авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Создание интегрированной геномно-протеомной системы для типирования и изучения патогенов бактериальной и вирусной природы

-- [ Страница 2 ] --

Сам факт использования разработанной технологии для анализа как бактери альной, так и вирусной ДНК (или РНК в случае ВГС) указывает на универсальность предложенного нами подхода. Будучи реализован в плашечном формате, этот метод дает возможность использовать роботизированные системы для разнесения образцов и реагентов, автоматизированные алгоритмы считывания результатов. Внедрение данного подхода, позволяющего осуществлять одновременное тестирования 96/384/1536 образцов, может значительно ускорить масштабные исследования, на правленные на мониторинг распространения ВГВ и ВГС в нашей стране. В тоже вре мя, метод минисеквенирования имеет явное преимущество перед прямым считывани ем нуклеотидной последовательности, поскольку позволяет однозначно выявлять случаи смешанного инфицирования вирусами с различными генотипами.

2.2.5. Молекулярное типирование бактериальных патогенов Преобладание хромосомных механизмов формирования резистентности, рас пространяющихся клонально в микробных популяциях, диктует необходимость до полнения средств генетического тестирования резистентности средствами штаммово го типирования, нацеленными на отслеживание путей распространения инфекции.

Поскольку для популяции пневмококка существуют общепризнанные стан дартные методы типирования – MLST и серотипирование на основании капсидных антигенов, основное внимание в этой области было уделено типированию туберкуле за и гонококка. Причем ставились задачи оценить пригодность разнообразных мето дов для решения конкретных эпидемиологических задач, связанных с молекулярно генетической характеристикой и оценкой природного разнообразия бактериальных популяций, а так же поиска закономерностей распространения лекарственной устой чивости.

Среди существующего разнообразия методов типирования туберкулеза основ ное внимание уделено двум – сполиготипирование и мультилокусное VNTR типиро вание, первый из которых является специфичным для M. tuberculosis. Его применение ограничивается изучением популяции микобактерий, поскольку основывается на оп ределении структуры уникального генетического элемента (т.н. DR-региона) методом гибридизации. Второй подход – VNTR типирование – является достаточно универ сальным и применяется для изучения генетического разнообразия многих микроорга низмов [Van Belkum, 2007].

Оба метода использованы для типирования ограниченной группы клинических изолятов (n = 115), выделенных от больных легочным туберкулезом жителей Москвы и Московской области (проживание не менее 5-ти лет). Согласно данным сполиготи пирования, исследованная выборка разделена на 20 сполиготипов, входящих в состав 15 генетических семейств. Наибольший кластер образован 76-ю (66,0 %) изолятами, относящимися к семейству Beijing. Гораздо меньше изолятов входило в состав двух следующих по величине семейств – LAM и T, 12 (10,4 %) и 10 (8,7 %) изолятов, соот ветственно. Шесть изолятов имели уникальный генотип, не представленый в между народных базах данных. Разрешающая способность метода сполиготипирования ока залась весьма низкой (D = 0,59).

При этом для штаммов, принадлежащих к преобладающему в исследуемой вы борке генетическому семейству Beijing, значение индекса разнообразия Симпсона со ставило всего 0,08. В то же время, для группы штаммов, не относящихся к этому се мейству, разрешающая способность сполиготипирования оказалась весьма высокой (D = 0,94). Однако, учитывая, что большая часть изолятов (66,0 %) в исследованной выборке относилась к семейству Beijing, становится очевидным, что использование метода сполиготипирования без комбинации с другими схемами молекулярно эпидемиологического анализа, недостаточно эффективно для мониторинга M. tubercu losis в России.

Значительное преобладание в исследуемой выборке изолятов, относящихся, по данным сполиготипирования, к семейству Beijing, является характерной особенно стью популяции M. tuberculosis, циркулирующей на территории Российской Федера ции [Drobniewski, 2005], а также в странах – бывших республиках СССР и многих ре гионах мира (Азия, Южная Африка, Северная Америка) [Bifani, 2002]. В качестве од ной из причин широкой мировой экспансии штаммов этого семейства предполагается ассоциация генотипа Beijing с устойчивостью (в т.ч. и MDR) к противотуберкулезным препаратам [Bifani, 2002].

В исследованной нами выборке MDR-изоляты также достоверно чаще встреча лись среди семейства Beijing (59/76;

77,6 %), чем среди других семейств (17/39;

43,6 %) (2 = 13,3;

p0,001), что подтверждает ведущую роль изолятов семейства Bei jing в распространении мультирезистентного туберкулза в Московском регионе.

Анализ разнообразия исследованной микробной популяции при помощи 24-х локусного VNTR типирования позволил обнаружить 71 различных генетических ва риантов, из которых 59 (83,0 %) были уникальными (выявлялись только у одного изо лята в выборке). Остальные 56 изолятов M. tuberculosis образовывали 12 кластеров.

Три основных кластера имели VNTR-профили 223325173533424454433672, 223325153533424454433682 и 22332513533424454433662 и включали 13 (11,3 %), (10,4 %) и 9 (7,8 %) изолятов M. tuberculosis, соответственно. Необходимо отметить, что изоляты, образующие основные кластеры, входили в состав крупной эволюцион но близкой группы. Разрешающая способность 24-х локусного VNTR-анализа значи тельно превосходила таковую для сполиготипирования – 0,97 и 0,59, соответственно.

Различная степень вариабельности тех или иных VNTR локусов позволила рас смотреть возможность оптимизации схемы VNTR типирования M. tuberculosis за счет исключения локусов, характеризующихся низким полиморфизмом. При этом шесть отобранных нами локусов (MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, M tub21, QUB-11b и QUB-26), отличающихся наибольшим индексом вариабельности (более 0,5), обеспечивали вы сокую разрешающую способность (D = 0,94), приближающуюся к значениям разре шающей способности всей совокупности 24 локусов. Как показывают исследования других авторов [Wada, 2007], подобный подход, направленный на оптимизацию про токола VNTR анализа за счет формирования альтернативной комбинации локусов с учетом молекулярно-генетических особенностей региональной микробной популя ции, представляется весьма интересным и перспективным для использования в сис темах национального мониторинга туберкулезной инфекции.

Сравнение разрешающей способности комбинаций различных методик геноти пирования, использованных в данной работе (табл. 6) показало, что наилучшие ре зультаты достигаются путем сочетания сполиготипирования с 24-х локусным VNTR анализом.

Таблица 6. Сравнительная характеристика использованных методов молекулярно генетического типирования клинических изолятов M. tuberculosis.

Общее Число Размеры кла Метод, исследуемая группа Число число уникальных стеризованных D изолятов кластеров генотипов генотипов групп Сполиготипирование Все изоляты 2 – 26 19 7 0, Изоляты семейства Beijing 2 – 3 1 2 0, Изоляты, не относящиеся 2– 23 18 5 0, к семейству Beijing VNTR-анализ, все изоляты 2 – 24-VNTR 71 52 12 0, 2 – 12-MIRU-VNTR 48 36 12 0, 2 – 6-VNTR 49 36 13 0, Сполиго+24-VNTR Все изоляты 2 – 74 63 11 0, Изоляты семейства Beijing 2 – 36 26 10 0, Сполиго+12-MIRU-VNTR Все изоляты 2 – 53 42 11 0, Изоляты семейства Beijing 2 – 17 11 8 0, Сполиго+6-VNTR Все изоляты 2 – 56 44 12 0, Изоляты семейства Beijing 2 – 22 14 8 0, Уникальный генотип – генотип, представленный в исследуемой выборке одним штаммом.

24-VNTR – типирование с использованием 24 локусов: MIRU-2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40;

ETR-A, B, C;

Mtub-04, 21, 29, 30, 34, 39;

QUB-11b, 26, 12-MIRU-VNTR – типирование с использованием 12 локусов: MIRU-2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 6-VNTR – типирование с использованием шести наиболее полиморфных локусов: MIRU-26, MIRU-31, ETR-A, M tub21, QUB-11b и QUB- D – дискриминирующая способность метода, индекс Симпсона Необходимо отметить, что это первый опыт применения VNTR типирования по 24 локусам для российских изолятов M. tuberculosis. Будучи изначально известным как микросателлитный анализ эукариотической ДНК, начиная с 2000 года, мультило кусное VNTR типирование активно используется для исследования микроэволюции прокариот [Grissa, 2008]. При этом M. tuberculosis был первым микроорганизмом, для которого сформулирован принцип VNTR анализа [Supply, 2000]. Сейчас общедоступ ная база данных (http://minisatellites.u-psud.fr) содержит информацию о вариабельно сти числа тандемных повторов в геномах более чем 150 видов бактерий, и этот метод типирования продолжает активно развивается в силу своей универсальности, воз можности автоматизации в исполнении, простоте интерпретации, точности и воспро изводимости получаемых данных.

В качестве потенциальных схем типирования N. gonorrhoeae в данной работе рассмотрены прямое масс-спектрометрическое профилирование, por-типирование и мультилокусное типирование в двух вариантах реализации – мультиантигенное (NG MAST) и мультилокусное секвенирование (MLST).

Осуществленное прямое масс-спектрометрическое профилирование географи чески разнородной группы из 278 изолятов гонококка продемонстрировало постоян ство получаемых масс-профилей, что полностью закрыло вопрос о возможности при менения данной методики в штаммовом типировании гонококка.

Гетерогенность популяции на уровне изменчивости гена porB оценивали двумя способами, в основе которых лежал анализ практически полноразмерной (более п.н.) нуклеотидной последовательности гена porB.

Первый подход заключался в установлении серотипа возбудителя на основании сравнении анализируемых последовательностей гена porB с представленными в базах данных по принципу максимальной гомологии. Предложенный анализ позволил от носительно легко получить общее представление о гетерогенности популяции, при чем в терминах серотипирования – традиционного метода молекулярно эпидемиологической характеристики штаммов N. gonorrhoeae. Таким образом, дан ные генетического анализа, приведенные к формату «серотипирования» могут быть сопоставлены с уже накопленной в разных странах информацией о циркулирующих в популяции гонококка сероварах и серотипах.

Всего в исследованной выборке (n = 464) выявлено 11 P1B и 6 P1A серотипов, отмечено преобладание в выборке P1B серовара (88,6 %) с высоким процентом встре чаемости серотипов Р1B2 (41,3 %), Р1B3 (29,6 %) и Р1B22 (9,9 %). В группе штаммов, относящихся к P1A серовару (11,4 %), доминирует серотип Р1A6 (71,2 %). Индекс разнообразия Симпсона, определяющий дискриминирующую способность метода, составил 0,78, что свидетельствует о низкой эффективности такого типирования.

Следует отметить, что убедительные данные о представленности основных се ротипов гонококка для российской популяции получены впервые. Кроме того, сопос тавление серотипа гонококка с профилем устойчивости позволило проверить гипоте зу об ассоциации P1B серовара с феноменом мультирезистентности. Установлено, что наблюдаемая ассоциация обусловлена известными изменениями локуса penB, участ вующими в формировании неспецифической устойчивости гонококка путем сниже ния проницаемости поринового канала для ксенобиотиков [Shafer, 2006].

Второй подход в типировании популяции гонококка на основании регистрации изменчивости гена porВ состоял в прямом детальном сравнении нуклеотидных после довательностей, оценке их вариабельности, выявлении уникальных аллельных про филей. Такой подход, несомненно, дает более полное представление об изменчивости гена белка порина, более информативен с точки зрения объема и точности эпидемио логической информации, хотя и более трудоемок.

На выборке, состоящей из 103 клинических изолятов N. gonorrhoea, получен ных из 5-ти областных центров РФ – Иркутск (n = 22), Самара (n = 10), Архангельск (n = 28), Мурманск (n = 14), Санкт-Петербург (n = 29), осуществлен детальный срав нительный анализ нуклеотидных последовательностей генов porВ, а также апробиро ваны две альтернативные системы мультилокусного молекулярного типирования.

Среди исследованных изолятов 92 имели аллель 1b гена porВ, соответствующую P1В серовару, и 11 - аллель 1a (P1A серовар). Всего были выявлены 55 варианта гена porB, при этом обнаружена более высокая гетерогенность аллеля porB1b по сравнению porB1a. Индекс разнообразия Симпсона данного метода типирования составил 0,96.

Кластерный анализ позволил разделить исследованную выборку на две круп ные группы, соответствующие аллелям porB1a и porB1b, а также выделить несколько групп внутри аллеля porB1b. Полученное распределение свидетельствует о высокой вариабельности исследованной выборки, однако, не отражает ни географию выделе ния исследованных изолятов гонококка, ни их фенотип.

Поскольку в современной эпидемиологии гонококка нет устоявшихся систем штаммовой дискриминации, кроме серотипирования, базирующегося на антигенной структуре белка порина, нами рассмотрены две альтернативные системы мультило кусного молекулярного типирования, каждая из которых имеет шансы стать основной в эпидемиологии гонококка. Это мультиантигенное типирование (NG-MAST), оцени вающее полиморфизм генов porB и tbpB [Martin, 2004] и мультилокусное секвениро вание (MLST) [Maiden, 1998]. Причем в случае последнего был изучен расширенный набор генов с учетом их индивидуальной вариабельности.

По результатам NG-MAST вся анализируемая выборка изолятов (n = 103) ока залась разделена на 61 сиквенс-тип, что ощутимо больше, чем при por-типировании (55 вариантов), однако сохранилось четкое разграничение между двумя сероварами.

57 (55 %) изолятов сформировали 15 различных сиквенс-типов, представленных дву мя и более изолятами. Самые крупные из них были 206 (n = 6), 285 (n = 7), 1043 (n = 8) и 972 (n = 5). Остальные 46 сиквенс-типа были представлены одиночными изоля тами, включая четыре бета-лактамазных гонококка. Стоит отметить, что наиболее распространенный в странах Евросоюза сиквенс-тип 225 [Palmer, 2008] обнаружен у единственного гонококка, изолированного в Иркутске. Расчитанный индекс разнобра зия Симпсона составил 0,98, что свидетельствует в пользу высокой дискриминирую щей способности метода.

Анализ генетической вариабельности 13-ти генов «домашнего хозяйства», про веденный для той же группы клинических изолятов N. gonorrhoeae (n = 103), выявил существенные отличия в уровне их изменчивости. Причем полученные характеристи ки генов оказались сопоставимы с результатами аналогичного исследования, прово димого в это же время на группе из 204 гонококков, выделенных в клиниках Балти мора [Prez-Losada, 2005].

Ориентируясь на максимально выявленное количество аллельных вариантов, обоснованным для дальнейшего использования в мультилокусном типировании гоно кокка выглядит набор 7 локусов: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC. Этот перечень несколько отличается от применяемого для типирования N. meningitidis (abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC, pgm) и предложенного как универсальный типирующий инст румент для всех нейссерий (N. meningitidis, N. lactamica и N. gonorrhoeae) в рамках общедоступного MLST сайта (www.pubmlst.org), функционирующего на базе Окс фордского университета с 2006 года [Bennett, 2007].

Осуществленное по стандартному международному протоколу MLST гонокок ка разделило анализируемую выборку на 30 секвенс-типов, индекс разнообразия Симпсона в этом случае составил 0,91. В случае типирования по максимально гетеро генным локусам: fumC, gdh, glnA, gnd, pilA, pyrD, serC, стало возможным разделить исследуемую выборку на 63 сиквенс-типа. Индекс разнообразия Симпсона при таком варианте MLST стал 0,98. В обоих случаях MLST позволило отойти от обязательного в формате por-типирования и NG-MAST разделения на серовары с выделением от личных от упомянутых методов групп изолятов.

Стоит отметить, что оба метода типирования – NG-MAST и MLST – так или иначе группируют изоляты гонококка согласно региону их выделения. Является ли это следствием клонального распространения гонококка в изолированных группах населения, или отражает миграционные процессы – вопросы будущих исследований.

Однако, большая часть изолятов имела уникальные сиквенс-типы, не связанные меж ду собой. Более того, исследуемая выборка содержала 39/61 (64 %) новых сиквенс типов согласно NG-MAST схеме типирования и 24/30 (80 %) – согласно MLST.

Таблица 7. Сопоставление результатов кластеризации клинических изолятов гонококка с профилем устойчивости к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину. Чувствительный (S), ус тойчивый (R) фенотипы и фенотип с промежуточной чувствительностью (I) установлены согласно CLSI (www.clsi.org) критериям.

Сиквен-тип по MLST преобладающий фенотип чувствительности N (%) схеме типирования изолятов (доля изолятов с данным фенотипом, %) пенициллин тетрациклин ципрофлоксацин 1595 8 (7,8) *S/I S (87,5) S (100,0) 1892 8 (7,8) S (87,5) S (87,5) S (100,0) 1901 11 (10,7) I (100) R (90,1) R (100,0) 1905 11 (10,7) I (81,8) R (81,8) S (100,0) 6716 25 (24,3) I (84,0) R (65,0) R (100,0) 6720 5 (4,8) S/I S (100,0) S (100,0) * - равное соотношения изолятов Сопоставление данных молекулярного типирования гонококка с профилем ус тойчивости клинических изолятов позволило установить определенную закономер ность в распространении резистентности для данной выборки. Изоляты, относящиеся к шести наиболее крупным кластерам, идентифицированным согласно международ ному протоколу MLST, имели сходный профиль устойчивости к пенициллину, тетра циклину, ципрофлоксацину внутри каждой группы (табл. 7).

Малый объем выборки не позволил сделать выводы о существовании в россий ской популяции гонококка крупных клональных комплексов с характерным феноти пом. Однако, опираясь на собственные данные, мы можем предполагать преимущест венное распространение сиквенс-типов 6716 и 1901, для представителей которых ха рактерны снижение чувствительности к пенициллину, устойчивость к тетрациклину и фторхинолонам.

Полученные результаты в полной мере отражают ситуацию, существующую в сфере молекулярного типирования гонококка. Поскольку обе схемы мультилокусного секвенирования – NG-MAST и MLST, были предложены почти одновременно, идет лавинообразное накопление информации о популяционной изменчивости гонококка в разных странах – Австралии [Martin, 2004], Швеции [Olsen, 2008], Китае [Yang, 2006].

Имеются даже сведения о NG-MAST типировании 76 образцов, изолированных на территории Архангельска [Unemo, 2007]. Закономерно, что среди исследованных изолятов также преобладали вновь идентифицированные сиквенс-типы – 37/ (77 %). Из них три сиквенс-типа – 1534, 1544 и 1548 встретились среди проанализи рованной нами выборке и также относились к изолятам, выделенным в Архангельске.

В настоящий момент сложно сформулировать однозначное мнение о границах применимости использованных в настоящем исследовании методов типирования го нококка. Была продемонстрирована актуальность использования por-типирования и/или NG-MAST для отслеживания путей передачи инфекции между половыми парт нерами [Bilek, 2007;

Liao, 2009], имеются указания на клональность распространения лекарственной устойчивости в популяции гонококка Южной Африки и Шотландии [De Jongh, 2008;

Palmer, 2008]. В тоже время мультилокусное секвенирование, имею щее дело с консервативными фрагментами генома и фиксирующее более «древние» и стабильные генетические изменения, в большей степени отвечает задачам популяци онной геномики по изучению микроэволюции микроба [Martin, 2008].

Таким образом, полученные данные вносят важный вклад в создание наиболее информативной, стандартизированной системы молекулярного типирования N. go norrhoeae. Примечательно, что в основе всех методов, адекватных задачам молеку лярно-эпидемиологического мониторинга гонококка (por-типирование, NG-MAST, мультилокусное секвенирование) лежит выявление аллельных полиморфизмов нук леотидной последовательности ДНК, что открывает возможность применения новых, более дешевых высокопроизводительных технологий сканирования бактериальных геномов.

В частности, уже продемонстрирована возможность использования направлен ной деградации нуклеиновых кислот с последующей МАЛДИ масс спектрометрической детекцией для анализа нуклеотидной последовательности 7-ми локусов геномной ДНК N. meningitidis, необходимых для осуществления типирования возбудителя и установления его секвенс-типа [Honisch, 2007].

2.3. Сравнительная протеомика гонококка для выявления новых меха низмов формирования лекарственной устойчивости.

В ходе молекулярно-генетического мониторинга гонококка были отобраны клинических изолята со сниженной чувствительностью к цефтриаксону (МПК= 0,06 – 0,12 мг/л) и один изолят с МПК пенициллина 0,25 мг/л и генотипом penAmut. Для этого генотипа не установлена достоверная ассоциация с фенотипической устойчивостью и, возможно, в этом случае бактериальные клетки реализуют некие неизвестные спосо бы защиты от воздействия АМП. Оба рассматриваемых препарата относятся к лактамным антибиотикам, что позволяет предположить возможную общность меха низмов устойчивости. В качестве контроля выбран клинический изолят, чувствитель ный ко всему спектру тестируемых АМП и не имеющий нуклеотидных перестроек в генах, вовлеченных в процессы формирования антибиотикорезистентности гонокок ка, и обладающий сходным с изолятами опытной группы Por-типом (табл. 8).

Таблица 8. Микробиологическая и генетическая характеристика штаммов, отобранных для протеомного исследования.

Опыт Маркерный Контроль параметр е03.04 i19.05 ch37.06 k51. пенициллин 0,015 0,25 2 МПК (мг/л) цефтриаксон 0,005 0,005 0,06 0, тетрациклин 0,03 0,25 2 ципрофлоксацин 0,001 0,002 16 спектиномицин 32,0 32,0 32 азитромицин 0,06 0,5 0,12 0, P1B3 P1B3 P1B2 P1B Por-тип blaTEM1 - - - Asp345a Asp345a Asp345a penA (ПСБ 2) wt лекарственой устойчивости Leu421Pro Leu421Pro ponA (ПСБ 1) Генетические маркеры wt wt Gly120Lis;

Gly120Lis;

penB (PorB1b) wt wt Ala121Asn Ala121Asp penC (PilQ) wt wt wt wt delA-35;

wt delA-35;

wt mtrR промотор;

MtrR wt wt tetM - - - Val57Met Val57Met rpsJ (RS10) wt wt Ser91Phe, Ser91Phe, gyrA (GyrA) wt wt Asp95Gly Asp95Gly Ser87Arg Ser87Arg parC (ParC) wt wt rrs (16S рРНК) wt wt wt wt Поскольку именно протеомные методы рассматриваются сейчас как один из основных инструментов изучения живых систем, в рамках данной работы был прове ден сравнительный анализ растворимой фракции клеточных белков изолятов e03.04 и i19.05, что позволило обнаружить белок порин на 2D карте изолята i19.05 (рис. 7, табл. 9).

Порин (PorB1 белок) является компонентом внешней мембраны клетки, который формирует каналы для пассивной диффузии небольших молекул, включая антибио тики, в периплазматическое пространство. Поскольку визуализация мембранных бел ков требует специальных условий экстракции и проведения 2D электрофореза, кото рые не были выполнены в данном эксперименте, факт обнаружения значительных ко личеств порина на протеомной карте изолята i19.05 потребовал адекватных объясне ний.

Порин (PorB1) Рисунок 7. Электрофореграммы растворимой фракции клеточных белков изолятов N.

gonorrhoeae e03.04 (А) и i19.05 (В) после культивирования на шоколадном GC агаре в стандартных условиях. Окраска серебром.

Таблица 9. Фрагмент сравнительной характеристики белкового профиля изолята i19.05 отно сительно e03.04. Серым выделены дифференциальные белки, идентифицированные как порин.

Количественное соотноше Наименование белка NCBI ID ние белка (i19.05/e03.04) PorB precursor (предшественник белка внешней мембраны 1) 2827064 30369, -фактор РНК-полимеразы 59801382 1662, PorB (белок внешней мембраны 1, порин) 54043055 1411, НАДФН-зависимая-флавинмононуклеотидредуктаза 59801813 515, белок теплового шока 59801766 257, 59802457 3-кетоацилредуктаза 160, АТФаза 59800521 115, PorB (белок внешней мембраны 1, порин) 54043055 93, фактор реассоциации рибосомы (RRF - ribosome recycling factor) 59802114 81, изопролилмалатизомераза 59801106 76, PorB (белок внешней мембраны 1, порин) 54043055 41, фенилаланин-тРНК-синтетаза 59800747 17, белок-шаперон СlpB 59801418 5, урацилфосфорибозилтрансфераза 59800797 5, пролиндегидрогеназа 7225623 5, Мы предположили, что это явление может быть вызвано нарушением процесса интеграции PorB1 во внешнюю мембрану, в результате чего белок накапливается в цитоплазме, или периплазматическом пространстве. В таком случае уменьшение доли порина в составе наружной мембраны приводит к снижению проницаемости клеточ ной стенки для АМП и формированию устойчивости к пенициллину в синергизме с мутацией в гене penA.

Поскольку через порины в микробную клетку поступает также тетрациклин, в пользу выдвинутой нами гипотезы свидетельствовал факт повышения МПК тетра циклина у изолята i19.05 (0,25 мг/л) при отсутствии известных хромосомных мута ций. Экспериментально измеренное накопление пенициллина и тетрациклина клетка ми изолята i19.05 было в три раза меньше по сравнению с изолятом е03.04 и лабора торным штаммом АТСС 49226.

Анализ транскриптов подтвердил 10-ти кратное превышение уровня экспрес сии мРНК порина в изоляте i19.05 по сравнению с е03.04. Однако, для изолята i19. не было зафиксировано отличий в нуклеотидной последовательности промоторной области гена porB, способных объяснить различия в экспрессии. Кроме того, отсутст вие мутаций в области сигнального пептида PorB, включающего первые 20 а.о. поли пептидной цепи, показало, что со стороны порина нет препятствий к его встраиванию во внешнюю мембрану.

Процессы биогенеза белков внешней мембраны рассмотрены нами на примере N. meningitidis (рис. 8). Анализ транскриптов всех генов, потенциально вовлеченных в биогенез порина, продемонстрировал для большинства из них гиперэкспрессию в изоляте i19.05 по сравнению с е03.04, однако гены secA и surA экспрессировались одинаково (табл. 10).

Рисунок 8. Модель биогенеза белков наружной мембраны. Иниции рующую роль в этом процессе играет белок SecA, связывающийся при уча стии SecB с сигнальным пептидом белка-предшественника (prePorB1, prePilQ и т.п.). Образуемый совместно с белками Sec D, E, F, G, Y Sec транслокон проталкивает белок на ружной мембраны сквозь внутреннюю мембрану клетки. В ходе транслокации сигнальный пептид отщепляется сери новой протеазой, и по выходу из Sec канала белок передается двумя шапе ронами Skp и SurA на периплазмати ческий фрагмент мембранного белка Omp85, завершающего процесс инте грации.

В ходе анализа нуклеотидных последовательностей были обнаружены отличия в кодирующих областях генов surA и omp85 изолятов i19.05 и е03.04 (табл. 10). Дан ный факт позволяет предположить функциональную недостаточность соответствую щих белков, обеспечивающих терминальные стадии интеграции порина в структуру внешней мембраны. В этом случае невстроенные в мембрану молекулы порина нака пливаются в периплазме, что позволяет обнаружить их во фракции растворимых бел ков при протеомном анализе.

Описанный нами механизм устойчивости гонококка не является специфиче ским в отношении пенициллина, а затрагивает широкий спектр АПМ, что объясняет факт повышения МПК тетрациклина и азитромицина для изолята i19.05. Интересно, что указанные нарушения проницаемости внешней мембраны никак не сказываются на чувствительности данного изолята к цефтриаксону, что дает основание предполо жить существование альтернативных путей проникновения этого антибиотика в бак териальную клетку.

Таблица 10. Генетический анализ элементов метаболического пути, ответственного за транс локацию белков внешней мембраны гонококка, для изолятов i19.05 и е03.04. Серым выделены гены, экспрессия которых не отличается в тестируемых изолятах.

Белок Соотношение концентрации Ген (п.н.) Мутации, отличные для изолята кДНК изолятов i19.05 и е03.04 i19.05 по сравнению с e03. нет SecA 1 secA (2751) нет SecB 11,2 secB (444) нет SecD 31,1 secD (1857) нет SecE 4,6 secE (279) нет SecF 58,1 secF (936) нет SecG 54,2 secG (351) нет SecY 17,5 secY (1311) Сериновая протеаза нет 17,5 NGO0138 (1500) Asn105Ser, Lys206Glu, SurA 1 surA (1002) Ala230Thr Leu568Trp Omp85 16 omp85 (2379) Феномен устойчивости к цефалоспоринам исследован на основании регистра ции изменений белковых фракций изолятов е03.04, ch37.06 и k51.05, возникающих при добавлении в среду низких концентраций цефтриаксона. В данном случае приме нение дифференциального протеомного анализа было продиктовано существенными отличиями в генетическом профиле между опытной группой изолятов со сниженной восприимчивостью к цефтриаксону – ch37.06, k51.05, и контролем – е03.04.

Хотя основное внимание в формировании устойчивости к цефалоспоринам уделяется мозаичности ПСБ 2 [Takahata, 2006;

Lindberg, 2007;

Ochiai, 2008], по ре зультатам полноразмерного секвенирования гена penA изолятов ch37.06, k51.05, е03.04 и штамма АТСС 49226 (два последних образца служили контролем), мы не об наружили мутаций, объясняющих снижение чувствительности к цефтриаксону изоля тов ch37.06 и k51.05.

Исследование изменений, происходящих в клетках N. gonorrhoeae под действи ем цефтриаксона, с помощью 2D электрофореза с дифференциальным окрашиванием белковых фракций флуоресцентными красителями Cy3-DIGE и Cy5-DIGE (табл. 11) позволило сделать заключение о схожести наблюдаемого метаболического ответа.

Среди зарегистрированных изменений обращают на себя внимание выражен ное увеличение экспрессии АВС-транспортеров и цистеинсинтазы на фоне резкого снижения экспрессии ферментов, обеспечивающих включение глутамата в основные метаболические пути клетки: глутаматдегидрогеназы, -кетоглутаратдекарбоксилазы, глутаминсинтетазы, карбомоилфосфатсинтетазы, что также согласуется со снижени ем уровня ферментов цикла трикарбоновых кислот. В целом, под влиянием цефтриак сона наблюдается общее угнетение основных метаболических путей бактериальной клетки, что особо подчеркивает значимость белков, продукция которых возрастает.

На основании наблюдаемой картины выдвинута гипотеза, что молекулярные события, разворачивающиеся в клетке в процессе нарушения целостности пептидог ликана под действием -лактамных антибиотиков, напоминают ситуацию, возникаю щую при гиперосмотическом стрессе [Сsonka, 1989]. Ионам глутамата, наряду с ио нами калия, отводится ведущая роль в осморегуляции бактерий. С учетом того, что значительная часть обнаруженных нами дифференциальных изменений затрагивает метаболизм глутамата, следует рассмотреть возможные пути утилизации этой амино кислоты гонококком (рис. 9).

Таблица 11. Фрагмент сравнительной характеристики изменений белкового профиля изоля тов е03.04, ch37.06 и k51.05, происходящих под действием цефтриаксона. Маркерные для построения рабочей гипотезы белки выделены цветом: серый – снижение продукции белка в изолятах под дейст вием антибиотика, черный – усиление.

Соотношение интенсивности свечения опыт/контроль для Биохимический процесс в Название белка NCBI изолятов прокариотической клетке e03.04 ch37.06 k51. глутаматдегидрогеназа, Метаболизм глутамата 59801706 0,1 0,32 0, КФ: 1.4.1.3.

глутаминсинтетаза, Метаболизм глутамата, синтез 59801928 0,13 0, КФ: 6.3.1.2 клеточной стенки Рефолдинг белков с ошибочной шаперонин GroEL 59802396 0,15 0,35 0, конформацией при стрессе изоцитратдегидрогеназа Цикл трикарбоновых кислот 59801449 0,22 0, -кетоглутаратдекарбо- Метаболизм глутамата, цикл 59801313 0,3 0,22 0, ксилаза, КФ: 1.2.4.2. трикарбоновых кислот ДНК-зависимая-РНК РНК полимераза 59802172 0,38 0, полимераза Фактор элонгации G Трансляция и биогенез 59802164 0,39 0,33 0, сукцинатдегидрогеназа Цикл трикарбоновых кислот 59801317 0,39 0, полинуклеотидфосфорила Деградация мРНК прокариот 59800780 0,4 0, за/полиаденилаза фосфоенолпируватсинтаза Метаболизм пирувата 59800653 0,41 0,45 0, белок семейства перокси Антиоксидантная защита 59801322 0,41 2, редоксинов/глутаредоксин инозитол-5 Метаболизм пуринов 59801213 0,45 0,46 0, монофосфатдегидрогеназа 2-метилизоцитратдегид Цикл трикарбоновых кислот 59801590 0,47 0,39 0, ратаза карбомоилфосфатсинтета Метаболизм глутамата 59800515 0,48 0, за, КФ: 6.3.5. рибосомальный белок Трансляция и биогенез 59802173 0,48 0, L7/L фосфопируватгидратаза Гликолиз/Глюконеогенез 59801045 0,48 0, сукцинил–КоА-синтетаза Цикл трикарбоновых кислот 59801308 0, Дигидролипоамидацетил Цикл трикарбоновых кислот 59801312 0,27 0, трансфераза форматтетрагидрофолат- Метаболизм дикарбоновых 59800526 0,28 0, лигаза кислот Периплазматический АВС-транспортер транспорт широкого 59800816 2,69 3,31 2, диапазона веществ цистеинсинтаза, Метаболизм цистеина, 59800785 3,5 2, КФ: 2.5.1.47 синтез эндогенного глутатиона ГМФ синтетаза/глутамин амидотрансфараза, Метаболизм глутамата 59802458 2, КФ: 6.3.5. пептидилпролилизомераза Биогенез белковых молекул 59801584 3,68 1, При осмострессе глутамат, в избытке присутствующий в питательной среде, аккумулируется бактериальной клеткой [Csonka, 1989;

Wood, 2007]. Вероятно, в этом процессе задействованы АВС транспортеры, активация которых видна у всех иссле дованных изолятах. Кроме того, анализ существующих метаболических путей глута мата и цистеина позволил выдвинуть гипотезу о вовлечении этих аминокислот в син тез глутатиона, и об участии последнего в процесс формирования толерантности N.

gonorrhoeae к цефтриаксону.

Рисунок 9. Возможные пути метаболизм глутамата в клетках N. gonorrhoeae. Функциональ ные белки (ферменты) обозначены розовыми кружками, нефункциональные белки и аминокислоты зелеными. Белки, чья концентрация снижается на фоне индукции цефтриаксоном, обведены зеленым цветом, повышается – красным. Исследованные гены ферментов указаны в прямоугольниках.

Глутатион (L--глутамил-L-цистеинилглицин), синтезируется микробными клетками в ходе последовательных реакций, катализируемых глутамилцистеинсинтазой (-GCS, КФ: 6.3.2.2) и глутатионсинтетазой (GS, КФ:

6.3.2.3). Сегодня место эндогенного глутатиона в жизнедеятельности бактерий явля ется предметом активного изучения. Основная роль глутатиона логично отводится редокс-регуляции и адаптации бактерий к оксидативному стрессу [Masip, 2006]. Од нако, показано его участие в адаптации микробов к солевому шоку путем негативной регуляции калиевых каналов, а также в модулировании чувствительности бактерий к антибиотикам. Причем влияние глутатиона не однозначно. Так, для Е. coli продемон стрировано снижение чувствительности к фторхинолонам [Goswami, 2006] и стреп томицину [Goswami, 2007] в присутствии восстановленного глутатиона, и одновре менное возрастание чувствительности к -лактамам [Goswami, 2007]. Роль эндогенно го глутатиона в метаболизме гонококка, его участие в ответе микроба на воздействие АМП исследованы плохо. Имеется указание на влияние восстановленного глутатиона на рост гонококка [Gould, 1944], есть данные об использовании его в системах защи ты N. gonorrhoeae от оксидативного стресса [Seib, 2006].

Нами была выдвинута гипотеза о снижении чувствительности N. gonorrhoeae к цефалоспоринам за счет активации синтеза эндогенного глутатиона. Частично эта ги потеза была подтверждена снижением чувствительности к цефтриаксону и цефикси му изолятов ch37.06 и k51.05, выращенных на среде с добавлением 10 мМ восстанов ленного глутатиона, тогда как для изолята е03.04 и лабораторного штамма АТСС 49226 данный эффект отсутствовал.

Анализ нуклеотидной последовательности генов ферментов, участвующих в синтезе глутатиона, позволил обнаружить мутацию, приводящую к аминокислотной замене Glu221Lys в глутатионсинтетазе изолятов ch37.06 и k51.05, в отличие от е03.04 изолята. Интересно, что чувствительный ко всем антибиотикам штамм FA имеет последовательность, идентичную е03.04, тогда как в недавно аннотированном геноме мультирезистентного изолята NCCP11945 [Chung, 2008] ген глутатионсинте тазы также содержит замену Glu221Lys.

Поскольку среди исследованной коллекции не было выявлено устойчивых к спектиномицину клинических изолятов N. gonorrhoeae, путем селекции на возрас тающих концентрациях антибиотика штамма АТСС 49226 и изолята е03.04, относя щихся к разным сероварам N. gonorrhoeae, были получены штаммы 49226mut и 03mut, обладающие выраженной устойчивостью к данному АМП (МПК 256 мг/л).

Для визуализации изменений, возникающих в клетках N. gonorrhoeae под дей ствием спектиномицина построены дифференциальные протеомные карты лабора торных штаммов 49226mut и 03mut в сравнении с исходными АТСС 49226 и е03. (рис. 10).

При детальном рассмотрении дифференциальных белков в обоих случаях об ращает на себя внимание факт появления в мутантных штаммах большого количества модифицированных по сравнению с нативной формой белков, вовлеченных в различ ные, часто ничем не связанные, метаболические процессы. Этот эффект более ярко проявляется в штамме 49226mut и менее выражен для штамма 03mut.

Несмотря на давнюю историю использования спектиномицина в терапии гоно кокковой инфекции, точный механизм его действия остается малоизученным. Пока зано, что антибиотик связывается с участком 30S-субъединицы в районе 1060- н.о. 16S рРНК (согласно нуклеотидной последовательности рРНК E.coli). Соответст вующий район 16S рРНК контактирует с белками S5, S4 и S8 [Wirmer, 2006].

Секвенирование генов rrs, rpsD, rpsE, rpsH, кодирующих структуру 16S рРНК и рибосомальных белков S4, S5, S8, соответственно, установило наличие нуклеотид ной мутации в кодирующей области белка S5, приводящей к аминокислотной замене Thr24Pro у штаммов 49226mut и е03.04mut (рис. 11). Мутаций в генах остальных рибосомальных белков обнаружено не было.

А. 49226mut/АТСС 49226 B. 03mut/e03. C. 49226mut/АТСС 49226 D. 03mut/e03. Рисунок 10. Дифференциальное протеомное картирование гонококка. Белки «родительских» штаммов окрашены Cy3 (зеленое свечение);

белки модифицированных штаммов с приобретенной устойчивостью к спектиномицину, окрашены Cy5 (красное свечение).

А. Сопоставление белковых профилей штаммов 49226mut и АССТ 49226.

В. Сопоставление белковых профилей штамма 03mut и изолята е03.04.

С. и D. Увеличенное изображение изменений белкового профиля штаммов 49226mut и 03mut, возникших в процессе адаптации к спектиномицину.

1 Rps5_ATCC49226 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVTKVVKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM Rps5_e03.04 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVTKVVKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM Rps5_49226mut MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVPKVVKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM Rps5_03mut MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVPKVVKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM Rps5_FA1090 MAKHEIEERG DGLIEKMVAV NRVTKVVKGG RIMAFSALTV VGDGDGRIGM Rps5_E.coli_K12 MA-H-IEKQA GELQEKLIAV NRVSKTVKGG RIFSFTALTV VGDGNGRVGF Рисунок 11. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности N-концевого доме на рибосомального белка S5 гонококка и E. coli. Черным обозначена область обнаруженной в штам мах 49226mut и 03mut мутации Thr24Pro. Подчеркнуты аминокислотные позиции, замены в кото рых приводят к формированию устойчивости к спектиномицину у Е. coli [Kirthi, 2006].

Факт обнаружения перестроек именно в рибосомальном белке S5 позволил ло гично объяснить феномен «сдвига» белковых пятен, наблюдаемый на дифференци альных 2D картах. Нарушение клеточного роста, изменение процесса сворачивание 16S рРНК, снижение точности трансляции полипептидной цепи – все эти явления описаны для штаммов E. coli, имеющих мутации в белке S5, обуславливающие устой чивость к спектиномицину [Kirthi, 2006]. Пул «неправильных» белковых молекул, образующихся в результате сдвига рамки считывания или преждевременной терми нации трансляции, в мутантных штаммах E. coli был достоверно выше. Подобные процессы, происходящие в мутантных штаммах гонококка, в свою очередь могут приводить к снижению жизнеспособности клеток, что отчасти объясняет низкий про цент устойчивых к спектиномицину изолятов N. gonorrhoeae в природной популяции.

Секвенирование генов rrs, подтвержденное процедурой минисеквенирования с последующей МАЛДИ ВМС, зафиксировало наличие в исходном штамме ATCC 49226 мутаций Т459С и G1215A во всех четырех копиях этого гена. Интересно, что в штамме 49226mut эти мутации отсутствовали, равно как в штаммах 03mut и e03.04.

Этот факт объясняет наблюдаемые в эксперименте более глубокие отличия в белко вых профилях штаммов 49226mut и АССТ 49226 по сравнению с парой 03mut и e03.04. Вероятно, гонококки, несущие мутации как в 16S pРНК, так и в рибосомаль ных белках, оказались нежизнеспособными и были элиминированы в ходе селекции.

Таким образом, совокупность выявленных молекулярных изменений позволяет предположить существование у N. gonorhoeae не описанного ранее механизма фор мирования устойчивости к спектиномицину за счет изолированной мутации в N концевом домене рибосомального белка S5. В пользу этого предположения свиде тельтвует факт обнаружения идентичной аминокислотной замены в обоих мутантных штаммах, отличающихся по своему антигенному составу гонококках и полученных в независимых экспериментах, а также локализация обнаруженной мутации в области связывания антибиотика с рибосомой. И хотя феномен формирования устойчивости к спектиномицину исключительно путем модификации рибосомальных белков до на стоящего времени не описан, для родственного антибиотика – стрептомицина – такой путь известен давно, в частности, около 60 % изолятов M. tuberculosis реализуют ус тойчивость к стрептомицину исключительно за счет мутаций в рибосомальном белке S12 и только 10 % из них имеют мутации в 16S pРНК [Spies, 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сходство молекулярной организации микроорганизмов и универсальность со временных методов анализа биомолекул позволили выстроить строгую логичную систему геномно-протеомного типирования патогенов, направленную на решение практических задач, связанных с реализацией средств молекулярного мониторинга клинически-значимых возбудителей бактериальной и вирусной природы, с одной стороны, и способствующую получению новых знаний в области молекулярной мик робиологии, в частности в сфере расшифровки неизвестных механизмов лекарствен ной устойчивости бактерий, с другой.

Унификация приборной базы, развитие коммуникационных технологий предо пределяет наступление новой эры в клинической микробиологии – эры сочетания ру тинных и исследовательских процедур на базе одной технологической платформы, что и было продемонстрировано в ходе данной работы. Дистанция между фенотипи ческим описанием устойчивости бактерий и нашими знаниями о молекулярных меха низмах, предопределяющим эту резистентность, стремительно сокращается, что по зволяет прогнозировать наступление эры «быстрой микробиологии», практически не нуждающейся в культивировании микроорганизмов.

В тоже время, высокопроизводительные системы скрининга известных генети ческих маркеров резистентности на большой выборке клинических изолятов позво лили нам отобрать клинические изоляты, устойчивый фенотип которых невозможно было объяснить на основании регистрируемых изменений в геномной ДНК. Надо от метить, что количество таких изолятов невелико, что указывает на принципиальную возможность разработки и внедрения измерительных систем нового поколения. С другой стороны, выявление клинических изолятов, реализующих не изученные меха низмы устойчивости, позволяет расшифровывать их и возвращать эти новые знания в виде тестов в практику, не отставая от изучаемых объектов по скорости ответа на применение новых АМП. Такая идеология постепенно должна заменить традицион ное мышление и стать главенствующей, поскольку основой современной жизни явля ется способность быстро отвечать на разнообразные вызовы, возникающие в разных областях, в том числе и медицине.

Фундаментальные аспекты нашей работы были сфокусированы в области рас шифровки новых молекулярных механизмов формирования резистентности. Изло женный алгоритм построения исследования – отбор изолятов на основании широко масштабного микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга гоно кокка, привлечение методов протеомного картирования в сочетании с генетическим анализом и системным подходом к функционированию бактериальной клетки, пока зал свою эффективность в изучении биохимических процессов, снижающих воспри имчивость N. gonorrhoeae к пенициллину, цефтриаксону, спектиномицину.

Описанные новые механизмы устойчивости гонококка вносят существенный вклад в общее понимание феномена резистентности и расширяют наши представля ния о биохимических основах функционирования микробной клетки.

ВЫВОДЫ 1. Оптимизирован и внедрен в практику протокол прямого МАЛДИ масс спектрометрического профилирования бактерий для видовой идентификации грамположительных (S. pneumoniae) и грамотрицательных (N. gonorrhoeae, N. meningitidis) микроорганизмов.

2. В ходе клинической апробации разработанных ДНК-микроматриц продемонстро рована возможность выявления анаэробной флоры при обследовании пациентов с дисбиотическими явлениями урогенитального тракта – бактериальный вагиноз женщин, неспецифический баланопостит мужчин, что особенно важно в оценке эффективности специфической терапии.

На основе МAЛДИ масс-спектрометрии фрагментов нуклеиновых кислот, сопря 3.

женной с последовательными реакциями амплификации и минисеквенирования, разработаны высокопроизводительные системы обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов в геномах бактерий и вирусов, пригодные для оценки лекарствен ной устойчивости S. pneumoniae, M. tuberculosis, N. gonorrhoeae и генотипирова ния вирусов гепатита В и С, как в культуре микроорганизмов, так и непосредст венно в клиническом материале.

Молекулярный мониторинг больших и географически неоднородных выборок 4.

изолятов S. pneumoniae, M. tuberculosis, N. gonorrhoeae позволил объяснить на блюдаемый устойчивый фенотип микробов на основании обнаруживаемых пере строек в геномной ДНК. В зависимости от возбудителя и рассматриваемой группы АМП прогностическая значимость регистрируемых маркеров генетически детерминированной лекарственной устойчивости составила от 82 % до 96 %.

Осуществленное генотипирование вирусов гепатита В и С доказывает универсаль 5.

ность разработанного способа регистрации однонуклеотидных полиморфизмов, базирующегося на масс-спектрометрическом анализе ДНК, и открывает перспек тивы широкомасштабным эпидемиологическим исследованиям в этой области.

Расшифрован механизм формирования устойчивости N. gonorrhoeae к спектино 6.

мицину за счет изолированной мутации в рибосомальном белке S5;

объяснен фе номен снижения чувствительности гонококка к пенициллину, обусловленный не достаточностью пориновых каналов, вызванной нарушением интеграции белков внешней мембраны;

показано, что невосприимчивость гонококка к сублетальным концентрациям цефтриаксона обеспечивают механизмы, ответственные за выжи вание бактериальной клетки в условиях осмотического стресса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Афанасьев М.В., Боровская А.Д., Ильина Е.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Говорун В.М. Выявление мутаций в 306 кодоне embB ге на для молекулярно-генетической характеристики клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Пробл. Тубер. Болезн. Легких. - 2009. - № 5. - C. 48 - 52.

2. Малахова М.В., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Шутько С.А., Дудина К.Р., Знойко О.О., Климова Е.А., Ющук Н.Д. Масс-спектрометрическое генотипирование вируса гепатита В. // Бюлл.

Экспер. Биол. мед. – 2009. – Т. 147. – № 2. – С. 181 - 187.

3. Ильина Е.Н., Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной меди цине. // Биоорганическая химия. – 2009. – Т. 35. – №. 2. – C. 149 - 164.

4. Владимиров Г.Н., Кононихин А.С., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Николаев Е.Н. Точное изме рение масс продуктов полимеразно-цепной реакции как метод генотипирования. // Труды МФТИ. – 2009. – Т. 1. - № 1. – C. 36 – 40.

5. Ilina EN, Borovskaya AD, Malakhova MM, Vereshchagin VA, Kubanova AA, Kruglov AN, Svistu nova TS, Gazarian AO, Maier T, Kostrzewa M, Govorun VM. Direct bacterial profiling by matrix assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry for identification of pathogenic Neisseria. // J Mol Diagn. – 2009. – V. 11 – No 1. – P. 75 - 86.

6. Ilina E., Shitikov E., Borovskaya A., Maier T., Kostrzewa M., Govorun V. Comparative application of modern molecular methods for Neisseria gonorrhoeae typing. // P135 in Abst. book of 16 th Inter national Pathogenic Neisseria Conference. – 2008. – Rotterdam – P. 203.

7. Ilina E., Borovskaya S., Sidorenko S., Kubanova A., Maier T., Kostrzewa M., Govorun V. A mass spectrometry based approach for Neisseria gonorrhoeae species identification. // Abst. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and 26th International Congress of Che motherapy. – 2008. – Barselona.– O. 178.

8. Afanas`ev MV, Ilina EN, Smirnova TG, Larionova EE, Kuz’min AV, Andreevskaya SN, Chernou sova LN, Govorun VM. MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains from Cen tral region of Russia. // Abst. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Dis eases and 26th International Congress of Chemotherapy. – 2008. – Barselona. – P. 1559.

9. Ikryannikova LN, Shitikov EA, Zhivankova DG, Il'ina EN, Edelstein MV, Govorun VM. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae. // J Microb Meth. – 2008. – V. 75 – No 3. – P.

385-91.

10. Ilina E.N., Vereshchagin V.A., Borovskaya A.D., Malakhova M.V., Sidorenko S.V., Al-Khafaji N.C., Kubanova A.A., Govorun V.M. Relation between Genetic Markers of Drug Resistance and Susceptibility Profile of Clinical Neisseria gonorrhoeae Strains. // Antimicrob Agents Chemother. – 2008. – V. 52. – No. 6 – P. 2175-2182.

11. Reinert RR, Filimonova OY, Al-Lahham A, Grudinina SA, Ilina EN, Weigel LM, Sidorenko SV.

Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia. // An timicrob Agents Chemother. – 2008. – V. 52. – No. 6 – P. 2260 - 2262.

12. Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Сидоренко С.В. Применение метода MALDI-TоF масс-спектрометрии для анализа гене тически детерминированной устойчивости S.pneumoniae к фторхинолонам. //Антибиот. Хи миотер. – 2007.- Т. 52. – № 1 - 2. – С. 10 – 17.

13. Мудрак Д.Е., Икрянникова Л.Н., Сидоренко С.В., Ильина Е.Н. Изучение распространенности и молекулярных механизмов антибактериальной резистентности у грамотрицательных возбу дителей нозокомиальных инфекций в стационарах Москвы и Перми. // Антибиот. Химиотер. 2007.- Т. 52. – № 7 - 8. – С. 10-16.

14. Afanas'ev MV, Ikryannikova LN, Il'ina EN, Sidorenko SV, Kuz'min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chernousova LN, Kamaev EY, Skorniakov SN, Kinsht VN, Cherednichenko AG, Govorun VM.

Molecular characteristics of rifampicin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Russian Federation. // J Antimicrob Chemother. – 2007. – V. 59. – No. 6. – P. 1057 - 1064.

15. Vereshchagin V., Ilina E., Atroshkina M., Serebryakova M., Maier T., Kostrzewa M., Govorun V. A new mass-spectrometric approach to antibacterial susceptibility testing. // Abst. 17th European Con gress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and 25th International Congress of Chemo therapy. – 2007. – Munich – P. 1648.

16. Ikryannikova LN, Afanas'ev MV, Akopian TA, Il'ina EN, Kuz'min AV, Larionova EE, Smirnova TG, Chernousova LN, Govorun VM. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. // J Microb Meth. – 2007. – V. 70. – No.

3. – P. 395 - 405.

17. Ильина Е.Н., М.В. Малахова, В.А. Верещагин, В.М. Говорун, Т.В. Припутневич, А.А. Куба нова. Прямая оценка параметров лекарственной устойчивости гонококка. // Бюлл. Экспер.

Биол. Мед. – 2007. – Т. 144, - № 8. – C. 194 - 197.

18. Афанасьев М.В., Икрянникова Л.Н., Ильина Е.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Черноусова Л.Н., Камаев Е.Ю., Скорняков С.Н., Киншт В.Н., Чередниченко А.Г., Гово рун В.М. Применение реакции мини-секвенирования с последующим MALDI-TOF масс спектрометрическим анализом для оценки устойчивости к рифампицину и изониазиду штам мов Mycobacterium tuberculosis // Пробл. Тубер. Болезн. Легких. - 2007. - № 7. - C. 37 - 42.

19. Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина M.E., Ильина Е.Н., Говорун В.М. Идентификация микробного состава выделений из влагалища методами генодиагностики. // Вест. Дермат. Ве нерол. – 2007. – № 6. – C. 9 - 13.

20. Плахова К.И., Гомберг М.А., Атрошкина М.Е., Ильина Е.Н., Говорун В.М. Роль Atopobium vaginae при рецидивировании бактериального вагиноза // Вест. Дермат. Венерол. - 2007. – № 5. – C. 10 - 13.

21. Боровская А.Д., Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Припутневич Т.В., Аль-Хафаджи Н., Кубанова А.А. Анализ вклада молекулярных механизмов в формиро вание устойчивости гонококка к тетрациклину. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2007. – Т. 144. – № 3. – С. 432 - 437.

Малахова М.В., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Зубков М.М., Припутневич Т.В., 22.

Кисина В.И., Кубанова А.А. Анализ генетических маркеров резистентности N. gonorrhoeae к -лактамным антибиотикам. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. – 2006. – Т. 141. – № 5. – С. 549 554.

Кубанова А.А., Говорун В.М., Ильина Е.Н., Верещагин В.А., Фриго Н.В., Припутневич Т.А.

23.

Первый опыт применения метода прямого белкового профилирования для идентификации и типирования N.gonorrhoeae. // Вест. Дермат. Венерол. – 2006. – № 5. – C. 25 - 29.

Ильина Е.Н., Малахова М.В., Генерозов Э.В., Говорун В.М., Арчаков А.И., Покровский В.И.

24.

Масс-спектрометрический анализ для типирования вируса гепатита C. // Биомед. химия. – 2005. – Т. 51. – № 1. – С. 41 - 47.

Момыналиев К.Т., Cелезнева О.В., Козлова А.А., Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Говорун 25.

В.М.. А2144G – основная мутация в гене 23S rRNA Helicobacter pylori, ассоциированная с ус тойчивостью к кларитромицину // Генетика. – 2005. – Т.41. – №10. – С. 1338 - 1344.

Ильина Е.Н., Малахова М.В., Степанова Ю.Н., Кубанова A.A., Говорун В.М. Идентификация 26.

бактериальной флоры c применением технологии днк-макрополей. // Мол. Медицина. – 2005.

– № 2. – C. 41 - 45.

27. Ilina EN, Malakhova MV, Generozov EV, Nikolaev EN, Govorun VM. Matrix-Assisted Laser De sorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry for Hepatitis C Virus Genotyping. // J Clin.

Microbiol. – 2005. – Vol. 43. – No. 6. – P. 2810 – 2815.

Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Зубков М.М., Припутневич Т.В., Кубанова А.А., Говорун В.М.

28.

Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления в генах gyrA и parC Neisseria gonorrhoeae однонуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхи нолонам // Мол. Биол. – 2005. – Т. 39. - № 6. – С. 923 - 932.

Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Малахова М.В., Зубков М.М., Сидоренко С.В., Кубанова А.А., 29.

Говорун В.М. Устойчивость к фторхинолонам среди Российских изолятов Neisseria gonorrhoeae // Мол. Ген. Микробиол. Вир. – 2005 – № 1. – С. 23 - 27.

30. Vereshchagin V.A., Ilina E.N., Malakhova M.V., Zubkov M.M., Sidorenko S.V., Kubanova A.A., Govorun V.M. Fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates from Russia: molecular mechanisms implicated // J. Antimicrob. Chem. – 2004. – Vol. 53. – P. 653 – 656.

А.А. Кубанова, М.М. Васильев, В.М. Говорун, О.А. Терман, Е.Н. Ильина, Т.В. Припутневич.

31.

Современные подходы к типированию штаммов N.gonorrhoeae. // Вест. Дермат. Венерол. – 2004. – № 1. – C. 4 - 8.

Ильина Е.Н. Особенности генодиагностики трансфузионных вирусных гепатитов. // 32.

Гепатология, приложение к журналу Экспер. Клин. Гастроэнтер. – 2003. – № 1. – C. 28 – 36.

Ильина Е.Н., Малахова М.В., Верещагин В.А., Говорун В.М., Сергиенко В.И., Зубков М.М., 33.

Васильев М.М., Кубанова А.А. Молекулярное типирование штаммов N. gonorrhoeae, распро страненных на территории РФ // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2003. – Т. 136. – № 8. – С. 205-208.

Ильина Е.Н., Говорун В.М., Иваников И.О. Некоторые аспекты лабораторной диагностики 34.

вирусных гепатитов В и С. Обзор. // Тер. архив. – 2003. – T. 75. – № 4. – C. 84 - 86.

Ильина Е.Н., Говорун В.М., Климова Е.А., Гаджикулиева М.М., Ющук Н.Д. Изменчивость ге 35.

нома вируса гепатита С при лабораторном мониторинге больных острым вирусным гепати том. // Росс. Журн. Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. – 2002. – № 1. – C. 30 – 37.

Ильина Е.Н., Артемов Е.К., Говорун В.М., Иванова Л.М., Иваников И.О. Генотипирование 36.

РНК вируса гепатита С аллельспецифичной амплификацией. // Кремлевская Медицина. Кли нический вестник. – 2002. – № 1. – C. 38 – 41.

Ющук Н.Д., Знойко О.О., Климова Е.А., Огиенко О.Л., Говорун В.М., Гущин А.Е., Ильина 37.

Е.Н. Роль персистенции HCV в плазме и лейкоцитах при хронической HCV инфекции. // Росс.

Журн. Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. – 2000. – № 4. – C. 59 - 64.

Ильина Е.Н., Гущин А.Г., Говорун В.М., Знойко О.О., Климова Е.А., Ющук Н.Д. Новый под 38.

ход в генотипировании вируса гепатита С. // Эпидем. Инфекц. Болезни. – 1999. – № 5. – C. 23 26.

Ющук Н.Д., Климова Е.А., Гаджикулиева М.М., Кареткина Г.Н., Говорун В.М., Гущин А.Е., 39.

Ильина Е.Н., Соколова М.В., Елисеева И.Я., Чешик Д.С., Малышев Н.А. Распространенность маркеров герпесвирусных инфекций у больных парентеральными гепатитами. // Росс. Журн.

Гастроэнтер. Гепат. Колопроктол. – 1999. – № 5. – C. 36 - 41.

Список сокращений а.о. – аминокислотный остаток АМП – антимикробный препарат ВГВ – вирус гепатита В ВГС – вирус гепатита С ВМС – времяпролетная масс-спектрометрия ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ – дитиотрейтол МАЛДИ – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация МПК – минимальная подавляющая концентрация ПСБ – пенициллин связывающий белок ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота ddNTP – дидезоксинуклеозидтрифосфаты dNTP – дезоксинуклеозидтрифосфаты EMB – этамбутол INH – изониазид MDR (multidrug resistant) – применительно к М. tuberculosis, изолят устойчивый как минимум к ри фампицину и изониазиду MLST (multilocus sequencing typing) –типирование мультилокусным секвенированием NG-MAST (N. gonorrhoeae multiantigen sequence typing) – мультиантигенное типирование гонококка QRDR (quinolone resistance-determining region) – область, определяющая устойчивость к хинолонам.

RIF – рифампицин RRDR (rifampicin resistance determinant region) – область, определяющая устойчивость к рифампици ну SSC (20x) – буферная смесь 3M NaCl и 0,3M цитрата натрия (pH 7,0) VNTR (variation number tandem repeats) – вариации числа повторяющихся фрагментов ДНК

Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.