2009. – С. 319-322.

7. Порцель-Снегерева, М. Н. Гидролиз гликозидных связей в хондроитинсульфате / М. Н. Порцель-Снегерева, В. Ю. Новиков, И. Н.

Коновалова // Труды 7-ой междунар. науч. конф. «Инновации в науке и образовании-2009» / КГТУ. – Калининград, 2009. – С. 257-260.

8. Порцель, М. Н. Кинетика химического гидролиза полисахаридов, полученных из гидробионтов / М. Н. Порцель, Н. В.

Долгопятова // Материалы школы молодых ученых «Научно-прикладные проблемы химической технологии минерального сырья и гидробионтов Кольского региона», 27 октября 2009 г. – Мурманск, 2009. – С. 61-66.

9. Порцель, М. Н. Выделение хондроитинсульфата из кукумарии / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Наука и образование 2010 [Электронный ресурс] : междунар. науч.-техн. конф., Мурманск, 5- апр. 2010 г. / МГТУ. - Электрон. текст дан. (139 Мб). – Мурманск : МГТУ, 2010. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM). - С. 489-491. - Гос. рег. НТЦ «Информрегистр» № 0321000362.

10. Изучение строения антикоагулянтной и противовоспалительной активности хондроитин сульфатов из хрящей семги и полярной акулы / В. Б.

Крылов, Н. Е. Устюжанина, А. А. Грачев, Н. А. Ушакова, М. Н. Порцель, В.

Ю. Новиков, И. Н. Коновалова, М. Е. Преображенская, Н. Э. Нифантьев // Химия и медицина : Материалы VIII Всерос. конф. с междунар. участием, 6– 8 апр. 2010 г. – Уфа, 2010. – С. 213.

11. Порцель, М. Н. Исследование фракционного состава хондроитинсульфатов из морских гидробионтов методом ВЭЖХ / М. Н.

Порцель, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Материалы конф. «Инновации в науке и образовании-2010», Калининград, 19-21 окт. 2010 г. – Калининград, 2010. – С. 88-90.

12. Порцель, М. Н. Хроматографический анализ хондроитинсульфатов из гидробионтов / М. Н. Порцель, В. Ю. Новиков, И.

Н. Коновалова // Наука и образование-2011 [Электронный ресурс] :

междунар. науч.-техн. конф., Мурманск, 4-8 апреля 2011 г. / МГТУ. Электрон. текст дан. (30 Мб). – Мурманск : МГТУ, 2011. - 1 электрон. опт.

диск (CD-ROM). - С. 365-368. - Гос. рег. НТЦ «Информрегистр» № 0321100504.

13. Portsel, M. N. Polysaccharide analysis by reversed-phase HPLC / M.

N. Portsel, V. Yu. Novikov, I. N. Konovalova // Advances in Chitin Science. Vol.

XI. Proc. of the 10-th Int. Conf. of the European Chitin Society, 20-24 May y./ ed. by V. Varlamov, S. Bratskaya, I. Yakovleva, S. Senel. – S.-Petersburg, 2011. – P. 219-223.

  Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии и технологии Полярного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (г.Мурманск) и лаборатории химии гликоконъюгатов Института органической химии им. Н. Д.

Зелинского Российской академии наук (г.Москва) за помощь в проведении физико-химических анализов.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.