авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 |

Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Гоголев Юрий Викторович ФЕРМЕНТЫ ЛИПОКСИГЕНАЗНОГО КАСКАДА:

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ 03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственно го бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный консультант: академик РАН, доктор химических наук, директор КИББ КазНЦ РАН, Гречкин Александр Николаевич

Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук, с.н.с. каф. энзимологии химического факультета Московского государственного университета Тишков Владимир Иванович профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. молекулярных основ внутриклеточной регуляции Института физиологии растений РАН Лось Дмитрий Анатольевич профессор, доктор биологических наук, зав. лаб. механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН Горшкова Татьяна Анатольевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН 2013 г. в 00 часов на заседании диссертационного совета

Защита состоится Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на со искание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу: 420111, г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, а/я № 30, тел/факс (843)2927347, e-mail: gogolev.yuri@gmail.com

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского на учного центра РАН.

Автореферат разослан «_»2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Пономарева Анастасия Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Липоксигеназный каскад является ис точником физиологически активных соединений – оксилипинов. У высших растений ок силипины отвечают за регуляцию роста, морфогенез, участвуют в формировании системной устойчивости к экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2002]. По мимо высших растений, оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у бактерий, бурых и красных водорослей, кораллов, хордовых и пластинчатых [Lee et al., 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада являются липоксигеназы и ци тохромы семейства CYP74 суперсемейства Р450. В зависимости от региоспецифичности действия липоксигеназы растений в основном разделяют на 9- и 13-специфичные, а также обладающие дуалистичными свойствами. Продукты липоксигеназной реакции – гидропе рекиси жирных кислот – преобразуются при участии ферментов CYP74: алленоксидсин таз (АОС), гидропероксидлиаз (ГПЛ), дивинилэфирсинтаз (ДЭС). Алленоксидсинтазы и дивинилэфирсинтазы являются дегидразами, в то время как гидропероксидлиазы – изо меразами. Разнообразие генов семейства CYP74 в геномах различных организмов пред полагает и другие типы катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, а также несколько ДЭС разных видов растений. Существует мне ние, что ферменты последнего класса не имеют широкого распространения в природе.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в агропромышленном производстве и биотехнологии. Оксили пины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа фермен тов липоксигеназного каскада, исследование их молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабора ториях мира, существенно расширил представления о механизмах ферментативного ката лиза. Во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и фер ментов CYP74 остается недостаточно охарактеризованным. Предложенные модели взаи модействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в ча стности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недоста точным.

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ позволяет предположить их возникно вение до цитохромов. Однако отсутствие функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в уже существую щий метаболический процесс, в котором поступление данного субстрата происходило из других источников, отличных от липоксигеназной реакции.

Филогения и систематика ферментов CYP74 до сих пор остается на стадии разработ ки. Использование стандартных алгоритмов классификации приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. Некоторые типичные представители CYP74 по биохимическим характеристикам не удовлетворяют принятым критериям принадлежности к семейству, в связи с чем их предложено включить в одно именный «клан» [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, связанной с их выходом на сушу. Однако от крытия липоксигеназного каскада у животных, бурых водорослей и прокариот, свиде тельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.





Данные противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов CYP74.

Так, у классического объекта – льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с которого нача лось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины – необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные – линолипины [Chechetkin et al., 2008]. Однако фермент, ответственный за синтез дивиниловых эфиров, до настоя щего времени оставался неизученным.

Выяснение процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представля ют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновремен ной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях пер вичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогене тической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов. Для достиже ния этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигена зы ZmLOX3 кукурузы (Zea mays).

2. Получение мутантных форм ZmLOX3;

сравнение реакций превращения ли нолевой кислоты и других субстратов при участии фермента дикого типа и его му тантных форм.

3. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и липоксигеназы GmLOX сои (Glycine max) с субстратами на основании экспериментальных данных и компью терного моделирования.

4. Выявление особенностей механизма катализа рекомбинантной алленоксид синтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum) в сравнении с алленок сидсинтазами подсемейства CYP74A.

5. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания ге на, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (5Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.);

получение рекомбинантного фермента, его структурно-функциональная характеристика.

6. Получение мутантных форм LeAOS3 и фермента, ответственного за биосин тез (5Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с модифи кациями каталитически важных доменов. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

7. Получение мутантных форм гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula);

сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

8. Проведение эволюционного анализа генетической информации, накопленной в отношении ферментов липоксигеназного каскада.

9. Построение филогенетических моделей, отражающих молекулярную эволю цию ферментов липоксигеназного каскада высших растений и их таксономическое по ложение.

Научная новизна работы. На основании экспериментальных данных и результатов компьютерного моделирования определены факторы, влияющие на специфичность окис ления субстратов при участии (9S)- и (13S)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOX1, соответственно). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре GmLOX1 и ZmLOX3 различается, однако в обоих случаях субстрат погружается в актив ный центр метильной концевой группой;

инверсии субстрата под действием внешних факторов не происходит. Специфичность действия ZmLOX3 не определяется ориентаци ей субстрата в активном центре, а детерминируется объемом активного центра, его про странственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа.

Выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фер мента. В результате единичной аминокислотной замены получена мутантная форма ZmLOX3 с измененной региоспецифичностью.

Впервые показано, что алленоксидсинтаза LeAOS3 подсемейства CYP74C цитохро мов Р450 является многофункциональным ферментом и катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Показано, что продуктами LeAOS3 являются (9S)--кетол и рацемическая смесь цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

Выявлен ген дивинилэфирсинтазы LuDES льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), клонирована его открытая рамка считывания. LuDES идентифицирована как первый фер мент подсемейства CYP74B, гомологичный 13-гидропероксидлиазам, входящим в состав данного подсемейства, и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой. На сегодняш ний день LuDES единственная известная 13-гидропероксид-специфичная дивинилэфир синтаза.

Проведен сравнительный анализ первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и представителей семейства CYP74;

выявлены гипотетические детерминанты ката лиза – сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих консервативные последовательности у ферментов с разным типом катализа – алленоксидсинтаз, гидропе роксидлиаз и дивинилэфирсинтаз. Смоделированы модификации первичной структуры алленоксидсинтазы LeAOS3 томата, гидропероксидлиазы MtHPL люцерны, дивинилэ фирсинтазы LuDES льна;

проведен сайт-направленный мутагенез соответствующих ге нов, изучены каталитические свойства мутантных форм ферментов. Впервые показано изменение механизмов каталитического действия ферментов семейства CYP74 в резуль тате замены аминокислотных остатков, находящихся вблизи гема. Получены мутантные формы алленоксидсинтазы LeAOS3, обладающие гидропероксидлиазной активностью, что означает конверсию дегидразного типа реакции в изомеразный. Впервые дивинилэ фирсинтаза LuDES превращена в алленоксидсинтазу, которая катализирует преобразова ние 13-гидроперекиси -линоленовой кислоты в 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту и -кетол. Проведенные превращения ферментов CYP74 могут служить подтверждением дивергенции генов CYP74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гид ропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липоксигеназа ZmLOX3 кукурузы проявляет (9S)-специфичность при окислении линолевой кислоты в нейтральных и щелочных условиях в диапазоне pH 6,5-9,5. Анализ моделей взаимодействия липоксигеназ с субстратами показал, что для ZmLOX3 характе рен единственный способ позиционирования субстрата в активном центре, обусловлен ный проникновением жирной кислоты в субстрат-связывающий карман метильной концевой группой. Аминокислотный остаток Ala562, расположенный в активном центре ZmLOX3, важен для проявления региоспецифичности действия;

замена аланина на мень ший по размерам глицин приводит к частичному проявлению (13R)-региоспецифичности.

2. Специфичность действия липоксигеназ высших растений не обнаруживает стро гой взаимосвязи с общей первичной структурой, что характерно для липоксигеназ живот ных, грибов и прокариот.

3. 13-cпецифичные липоксигеназы являются анцесторной группой по отношению к 9-специфичным липоксигеназам, которые образовались монофилетически до диверген ции однодольных и двудольных растений.

4. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принад лежащий подсемейству CYP74C, является многофункциональным. LeAOS3 катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Первичный продукт LeAOS3, окись аллена, после высвобождения из активного центра захватывается тем же ферментом, катализи рующим ее вторичные превращения, а именно – стереоспецифический гидролиз с образо ванием (9R)--кетола и циклизацию с образованием рацемической цис-10-оксо-11 фитоеновой кислоты.

5. Фермент LuDES льна является единственной дивинилэфирсинтазой, классифици руемой по общей первичной структуре как член подсемейства CYP74B цитохромов Р450, до сих пор включавшего только 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

Дивинилэфирсинтаза LuDES льна обладает строгой 13-региоспецифичностью к субстра ту;

предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись -линоленовой ки слоты, основным продуктом является (5Z)-этероленовая кислота.

6. В формировании определенного типа катализа ферментов семейства CYP74 прин ципиальная роль принадлежит центральному домену I-спирали и ERR-триаде.

7. Все ферменты семейства CYP74 относятся к одной близкородственной филогене тической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Семейство CYP74 сформировалось на ранних этапах эволюции цитохромов Р450 до дивергенции эу кариот от последнего общего предка. Предковая форма ферментов CYP74 высших расте ний дала начало трем большим группам. Первая включала 13-ГПЛ, вторая – 13-АОС, третья – 9/13-АОС, 9-АОС и 9/13-ГПЛ. Дивинилэфирсинтазы являются эволюционно наиболее молодыми ферментами, имеющими полифилетическое происхождение, не за вершившееся формированием таксономически обособленных единиц. Субстратная спе цифичность наряду с типом катализируемой реакции является существенным таксономическим признаком представителей семейства CYP74;

дивинилэфирсинтазы связаны с родственными группами общей субстратной специфичностью.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в по нимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способст вующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов липоксигеназной сигнальной системы – оксилипинов, участвующих в процес сах онтогенеза растений, а также в формировании ответа на стрессовые факторы. Многие оксилипины являются физиологически активными, бактерицидными соединениями.

В экономическом аспекте актуальными являются исследования липоксигеназного каскада масличных, зерновых и технических культур, а также лекарственных растений.

Оксилипины во многом определяют ценные технологические, органолептические и ле чебные свойства растений, которые могут быть востребованы в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Разработаны системы получения и препаративной очистки липоксигеназ и цитохро мов растений, способные найти применение в промышленности. Ферменты с измененны ми каталитическими свойствами могут быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохо зяйственного производства, и стать основой инновационных технологий переработки сы рья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов.

Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутаге незе представляет потенциальный интерес для практического использования в биоинже нерии. Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологическо го и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных фер ментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в иссле дования. Работа проводилась с 2004 по 2013 гг. в соответствии с планом научных иссле дований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74:

структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов – эндогенных биорегуляторов рас тений» (гос. рег. №: 01200901959). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 09-04 00915-а, 09-04-12222-офи_м, программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантом ведущей научной школы НШ № 6992.2010.4, Федеральной целевой программой «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров» (ГК № 14.740.11.0797 от 30.10.2010). Научные положения диссертации и выво ды базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (Солт-Лейк-Сити, США, 2007);

на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Вальядолид, Испания,2008);

на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биоло гов (Новосибирск, 2008);

на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Лозанна, Швейцария, 2009);

на 35-ом и 36-ом конгрессах FEBS (Прага, Чешская респуб лика, 2009;

Турин, Италия, 2011);

на VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011);

на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализа ция у растений» (Казань, 2011);

на 4-ом Съезде EMBO (Ницца, Франция, 2012);

на 18-ой Международной конференции «Цитохромы Р450: биохимия, биофизика и биотехноло гия» (Сиэтл, США, 2013);

на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2006-2013 гг.).

Публикации. По результатам работы опубликовано семь статей в отечественных и семь в зарубежных рецензируемых изданиях. По докладам на научных мероприятиях опубликовано 50 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 345 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В ра боте представлено 13 таблиц и 92 рисунка. Список литературы включает 395 источников.



1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Методы биоинформатики. Поиск аминокислотных последовательностей липокси геназ и цитохромов P450 проводили с помощью программы PSI-BLAST в базе данных NCBI и банке данных д-ра Нельсона [http://drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html].

Множественные выравнивания проводили с применением программы Clustal Omega [Sievers et al., 2011]. Для филогенетического анализа использовали пакет программ MEGA 5 [Tamura et al., 2011]. Трехмерные модели белков строили с помощью пакета программ EsyPred3D [Lambert et al., 2002]. Позиционирование субстрата в активном цен тре исследовали с помощью программ Autodock 4.2 и AutodockTools 1.5.4 (The Scripps Research Institute). Модели лигандов получали с помощью программы ChemOffice (CambridgeSoft), визуализацию данных проводили с помощью программы PyMol APBS Tool (Carlson Group, University of Michigan). Праймеры конструировали с помощью про граммы Vector NTI 9 (Invitrogen, США).

Подготовка материала. Рекомбинантные плазмиды, содержащие открытые рамки считывания (ОРС) генов LeAOS3 [Howe et al., 2000] и ZmLOX3 [Wilson et al., 2001], были любезно предоставлены доктором Г. Хоу (Университет штата Мичиган, США) и Н. Кэл лер (Университет штата Висконсин, США), соответственно. Для клонирования генов ферментов CYP74 льна-долгунца (Linum usitatissimum L., сорт Новоторжский) их экс прессию индуцировали инокуляцией клетками штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 растений, выращенных в течение 35 дней в открытом грунте.

Тотальную ДНК экстрагировали фенольным методом [Георгиев, 1959];

РНК выде ляли с помощью коммерческого набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). Для получения двуцепочечной кДНК использовали коммерческий набор MINT (Евроген, Рос сия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в стандартном температурном режиме, от 14 до 40 циклов. Праймеры синтезировали в НПО «Синтол» (Россия). Качест во нуклеиновых кислот оценивали после их электрофоретического разделения в агароз ном геле;

количество определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Для выделения ДНК из агарозного геля использовали наборы MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили с помощью вектора pGem-T Easy (Promega, США). Определение нуклеотидной последова тельности ДНК проводили на автоматическом капиллярном ДНК-анализаторе ABI Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для анализа и сопоставления секвенирован ных последовательностей применяли программы Sequencing Analysis 5.3.1. и SeqScape Software 2.6. (Applied Biosystems, США).

Для определения последовательностей полноразмерных кДНК использовали метод RACE (Rapid Amplification of cDNA End), основанный на гнездовой ПЦР. Мутации в кло нированные гены вводили методом полноразмерной амплификации плазмид с модифици рованными праймерами с помощью ПЦР с ДНК-полимеразой KOD (Novagen, США) или Pfu Turbo (Stratagen, США). Реакционную смесь обрабатывали рестриктазой DpnI (Fer mentas, Литва), гидролизующей метилированную ДНК бактерий.

Получение рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки нарабатывали в клет ках E. coli BL21(DE3)pLysS и Rosetta-gami(DE3)рLysS B с использованием векторов pET 30, рЕТ-32 Ek/LIC, рЕТ-23а (Novagen, США). Протокол был составлен на основе обще принятых методик. Клетки продуцентного штамма E. coli выращивали в среде Luria Bertani (LB), разведенной равным объемом минеральной среды М9, до достижения куль турой OD600 = 0,8-1,0. Клеточную культуру охлаждали до 20 оС и добавляли в нее 0,1 мМ ИПТГ. Для синтеза цитохромов добавляли предшественник гема – -аминолевулиновую кислоту – из расчета 115 мг/л. Индуцированные клетки инкубировали 18-24 часа при умеренной аэрации и 16-20 oC, после чего собирали центрифугированием, суспендирова ли и разрушали в лизирующем буфере BugBuster (Invitrogene, США).

Очистку ферментов CYP74 проводили металлоаффинной хроматографией на колон ке Bio-Scale Mini Profinity IMAC (Bio-Rad, США). Содержащую белок фракцию подвер гали ультрафильтрации через фильтр AmiconUltra 50k (Millipore, США). Рекомбинантную липоксигеназу ZmLOX3 собирали высоливанием ((NH4)2SO4, 20-50 % насыщения), диа лизовали и последовательно подвергали анионообменной (Q-Sepharose) и гидрофобной (Octyl-Sepharose) хроматографии.

Биохимическая характеристика ферментов. (9Z,11E,13S)-13-гидроперокси-(9,11) октадекадиеновую кислоту (13-гидроперекись линолевой кислоты, 13-ГПОД) и (13S) гидроперокси-(9Z,11E,15Z)-октадекатриеновую кислоту (13-гидроперекись -линолено вой кислоты, 13-ГПОТ) получали окислением линолевой и -линоленовой кислот, соот ветственно, при участии соевой липоксигеназы (Sigma-Aldrich, США). (9S,10E,12Z)-9 гидроперокси-(10,12)-октадекадиеновую кислоту (9-гидроперекись линолевой кислоты, 9 ГПОД) и (9S,10E,12Z,15Z)-гидроперокси-(10,12,15)-октадекатриеновую кислоту получали в результате инкубации линолевой и -линоленовой кислот, соответственно, с липоксиге назой томата. Гидроперекиси очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на колонке Separon SIX (5 мкм, 3,2150 мм, Tessek, Чехия).

Реакцию липоксигеназного окисления проводили в насыщенном кислородом 0,1 M Na-фосфатном буфере (pH 7,0 или 9,0), содержавшем 0,3 мM субстрата. Активность фер ментов CYP74 определяли по снижению характерного для гидроперекисей жирных ки слот оптического поглощения при 234 нм. Анализ проводили в 0,05 M Na-ацетатном (pH 5,0), Na-фосфатном (pH 6,0-8,0), трис-HCl (pH 7,5-8,5) и глицин-NaOH (pH 9,0) буферах.

Для расчета скорости реакций использовали начальные линейные участки кинетических кривых. Кинетические параметры рассчитывали по установке наборов данных для насы щающей модели с одним сайтом связывания простого лиганда с помощью программного обеспечения SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., США).

Продукты реакций экстрагировали смесью этилацетата и гексана (1:1), высушивали, перерастворяли в метаноле и наносили на колонку Nucleosil 5 ODS (2504,6 мм) (Ma cherey-Nagel, Германия) с обращенной фазой. Растворитель нужных фракций высушива ли. Остаток перерастворяли в ацетоне и наносили на две соединенные колонки Separon SIX с нормальной фазой. Для протонирования жирных кислот в систему растворителей добавляли ледяную уксусную кислоту (1:1000). Фракции ВЭЖХ на нормальной фазе, со ответствующие отдельным пикам продуктов, метилировали диазометаном. Метиловые эфиры анализировали хирально-фазовой ВЭЖХ на колонке Chiralcel OD-H (Daicel Chemi cal Industries, Япония) в смеси растворителей гексан/изопропанол (97:3 по объему).

Образцы для ГХ-МС готовили по протоколу, разработанному ранее [Grechkin et al., 2007]. Реакционную смесь экстрагировали смесью гексана с этилацетатом (1:1). Продук ты высушивали, растворяли в метаноле и восстанавливали в присутствии NaВН4. Восста новленные продукты метилировали диазометаном, диазометан выпаривали, продукты растворяли в метаноле и гидрировали водородом над PtO2. Продукты силилировали сме сью пиридин/гексаметилдисилазан/триметилхлорсилан (2:1:2). После упаривания сили лирующей смеси продукты экстрагировали гексаном. Очистку продуктов проводили с помощью ВЭЖХ, после чего проводили их анализ методом газовой хромато-масс спектрометрии (ГХ-МС) путем полного спектрального сканирования ионов в диапазоне отношений массы к заряду от 50 до 650 с помощью масс-спектрометра QP5050A, соеди ненного с газовым хроматографом GC-17A (Shimadzu, Япония).

Для определения пространственной структуры оксигенированных жирных кислот и подтверждения данных по геометрической изомерии применяли метод спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса. 1Н-ЯМР спектры исследуемых веществ, рас творенных в CDCl3, и 2D-COSY регистрировали с помощью спектрометра Avance (Bruker, Германия) при рабочей частоте 600 МГц. Эксперименты по гомоядерному 1Н двойному резонансу проводили с помощью того же инструмента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Биохимическая характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX кукурузы обыкновенной (Zea mays). Наработку рекомбинантного фермента ZmLOX проводили в клетках штамма E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS B. Оптимизация условий экспрессии гена ZmLOX3 позволила достичь высокой каталитической активности фер мента. Его очистку проводили комбинацией методов ионообменной и гидрофобной хро матографии. В табл. 1 представлены результаты типичного эксперимента.

Табл. 1. Каталитическая активность препаратов рекомбинантной ZmLOX3.

Стадия очистки Белок, мг Активность, ед./мг Выход, % Клеточный лизат 1570 132 Фракция 20-50 % насыщения (NH4)2SO4 435 390 Фракция элюента после Q-Sepharose 22 4180 Фракция элюента после Octyl-Sepharose 4,2 9970 Согласно теории обратной ориентации, предложенной Гарднером [Gardner, 1989], появление 9-гидропероксипроизводных жирных кислот связано с тем, что в кислых усло виях карбоксильная концевая группа жирной кислоты находится в неионизированном со стоянии и способна погружаться в субстрат-связывающий карман. При защелачивании реакционной среды ионизация карбоксильной группировки заставляет жирную кислоту переориентироваться;

происходит погружение в активный центр метильной концевой группы, что ведет к образованию 13-гидропероксипроизводных жирных кислот.

Скорости и продукты окисления линолевой и -линоленовой кислот при участии ZmLOX3 исследовали при разных значениях pH. Было установлено, что вне зависимости от рН среды преобладающим продуктами реакции являлись (9S)-гидроперекиси жирных кислот (табл. 2). В отличие от опубликованных данных для (9S)-липоксигеназ, регио- и стереоспецифичность ZmLOX3 не зависели от условий реакции.

Скорость окисления -линоленовой кислоты была меньше, чем линолевой. Согласно модели, предложенной для ЛОГ млекопитающих [Kuhn et al., 1990], субстрат должен по зиционироваться так, чтобы пентадиеновая группировка связалась с определенным клю чевым аминокислотным остатком;

взаимодействие акцептора с водородом прохирального центра субстрата должно быть энергетически выгодным. Вероятно, взаимодействие пен тадиеновой группировки, центром которой является 11-ый атом углерода, с соответст вующим аминокислотным остатком активного центра ZmLOX3 происходит как в случае -линоленовой, и линолевой кислот. Это обеспечивает специфичность реакции. Однако для -линоленовой кислоты энергетически выгодным является удаление атома водорода от прохирального центра другой пентадиеновой группировки (9-го атома);

увеличение расстояния от акцептора водорода до пентадиеновой группировки с прохиральным цен тром на 11-ом атоме углерода снижает скорость реакции.

2.2. Направленная модификация первичной структуры ZmLOX3. Для выясне ния особенностей первичной структуры и филогенетического положения ZmLOX3 про водили множественное выравнивание аминокислотных последовательностей липоксигеназ растений, для которых получены данные о специфичности действия. Кроме того, с помощью методов компьютерного моделирования нами была построена трехмер ная модель ZmLOX3. Полученные данные свидетельствуют о том, что разделение липоксигеназ на группы по специфичности не обнаруживает строгого соответствия степени схожести первичных структур. В то же время, согласно сравнительному анализу для проявления 13 специфичности действия ли поксигеназ необходимо нали чие в области 537-580 мотива INGLAR или INALGR (рис.

1). В отличие от 13 специфичных липоксигеназ, в Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последователь- последовательности 9 ностей липоксигеназ сои GmLOX1, VLXD, GmLOX3, специфичного фермента VLXB и кукурузы ZmLOX3. а – Ala560, б – Ala562 в ZmLOX3 присутствует мотив последовательности ZmLOX3. INALAR.

В полипептидной цепи рекомбинантного фермента ZmLOX3 были проведены заме ны аминокислотных остатков A560G и A562G. Было обнаружено, что преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии ZmLOX3 A560G была (9S) гидроперекись. Количество минорных продуктов (9R)-, (13S)-, (13R)-гидроперекисей ли нолевой кислоты составляло не более 3 %, что соответствовало профилю продуктов окисления субстрата при участии ZmLOX3 дикого типа (табл. 2). Полученный результат согласуется с компьютерной моделью, согласно которой боковая группировка Ala560 не участвует в формировании субстрат-связывающего кармана. Продуктами окисления ли нолевой кислоты при участии ZmLOX3 A562G являлись 9- и 13-гидроперекиси в соотно шении 68,5:31,5. С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показано, что среди 9 гидроперекисей линолевой кислоты преобладали (S)-энантиомеры (97 %), тогда как среди 13-гидроперекисей преобладали (R)-энантиомеры (96 %). Для ZmLOX3 дикого типа кон станта Михаэлиса для линолевой кислоты составила 20,2 мкМ, тогда как для ZmLOX A562G – 3,2 мкМ. Таким образом, в результате мутации A562G липоксигеназы ZmLOX кукурузы была изменена региоспецифичность каталитического действия фермента.

Табл. 2. Процентное соотношение продуктов окисления линолевой кислоты при уча стии ZmLOX3 дикого типа и ее мутантных форм A560G и A562G.

фермент гидроперекиси линолевой кислоты суммы продуктов (9S)- (9R)- (13S)- (13R)- (9S)- + (13R)- (9R)- + (13S) ZmLOX3 97,5 % 1 % 0,6 % 0,9 % 98,4 % 1,6 % ZmLOX3 A560G 97,7 % 0,8 % 0,7 % 0,8 % 98,5 % 1,5 % ZmLOX3 A562G 66,4 % 2,1 % 1,3 % 30,2 % 96,6 % 3,4 % Согласно гипотезе Коффа [Coffa, Brash, 2004] для каталитической активности (13S) специфичных липоксигеназ оптимальными являются щелочные условия, когда карбок сильная концевая группа жирной кислоты ионизирована и субстрат входит в активный центр фермента метильной концевой группой. Для образования (9S)-гидроперекиси суб страт должен проникнуть в активный центр неионизированной карбоксильной группой при кислых pH. Альтернативная гипотеза заключается в том, что ориентация субстрата всегда соответствует его погружению в активный центр метильной концевой группой.

Ключевую роль играет боковая группа аминокислотного остатка Ala542 GmLOX (Ala562 ZmLOX3), расположенного у входа в субстрат-связывающий карман. У (13S) специфичных липоксигеназ она закрывает от молекулы кислорода 9-ый атом углеродной цепи субстрата. У (9S)-специфичных липоксигеназ боковая группа остатка аланина бло кирует 13-ый атом. При замене остатка аланина на менее объемный остаток глицина уг лерод в 13-ом положении открывается для присоединения кислорода. Поэтому мутантная форма ZmLOX3 A562G катализирует образование не только (9S)-, но и (13R) гидроперекиси линолевой кислоты.

Ранее высказано предположение, что у некоторых липоксигеназ, в частности, (8R) ЛОГ коралла Plexaura homomalla субстрат-связывающий центр представляет собой не карман, а U-образный канал [Neau et al., 2009]. В этом случае специфичность действия липоксигеназы может зависеть от ориентации субстрата в канале. До настоящего времени мы не располагаем данными о трехмерной структуре (9S)-специфичных липоксигеназ.

Однако использование методов биоинформатики позволило построить пространственную модель фермента на основании сходства аминокислотных последовательностей с липок сигеназами, для которых данные рентгеноструктурного анализа получены.

2.3. Моделирование механизма ферментативного действия ZmLOX3. Согласно филогенетическим данным специфичность действия липоксигеназ определяется не про тяженными последовательностями, а компактными доменами. При этом для липоксигеназ характерны разные спектры специфично окисляемых субстратов. Так, (13S) липоксигеназа GmLOX3 сои, в отличие от ZmLOX3, специфично окисляет полиненасы щенные жирные кислоты длиной 20 и 22 углеродных атома, хотя и с меньшей эффектив ностью, чем линолевую и -линоленовую кислоты. При этом как GmLOX3, так и ZmLOX3 способны использовать в качестве субстрата сложные липиды [Чечеткин и со авт., 2009]. Данные о пространственной структуре 13-ЛОГ GmLOX1 и GmLOX3, а также комплекса GmLOX3 с аналогом субстрата были получены методом рентгеноструктурного анализа [Dainese et al., 2005]. Эти данные были использованы нами при конструировании пространственной модели ZmLOX3 (рис. 2).

Полученная модель ZmLOX3 обладает значительным сходством с пространственной структурой соевых липоксигеназ. N-концевой PLAT-домен ZmLOX3 длиной 160 амино кислотных остатков участвует во взаимодействии с мембранами и свободными жирными кислотами. В состав PLAT-домена входят аминокислотные остатки Asp31 и Glu120, не обходимые для связывания Ca2+, и Lys114. Благодаря Lys114 обеспечивается ассоциация белка с мембраной, либо липопротеин-связанным субстратом. В состав С-концевого до мена входит третий Ca2+-связывающий аминокислотный остаток Glu194.

Для (8R)-липоксигеназы коралла, GmLOX1 и ZmLOX3 провели моделирование взаимодействия субстрата и активного центра (рис. 3) и определили следующее. Актив ный центр GmLOX1 формируется тремя полостями, соединяющимися у атома железа.

Жирная кислота в активном центре может располагаться одним из двух способов (рис. 4).

В первом случае карбоксильная концевая группа субстрата фиксируется водородными связями с Thr257 (GmLOX1) в полости I (рис. 4В). Углерод, от которого отрывается водо род, располагается в непосредственной близости (3 ) от атома железа. Алифатическая часть субстрата располагается в полости II. Во втором случае часть субстрата находится в полости I в непосредственной близости от аминокислотных остатков Leu255, Glu256, Thr259, Ile538, Ile753, Leu754 и Ile839;

остальная часть субстрата располагается в полости III (рис. 4Г). Таким образом, специфичность действия GmLOX1 при использовании в ка честве субстратов жирных кислот с разной длиной углеродной цепи объясняется возмож ностью их разного позиционирования в активном центре.

Рис. 2. Модель трех мерной структуры ZmLOX кукурузы. а – общая структу ра фермента, б – расположе ние боковых групп аминокислотных остатков ли гандов железа. Консерватив ными лигандами железа ZmLOX3 являются аминокис лотные остатки His519, His524, His710, Asn713 и Ile864. Для N-концевого до мена характерно наличие складчатых областей;

боль шую часть C-концевого доме на, составляют -спирали.

Рис. 3. Положения субстратов в активных центрах ZmLOX3 (а, б, в) и GmLOX1 (г, д, е), рассчитанные с помощью программы Autodock 4.2. Субстраты: а, г – (7Z,10Z,13Z) гексадекатриеновая, б, д – -линоленовая, в, е – (13Z,16Z)-докозадиеновая кислоты.

Сопоставление пространствен ных структур GmLOX1 и (8R) липоксигеназы коралла (рис. 4А) [Neau et al., 2009] выявило, что ами нокислотные остатки, образующие «U»-образный субстрат-связываю щий канал (8R)-липоксигеназы, в последовательности GmLOX1 рас полагаются сходным образом, одна ко имеется ряд существенных различий. В последовательности GmLOX1 в положении 539 находит ся лейцин вместо изолейцина в со ответствующем положении у липоксигеназы коралла, Ala560 – вместо Gly, Ala503 – вместо Leu, Рис. 4. Модели позиционирования субстрата Trp498 – вместо Leu в соответст в активном центре липоксигеназ. А – «U»- вующих положениях. В случае ко образная модель (8R)-ЛОГ коралла, Б – ZmLOX3, раллового фермента карбоксильная В – GmLOX1 при взаимодействии с субстратами группа субстрата фиксируется на C20, Г – GmLOX1 при взаимодействии с суб- Arg183. У GmLOX1 этой позиции стратами C20 и сложными липидами. Римскими соответствует Gly256. Аланин в по зиции 503 GmLOX1 вместо лейцина цифрами обозначены полости I, II, и III.

в соответствующем положении фер мента коралла дает увеличение объ ема субстрат-связывающей полости соевой липоксигеназы. В то же время, аминокислот ный остаток Trp498 перекрывает доступ к другой части U-образного канала (рис. 4Б-Г).

Таким образом, предложенная для (8R)-липоксигеназы коралла модель U-образного кана ла не соответствует структуре GmLOX1. Аналогичный вывод можно сделать для расчет ной модели ZmLOX3, поскольку в соответствующих сайтах также находятся остатки аланина и триптофана.

В случае ZmLOX3 объем доступный для субстрата несколько меньше в сравнении с объемом субстрат-связывающей полости GmLOX1. Боковые группы аминокислотных ос татков Ser272 и Ile273 ZmLOX3, соответствующих Gly256 и Thr257 у GmLOX1, перего раживают проход в полость I, ограниченную с другой стороны приподнятым по сравнению с GmLOX1 атомом железа (рис. 4Б). Боковая группа Phe571 (Ile551 у GmLOX1) не позволяет алифатической части субстрата проникнуть в полость II. Этот сайт обусловливает различия объема и положения субстрат-связывающей полости III у 9 ЛОГ и 13-ЛОГ. Сайт-направленный мутагенез соответствующего фенилаланина привел к изменению специфичности действия ЛОГ [Hornung et al., 1999]. Полость III частично пе рекрывается с полостью II. Боковые группы аминокислот дна полости III у ZmLOX смещены таким образом, что субстрат располагается ближе к атому железа. Меньший объем субстрат-связывающей полости ZmLOX3 накладывает ограничения на конформа цию субстрата при его позиционировании возле атома железа. ZmLOX3 имеет единст венный канал для проникновения субстрата через полость III, и для нее выявлен только один способ позиционирования субстратов, позволяющий специфично окислять жирные кислоты с длиной углеродной цепи 18 и 16 атомов.

Таким образом, 9- и 13-специфичность липоксигеназных реакций не определяется случайным позиционированием субстрата, зависящим от условий реакции, а детермини руется структурными особенностями соответствующих липоксигеназ.

Представленные результаты позволяют заключить, что 9-липоксигеназный путь не является второстепенным ответвлением липоксигеназного каскада, связанным с образо ванием побочных продуктов, а представляет собой самостоятельное направление адап тивной эволюции. Эволюционное закрепление 9-липоксигеназного пути у цветковых связанно с важной физиологической ролью образуемых оксилипинов для этих растений.

Узкий диапазон субстратной специфичности 9-липоксигеназ, а также результаты сайт направленного мутагенеза, приводящие к частичной конверсии (реверсии) специфично сти, свидетельствуют об их происхождении от 13-липоксигеназ.

На следующем этапе липоксигеназного каскада, вслед за липоксигеназами, катали тическую эстафету принимают цитохромы Р450 семейства CYP74. Изучению уникальных свойств некоторых из них были посвящены наши дальнейшие исследования.

2.4. Участие (7S)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты (ГДК) в липокси геназном каскаде. В липоксигеназном каскаде гидроперекиси линолевой или линоленовой кислот преобразуются ферментами семейства CYP74 суперсемейства цито хромов P450. Ранее было показано, что гексадеканоиды также являются нативными суб стратами 9- и 13-липоксигеназ [Чечеткин и др., 2009]. Исследование возможности дальнейшего превращения гидроперекисных производных гексадеканоидов в липоксиге назном каскаде представляет значительный интерес. В наших экспериментах мы инкуби ровали (7S)-гидроперекись гексадекатриеновой кислоты с очищенными рекомбинантными ферментами CYP74: алленоксидсинтазой ZmAOS1 кукурузы и диви нилэфирсинтазой NtDES табака. Субстрат эффективно превращался при участии ZmAOS1 в 7-гидрокси-8-оксо-(10Z,12Z)-гексадекатриеновую, при участии NtDES – ди нор-колнеленовую кислоты.

Таким образом, (7S)-гидроперекись ГДК может быть использована в качестве суб страта дивинилэфирсинтазами и алленоксидсинтазами. Эффективное и специфичное окисление ГДК при участии липоксигеназ in vitro и превращение образуемой гидропере киси в последующих реакциях, катализируемых ферментами CYP74, указывают на воз можность существования у растений наряду с октадеканоидным гексадеканоидного липоксигеназного каскада. Физиологическое значение данного каскада не выявлено.

2.5. Структурные особенности ферментов семейства CYP74. Все цитохромы Р имеют консервативные «субстрат-распознающие сайты» (СРС), например, I-спираль.

Входящий в ее состав «кислород-связывающий домен» участвует в катализе монооксиге назной реакции [Denisov et al., 2005] и имеет консервативную последовательность A/G-G X-D/E-T-T/S. Поскольку для функционирования ферментов CYP74 не требуется наличие молекулярного кислорода, аминокислотные остатки, участвующие в связывании и акти вации кислорода, в последовательности ферментов CYP74 отсутствуют. Проведенное со поставление первичных структур I-спиралей классической монооксигеназы цитохрома Р450 2с8 человека (Homo sapiens) и алленоксидсинтазы AtAOS Arabidopsis thaliana вы явило, что абсолютно консервативный и необходимый для катализа монооксигеназной реакции остаток треонина (Т) монооксигеназы Р450 2с8, входящий в состав «кислород связывающего домена», соответствует консервативному для всех ферментов CYP74 ос татку аспарагина (N) AtAOS:

Р450 2с AVSDLFGAGTE(T)TSTTLRYSLLLLLK AtAOS ATHNLLFATCF(N)TWGGMKILFPNMVK Согласно результатам сопоставления третичных структур каталитических центров AtAOS, расшифрованной в работе [Lee et al., 2008], и монооксигеназы Р450 2с8, расшиф рованной в работе [Schoch et al., 2003], в структуре ферментов CYP74 «кислород связывающему домену» соответствует последовательность, названная нами «централь ный домен I-спирали» (IHCD) (рис. 5). Мы предполагаем, что функция этого домена за ключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата и непосредственном участии в катализе ферментов.

Рис. 5. Результат сопоставле ния третичных структур ка талитических центров монооксигеназы Р450 2с8 и AtAOS, проведенного с по мощью программы VMD 1.8.6. Красным цветом отме чены гемы обоих ферментов, желтым – I-спираль Р450 2с8, синим – I-спираль AtAOS.

Желтыми цилиндрами выде лены -спирали Р450 2с8, зе леными – -спирали AtAOS.

2.6. Биохимическая характеристика рекомбинантной алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum). В качестве модельного объекта исследования каталитических свойств 9-гидропероксид-специфичных цитохромов CYP использовали рекомбинантную алленоксидсинтазу LeAOS3 томата. Для ее наработки был использован бактериальный продуцент на основе штамма E. coli BL21(DE3)pLysS. Очи стка фермента методом металлоаффинной хроматографии позволила получить активный препарат LeAOS3 не менее 90 % чистоты.

Все алленоксидсинтазы (подсемейств CYP74A и CYP74C) катализируют синтез ко роткоживущих окисей аллена. Образуемые при участии АОС подсемейства CYP74A оки си аллена на следующем этапе циклизуются с образованием циклопентенонов, либо спонтанно гидролизуются с образованием - или -кетолов. Циклизация протекает спон танно, либо при участии алленоксидциклаз (АОЦ), и зависит от наличия двойной связи в,-положении по отношению к оксирану. Окиси аллена, продуцируемые из линолевой кислоты, спонтанно гидролизуются, но не циклизуются [Grechkin et al., 2000]. В отличие от этого, среди продуктов инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 (CYP74C3) наряду с (12Z)-9 гидрокси-10-оксо-12-октадеценовой кислотой (-кетолом) присутствует циклопентенон – 10-оксо-11-фитоеновая кислота (10-ОФЕК) (рис. 6) [Hamberg, 2000]. Это явление до на стоящего времени не получило объяснения.

Для биохимической характеристики LeAOS3 продукты инкубации 9- и 13 гидроперекисей жирных кислот с LeAOS3 анализировали с помощью ГХ-МС в виде ме тиловых эфиров триметилсилил-производных (Ме/ТМС) (рис. 7). Для выявления зависи мости профиля продуктов реакции от концентрации LeAOS3 9-ГПОД (100 мкг) инкубировали с различными количествами LeAOS3 при 0 оС в течение 10 секунд. По скольку ожидаемым первичным продуктом каталитического действия LeAOS3 является нестабильная окись аллена (12Z)-9,10-эпоксиоктадека-10,12-диеновая кислота (9,10-ЭОД), продукты инкубации после быстрой экстракции подвергали метанолизу. Эта стадия по зволяла регистрировать наличие окиси аллена, эффективно превращая 9,10-ЭОД в раце мический метоксикетон [Hamberg, Hughes, 1989].

В результате инкубации субстрата с 0,5 мкг LeAOS3 (рис. 7А) основным улавливае мым продуктом был метоксикетон 3а (рис. 6), соответствующий окиси аллена 9,10-ЭОД I.

Среди продуктов реакции присутствовал -кетол 4а – продукт гидролиза 9,10-ЭОД. Иден тификацию соединения 3а и -кетола 4 (Ме/ТМС) подтвердили данные масс-спектров (рис. 8). Кроме того, наблюдалось появление двух дополнительных продуктов, 1а и 2а (в виде метиловых эфиров 1 и 2). Соединения 1 и 2 идентифицировали как циклопентеноны – транс- и цис-10-оксо-11-фитоеновая кислоты (10-ОФЕК).

При увеличении концентрациями LeAOS3 (2, 5 или 40 мкг/мл) профили продуктов менялись (рис. 7). Регистрируемое количество метоксикетона постепенно снижалось;

уменьшение пика сопровождалось увеличением пиков 1 и 2, а также пика -кетола. При этом скорость преобразования 9,10-ЭОД в присутствии LeAOS3 была значительно выше, чем ожидаемая скорость спонтанного превращения окиси аллена (время полужизни секунд [Hamberg, 2000]). На основании масс-спектров соединения 1 и 2 идентифицирова ли как транс- и цис-изомеры 10-ОФЕК. Присутствие циклопентенона в качестве продук та реакции подтвердили данные ЯМР-спектроскопии. 1Н-ЯМР-спектр был идентичен таковому для цис-10-ОФЕК [Hamberg, 2000]. Цис-циклопентенон (2) являлся первичным продуктом циклизации окиси аллена и основным изомером. Ранее отмечалось, что цик лопентенон с цис-конфигурацией боковых цепей является ожидаемым продуктом антара поверхностной циклизации окиси аллена в соответствии с правилами сохранения орбитальной симметрии [Grechkin, 1994].

Рис. 6. Химические структуры соединений, полученных в качестве продуктов ин кубаций гидроперекисей жирных кислот с рекомбинантной LeAOS3. Номера соединений по тексту выделены полужирным шрифтом.

Рис. 8. Электронные масс-спектры Рис. 7. Хроматограмма продуктов продуктов инкубации 9-ГПОД с разными инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 в концен концентрациями LeAOS3:

трациях: A – 0,5, Б –5, B – 40 мкг/мл. 1 и А – метиловый эфир рацемического цис 2 – транс- и цис-изомеры 10-оксо-11 циклопентенона;

фитоеновой кислоты, 3 – метоксикетон.

Б – продукт метанолиза окиси аллена в Селективные ионные токи соответству виде метилового эфира 3;

ют: 152 –метиловому эфиру циклопенте В – -кетол 4а в виде метилового эфира нона, 201 – продукту метанолиза окиси ТМС-производного (4).

аллена, 259 – -кетолу 4а в виде метило вого эфира ТМС-производного (4).

2.6. Анализ энантиомерного состава продуктов инкубации 9-ГПОД с рекомби нантной LeAOS3. Очистку соединения 2 проводили с помощью ВЭЖХ на нормальной фазе, после чего его нанесли на колонку Chiralcel OD-H и выяснили, что энантиомеры со единения 2 не разделяются на этой колонке. Повторный анализ проводили после щелоч ной изомеризации цис-циклопентенона 2 в соответствующий транс-изомер 1. Результаты анализа указывают на то, что исследуемый продукт является рацемическим и состоит из равных частей (9R,13R)- и (9S,13S)-энантиомеров.

Стерический анализ -кетола, полученного в результате инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 (4а), выявил преимущественно (9R)-энантиомер (92%). В то же время, -кетол, образуемый при участии ZmAOS1, представлял собой смесь (9R)- и (9S)-энантиомеров.

Избирательное образование (9R)--кетола при участии LeAOS3 означает, что окись алле на гидролизуется по SN2 механизму. При спонтанном гидролизе значительный вклад вно сит SN1 механизм, в результате чего образуется рацемический -кетол, как в случае реак ции, катализируемой ZmAOS1. Таким образом, гидролиз окиси аллена в присутствии LeAOS3 не является спонтанным.

2.7. Механизм реакции, катализируемой рекомбинантной LeAOS3. Результаты наших экспериментов согласуются с данными, указывающими на то, что короткоживу щая окись аллена является первичным продуктом LeAOS3 [Itoh et al., 2002]. Это означает, что синтез окиси аллена является общей функцией алленоксидсинтаз подсемейств CYP74А и CYP74С. Однако характер дальнейших превращений окиси аллена при уча стии LeAOS3 отличается от такового при участии ферментов CYP74А. Время полужизни окиси аллена зависит от концентрации LeAOS3, тогда как в реакциях, катализируемых АОС подсемейства CYP74A, время полужизни окисей аллена постоянно (27-44 с) [Tijet, Brash, 2002]. Когда концентрация LeAOS3 достигает насыщения, происходит полное пре вращение 9-ГПОД через 9,10-ЭОД в 10-ОФЕК и -кетол за 20 секунд. Кроме того, в ре акции стереоспецифично образуется (9R)-изомер -кетола.

Таким образом, LeAOS3 является мультифункциональным ферментом, который ка тализирует три превращения (рис. 9). Продуктом первой реакции является короткоживу щее промежуточное соединение окись аллена – 9,10-ЭОД (рис. 9, реакция 1), – синтезируемая и высвобождаемая из ка талитического центра LeAOS3. Затем LeAOS3 вновь захватывает 9,10-ЭОД для катализа двух последующих конкури рующих превращений, а именно гидро лиза и циклизации (рис. 9, реакции 2 и 3, соответственно). Гидролиз, но не цикли зация, протекает стереоспецифично.

Окончательными продуктами LeAOS являются (9R)--кетол 4а и рацемическая цис-10-оксо-11-фитоеновая кислота 2а.

Полученные результаты позволяют Рис. 9. Предполагаемая схема меха дополнить существующую схему мета низма реакции с участием LeAOS3.

болизма оксилипинов (рис. 10).

R=(CH2)7CO2Me;

R’=(CH2)4Me.

Результаты работы свидетельствуют о том, что, LeAOS3 и аналогичные 9-АОС подсемейства CYP74C контролируют новый метаболический путь от линолевой кислоты до циклопентенонов. Физиологическое зна чение данного пути еще предстоит выяснить.

Циклопентеноны – производные 9-гидроперекисей линолевой и -линоленовой ки слот – обнаружены в корнях имбиря, ландыша и подсолнечника [Grechkin et al., 2007].

Тканеспецифичное образование этих соединений указывает на их участие в сигнальных цепях, альтернативных образованию жасмоновой кислоты в 13-ЛОГ/АОС пути.

Рис. 10. Схема превращения линолевой и -линоленовой кислот. Выделены реакции гидролиза и циклизации окисей аллена с образованием (9R)--кетола и цис циклопентенонов при участии LeAOS3.

2.8. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца (Linum usitatis simum L.). Лен был первым растением, в котором удалось выявить и охарактеризовать цитохром Р450 семейства CYP74 – алленоксидсинтазу LuAOS [Song et al., 1993]. Долгое время считалось, что LuAOS является единственным представителем данного семейства у льна, и его активность необходима только в семенах. Обнаружение в листьях льна диви нилового эфира – (5Z)-этероленовой кислоты и новых соединений – линолипинов [Che chetkin et al., 2008] – поставило вопрос о ферментативных основах их метаболизма.

Однако соотнесение предполагаемой ферментативной активности с каким-либо фермен том у малоизученных организмов представляет собой крайне сложную задачу. Одно из ее решений может быть связано с поиском и идентификацией соответствующих мРНК. По иск мРНК предполагаемой дивинилэфирсинтазы льна провели благодаря наличию в пер вичной структуре цитохромов CYP74 консервативных участков, что позволяет с некоторой вероятностью предсказать варианты последовательностей генов, кодирующих данные области.

Для выявления молекул кДНК, полученных в результате обратной транскрипции це левых мРНК, использовали различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Ключевым моментом исследования являлся выбор участков кодирующих последователь ностей генов ферментов CYP74, которые отличались бы от последовательностей генов других цитохромов Р450, но, вместе с тем, были достаточно консервативными для генов семейства CYP74. В дальнейшем эти последовательности использовали при конструиро вании вырожденных праймеров для амплификации фрагментов целевых генов в ПЦР. Для выбора праймируемых участков проводили сравнительный анализ аминокислотных по следовательностей известных ферментов CYP74 разных видов растений. В зависимости от степени сходства аминокислотных последовательностей все ферменты разделили на три группы. В каждой группе выделяли и сравнивали каталитически важные домены, из которых наиболее консервативными оказались B-спираль и ERR-триада. По их амино кислотным последовательностям с учетом частоты встречаемости кодонов у высших рас тений определили наиболее вероятные кодирующие нуклеотидные последовательности, на основе которых сконструировали три пары олигонуклеотидных праймеров.

Ферменты разделили на группы. В первую группу (ДЭС) включили охарактеризо ванные к настоящему времени дивинилэфирсинтазы растений семейства пасленовых (Solanaceae). Праймеры LDF и LDR оказались строго комплементарны выбранным участ кам генов данной группы. Вторую группу (ГПЛ) составили гидропероксидлиазы, которые обладали наибольшим сходством первичной структуры и субстратной специфичности с известными дивинилэфирсинтазами. На основе последовательностей кодирующих их ге нов сконструировали вырожденные праймеры LHF и LHR. Третья группа (АОС) включа ла алленоксидсинтазу льна (Linum usitatissimum, GenBank ID: U00428.1) и гидропероксидлиазу тополя (Populus trichocarpa, GenBank ID: EF145878), который среди растений с расшифрованным геномом оказался таксономически наиболее близким видом для льна. На основе нуклеотидных последовательностей генов третьей группы сконст руировали праймеры LAF и LAR. Сконструированные праймеры использовали для выяв ления последовательностей, гомологичных генам семейства CYP74, в библиотеке кДНК.

Содержание галактолипидов, включающих этерифицированные дивиниловые эфи ры, увеличивается после инфицирования растений льна-долгунца клетками фитопатоген ных бактерий Pectobacterium atrosepticum [Chechetkin et al., 2009]. Исходя из этого, тотальную РНК выделяли из листьев 35-дневных растений через сутки после инокулиро вания их суспензией клеток возбудителя мягких гнилей Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 (Erwinia carotovora ssp. atroseptica). На основе выделенной РНК получали биб лиотеку двуцепочечной кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Смесь кДНК использовали в качестве источника матрицы для гнездовой ПЦР с тремя парами прайме ров. Полученные фрагменты клонировали с помощью бактериального вектора pGem-T Easy (Promega, США), после чего определили их нуклеотидную последовательность. По следовательности фрагментов LHF-LHR имели высокую степень сходства с генами фер ментов подсемейства CYP74B многих видов растений.

Следующим этапом определения структуры новых генов подсемейства CYP74B льна стала амплификация последовательностей 5- и 3-концевых участков их кДНК мето дом RACE. Амплифицированные концевые участки клонировали;

их последовательности определили. Поскольку клонированные нами 5- и 3-фрагменты могли соответствовать генам разных изоформ, проводили дополнительный раунд амплификации полноразмер ных кДНК, соответствующих транскриптам генов подсемейства CYP74B льна. Для этого использовали праймеры, комплементарные 5- и 3-концевым участкам. Полученные ам пликоны также клонировали с помощью вектора pGem-T Easy и секвенировали.

Дальнейшая работа была сосредоточена на изучении гена и белка изоформы 1 фер мента подсемейства CYP74В льна. Открытая рамка считывания (ОРС) данного гена со держит 1419 нуклеотидов и соответствует полипептиду размером 473 аминокислотных остатка. Последовательность гена зарегистрирована в базе данных GenBank NCBI под идентификационным номером HQ286277.1 (GI:310687282). Предполагаемому белку было присвоено название CYP74B16 [Nelson, личное сообщение].

Проведенное нами сопоставление аминокислотной последовательности изоформы с описанными ферментами CYP74 с помощью программы BLAST также показало, что новый фермент CYP74B16 льна относится к подсемейству CYP74B и проявляет высокую степень сходства первичной структуры с 13-ГПЛ. Однако его последовательность имеет несколько уникальных аминокислотных замен, затрагивающих каталитически важные домены и, в первую очередь, центральный домен I-спирали (IHCD) (рис. 11). Как у всех ферментов CYP74B, в начале домена IHCD в положении 286 фермента CYP74B16 нахо дится лейцин (рис. 11, положение 1). В следующем положении у CYP74B16 находится остаток аланина, тогда как у всех известных ферментов CYP74B в этом месте располага ется остаток глицина (рис. 11, положение 2). Из всех ферментов CYP74 в этом участке ос таток аланина находится только у дивинилэфирсинтазы чеснока AsDES [Stumpe et al., 2008]. Непосредственно после домена IHCD в последовательности CYP74B16 находится остаток глутаминовой кислоты. У всех членов подсемейства CYP74B, также как у боль шинства ферментов CYP74, в этом положении находится консервативный остаток глици на. Исключение составляют ДЭС пасленовых растений, у которых в этом положении остаток глицина также замещен остатком другой аминокислоты (рис. 11). В связи с этими структурными особенностями, была проведена биохимическая характеристика рекомби нантного фермента CYP74B16.

Рис. 11. Результаты множе ственного выравнивания по следовательностей I-спирали ферментов CYP74 (домен IHCD обозначен 1-6).

2.9. Характеристика рекомбинантного фермента CYP74B16 льна. Для получения рекомбинантного белка CYP74B16 ОРС соответствующего гена поместили в экспресси рующий вектор рЕТ-32 Ek/LIC (Novagen,США) методом безлигазного клонирования. На работку и очистку рекомбинантного фермента проводили с использованием штамма E.

coli Tuner(DE3)pLysS по методике, разработанной ранее для LeAOS3.

Очищенный препарат CYP74B16 обладал ферментативной активностью в отноше нии гидроперекисей жирных кислот в широком диапазоне рН, с максимумом при значе ниях рН от 7.5 до 8.0. Снижение оптического поглощения реакционной смеси при длине волны 234 нм сопровождалось возрастанием поглощения в области 267 нм, что характер но для дивиниловых эфиров.

Для определения константы Михаэлиса и константы каталитической были измерены начальные скорости реакций с разными субстратами в концентрациях от минимальной до насыщающей. Из полученных данных сделали вывод, что сродство рекомбинантного фермента CYP74B16 к (13S)-ГПОТ значительно выше, чем к (13S)-ГПОД, (9S)-ГПОД (табл. 3) и (9S)-ГПОТ (данные не представлены). В то же время, максимальную каталити ческую активность рекомбинантный фермент CYP74B16 проявлял по отношению к (13S) ГПОД. Соотношение kcat/Km свидетельствует, что 13-гидроперекиси -линоленовой и ли нолевой кислот являются предпочтительными субстратами (табл. 3). Такие субстратные предпочтения характерны для большинства ГПЛ подсемейства CYP74B.

Табл. 3. Константы каталитические и константы Михаэлиса рекомбинантного фер мента CYP74B16, рассчитанные для каждого субстрата с помощью пакета программ SigmaPlot 11 software (Systat Software Inc., USA).

Ми- kcat/Km Субстрат Константа ката- Константа Субстратная 1 kcat хаэлиса, Km (сек мкмоль ) специфичность, литическая, (сек ) (мкмоль) % 13(S)-ГПОТ 545,8±12,9 28,0±1,9 19,5 13(S)-ГПОД 956,4±31,7 132,5±5,8 7,22 9(S)-ГПОД 33,7±1,1 122,4±8,6 0,28 1, Анализ выявил наличие одного преобладающего продукта, в спектре которого име ется молекулярный ион [M]+ при m/z 306 (рис. 12А). Его масс-спектр (рис. 12Б) идентичен спектру, описанному ранее для метилового эфира (5Z)-этероленовой кислоты [Hamberg, 1998;

Chechetkin et al., 2008] и этероленовой кислоты [Grechkin et al., 1995]. Время удер живания основного продукта соответствует таковому для (5Z)-этероленовой кислоты.

Анализ продуктов реакции в виде Me/ТМС после восстановления боргидридом натрия и каталитического гидрирования выявил полностью гидрированный дивиниловый эфир – 13-оксанонадекановую кислоту (рис. 12В) – и продукт фрагментации цепи – 12-гидрокси додеканоевую кислоту (Me/ТМС).

Основное соединение очищали с помощью ВЭЖХ на обратной и нормальной фазах и исследовали методом ЯМР-спектрометрии. 1H-ЯМР спектр оказался идентичен спектру (5Z)-этероленовой кислоты, полученному ранее [Chechetkin et al., 2008]. Значения констант спин-спинового взаимодействия J11,12 = 12,0 Гц и J1’,2’ = 6,2 Гц свидетельствуют о транс- и цис-конфигурации двойных связей.

Полученные данные позволили идентифицировать основной продукт преобразования (13S)-ГПОТ как (5Z) этероленовую кислоту, а фермент CYP74B16 – как дивинилэфирсинтазу.

В соответствии с принятой номенклату рой ферментов CYP74, новому фермен ту присвоили тривиальное название LuDES (дивинилэфирсинтаза L. usitatis simum L), также как и соответствующе му гену – LuDES [Gogolev et al., 2012].

Как указывалось выше, структура LuDES имеет высокую степень сходства со структурами других членов подсе мейства CYP74B. Кроме того, ген LuDES, также как и гены ГПЛ подсе мейства CYP74B, экспрессируется в ли стьях;

фермент утилизирует в качестве Рис. 12. Результат анализа продуктов ин- субстрата преимущественно (13S) фермента ГПОТ. Превращение (13S)-ГПОТ при кубации рекомбинантного - водит к образованию дивинилового CYP74B16 с 13-гидроперекисью линоленовой кислоты методом ГХ-МС: (А) эфира, тогда как продуктами превраще инкубации ния (13S)-ГПОД являются сопостави хроматограмма продуктов (Me/ТМС) по полному ионному току (TIC), (Б) мые количества дивинилового эфира и электронный масс-спектр метилового эфира (9Z)-12-оксо-9-додеценовой кислоты.

основного продукта, (В) электронный масс- Продукты фрагментации, вероятно, об спектр метилового эфира основного продукта разуются благодаря дополнительной гидропероксидлиазной активности, после каталитического гидрирования.

проявляемой LuDES по отношению к (13S)-ГПОД. В листьях льна преобладающей жирной кислотой является -линоленовая.

По всей вероятности, превращение (13S)-ГПОТ в (5Z)-этероленовую кислоту является основной функцией LuDES.

Еще одной особенностью LuDES является геометрическая специфичность образуе мого дивинилового эфира – (5Z)-этероленовой кислоты. Эта особенность объединяет LuDES с дивинилэфирсинтазами растений рода лютик (Ranunculus), которые также лока лизованы в листьях и предпочтительно утилизируют (13S)-ГПОТ [Hamberg, 1998;

2002;

2004;

2005]. Синтез (5Z)-этероленовой кислоты и других подобных дивиниловых эфи ров происходит у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993].

Дивинилэфирсинтазы бурых водорослей и растений рода и лютик, как и кодирующие их гены, до сих пор не изучены;

систематическое положение ферментов не определено.

Полученные результаты указывают на то, что LuDES является уникальным фермен том, представляющим особый интерес для изучения механизма катализа и филогении как представителей семейства CYP74, так и цитохромов Р450 в целом. По сходству первич ной структуры белок относится к подсемейству CYP74B. Однако в то время как все из вестные цитохромы подсемейства CYP74В являются гидропероксидлиазами, LuDES проявляет дивинилэфирсинтазную активность. Обнаружение данного фермента открыва ет новые возможности для выявления особенностей структуры активного центра цито хромов CYP74, определяющих тип катализа. Кроме того, полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярной эволюции семейства CYP74.

2.10. Выявление значения доменов IHCD и ERR для формирования типа ката лиза ферментов CYP74. Практически все цитохромы суперсемейства Р450 являются мо нооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства CYP74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно – молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидроперокси-группы окислен ной жирной кислоты. В связи с этим, домен IHCD ферментов CYP74 отличается от соот ветствующего ему «кислород-связывающего домена» монооксигеназ отсутствием аминокислотных остатков, участвующих в связывании и активации кислорода и переносе электронов. С противоположной стороны к гему примыкает другой консервативный для всех цитохромов Р450 домен, названный ERR-триада. Исходя из сопоставления первич ных и третичных структур представителей разных семейств цитохромов Р450, мы пред положили, что функция некоторых аминокислотных остатков, входящих в состав этих доменов, заключается в непосредственном участии в каталитическом действии ферментов CYP74. Для проверки результатов анализа мы провели замены аминокислотных остатков, входящих в состав домена IHCD и ERR-триады алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата, гидропероксидлиазы MtHPL (CYP74C3) люцерны и дивинилэфирсинтазы LuDES (CYP74B16) льна, получили и проанализировали следующие мутантные формы: LeAOS F295I, S297A, K302S, D359R и T366Y, MtHPL F284I и N285T и LuDES E292G. Кроме то го, три мутантные формы MtHPL F287V, N285A и G288I были любезно предоставлены доктором Р. Хьюзом из Великобритании.

Выбор сайтов для замен в последовательностях АОС, ГПЛ и ДЭС основан на сопос тавлении последовательностей изученных ферментов CYP74 и наличии в каталитически важных доменах несинонимических аминокислотных остатков, консервативных для фер ментов с разным типом катализа. Например, фермент LuDES является единственной ди винилэфирсинтазой, проявляющей сходство первичной структуры с 13 гидропероксидлиазами. Эта особенность предоставляет возможность выявления минор ных различий в аминокислотных последовательностях, определяющих разницу в катали тических свойствах, что представляет интерес для энзимологии. В последовательностях всех алленоксидсинтаз и гидропероксидлиаз после домена IHCD находится два остатка глицина подряд;

у всех исследованных к настоящему времени дивинилэфирсинтаз пер вый остаток глицина заменен на остаток аланина (ДЭС пасленовых) или лейцина (ДЭС чеснока). В данном сайте LuDES содержит остаток глутаминовой кислоты. В клониро ванном гене LuDES провели мутацию, обеспечивающую замену остатка глутаминовой кислоты в положении 292 на остаток глицина. С некоторой вероятностью можно было ожидать приобретение новым ферментом гидропероксидлиазной активности.

2.11. Анализ продуктов реакций, катализируемых ферментами дикого типа и их мутантными формами. В результате инкубации LeAOS3 дикого типа с 9-ГПОД основ ным регистрируемым продуктом был -кетол – (12Z)-9-гидрокси-10-оксо-12 октадеценовая кислота 4а в виде Ме/ТМС 4 (рис. 13A). Этот продукт образуется в резуль тате гидролиза окиси аллена. В ничтожно малых количествах регистрировали также гид ропероксидлиазный продукт – 9-оксононановая кислота 11а в виде метилового эфира (рис. 13A). Дивиниловые эфиры обнаружены не были.

Все полученные нами мутантные формы LeAOS3 сохранили способность утилизи ровать 9-гидроперекись линолевой кислоты. Мутантные формы F295I (рис. 13Б), S297A (рис. 13В), K302S (рис. 13Г) и T366Y (рис. 13Д) проявляли 13, 52, 36 и 72 %, соответст венно, тотальной активности LeAOS3 дикого типа. Анализ продуктов превращений суб страта при участии этих мутантных форм, продемонстрировал кардинальные изменения в типе катализа. Все четыре мутанта проявляли активность гидропероксидлиазы (изомера зы), продуцируя значительно большее количество 9-оксононановой кислоты 11а, чем фермент дикого типа. В то же время алленоксидсинтазная (дегидразная) активность му тантных форм LeAOS3 была сильно снижена (S297A, K302S и T366Y) или отсутствовала (F295I). С другой стороны, замена аспарагиновой кислоты на аргинин в ERR-триаде (D359R) не привела к изменениям в характере катализа (данные не представлены).

В качестве субстрата для MtHPL дикого типа и ее мутантных форм использовали 13 ГПОТ. Продукты анализировали в виде Ме/ТМС после восстановления NaBH4 и гидри рования над PtO2. Все мутантные формы сохранили способность утилизировать 13-ГПОТ.

Однако помимо основного продукта реакции 12-оксо-(9Z)-додеценовой кислоты (12 ОДДК, Ме/ТМС), характерной для MtHPL дикого типа, выявлялись дополнительные про дукты, а именно – (9Z,11E)-13-оксотридекадиеновая (13-ОТДК) и (9Z)-11 оксоундеценовая (11-ОУДК) кислоты (Ме/ТМС). Относительное количество этих про дуктов в некоторых случаях превышало количество специфического продукта (рис. 14).

Появление 13-оксотридекадиеновой и 11-оксоундеценовой кислот свидетельствует о нарушениях в ферментативном катализе. Эти соединения являются результатом спонтан ного - или -разрезания. В обоих вариантах происходит задержка катализа после пере группировки эпоксиаллильного радикала. В случае образования 13-ОТДК происходит разрыв С13-С14 связи. В случае образования 11-ОУДК, как мы предполагаем, происходит окисление эпоксиаллильного радикала с последующим разрывом С11-С12 связи.

Рис. 13. Хроматограмма продук- Рис. 14. Хроматограмма продуктов ин тов инкубации 9-ГПОД с LeAOS3 (A) кубации 13-ГПОТ с MtHPL дикого типа (А) и ее мутантных форм: F295I (Б), S297A и ее мутантными формами: F284I (Б), G288I (В), K302S (Г), T366Y (Д). (В), N285A (Г), N285T (Д) и F287V (Е).

Полученные данные демонстрируют возможность конверсии ферментов CYP74 в результате точечных мутаций. Четыре мутации LeAOS3 – F295I, K302S, T366Y и S297A превратили АОС в ГПЛ. Это свидетельствует об определяющей роли данных аминокис лотных остатков в специфичной функции фермента. Гидропероксидлиазная активность обнаруживается у мутантов LeAOS3 F295I и D359R, не смотря на то, что у этих форм можно было ожидать появления дивинилэфирсинтазной активности. С другой стороны, ни одна мутация MtHPL не привела к приобретению нового типа катализа. Таким обра зом, можно предположить, что гидропероксидлиазная реакция является базовой по меха низму, а алленоксидсинтазная и дивинилэфирсинтазная реакции формируются в процессе ее видоизменения под влиянием боковых групп ключевых аминокислот.

Для проверки выдвинутого пред положения мы получили мутантную форму LuDES E292G и проанализиро вали ее свойства. Модифицированный фермент сохранил способность утили зировать (13S)-ГПОТ. В то же время, анализ продуктов превращения гидро перекиси продемонстрировал карди нальные изменения в типе катализа (рис. 15Б). Основным продуктом реак ции, катализируемой LuDES E292G, было соединение, идентифицированное как -кетол. В качестве контроля (13S) ГПОТ инкубировали с рекомбинантной алленоксидсинтазой ZmAOS1 (CYP A19) кукурузы (Zea mays) (рис. 15В).

Сравнение продуктов подтвердило правильность идентификации. Масс спектр минорного продукта превраще Рис. 15. Хроматограммы продуктов инку- ния (13S)-ГПОТ модифицированным бации (13S)-ГПОТ с LuDES дикого типа (A), ферментом соответствует цис-12-оксо мутантной формой LuDES E292G (Б) и 10,15-фитодиеновой кислоте. Дивини лэфирсинтазный продукт LuDES – ZmAOS1 (В).

(5Z)-этероленовая кислота – обнару жен не был (рис. 15Б). Таким образом, в результате мутации E292G LuDES полностью утратила активность дивинилэфирсинтазы и приобрела активность алленоксидсинтазы.

При выборе сайта модификации LuDES отсутствие глицина в позиции 292 представ лялось наиболее существенной особенностью, отличающей LuDES (CYP74B) от гидропе роксидлиаз подсемейства CYP74B. Результат мутации – превращение ДЭС в АОС, а не ГПЛ – может представляться неожиданным. Вместе с тем, результат подтверждает клю чевое значение сайта в каталитическом действии ферментов CYP74. В целом, структуры домена IHCD и ERR-триады во многом определяют тип катализа ферментов CYP74. По следовательности этих доменов можно использовать в качестве «отпечатков пальцев» ферментов CYP74, предсказывая, как правило, тип катализа по первичной структуре.

Результаты работы показывают, что все ферменты CYP74 обладают сходными меха низмами катализа. Ранее гидропероксидлиазы были идентифицированы как изомеразы, катализирующие гомолитическую перегруппировку с промежуточными продуктами – ал коксирадикалом и эпоксиаллильным радикалом [Grechkin et al., 2006]. Результаты сайт направленного мутагенеза указывают на то, что эпоксиаллильный радикал является клю чевой точкой катализа всех ферментов CYP74 (рис. 16).

Рис. 16. Общая схема реакций, катализируемых ферментами CYP74 и их мутантными формами. Выделены стадии реакций, в которых происходит переключение типа катализа в результате единичных аминокислотных замен. LeAOS3 и ее мутантные формы инкубиро вали с (9S)-ГПОД;

R1 = -(CH2)6COOH, R2 = -(CH2)4CH3. LuDES и MtHPL и их мутантные формы инкубировали с (13S)-ГПОТ;

R1 = -CH=CHCH2CH3, R2 = -(CH2)7COOH.

Алленоксидсинтазы, как и дивинилэфирсинтазы, являются гидропероксид дегидратазами. Несмотря на это, механизм каталитического действия ДЭС имеет больше общего с механизмом каталитического действия ГПЛ, которые являются изомеразами.

Первой стадией катализа у всех ферментов CYP74 является гомолиз гидроперокси группы (рис. 16) с образованием эпоксиаллильного радикала и соединения II (FeIV–OH комплекс). В зависимости от структуры домена IHCD и ERR-триады эпоксиаллильный радикал претерпевает различные превращения. Второй стадией у АОС является отщепле ние атома водорода с образованием экзо-двойной связи при оксиране, что приводит к об разованию окиси аллена. У гидропероксидлиаз и дивинилэфирсинтаз вторая стадия иная – гомолиз углерод-углеродной связи в оксиране с образованием винилоксикарбинильного радикала. Заключительным этапом катализа ДЭС является отщепление атома водорода от радикала с образованием второй двойной связи дивинилового эфира. Заключительным этапом катализа ГПЛ является рекомбинация винилоксикарбинильного радикала с гидро ксильным радикалом с образованием полуацеталя.

Насколько нам известно, до нашей работы [Toporkova et al., 2008] и независимо вы полненной работы группы проф. Рамана [Lee et al., 2008], в литературе не было примеров направленного изменения первичной структуры ферментов, приводивших к превраще нию фермента с одним типом катализа в фермент с другим типом в результате единичной замены аминокислотного остатка.

Экспериментальные данные согласуются с результатами компьютерного анализа структуры цитохромов CYP74, выявившими домены и аминокислотные остатки, опреде ляющие тип катализа CYP74, в частности, домен IHCD. Полученные результаты вносят вклад в представление об эволюции ферментов CYP74 и цитохромов Р450 в целом.

2.19. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада. Непротиворечивая модель молекулярной эволюции ферментов липоксигеназно го каскада до сих пор не построена. Долгое время липоксигеназный каскад считался эво люционным приобретением высших растений. Последние данные о присутствии цитохромов семейства CYP74 и оксилипинов у прокариот, водорослей и животных за ставляют разрабатывать альтернативные гипотезы. На рис. 17 представлено филогенети ческое дерево липоксигеназ, построенное с помощью алгоритма «присоединения ближайших соседей» [Saitou, Nei, 1987]. Для построения было отобрано 438 последова тельностей липоксигеназ организмов разного таксономического положения.

Молекулярно-филогенетический анализ аминокислотных последовательностей ли поксигеназ позволил выявить относительную взаимосвязь между первичной структурой и функциональными характеристиками ферментов, в частности субстратной и каталитиче ской специфичностью. Так, липоксигеназы млекопитающих разделяются на 5 групп. В группу A входят липоксигеназы, проявляющие 12R-специфичность действия. Группа B объединяет в себе эпителиальные липоксигеназы с дуалистичной 12/15-активностью.

Ферменты, имеющие 15S-специфичность действия (n+2 тип катализа), включены в группу C. Липоксигеназы, обладающие 12-специфичной активностью, составляют большую часть группы Е. Обособленная группа F включает исключительно 5-липоксигеназы (n- тип катализа). Липоксигеназы высших растений разделились на четыре группы. Две из них принадлежат, споровым и голосеменным. Группа J представляет ферменты мхов (Physcomitrella patens) и печеночников (Marchantiа polymorpha), у которых обнаружены 15- и 13-специфичные ЛОГ. Единственный охарактеризованный 13-специфичный фер мент плауновидных (Selaginella moellendorffii, сектор L) имеет менее 45 % идентичности с известными последовательностями ЛОГ. В секторе К находятся ферменты однодольных и двудольных, проявляющие 13-специфичную активность. Хотя 9-липоксигеназы состав ляют монофилетическую группу, значимых различий первичной структуры этих фермен тов с последовательностями 13-ЛОГ выявить не удается (сектор М).

Рис. 17. Филогенетическое дерево липоксигеназ. Группа H включает ферменты Po lysphondylium pallidum и Cyanothece sp.;

J – Physcomitrella patens и Marchantiа polymorpha;



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.