авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция

-- [ Страница 2 ] --

L – Selaginella moellendorffii. Дерево построено методом «присоединения соседей».

По всей видимости, эволюционное развитие липоксигеназ происходило в соответст вии с эволюцией основных таксонов. Вероятно, 13-специфичные ЛОГ возникли монофи летически у растений одновременно с группой ЛОГ грибов, образующих широкий спектр продуктов (5-, 8-, 15-гидроперекиси, рис. 17, группа I);

эти группы, также как липоксиге назы животных, протеобактерий, цианобактерий имели общего предка. Первые этапы эволюции группы липоксигеназ, вероятно, совпали с появлением эукариотических орга низмов или непосредственно предшествовали этому событию.

Возникновение 9-специфичных липоксигеназ в результате минорных модификаций 13-липоксигеназ произошло, вероятно, незадолго до расхождения однодольных и дву дольных растений. Это предположение подтверждается экспериментами по сайт направленному мутагенезу. В результате мутации A562G проведено частичное изменение специфичности ZmLOX3, по-видимому, представляющее собой реверсию к 13 специфичной активности у 9-специфичного фермента. Для уточнения времени возникно вения 9-липоксигеназного пути необходимо получить данные о липоксигеназах споровых и разработать непротиворечивую филогенетическую модель цитохромов CYP74.

Разработку филогении и таксономии семейства CYP74 нельзя считать завершенной.

В работе Д. Нельсона, посвященной филогении цитохромов суперсемейства P450 расте ний [Nelson, Werck-Reichhart, 2011] описание семейства CYP74 содержит серьезные про тиворечия. В связи с низкой степенью сходства последовательностей внутри семейства CYP74 было сочтено целесообразным ввести новую таксономическую единицу – клан, состоящий из одного семейства. При этом сделано заключение, что в эволюционной ис тории данные ферменты впервые появляются у печеночников (Marchantiophyta) в связи с выходом растений на сушу. Предполагается, что возникновение клана CYP74 было связа но с развитием жасмонатной сигнальной системы, присутствующей у всех наземных рас тений. Ферменты CYP74 прокариот, морских кишечнополостных и хордовых распространились в результате горизонтального переноса генов от наземных растений посредством метилотрофных бактерий [Nelson, Werck-Reichhart, 2011].

Противоречивость приведенного представления об эволюции семейства CYP74 мо жет быть дополнена тем фактом, что дивиниловые эфиры обнаружены не только у назем ных растений, но также у бурых водорослей. Кроме того, алленоксидсинтазная активность обнаружена в клетках цианобактерий Acaryochloris marina [Gao et al., 2009].

Согласно альтернативной точке зрения клан CYP74 не имеет общих предков с другими группами цитохромов Р450;

он возник на ранних этапах эволюции суперсемейства до ди вергенции животных и растений от их последнего общего предка [Lee et al., 2008].

Для выяснения причин возникшего противоречия мы провели филогенетический анализ 493 аминокислотных последовательностей цитохромов Р450 не только высших растений, но и представителей следующих таксонов: Archaea, Bacteria, Amoebozoa, Alveo lata, Euglenozoa, Fungi, Metazoa (рис. 18).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что клан CYP74 не является произ водным других семейств Р450 высших растений, а представляет собой монофилетиче скую группу ферментов, гомологичных представителям других групп цитохромов Р широкого спектра организмов, включающего цианобактерии (Nostoc punctiforme), грам положительные бактерии (Bacillus subtilis) и нитчатые грибы (Neurospora crassa). Фер менты CYP74 проявляют сходство с представителями семейств CYP7 и CYP51 (рис. 18).

Рис. 18. Филогенетическое дерево суперсемейства Р450. Цифрами обозначены се мейства и кланы цитохромов Р450 согласно [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Построение выполнено методом «максимального правдоподобия».

Еще одно построение было выполнено с использованием в качестве оперативных таксономических единиц (ОТЕ) последовательностей всех цитохромов трех организмов – A. thaliana, Ph. patens, Branchiostoma floridae. Обе модели подтверждают предположение о древнем эволюционном происхождении семейства CYP74. Воспроизводимое объедине ние эпоксиалкогольсинтазы CYP74В2 хордового животного, гидропероксидлиазы CYP74Y мха и алленоксидсинтазы CYP74А1 двудольного растения в монофилетичную группу указывает на высокую консервативность первичной структуры ферментов CYP74.

Принятые алгоритмы молекулярно-филогенетического анализа учитывают только аминокислотные замещения (нуклеотидные замены). В то же время, характерной особен ностью ферментов CYP74, отличающей их от других цитохромов Р450, является наличие дополнительной консервативной последовательности из 9 аминокислотных остатков в гем-связывающей петле. Ранее высказывалось предположение, что эта последователь ность возникла у семейства CYP74 после инсерции в соответствующую часть гена [Brash, 2009]. Однако в этом случае следует признать, что в одни и те же локусы генов CYP животных, растений и бактерий независимо были встроены фрагменты одинаковой по следовательности. Данное событие в эволюции цитохромов Р450 является менее вероят ным, чем делеция 9 кодонов у одного из анцесторных генов суперсемейства.

В отличие от ферментов CYP74, остальные цитохромы Р450 являются монооксиге назами или оксигеназами и используют молекулярный кислород в качестве субстрата.

Отсутствие цитохромов Р450 у облигатных анаэробов указывает на то, что начало эволю ции этих ферментов связано с возникновением фотосинтеза и последующей сменой вос станавливающей атмосферы на окислительную. Накопление кислорода в атмосфере началось 850 млн. лет назад [Konhauser et al., 2009] и совпало с появлением последнего эукариотического общего предка [Cavalier-Smith, 2010]. При последующем изменении условий существования основным направлением эволюции являлась адаптация клеточно го метаболизма, связанная с выработкой механизмов защиты от повреждения биополиме ров активными формами кислорода (АФК) и способов ликвидации последствий этих повреждений. Использование молекулярного кислорода эукариотами началось позднее благодаря приобретению митохондрий [Di Giulio, 2007]. Переход эукариот к аэробному образу жизни произошел за 150 млн. лет до дивергенции животных и растений, связанной с приобретением последними хлоропластов. Сопоставление событий с геологической шкалой выявляет резкое ускорение эволюции в этот период. Длительное (более 1 млрд.

лет) существование древних организмов в условиях низких концентраций кислорода по сле появления первых цианобактерий 2,1 млрд. лет назад [Javaux et al., 2004] создавало предпосылки для первичной адаптации к образованию перекисных продуктов.

Одним из последствий повреждения мембран АФК является образование гидропере кисей жирных кислот. Вероятно, эти соединения, как субстрат для образования оксили пинов, существовали до появления липоксигеназ. В то же время, нельзя исключать, что эволюция многих железосодержащих белков, в том числе липоксигеназ, десатураз и ци тохромов CYP74, обеспечивающих липоксигеназный каскад, протекала параллельно. В результате перехватываемый ими кислород передавался различным субстратам, которые затем претерпевали превращения во все более сложных и разветвленных цепях реакций.

При этом некоторые компоненты могли включаться в существующие цепи на определен ных этапах. Так, например, ненасыщенные жирные кислоты могли синтезироваться пер воначально в анаэробных условиях без участия десатураз, как в настоящее время происходит у некоторых бактерий, у которых синтазы жирных кислот способны образо вывать двойную связь в процессе синтеза ацильной цепи [Heath, Rock, 1996;

Лось, 2001].

Еще до радикального изменения состава атмосферы локальные концентрации ки слорода в фотосинтезирующих клетках и непосредственном их окружении (матах и био пленках) могли быть выше средних значений. Это означает, что для фотосинтетиков и организмов, входящих в сообщества с ними, развитие защиты от перекисных продуктов было актуально уже около двух млрд. лет назад. Это создавало предпосылки для дли тельной эволюции антиоксидантных ферментов и цитохромов до формирования кисло родной атмосферы. При этом предковые формы цитохромов Р450 могли обходиться одним субстратом – продуктом спонтанного окисления биополимеров. Возможно, фер менты CYP74, осуществляющие подобную реакцию в отношении гидроперекисей жир ных кислот, являются рудиментарными представителями этой древней группы цитохромов. Удаление поврежденных молекул могло происходить в результате превра щения их в диффундирующие и летучие соединения, в том числе, оксилипины. Когда в результате эволюции развились более эффективные способы антиоксидантной защиты, данная группа могла быть элиминирована. Сохранению семейства CYP74 способствовало переключение с репаративных функций на сигнальные. Кроме того, ферменты CYP74 не посредственно участвовали в эволюции антиоксидантной системы. Показано, что АОС кораллов [Koljak et al., 1997] и цианобактерий [Schneider et al., 1997] имеют сходство с каталазами. Например, белок Mycobacterium avium, проявляющий сходство структуры с каталазами и ферментами CYP74, с высокой эффективностью метаболизирует перекись водорода в присутствии как (13S)- так и (9S)-гидроперекисей линолевой, либо (15S)-, (8R)-гидроперекисей арахидоновой кислот, необходимых в качестве косубстрата в перок сидазной реакции [Pakhomova et al., 2009].

Гипотезу о древнем происхождении CYP74 подтверждают следующие факты. Во первых, локализация современных ферментов семейства в значительной степени связана с хлоропластами, являющимися потомками первых фотосинтезирующих организмов. Во вторых, регрессивная эволюция белков путем утраты фрагментов аминокислотных цепей и связанных с ними функций требует меньше времени по сравнению с усложнением структуры путем приобретения новых функциональных последовательностей;

в этом смысле делеция фрагмента из 9 аминокислотных остатков более вероятна, чем их случай ная вставка с появлением новой функции. В-третьих, отсутствие кислорода предшество вало его появлению в атмосфере в качестве доступного субстрата. В-четвертых, на независимо построенных филогенетических деревьях представители семейства (клана) CYP74 собраны в отдельную монофилетическую ветвь. В-пятых, данная модель не требу ет привлечения дополнительных эволюционных механизмов, эффективность которых не может быть подтверждена;

так, для объяснения присутствия представителей CYP74 у таксономически отдаленных организмов было выдвинуто предположение о горизонталь ном переносе соответствующих генов между растениями, протеобактериями и животны ми [Nelson, Werck-Reichhart, 2011;

Nelson et al., 2013]. В качестве еще одного аргумента можно привести тот факт, что по сравнению с монооксигеназной реакцией реакция пре вращения гидроперекиси с участием ферментов CYP74 является простой, не требующей переносчиков электронов;

предположение о поступательном развитии от двухкомпонент ной системы к сложному реакционному комплексу представляется оправданным.

Современное распространение ферментов CYP74, в основном, связано с сосудисты ми растениями. Это обстоятельство послужило основой концепции позднего происхож дения семейства. Новые данные о присутствии АОС, ГПЛ и ЭАС у бактерий и животных дают основания для пересмотра этих представлений. Тем не менее, предположение о том, что ферменты CYP74 могли передаться и растениям и животным от общего предка отвер гается на том основании, что эти ферменты не обнаружены у одноклеточных простейших и зеленых водорослей [Nelson, Werck-Reichhart, 2011]. Однако отсутствие той или иной группы ферментов на том или ином отрезке филогенетической линии может быть следст вием редуктивной эволюции, часто встречающейся в природе.

Существующая классификация ферментов CYP74 была заложена с использованием ограниченного объема данных, и в настоящее время нуждается в реорганизации. Соглас но ранней классификации семейство было разделено на четыре подсемейства: CYP74A, CYP74B, CYP74C и CYP74D [Itoh, Howe 2001]. Однако появляется все больше ферментов CYP74, которые, согласно критерию сходства первичной структуры, не могут быть отне сены к этим подсемействам. Примерами служат ферменты CYP74 споровых и голосемен ных, протеобактерий, хордовых и кишечнополостных. По обновленной классификации [Nelson, 2013] ферменты протеобактерий и животных не входят в новообразованный так сон клан CYP74, а относятся к новым семействам. С такой классификацией не согласны некоторые исследователи, по мнению которых функциональное сходство не менее важно для классификации, чем сходство последовательностей [Lee et al., 2008].

Результаты нашей работы показывают, что среди изученных подсемейств CYP могут появляться новые члены, гомологичные по степени сходства первичной структуры и при этом отличающиеся по типу катализа от ферментов, образующих подсемейство.

Так, LuDES, гомологичная ферментам СYP74B, является ДЭС, в отличие от изученных членов подсемейства, обладающих активностью 13-ГПЛ.

Нами было предпринято построение филогенетического дерева клана CYP74, вклю чающего новые ферменты, в том числе, охарактеризованные в данной работе (рис. 19).

Кроме ферментов высших растений дерево позволяет включить в семейство (клан) CYP74 последовательности АОС коралла A. palmata (ApAOS) и плаунка Selaginella moellendorffii (SemAOS), эпоксиалкогольсинтазы (ЭАС) ланцетника B. floridae (BfEAS).

Хотя экстраполяция на дальние эволюционные дистанции связана со значительной ошиб кой, полученный результат воспроизводился с применением разных алгоритмов построе ния эволюционных моделей и при использовании разных критериев выборки ОТЕ.

Согласно полученной модели ферменты CYP74 плауновидных (SemAOS) и мхов (CYP74G, рис. 19) наиболее близки к ферментам CYP74 животных, что согласуется с об щими представлениями об эволюции живых существ.

Общепризнанного критерия отнесения последовательности фермента к тому или иному подсемейству CYP74 не выработано. По нашим оценкам, степень идентичности между представителями признанных подсемейств не выходит за пределы 50 %. При обо значении подсемейств мы руководствовались этим пороговым значением.

Разделение на филогенетическом дереве двух основных типов ферментов CYP74 – ГПЛ и АОС – указывает на то, что эта дивергенция произошла на ранних этапах эволю ции семейства. В пользу такого вывода также свидетельствует тот факт, что оба типа ферментов представлены у филогенетически отдаленных организмов. Разделение на 9- и 13-гидропероксид-специфичные ферменты также закономерно отражает эволюцию се мейства. Две удаленные терминальные монофилетические группы – ГПЛ (подсемейства CYP74В, CYP74F) и АОС (подсемейство CYP74А) включают ферменты, обладающие ис ключительно 13-гидропероксид-специфичностью. В то же время, ферменты эволюционно более молодой группы CYP74С/CYP74D/CYP74А* обладают 9-гидропероксид специфичной или смешанной активностью. До настоящего времени 9-гидропероксид специфичные ферменты CYP74 обнаружены только у растений отдела покрытосеменных.

Рис. 19. Филогенетическое дерево цитохромов CYP74, построенное методом «при соединения соседей». Предполагаемые подсемейства обозначены символами, предложен ными Д. Нельсоном для соответствующих групп [http://drnelson.uthsc.edu]. Стрелками указаны ферменты, в отношении которых проведена конверсия ферментативной активно сти, в том числе в данной работе (выделено шрифтом).

Проведенный анализ не позволил определить филогенетические отношения ГПЛ и АОС. Результаты работ по сайт-направленному мутагенезу [Toporkova et al., 2008;

Lee et al., 2008] показали, что единичные аминокислотные замены могут привести к превраще нию АОС в ГПЛ. Дивинилэфирсинтаза LuDES была превращена в алленоксидсинтазу.

Учитывая то, что реверсии более вероятны, чем приобретение функций de novo, можно предположить, что эволюция семейства CYP74 состояла в последовательном превраще нии ферментов ГПЛ АОС ДЭС. В то же время, нельзя исключать, что у разных групп CYP74 был единый предковый фермент с собственной каталитической функцией.

Исходя из механизма реакций, катализируемых ферментами CYP74, наиболее вероятным кандидатом на предковую форму является эпоксиалкогольсинтаза (ЭАС). Этот фермент был обнаружен у B. floridae [Lee et al., 2008]. Выявление ЭАС у высших растений могло бы дать ценную информацию для уточнения эволюционной модели семейства CYP74.

Дивинилэфирсинтаза LuDES не единственное функциональное исключение из своей филогенетической группы. Дивинилэфирсинтаза чеснока (AsDES) также не соответствует группе 9/13-АОС и помещена в отдельное подсемейство. Таким образом, одним из ре зультатов нашей работы является заключение о полифилетическом эволюционном проис хождении дивинилэфирсинтаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Благодаря прогрессу геномных технологий, база данных первичной структуры бел ков увеличивается лавинообразно. В то же время, работы по характеристике ферментов часто завершаются поверхностным описанием белка. Так, субстратные предпочтения ли поксигеназ растений, регио- и стереоспецифичность их действия не достаточно изучены, что препятствует выяснению общих закономерностей 9- и 13-липоксигеназных путей.

Экспериментальные данные подтверждают построенную нами модель позиционирования субстрата в активном центре липоксигеназ, согласно которой расположение пентадиено вой группировки определяется объемом субстрат-связывающей полости фермента. Пока зано [Чечеткин и др., 2009], что для ZmLOX3 определяющим фактором соответствия субстрата является расстояние от карбоксильного конца до центра пентадиеновой груп пировки. Скорость и специфичность реакции сохраняются, если это расстояние такое же, как у линолевой кислоты, что наблюдается в случае гексадекадиеновой кислоты. Стери ческие препятствия для позиционирования 20:2 и 22:2 в активном центре фермента могут быть причиной потери регио- и стереоспецифичности диоксигенирования.

Ранее сообщалось, что замена аминокислотного остатка приводила к смене регио- и стереоспецифичности действия 13-ЛОГ [Coffa, Brash, 2004]. Нами показано, что мутация A562G 9-специфичной липоксигеназы ZmLOX3 изменяет лишь региоспецифичность фермента. Таким образом, результаты нашего исследования указывают на ограничен ность теории, объясняющей специфичность липоксигеназ ориентацией субстрата в ак тивном центре, и необходимость разработки новой модели, основанной на признании того, что субстрат погружается в активный центр только метильной концевой группой.

Согласно полученным нами результатам, 7-гидроперекись гексадекатриеновой ки слоты может вовлекаться в последующие реакции липоксигеназного каскада. Дивинилэ фирсинтаза табака in vitro преобразует данный субстрат в динор-колнеленовую кислоту, алленоксидсинтаза кукурузы в -кетол – 7-гидрокси-8-оксо-(10Z,12Z)-гексадекадиеновую кислоту. Это открывает новые возможности исследования гексадеканоидного липоксиге назного пути и механизмов регуляции специфичности действия липоксигеназ.

В липоксигеназном каскаде липоксигеназы и цитохромы Р450 семейства CYP действуют координировано. Продолжением исследования, посвященного 9-специфич ному направлению каскада, явилось изучение алленоксидсинтазы LeAOS3 томата, обла дающей необычными свойствами. Известно, что большинство АОС катализируют обра зование из гидроперекисей жирных кислот окисей аллена, которые претерпевают спонтанный гидролиз и, в гораздо меньшей степени, спонтанную циклизацию [Tijet, Brash, 2002]. В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутст вии LeAOS3 необычен. Во-первых, время полужизни окиси аллена зависит от концентра ции фермента. Во-вторых, LeAOS3 в насыщающей концентрации полностью превращает субстрат через окись аллена в циклопентенон и -кетол за 20 секунд при 0 оС. В-третьих, -кетол образуется стереоспецифично. Конечными продуктами являются (9R)--кетол и рацемическая смесь цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

Приведенный путь метаболизма жирных кислот характерен не только для томата.

Ранее показано, что аналогичные пути превращения жирных кислот в циклопентеноны и кетолы характерны для имбиря, ландыша и подсолнечника [Ogorodnikova et al., 2008].

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются монооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: окисляемого соединения и молекулярно го кислорода. В реакции, катализируемой ферментами CYP74, участвует кислород гидро перокси-группы окисленной жирной кислоты. Соответственно, аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксиге наз, в последовательностях CYP74 отсутствуют. Было высказано предположение, что функция центрального домена I-спирали CYP74 (IHCD), соответствующего «кислород связывающему домену» монооксигеназ, заключается во взаимодействии с гидроперекис ной группировкой субстрата. Сделанные заключения были проверены с помощью сайт направленного мутагенеза. Результатом этих экспериментов послужили конверсии фер ментов CYP74. Четыре единичные мутации LeAOS3 F295I, K302S, T366Y и S297A пре вратили АОС (дегидразу) в ГПЛ (изомеразу). Это свидетельствует о роли данных аминокислотных остатков домена IHCD в специфичной функции фермента.

Учитывая, что реверсии к исходному фенотипу встречаются чаще, чем образование нового, можно предположить, что предковый фермент CYP74 обладал гидропероксидли азной каталитической активностью, в то время как алленоксидсинтазная и дивинилэфир синтазная активности являются ее производными.

Дивинилэфирсинтазы наименее изучены из ферментов липоксигеназного каскада (за исключением эпоксиалкогольсинтаз, включение которых в клан CYP74 еще окончательно не признано). В настоящей работе впервые описана рекомбинантная 13-гидропероксид специфичная ДЭС – LuDES (CYP74B16), – которая обладает высокой степенью сходства по отношению к 13-ГПЛ (CYP74B) и отличается от всех ранее описанных ДЭС по суб стратной специфичности, продуктам реакции и органоспецифичности экспрессии гена [Гоголев и др., 2011]. В то же время, LuDES, вероятно, не единственная ДЭС, катализи рующая образование (-этероленовой кислоты или родственных соединений. Такие дивиниловые эфиры были обнаружены в растениях рода лютик (Ranunculus) и у бурых водорослей рода ламинария (Laminaria) [Proteau, Gerwick, 1993]. Сходный дивиниловый эфир с (Z,Z)-бутадиеновым фрагментом был обнаружен ранее в красной водоросли поли нейра (Polyneura latissima) [Grechkin, 2002]. Соответствующие ДЭС остаются совершенно неизученными. Они могут оказаться либо ортологами LuDES, либо представителями дру гих, в том числе, новых подсемейств CYP74.

В молекулярной филогении, связанной с систематикой ферментов, тип каталитиче ской реакции принято ассоциировать с определенным подсемейством. В случае семейства CYP74 это соответствие не соблюдается. Так, подсемейство CYP74C содержит АОС и ГПЛ, подсемейство CYP74B – ГПЛ и ДЭС, CYP74А – АОС и ДЭС (рис. 19). В то же вре мя, подсемейства CYP74D и CYP74Н выделены лишь по функциональному признаку.

Исходя из анализа первичной структуры LuDES, можно было бы предположить, что этот фермент является природным мутантом 13-ГПЛ. В связи с этим, нами была пред принята попытка направленной модификации LuDES путем замены E292G, моделирую щей реверсию данной мутации. Однако фермент полностью утратил активность дивинилэфирсинтазы и приобрел активность алленоксидсинтазы. Полученный результат кажется неожиданным, хотя он подтверждает важную роль домена IHCD в определении типа катализа CYP74. Кроме того, не отрицая базовой роли гидропероксидлиазной реак ции для ферментов CYP74, он вписывается в модель эволюции семейства CYP74, пред полагающей последовательное превращение ферментов ГПЛ АОС ДЭС.

Насколько нам известно, до настоящей работы [Toporkova et al., 2008] и одновре менно выполненного исследования [Lee et al., 2008], в литературе не было примеров принципиального изменения катализа ферментов в результате единичных замен амино кислотных остатков. Полученная серия превращений ферментов CYP74 позволяет заклю чить, что разработан алгоритм направленных модификаций первичной структуры белков данного семейства, с высокой вероятностью изменяющих их каталитические свойства.

Алгоритм включает построение филогенетических моделей, анализ третичной структуры белков, изучение механизма катализа. Промежуточным результатом служит определение консервативных, каталитически важных доменов, положения субстрата относительно ак тивного центра, выявление роли отдельных аминокислотных остатков в зависимости от их свойств и пространственного расположения. На завершающем этапе должно быть осуществлено моделирование предполагаемых каталитических свойств белка с изменен ной структурой. Результаты проведенных экспериментов подтверждают эффективность используемого алгоритма и открывают возможности для целенаправленного изменения каталитического действия ферментов CYP74.

Полученные данные подтверждают эволюционное происхождение семейства CYP от единого предкового гена. Обнаружение представителей семейства у прокариот и жи вотных дают основание отнести время образование такого предкового гена ко времени существования последнего общего предка эукариот. Результаты расчета эволюционных дистанций также свидетельствуют о древнем происхождении семейства и соответствии его филогенетической модели общей эволюции организмов, у которых обнаружены фер менты CYP74. Таким образом, предположение о существенной роли горизонтального пе реноса генов в эволюционной истории семейства CYP74 не является обоснованным.

Несмотря на то, что в настоящее время липоксигеназы представлены широко, их эволюционная история связана, в основном, с эукариотическими организмами (рис. 17).

Вероятно, распространение липоксигеназ не являлось обязательным условием возникно вения ферментов CYP74. Не нуждаясь в молекулярном кислороде, эти ферменты могли появиться в период восстанавливающей атмосферы, выполняя репаративные функции, связанные с элиминацией гидроперекисей. Протекторная функция могла принадлежать и первыми липоксигеназам, способным перехватывать кислород и передавать его цитохро мам в виде гидроперекисей. В этом случае, два железосодержащих белка могли пройти путь коэволюции, на протяжении которого их протекторная функция трансформирова лась в метаболическую и сигнальную;

в итоге был сформирован липоксигеназный каскад.

Другое направление эволюции цитохромов Р450 определилось кооперацией с переносчи ками электронов и усложнением реакции за счет формирования серии промежуточных комплексов в процессах поэтапного восстановления и окисления железа.

Проверить высказанные предположения экспериментально не представляется воз можным. Однако можно отметить, что у современных растений липоксигеназный сиг нальный каскад является частью фитоиммунитета и активизируется при повреждениях клеток, связанных с последующими окислительными событиями, в том числе такими драматичными, как окислительный взрыв [Тарчевский, 2002].

С точки зрения общей молекулярной филогении на примере липоксигеназ и цито хромов CYP74 можно сделать заключение, что высокий потенциал структурной и функ циональной (фенотипической) изменчивости не всегда определяет темпы молекулярной эволюции. Поворотным пунктом в эволюции ферментов следует считать события, обес печивающие выбор партнеров по коэволюции. Это обуславливает дивергенцию фермен тов в связи с их принадлежностью к новым биохимическим процессам и одновременно расширяет спектр каскадов реакций, свойственных клеткам данного вида, увеличивая его физиологические возможности. При этих событиях возрастает вероятность скачкообраз ных изменений скорости эволюции, вызывающих сбои молекулярных часов, что часто обнаруживается при филогенетических построениях.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что ферменты ZmLOX3 кукурузы и GmLOX1 сои являются специ фичными (9S)- и (13S)-липоксигеназами;

условия реакции не оказывают влияния на спе цифичность действия данных ферментов.

2. Показано, что мутантная форма ZmLOX3 A562G при окислении линолевой кисло ты проявляет измененную региоспецифичность действия, образуя (13R)-гидроперекиси наряду с (9S)-гидроперекисями, что связано с изменением объема полости активного цен тра.

3. Созданы трехмерные модели взаимодействия субстратов (жирных кислот и слож ных липидов) с активными центрами липоксигеназ ZmLOX3 и GmLOX1, согласно кото рым 9- и 13-специфичность липоксигеназных реакций определяется не позиционированием субстрата, а архитектурой ферментов.

4. Выявлено, что первичная структура большинства липоксигеназ определяет специ фичность ферментативной активности;

исключение составляют липоксигеназы высших растений, у которых взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и регио специфичностью действия не выявляется. Липоксигеназы, обладающие 9 специфичностью, являются монофилетической группой, произошедшей от 13 специфичных липоксигеназ у цветковых растений перед дивергенцией однодольных и двудольных.

5. Показано участие (7S)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты в липоксиге назном каскаде растений: при участии дивинилэфирсинтазы NtDES табака и алленоксид синтазы ZmAOS1 кукурузы (7S)-гидроперекись превращается в дивиниловый эфир (динор-колнеленовую кислоту) и -кетол, соответственно.

6. Установлено, что алленоксидсинтаза LeAOS3 томата, принадлежащая подсемейст ву CYP74C, является мультифункциональным ферментом и, в отличие от алленоксидсин таз подсемейства CYP74А, катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена. Гидролиз протекает стереоспецифично с образованием (9R) -кетола;

циклизация приводит к образованию рацемической смеси цис-10-оксо-11 фитоеновой кислоты.

7. Клонированы нуклеотидные последовательности, соответствующие трем полно размерным мРНК генов подсемейства CYP74B, обнаруженным в транскриптоме листьев льна (Linum usitatissimum L.), инокулированных клетками фитопатогенного штамма Pectobacterium atrosepticum SCRI1043. Получен очищенный препарат функционально ак тивного рекомбинантного фермента CYP74B16 (GenBank ID: HQ286277.1).

8. Определены кинетические параметры фермента CYP74B16, в соответствии с кото рыми новый фермент является строго 13-гидропероксид-специфичным;

предпочтитель ным субстратом является 13-гидроперекись -линоленовой кислоты, основным продуктом катализируемой реакции – (5Z)-этероленовая кислота. Фермент CYP74B идентифицирован как 13-специфичная дивинилэфирсинтаза, которой присвоено триви альное название LuDES. По критериям молекулярной филогении LuDES относится к под семейству CYP74B, включавшему до настоящего времени исключительно 13 гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

9. Выявлены сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов CYP74. На основе анализа первичной и третичной структуры белков впервые проведены конверсии ферментов разных функциональных групп. В результате аминокислотной за мены E292G в центральном домене I-спирали LuDES проведена конверсия дивинилэфир синтазы в алленоксидсинтазу. Замены аминокислотных остатков F295I, K302S, S297A и T366Y в полипептидной цепи LeAOS3 привели к превращению алленоксидсинтазы (де гидразы) в гидропероксидлиазу (изомеразу). Мутации MtHPL F284I и N285T привели к появлению продуктов гомолитической фрагментации углеродного остова – (9Z,11E)-13 оксотридекадиеновой и (9Z)-11-оксоундеценовой кислот.

10. В результате объединения ферментов CYP74 животных, споровых и цветковых растений в отдельную монофилетическую группу, гомологичную цитохромам Р450 про кариот и нитчатых грибов, показано древнее происхождение семейства CYP74, имевшее место до дивергенции последнего общего предка эукариот. Данное семейство могло уча ствовать в начальных этапах эволюции цитохромов Р450.

11. Показано, что в эволюции ферментов CYP74 высших растений появление монофи летической группы 13-ГПЛ (подсемейства CYP74В, CYP74F) происходило одновременно с появлением 13-АОС споровых (подсемейство CYP74G). Следующим этапом явилось образование группы, включающей 13-АОС цветковых (CYP74А), 9/13-АОС (подсемейст во CYP74А*), 9-АОС и 9/13-ГПЛ (подсемейство CYP74С).

12. Дивинилэфирсинтазы имеют полифилетическое происхождение на поздних этапах эволюции семейства CYP74 и не образуют таксономически обособленной единицы;

вы деление данных ферментов в отдельные подсемейства (CYP74D, CYP74H) является ус ловным.

13. Субстратная специфичность и тип катализа являются существенными таксономи ческими признаками представителей семейства CYP74, отражающими распределение по филогенетическим группам;

дивинилэфирсинтазы связаны с близкородственными груп пами общей субстратной специфичностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Grechkin, A.N. Hydroperoxide lyases (CYP74C and CYP74B) catalyze the homolytic isomerization of fatty acid hydroperoxides into hemiacetals / A.N. Grechkin, F. Bruhlmann, L.S.

Mukhtarova, Y.V. Gogolev, M. Hamberg // Biochimica et Biophysica Acta. – 2006. – V. 1761.

– P. 1419-1428.

2. Чечеткин, И.Р. Регио- и стереоспецифичность рекомбинантной липоксигеназы- сои / И.Р. Чечеткин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. – 2007. – Т. 415, № 6. – С. 829-831.

3. Grechkin, A.N. Tomato CYP74C3 is a multifunctional enzyme not only synthesizing al lene oxide but also catalyzing its hydrolysis and cyclization /A.N. Grechkin, L.S. Mukhtarova, L.R. Latypova, Y.V. Gogolev, Y.Y..Toporkova, M. Hamberg // Chembiochem – 2008. – V. 9.– P. 2498-2505.

4. Toporkova, Y.Y. Determinants governing the CYP74 catalysis: Conversion of allene ox ide synthase into hydroperoxide lyase by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V.

Gogolev, L.S. Mukhtarova, A.N. Grechkin // FEBS Letters. – 2008. – V. 582. – P. 3423-3428.

5. Чечеткин, И.Р. Специфичность окисления гомологов линолевой кислоты липокси геназами растений / И.Р. Чечеткин, Е.В. Осипова, Н.Б. Тарасова, Ф.К. Мухитова, М. Хам берг, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Биохимия. – 2009. – Т. 74. – С. 1052-1059.

6. Осипова, Е.В. Рекомбинантная 9-липоксигеназа кукурузы: экспрессия, очистка и свойства / Е.В. Осипова, Р.И. Чечеткин, Ю.В. Гоголев, Н.Б. Тарасова // Биохимия. – 2010.

– Т. 75. – С. 968-983.

7. Топоркова, Я.Ю. Изменение катализа ферментов подсемейства CYP74C в результа те сайт-направленного мутагенеза / Я.Ю. Топоркова, Е.В. Осипова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. – 2010а. – T. 435. – C. 117-120.

8. Топоркова, Я.Ю. Происхождение разнообразия семейства CYP74 цитохромов Р по результатам сайт-направленного мутагенеза / Я. Ю. Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, Ю.В.

Гоголев, А.Н. Гречкин // Вестник Московского университета. Сер. 16, Биология. – 2010б.

– N 4. – С. 29– 9. Chechetkin, I.R. Oxidation of glycerolipids by maize 9-lipoxygenase and its A562G mu tant / I.R. Chechetkin, E.V. Osipova, L.L. Antsygina, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Chem.

Phys. Lipids – 2011. – V. 164. – Р. 216-220.

10. Mukhtarova, L.S. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: Non-volatile oxylipins and their age and stress dependent alterations / L.S. Mukhtarova, F.K. Mukhitova, Y.V. Gogo lev, A.N. Grechkin // Phytochemistry. – 2011. – V. 72. – Р. 356-364.

11. Гоголев, Ю.В. Выявление и первичная характеристика нового цитохрома CYP74B1 льна (Linum usitatissimum) / Ю.В. Гоголев, С.С. Горина, Н.Е. Гоголева, Я.Ю.

Топоркова, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, А.Н. Гречкин // Доклады Академии наук. – 2011.– Т. 440. – С. 540-543.

12. Gogolev, Y.V. Green leaf divinyl ether synthase: Gene detection, molecular cloning and identification of a unique CYP74B subfamily member / Y.V. Gogolev, S.S. Gorina, N.E. Gogo leva, Y.Y. Toporkova, I.R. Chechetkin, A.N. Grechkin // Biochimica et Biophysica Acta. – 2012. – V. 1821. – P. 287-294.

13. Ермилова, В.С. Изменение каталитических свойств дивинилэфирсинтаз в результа те единичных аминокислотных замен / Ермилова В.С., Горина С.С., Топоркова Я.Ю., Мухтарова Л.Ш., Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н. // ДАН. – 2013. – С. 1-4. – В печати.

14. Toporkova Y.Y. Structure-function relationship in CYP74 family: conversion of divinyl ether synthases into allene oxide synthases by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, V.S.

Ermilova, S.S. Gorina, L.S. Mukhtarova, E.V. Osipova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // FEBS Letters. – 2013. – P. 1-7.– In press. DOI 10.1016/j.febslet.2013.06.030.

ТЕЗИСЫ МАТЕРИАЛОВ НАУЧНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ 1. Осипова Е.В. Получение и свойства рекомбинантного белка 9-липоксигеназы куку рузы и его мутантной формы / Е.В. Осипова, И.Р. Чечеткин, А.Ю. Ярин, Ф.К. Мухитова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. – 2008. – Новосибирск: «Арта». – С. 42.

2. Toporkova Y.Y. Characterization of tomato allene oxide synthase LeAOS3 catalysis and its alteration by site-directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, Y.V. Gogolev, L.S. Mukhtarova, A.N. Grechkin // FEBS Journal. – 2009. – V. 276, Supp. 1 "34-th FEBS cоngress "life's Molecu lar Interactions". – Prague: Wiley-Blackwell. – P. 14.

3. Toporkova Ya.Yu. Origin of the CYP74 family of cytochromes P450 diversity based on results of site-directed mutagenesis / Ya.Yu. Toporkova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N.Grechkin // Аbstracts of the 2nd Moscow International Conference "Molecular Phylogenet ics". – 2010. – Moscow: Torus press. – P. 169.

4. Toporkova Ya.Yu. Alteration of catalytic mechanism of tomato allene oxide synthase LeAOS3 and alfalfa hydroperoxide lyase MtHPL by site-directed mutagenesis / Ya.Yu. Topork ova, L.Sh. Mukhtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin // 35th FEBS Congress Abstracts Book.

– 2010. – Gothenburg: Wiley-Blackwell. – P. 260.

5. Горина С.С. Дивинилэфирсинтаза LuDES льна – новый фермент подсемейства CYP74B / С.С. Горина, Я.Ю. Топоркова, Н.Е. Гоголева, Л.Ш. Мухтарова, И.Р. Чечеткин, Ю.В. Гоголев // Сб. тезисов VII Съезда общества физиологов растений России «Физиоло гия растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». – 2011. Н. Новгород: Изд. НГУ. – С. 196–197.

Gorina S.S. The unique enzyme of the CYP74B subfamily from flax (Linum usitatis 6.

simum L.) / S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, N.E. Gogoleva, L.S. Mukhtarova, I.R. Chechetkin, Y.V. Gogolev and A.N. Grechkin // 36th FEBS Congress Abstracts Book. – 2011. – Torino:

Wiley-Blackwell. – P. 211.

7. Топоркова Я.Ю. Исследование структуры комплекса мини- фермента, моделирую щего каталитический центр цитохрома Р450 (CYP74), с субстратом / Я.Ю. Топоркова, С.С. Горина, Л.Ш. Мухтарова, Е.А. Ермакова, Ю.В. Гоголев, А.Н. Гречкин // Сб. тезисов 4 съезда биофизиков России. – 2012. – Н. Новгород: Изд. НГУ. – стр. 219.

8. Toporkova Y.Y. Mini-enzyme modeling catalytic center of cytochrome P450 (CYP74) as a model for enzyme-substrate complex study / Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, E.A. Ermakova, L.S. Mukhtarova, Y.V. Gogolev, Y.F. Zuev, A.N.Grechkin // 4ht EMBO meeting Abstracts Book. – 2012. – Nice: Wiley-Blackwell. – Р. 88.

9. Gorina S.S. Structural and functional characteristics of new divinyl ether synthase (CYP74B16) from flax (Linum usitatissimum L.) / S.S. Gorina, Y.Y. Toporkova, L.S. Muk htarova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Plant Biology Congress. Book of abstracts. 2012.

Freiburg. P. 14.

10. Toporkova Y.Y. Interconversions of the enzymes within the CYP74 family by site directed mutagenesis / Y.Y. Toporkova, S.S. Gorina, V.S. Ermilova, L.S. Mukhtarova, Y.V.

Gogolev, A.N. Grechkin // 18th International conference on cytochrome P450: biochemistry, biophysics, biotechnology. Book of abstracts. 2013. Seattle. P. 106.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую признательность моему научному консультанту академику А.Н. Гречкину за неоценимую помощь в работе. Выражаю искреннюю благодарность профессору Н. Келлер (Университет Висконсин) и доктору А. Фаммартино (Университет Турина) за предоставленные препараты рекомбинантных плазмид. Благодарю сотрудни ков лаборатории оксилипинов Казанского института биохимии и биофизики Л.Ш. Мухта рову, Ф.К. Мухитову, Н.В. Ланцову, И.Р. Чечеткина, А.Ю. Ярина за помощь в подготовке растительного материала и проведение биохимических исследований. Выражаю призна тельность профессору Ю.Ф. Зуеву и Б.И. Хайрутдинову за проведение ЯМР исследований. Выражаю особую благодарность Н.Е. Гоголевой, Я.Ю. Топорковой, С.С.

Гориной, Е.В. Осиповой и всем аспирантам и сотрудникам лаборатории молекулярной биологии, без чьих знаний, таланта и увлеченности данная работа не могла бы состояться.

Выражаю глубокую благодарность Российскому фонду фундаментальных исследо ваний, Президиуму РАН и Министерству образования РФ за финансовую поддержку ис следований.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.