авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения

-- [ Страница 2 ] --

Были получены растения поколения F1 и некоторые из них проанализированы на наличие HBs-антигена. Максимальное количество HBs антигена в разных линиях трансгенных растений табака поколения F1 в условиях in vitro достигало 0.05% от общего растворимого белка листьев.

Получение и анализ растений картофеля Solanum tuberosum L., содержащих ген HBsAg под контролем промоторов CaMV 35SS и гена пататина B33. Получены две группы растений с геном HBsAg под контролем конститутивного двойного промотора CaMV 35SS и тканеспецифического промотора гена пататина клубней картофеля В33 (Rocha-Sosa et al., 1989). Пататин является одним из главных запасных белков клубней картофеля. Ген HBsAg, экспрессируемый под контролем промотора пататина, должен проявлять в трансгенных растениях картофеля тканеспецифическую экспрессию и синтезироваться преимущественно в клубнях. Ген HBsAg был встроен в плазмиду для трансформации растений pBin-B33 (Rocha-Sosa et al., 1989). Структура плазмид pSS-HBsAg и pB33-HBsAg, сконструированных нами для трансформации растений картофеля, представлена на рис. 26. Для получения трансгенных растений были использованы штаммы A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) с плазмидой pSS-HBsAg и LBA4404 (pAL4404) с плазмидой pB33-HBsAg.

Наличие гена HBsAg и маркерного гена nptII в геноме трансгенных растений было детектировано методом ПЦР. Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Для этого выделяли тотальную РНК из листьев и микроклубней картофеля и гибридизовали ее с меченным 32Р геном HBsAg в качестве зонда. Присутствие транскриптов этого гена установлено в клетках всех линий исследованных трансгенных растений картофеля.

Количество антигена в листьях или клубнях различных линий двух групп трансгенных растений картофеля, растущих в условиях in vitro и in vivo, составило 0.005-0.035% от общего растворимого белка. Содержание HBs-антигена в клубнях картофеля достигало 1.5 мкг/г массы клубня и было наибольшим в растениях, экспрессирующих антиген под контролем двойного промотора CaMV 35SS.

В соответствии со специфичностью генетической экспрессии под клубнеспецифическим пататиновым промотором, HBs-антиген был обнаружен исключительно в клубнях и отсутствовал в листьях трансгенных растений картофеля. Количество антигена в клубнях различных линий этого трансгенного картофеля, растущего в условиях in vitro и in vivo, составило от 0.005 до 0.018% от общего содержания растворимого белка клубней растений (200-400 нг/г сырого веса клубня).

Выделение и характеристика HBs-антигена, синтезируемого трансгенными растениями табака и картофеля. Нами получен очищенный концентрированный препарат HBs-антигена из растений. Для этого проведена иммунопреципитация HBsAg из экстрактов растений на белок А-сефарозе с помощью мышиных моноклональных антител к HBs-антигену. Для иммуноблоттинга использовали специально полученные кроличьи поликлональные антитела к мономерной форме HBs-антигена. Данные иммуноблотинга HBs-антигена из трансгенных растений картофеля и табака, экспрессирующих ген HВsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, представлены на рис 28. В этом анализе помимо мономерных форм HBs-антигена выявляются также его димерные формы, что может быть связано с неполной деградацией мультимерного комплекса HBs антигена в условиях наших экспериментов.

Рис. 28. Иммуноферментный блот анализ поверх ностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) после его осаждения из белковых экстрактов растений табака (А) и картофеля (Б) с помощью реакции иммунопреципитации на сорбенте белокА-сефароза CL-4B. А: 1, 2 – экстракт из листьев нетрансформированного табака;

3, 4 – экстракт из листьев трансгенного табака;

5, 6 – экстракт из дрожжей-продуцентов HBsAg;

7 – отрицательный контроль (белокА-сефароза CL 4B);

8 – положительный контроль (антиген без иммунопреципитации). Б: 1 – белковый экстракт из листьев нетрансформированного картофеля;

– экстракт из листьев трансгенного картофеля;

3 – экстракт из рекомбинантных дрожжей продуцентов HBsAg;

4 – отрицательный контроль (белокА-сефароза CL-4B);

5 – положительный контроль (антиген без иммунопреципитации).

Использовали поликлональные антитела к мономеру HBsAg в разведении 1:5000. Для визуализации связывания антител с антигеном использовали набор ECL (Pierce, США).

В проведенном анализе молекулярная масса мономерной формы HBs антигена из синтезирующих его растений и дрожжей определена равной 24 кДа, что соответствует молекулярной массе белковой части мономерной формы HBs антигена вируса гепатита В (Sunil Kumar et al., 2003). Эти результаты вместе с возможностью прямого иммуноферментного определения нативного НВs антигена в бесклеточных экстрактах трансгенных растений указывают на то, что синтезируемый в растениях картофеля НВs-антиген способен агрегировать в олигомеры, которые, как известно, обладают существенно большей иммуногенной и антигенной активностью, чем отдельные НВs-полипептиды (Mason et al., 1992).

На это указывает и стабильность продукта гена НВsAg в трансгенных растениях: в экстрактах растений НВsAg сохранял антигенную активность до семи дней при 40С без ее заметного падения. Эти предположения были проверены в экспериментах по аналитической гельфильтрации HBs-антигена, выделенного из трансгенных растений.

Для экспериментов по аналитической гельфильтрации использовали фракцию гомогената из листьев табака и листьев и микроклубней трансгенных растений картофеля, очищенную от пигментов и низкомолекулярных белковых веществ. Бесклеточный экстракт наносили на HPLC-колонку Superose-6 (HR10/30) (Pharmacia Biotech, Швеция). HBs-антиген обнаружен в зоне элюции высокомолекулярных соединений с молекулярной массой около 2000 кДа (рис.

29). Учитывая молекулярную массу мономерной формы HBs-антигена равной кДа (без гликозилирования), можно сделать вывод, что в клетках трансгенных растений продукт экспрессии гена HВsAg образует мультимерные формы и в агрегации HBs-мономеров в мультимерные формы участвует не менее 70- мономеров. Наши данные по аналитической гельфильтрации синтезированного трансгенными клетками табака и картофеля HBs-антигена соответствуют седиментационной и электронно-микроскопической характеристике HBs антигена, выделенного другими авторами из трансгенных клеток табака (Mason et al., 1992). Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках рекомбинантных дрожжей-продуцентов HBs-антигена идет его сборка в мультимерные агрегаты, которые обладают значительно повышенной иммуногенной и антигенной активностью по сравнению с исходной мономерной формой и поэтому могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.

Рис. 29. Высокоэффективная гель-фильтрация HBs-антиге на, выделенного из листьев трансгенного картофеля, на колонке Superose-6 (HR 10/30).

Элюция 0.05 М Na-фосфатным буфером (рН 7.5), содержащим 0.15 М NaCl, 60 мин со скоростью 0.4 мл/мин. Жирная линия – регистрация оптиче ской плотности. Тонкая крас ная линия – детекция HBs антигена. D2000 – декстран голубой (2000 кДа), TG – тироглобулин (669 кДа), F – ферритин (443 кДа).

Элюция HBs-антигена на колонке с Superose-6 (HR10/30) происходит в зоне, практически свободной от присутствия других белков, что позволяет рассматривать препаративный вариант гельфильтрации на этом носителе как эффективную стадию очистки в технологии промышленного получения вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений-продуцентов.

Совместно с НПК «Комбиотех» проведены исследования по созданию технологии переработки биомассы трансгенных растений и выделения очищенных препаратов HBs-антигена вируса гепатита В.

Количество поверхностного HBs-антигена в трансгенных растениях табака и картофеля, экспрессирующих ген HBsAg, составляет от 0.002 до 0.05% от общего растворимого белка растительной ткани, что гораздо ниже, чем уровень экспрессии HBs-антигена в дрожжевых продуцентах. Учитывая это, для повышения эффективности извлечения HBsAg было решено использовать выделение на аффинных сорбентах. Проанализированы сорбенты, приготовленные на основе различных полимерных матриц AffiGel-701, AffiGel-10, Sepharose-4B, Sepharose-2B с ковалентно связанными моноклональными и поликлональными антителами, полученными иммунизацией мышей и кроликов рекомбинантным HBs-антигеном. Наилучшие результаты показал сорбент на основе матрицы Sepharose-2B и очищенной IgG фракции поликлональных кроличьих антител.

Кроликов иммунизировали промышленной рекомбинантной вакциной HBsAg (НПК «Комбиотех», Москва). Обогащенную фракцию иммуноглобулинов G из сыворотки крови выделяли высаливанием 33%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой от альбумина ионообменной (DEAE) хроматографией.

Полученные антитела связывали с полимерной матрицей Sepharose-2B, активированной 0.5% CNBr. Оставшиеся активированные группы блокировали мМ раствором глицина. Количество связанных антител определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм.

Осветленный гомогенат листьев трансгенного табака или клубней трансгенного картофеля наносили на аффинную колонку в несколько циклов.

Неспецифически-связанные белки отмывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween-20. HBs-антиген элюировали 1 М раствором аммиака в PBS, содержащем 1% тритон Х100. Элюат сразу нейтрализовали 1 М раствором трисHCl до рН 7.5.

Содержание HBs-антигена определяли методом РПГА (реакция пассивной гемагглютинации). Фракции, содержащие HBsAg, объединяли и диализовали в фосфатном буфере с низкой концентрацией соли, после чего концентрировали в лиофилизаторе с низким вакуумом без замораживания.

Таким образом, разработана методика выделения рекомбинантного HBs антигена из экстрактов трансгенных растений-продуцентов HBsAg.

Использование разработанного аффинного сорбента позволяет выделить до 50% HBs-антигена в высокоочищенной концентрированной форме.

Тканеспецифическая экспрессия гена HBsAg в клетках трансгенных растений и культуры тканей Nicotiana tabacum L. Для получения растений продуцентов вакцины против гепатита В с тканеспецифической экспрессией этого гена в целых растениях и культуре тканей, может быть перспективным использование агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas. Эти промоторы состоят из регуляторных элементов генов октопинсинтазы (ocs) и маннопинсинтазы (mas), выделенных из A. tumefaciens. Схема рекомбинантных плазмид, сконструированных и использованных нами для трансформации растений, представлена на рис. 30. Эти плазмиды получены на основе векторов для трансформации растений pE1802 и pE1945, содержащих промотор (Aocs)3AmasPmas (Ni et al., 1995). Вектор pE1945 отличается от вектора рЕ наличием интрона гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adh1 и отсутствием энхансера TL. Полученные конструкции перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404), который использовали для заражения листовых эксплантов табака. Было отобрано по 15-20 линий трансформантов для дальнейшего молекулярно-генетического и биохимического анализа.

Наличие гена HBsAg в трансгенных растениях подтверждено методом ПЦР.

Иммуноферментный анализ показал, что HBs-антиген присутствует на различном количественном уровне во всех исследованных линиях трансгенного табака.

Экспрессия антигена в трансгенных растениях табака, растущих in vitro, достигала 0.01% от общего растворимого белка. При этом синтез поверхностного антигена HBsAg был максимальным в корнях растений. Конструкция pE1945-Ag содержала интрон гена алкогольдегидрогеназы. Известно, что включение интронов в состав трансгенов может усиливать их экспрессию в клетках растений (Rose, 2004), однако в наших экспериментах наличие интрона гена adh1 не привело к повышению экспрессии целевого трансгена. По-видимому, эффект усиления экспрессии трансгена с помощью вставки интрона зависит от локализации интрона в экспрессирующей генно-инженерной конструкции.

Рис. 30. Схема рекомбинантных плазмид, содержащих ген HBsAg в составе бинарных векторов для трансформации растений pE1802 и pE1945. Aocs – активатор гена ocs;

Amas – активатор гена mas;

TL – энхансер;

Pmas - промотор гена mas;

Pnos – промотор гена нопалин синтазы;

ags-ter и pAg7 – сигналы полиаденилирования и терминации генов агропинсинтазы и Ag7, соответственно;

ADH – интрон гена алкогольдегидрогеназы кукурузы;

HBsAg – ген поверхностного антигена вируса гепатита В;

nptII – ген неомицинфосфотрансферазы II;

RB, LB – правая и левая границы Т-ДНК.

На основе 8 линий трансгенных растений с наиболее высокой экспрессией HBs-антигена нами получены культуры так называемых «косматых корней» путем трансформации листовых дисков трансгенных растений клетками штамма Agrobacterium rhizogenes A4. Культуры косматых корней являются удобной системой для продуцирования вторичных метаболитов и рекомбинантных белков, так как они отличаются генетической стабильностью и быстрым ростом на безгормональной среде. Уровень синтеза HBs-антигена в различных линиях культур косматых корней оставался на уровне исходных трансгенных растений и достигал 0.01% от общего растворимого белка клеток.

Из листовых эксплантов трансгенных растений, синтезирующих HBs-антиген под контролем промоторов (Aocs)3AmasPmas, получены каллусные культуры. В них также показан синтез HBs-антигена, что можно объяснить регуляцией маннопинсинтазного и октопинсинтазного промоторов с помощью ауксинов, количество которых повышено в каллусной культуре, культивируемой на ауксин содержащей среде (Langridge et al., 1989).

Следует отметить, что результаты нашей работы не подтверждают повышенную эффективность экспрессии трангенов под контролем гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas по сравнению с эффективностью двойного промотора CaMV 35SS (Ni et al., 1995).

Использование гибридного промотора (Aocs)3AmasPmas может быть перспективным для тканеспецифической экспрессии различных белков, важных для фармакологии и медицины, а также для получения продуцентов на основе культуры клеток трансгенных растений.

Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Все генетические конструкции, использованные нами ранее, содержали ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII), придающий растениям устойчивость к антибиотику канамицину. Существует опасность случайного попадания гена устойчивости к канамицину в окружающую среду при выращивании трансгенных растений в открытом грунте. Возможен горизонтальный перенос генов между трансгенными растениями и микроорганизмами, в том числе обитающими в пищеварительном тракте животных и человека. При создании оральных вакцин следует учитывать этот риск и создавать трансгенные растения, не содержащие селективных генов. С этой целью нами была создана генетическая конструкция с геном HBsAg, не содержащая селективных генов для отбора трансгенных растений, а также разработана технология трансформации и отбора трансгенных растений на бесселективных средах.

Для получения трансгенных растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) без дополнительных селективных генов или генов-репортеров нами получен вектор pBM без таких маркерных генов и в нем клонирован ген HBsAg (рис. 31). Плазмида рВМ c ori широкого круга хозяев RK получена на основе вектора pBIN19 (Frisch et al., 1995). Из этого вектора нами удален маркерный ген устойчивости к канамицину nptII вместе с промотором и сигналом полиаденилирования агробактериального гена нопалинсинтазы.

Плазмида рВМ содержит практически полностью сохранившийся полилинкер вектора pBIN19 с различными сайтами для клонирования генов и последовательности LB и RB агробактериальной Т-ДНК, необходимые для ее интеграции в растительный геном. В плазмиде рВМ присутствует ген устойчивости к канамицину nptIII для отбора бактериальных клеток (Trieu-Cuot a.

Courvalin, 1983), однако он расположен вне области Т-ДНК и не включается в геном растений. В эту плазмиду по сайту SphI встраивали ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (рис.

31). Полученную плазмиду pBM-Ag перенесли в штамм A. tumefaciens LBA (pAL4404), который использовали для трансформации листовых эксплантов табака.

Для отбора трансгенных растений с геном HBsAg применяли метод иммуноферментного анализа, позволяющий определять в экстрактах трансгенных растений HBs-антиген в концентрации 0.5 нг/мл. Полученные нами ранее трансгенные растения табака и картофеля с селективным геном nptII синтезировали HBs-антиген на среднем уровне около 0.02% от общего растворимого белка клетки, соответствующем его содержанию около 1 мкг/г сырого веса растений. Это позволяет детектировать наличие HBs-антигена даже при 2000-кратном его разбавлении экстрактами нетрансформированных растений.

Для анализа отбирали приблизительно равные по весу (около 0.5 г) экспланты проростков, которые объединяли, разрушали и определяли в их экстрактах присутствие HBs антигена.

Рис. 31. Схема плазмиды pBM-Ag. Обозначения: ori V – начало репликации;

ColE1 – начало репликации из плазмиды ColE1;

KmR – ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий;

TL, TR – левая и правая границы Т ДНК;

CaMV35SS – двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты;

HBsAg – ген поверхностного антигена вируса гепатита В;

pACaMV – сигнал полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты;

R, K, Sm, B, Sl – сайты рестрикции EcoRI, KpnI, SmaI, BamHI, SalI.

В выборках из 600 регенерантов табака, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20- проростков, присутствие HBs-антигена постоянно выявлялось в нескольких группах. Дальнейшее дробление каждой группы по принципу "поиска фальшивой монеты" или прямое тестирование всех присутствующих в группе регенерантов делает возможным нахождение индивидуальных трансформантов, синтезирующих HBs-антиген. В некоторых случаях в положительно детектируемой HBs-группе было выявлено до 3-5 индивидуальных трансформированных растений.

Эффективность трансформации определяли как процентную долю HBs положительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам (табл. 5). С помощью проведенного иммуноферментного анализа отобраны 15 линий трансгенных растений табака без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка.

Таблица 5.

Эффективность трансформации эксплантов табака генетической конструкцией pBM-Ag Номер эксперимента Число HBs-позитивных побегов/ число тестируемых побегов (%) 1 1/138 (0.7) 2 3/128 (2.3) 3 5/120 (4.1) 4 3/117 (2.5) 5 3/97 (3.1) Общее число HBs-позитивных побегов/ общее число тестируемых побегов (%) 15/600 (2.5) Все обнаруженные таким способом трансформанты показали присутствие у них гена HBsAg, детектируемого методом ПЦР. Эффективность трансформации составила 2.5%. Наблюдаемая в наших экспериментах достаточная для практической селекции частота трансформации может быть результатом положительного влияния двух новых факторов примененного метода. Во-первых, отбор трансгенных растений на среде без антибиотиков создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома и при сохранении его эпигенетического статуса. Во вторых, в примененном методе трансформации растений был использован сконструированный нами вектор с Т-ДНК, укороченной на 2600 п.н., что снижает нежелательный эффект длинных вспомогательных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена.

В дальнейшем для трансформации растений томата и табака безмаркерной генетической конструкцией pBM-Ag нами был применен метод вакуумной инфильтрации семян в суспензии агробактерий. После трансформации семена проращивали на среде МС с цефотаксимом и через 10-14 дней в проростках определяли наличие HBs-антигена с помощью ИФА. В результате получено по нескольку линий растений табака и томата, синтезирующих HBsAg на уровне до 0.05% от общего растворимого белка. Метод трансформации семян оказался экономичным по времени отбора трансформантов и позволил нам повысить частоту агробактериальной трансформации до 15-20%.

Таким образом, нами создан вектор для трансформации растений без селективных генов устойчивости к антибиотикам и разработан новый метод отбора трансгенных растений нового поколения. Такие растения удовлетворяют требованиям повышенной безопасности при применении их в качестве вакцины против гепатита В. Достигнутый уровень синтеза HBs-антигена в клетках томата достаточен для проведения доклинических испытаний полученных растений в качестве безопасной “съедобной” вакцины нового поколения. Разработанный метод отбора трансформантов является основой общей стратегии получения безопасных растений без селективных маркеров.

С применением сконструированного нами вектора pBM в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН разработаны методы получения безмаркерных трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1 (Захарченко и др., 2005, 2007, 2008). Использованные в настоящей работе методические подходы свидетельствуют о принципиальной возможности проведения отбора трансформированных растений без дополнительных селективных или репортерных генов и получения растений без этого «генетического мусора».

ВЫВОДЫ 1. Получены и исследованы трансгенные растения с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis (bt), экспрессируемым под индуцибельным промотором TR1’ агробактериальной маннопинсинтазы. Впервые показано, что полученные растения устойчивы к личинкам табачного трипса и к паутинному клещу.

2. Получены прививочные варианты растений, у которых трансгенную часть с генами nptII и bt представлял только привой или подвой. Миграция фермента NPTII в нетрансгенную часть привитых растений не обнаружена. Предложенная стратегия сочетания индуцибельных промоторов и прививок перспективна для создания трансгенных растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях.

3. С помощью антисмысловых РНК впервые показано подавление активности неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum. Получены растения, в которых экспрессия гена nptII ингибирована с помощью интерферирующих РНК.

4. Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие гетерологичный ген hmg1 из Arabidopsis thaliana, кодирующий ключевой фермент метаболизма изопреноидных соединений 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазу. Показано, что трансгенные растения с антисмысловой копией гена hmg1 характеризуются мужской стерильностью и отличаются измененной окраской и морфологией цветков.

5. Получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией агробактериальных генов изопентенилтрансферазы ipt и триптофанмоно оксигеназы iaaM. Повышенный синтез цитокининов в ipt-растениях приводил к изменениям в их морфологии и биохимии, а также положительно влиял на фотосинтез этих растений и их устойчивость к стрессовым факторам.

Повышенный синтез ауксинов вызывал значительные физиологические и биохимические изменения, вплоть до снижения репродуктивных свойств iaaM растений.

6. С целью получения растений, устойчивых к агробактериальному раку, получены двойные трансформанты растений табака, несущие антисмысловые копии генов iaaM и ipt. При заражении этих растений вирулентными штаммами Agrobacterium tumefaciens C58 (pTiC58) и А6 (pTiA6) показано существенное, вплоть до полного, ингибирование экспрессии генов ipt и iaaM.

7. Получены растения табака и картофеля, а также культуры тканей и клеток с геном поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем конститутивных и тканеспецифичных промоторов. Содержание HBs-антигена в полученных растениях составило до 0.05% от суммарного растворимого белка.

Показано, что в клетках трансгенных растений происходит сборка мономерных форм HBs-антигена в иммуногенные мультимерные агрегаты, которые могут быть использованы в качестве субстанции для получения вакцины против вируса гепатита В.

8. С целью создания растений без «генетического мусора» сконструирован специализированный вектор и разработаны приемы получения трансгенных растений табака и томатов, экспрессирующих ген HBsAg и не содержащих дополнительных селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОБЗОРЫ 1. Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. Трансгенные растения для фармакологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.

2006. № 2. С. 3-12.

СТАТЬИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ 2. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum с помощью антисмысловой РНК // ДАН СССР. 1988. Т. 300. № 3. С.

727-730.

3. Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Шматченко В.В., Зинкевич В.Е., Север И.С., Асланян Е.М., Исангалин Ф.Ш., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в трансгенных растениях Nicotiana tabacum // ДАН СССР. 1990. Т.

315. № 6. С. 1489-1492.

4. Pукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э., Каляева М.А., Муpенец Л.Ю., Буpьянов Я.И. Комбиниpованное использование pегулиpуемых пpомотоpов и пpививок в генно инженеpной биотехнологии pастений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.

5. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И., Борисова В.Н., Мельников В.А.

Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. C. 42-45.

6. Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmg1 // Генетика.

2000. Т. 36. № 9. С. 1200-1205.

7. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Шутова Т.В., Хоробрых А.А., Бурьянов Я.И.

Физиолого-биохимические особенности растений табака с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 408-415.

8. Kаляева М.А., Захарченко Н.С., Доронина Н.В., Рукавцова Е.Б., Иванова Е.Г., Алексеева В.В., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений.

2001. Т. 48. № 4. С. 596-599.

9. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита B // Генетика. 2003. Т. 39. № 1. С. 51-56.

10. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Бобрешова М.Е., Ложникова В.Н., Бурьянов Я.И.

Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы // Физиология растений. 2004. Т. 51. № 4. С. 600-606.

11. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А., Борисова В.Н., Мельников В.А., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. № 10.

С. 1422-1430.

12. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Повышенная устойчивость к фитопатогенным бактериям у трансгенных растений табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина Р1 // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1445-1452.

13. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Юхманова А.А., Школьная Л.А., Кадо К.И., Бурьянов Я.И. Экспрессия искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к фитофторозу и белой гнили // Доклады РАН. 2007. Т. 415. № 1. С. 129-131.

14. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я., Быков В.А., Бурьянов Я.И.

Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 6. С.

864-869.

15. Сердюк О.П., Смолыгина Л.Д., Иванова Е.П., Ширшикова Г.Н., Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Семенова Г.А, Бутанаев А.М., Тарасевич Н. Ю. Фенотипические и физиологические изменения у фототрофной пурпурной несерной бактерии Rhodopseudomonas palustris, трансформированной бинарным вектором pGA 482 с геном биосинтеза цитокининов, ipt // Доклады РАН. 2007. Т. 415. № 4. С. 556-558.

16. Алексеева В.В., Рукавцова Е.Б., Голубчикова Ю.С., Бурьянов Я.И. Подавление экспрессии агробактериальных онкогенов с помощью антисмысловых РНК // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 172-183.

17. Рукавцова Е.Б., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я.И. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2009. Т. 45 (принята в печать).

СТАТЬИ В НАУЧНЫХ СБОРНИКАХ И ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ 18. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мърхова М.И., Бурьянов Я.И.

Антисмысловые РНК ингибируют экспрессию гена неомицинфосфотрансферазы II в протопластах Nicotiana tabacum // Сборник научных трудов «Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями». Пущино.

1989. С. 82-86.

19. Dolgov S.V., Mityshkina T.I., Rukavtsova E.B., Buryanov Ya.I. Production of transgenic plants of Chrysanthemum morifolium Ramat with the gene of Bac. thuringiensis d-endotoxin // Acta Horticulturae. 1995. V. 420. P. 46-47.

20. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я. И., Быков В.А. Получение трансгенных растений - перспективных продуцентов вакцины против гепатита В // Сборник материалов X Международного съезда «Фитофарм-2006». С.-Петербург. 2006. С. 383 387.

21. Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И. Анализ экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях и клеточных культурах // Сборник материалов Школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007». Пущино. 2007. С. 41-44.

22. Гапеева Т.А., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д.

Получение и характеристика трансгенных растений картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В // Доклады НАН Беларуси. 2008. Т. 52. № 1.

С. 84-87.

23. Гапеева Т.А., Захарченко Н.С., Юхманова А.А., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И., Волотовский И.Д. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген антибактериального пептида цекропина Р1 // Вести НАН Беларуси. 2008. № 4. С.

24. Алексеева В.В., Мудрик В.А., Голубчикова Ю.С., Рукавцова Е.Б., Иванов Б.Н.

Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на регуляцию фотосинтеза, роста и развития трансгенных растений табака // Сборник материалов Международной научно практической конференции «Актуальные проблемы экологии». Москва. 2008. С. 78-80.

25. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Юхманова А.А., Алексеева В.В., Шульга Н.Я., Дьяченко О.В., Шевчук Т.В., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н. Создание биологически безопасных трансгенных растений нового поколения с полезными свойствами // Сборник научных трудов по Программе Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека». Москва. 2008. С.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.