авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 ||

Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов

-- [ Страница 2 ] --

Титры специфических антител в Приме № сыворотках чания груп Препарат пы 15 день 27 день 29 день 58 день 1 GBD 400 1600 1600 3 GBD-глюкан 400 800 1600 64 128 64 Антите 4 D5-GBD 128 128 128 ла к D 5 D5-GBD-глюкан 128 256 1600 отриц отриц отриц 6 CBD 8 CBD-целлюлоза 8 64 3200 отриц отриц 9 D5-CBD 4 10 D5-CBD-целлюлоза 8 64 128 Инактивированная Антите отриц отриц отриц отриц Вакцина ла к D Антите Живая культура 12 64 64 128 ла к D 14 D5-GBD+Иммуномакс 128 256 256 Как видно из таблицы 8, иммобилизация антигенов на углеводном сорбенте, как на целлюлозе, так и на глюкане, усиливает антителообразование. Использование углеводного сорбента на основе частиц 1,3--глюкана в эксперименте способствовало более значительному увеличению титра специфических антител в сыворотках крыс, по сравнению с препаратом волокнистой целлюлозы, особенно в случае рекомбинантных антигенов D5-GBD и GBD.

Таким образом, сконструированы двудоменные белки антигенов лептоспир с целлюлозо- и глюкан-связывающими доменами, обладающие высокой специфической иммуногенной активностью. Препараты данных белков, иммобилизованных на соответствующих аффинных матрицах, могут быть использованы для создания кандидатных субъединичных противолептоспирозных вакцин нового поколения.

Двудоменные белки с EGF, FGF и бета–интерфероном.

5.4.

Несомненный интерес с точки зрения практического использования в различных областях биотехнологии, имеют гибридные белки, состоящие из биологически активного белкового домена – цитокина или фактора роста и аффинного домена. В работе получены гибридные белки, содержащие эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, интерферон бета, с различными аффинными доменами.

Эпидермальный фактор роста (EGF - Epidermal Growth Factor, урогастрон) - полипептид с молекулярной массой около 8 кДа, был впервые выделен из слюнных желез мыши. Впоследствии он был найден во многих нормальных и патологически измененных тканях животных и человека. EGF относится к группе факторов роста и играет важную роль в регуляции обменных и восстановительных процессов в организме. Он способен специфически связываться с рецепторами на поверхности клеточных мембран, стимулирует таксис противовоспалительных клеток и дифференциацию восстанавливающихся. Показано, что EGF стимулирует деление клеток в культурах фибробластов, участвует в поддержании гастроинтестинальной функции и обладает ранозаживляющей активностью (Savage, C. R. Jr., 1972;

Goodlad, R. A., 1989).

Семейство ростовых факторов фибробластов включает в себя, по меньшей мере, 20 различных мономерных белков с молекулярным весом от 13 до 18 кДа. Основной ростовой фактор фибробластов (bFGF) – мультифункциональный белок, который участвует в большом числе нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, миграция и дифференцировка. Он стимулирует пролиферацию клеток мезодермального и нейроэктодермального происхождения, включая фибробласты, хондроциты, миобласты, некоторые типы эндотелиальных клеток сосудов и мышечной ткани, а также глиальные клетки. В культуре клеток bFGF вызывает дифференцировку эндотелиальных клеток, хондроцитов и нейронов. Он также является сильным ангиогенным фактором.

Существуют несколько изоформ человеческого bFGF (Florkiewicz, R.

Z., 1989). Все они – 18, 22, 23 и 24 кДа – могут экспрессироваться с единственного транскрипта мРНК. Эти изоформы локализуются как в ядре (22, 23 и 24 кДа-изоформы), так и в цитозоле или на клеточной поверхности (изоформа 18 кДа).

Интерфероны относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и обладают противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, т.е. являются полифункциональными биорегуляторами широкого спектра действия и гомеостатическими агентами.

Интерферон- относится к семейству интерферонов I типа, и, подобно интерферону-, индуцирует множество биологических реакций, включая ингибирование вирусной репликации, стимуляцию иммунной системы и ингибирование пролиферации клеток. Препараты рекомбинантного интерферона- нашли применение в медицине при широком спектре патологий. Это, в первую очередь, лечение рассеянного склероза, различных вирусных инфекций (вирусные гепатиты, герпесвирусные заболевания), а также злокачественной меланомы, рака молочной железы и шейки матки, волосатоклеточной лейкемии и других не менее опасных заболеваний.

Однако, несмотря на безусловно доказанную медицинскую значимость этого препарата, биологически активный белок интерферон- производится в недостаточном количестве. Поэтому создание нового эффективного бактериального продуцента рекомбинантного интерферона- человека, а также разработка простых и практически безынструментальных методов очистки и выделения белка с высокой биологической активностью и степенью чистоты представляется актуальной задачей.

Гены, кодирующие вышеперечисленные биологически активные белки, были получены методом ОТ-ПЦР из суммарной РНК скелетной мышцы человека, при этом праймеры для ПЦР были спланированы таким образом, чтобы обеспечить возможность дальнейших генно-инженерных манипуляций (в концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз). В результате были созданы бактериальные штаммы-продуценты, синтезирующие рекомбинантные белки EGF, FGF и IFN-. Было показано, что после индукции экспрессии рекомбинантных генов, данные белки накапливаются количестве от 5% до 10% от тотального белка клетки (Табл. 9). Отсутствие продукции рекомбинантного белка IFN-, по-видимому, объясняется его токсичностью для клеток-продуцентов.

Были созданы слитные белки, содержащие биологически активные белки и аффинные домены: коллаген-связывающий (CollBD) и декстран связывающий (DBD).

В качестве коллаген-связывающего домена использовали коллаген связывающий домен белка ВМ-40 человека (другие названия – SPARC или остеонектин), внеклеточного кальций-связывающего белка размером 33 кДа, который предположительно модулирует клеточный фенотип. Показана роль этого белка в регуляции клеточной адгезии, пролиферации и миграции, а также в заживлении ран и образовании опухолей.

В качестве декстран-связывающего домена в работе был использован С-концевой участок декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Этот фермент катализирует синтез декстрана – разветвленного полимера, в котором более 90% остатков глюкозы соединены -1,6 связями. На основе литературных данных был выбран минимальный фрагмент С-концевого участка, сохраняющий аффинное сродство к декстрану.

Гены, кодирующие эти аффинные домены, были получены с помощью ПЦР или химико-ферментативного синтеза из олигонуклеотидов. Кодонный состав синтетических генов был подобран таким образом, чтобы обеспечивать максимальный уровень экспрессии этих генов в клетках E. coli.

В концевые последовательности генов были введены сайты рестрикции специфических эндонуклеаз, чтобы обеспечить возможность для дальнейших генно-инженерных манипуляций. Уровень продукции и растворимость полученных аффинных доменов приведены в таблице 9.

Ген коллаген-связывающего домена белка ВМ-40 человека был получен в виде слитной генно-инженерной конструкции с геном целлюлозосвязывающего домена (CBD), т.к. размер самого коллаген связывающего домена чрезвычайно мал и исследование уровня его продукции и биологических свойств без белка-носителя не представлялось возможным. Были получены также рекомбинантные плазмиды, кодирующие гибридные белки CollBD-FGF, DBD-EGF, DBD-IFN-. Уровень продукции и растворимость гибридных белков приведены в таблице 9.

Таблица 9.

Уровень продукции и растворимость белков.

Белок Уровень Растворимость продукции Растворимый CollBD-CBD (Collagen-binding Domain) 5% Растворимый DBD (Dextran binding domain) 10% Растворимый EGF (Epidermal Growth Factor) 5% Растворимый FGF (Fibroblast Growth Factor) 10% нет продукции IFN- (Interferon beta) Нерастворимый CollBD-FGF 5% Нерастворимый 20% DBD-EGF Нерастворимый DBD-IFN 15% Для изучения биологической активности белка CollBD-FGF in vitro была разработана модель культивирования клеток эукариот на поверхности, покрытой коллагеном. Было показано, что нанесение на коллагеновую подложку препарата химерного белка CollBD-FGF достоверно увеличивает число адгезированных на этой подложке эукариотических клеток в 2-3 раза по сравнению с контролем. Полученный белковый препарат может применяться для совершенствования систем культивирования эукариотических клеток и оптимизации производства биологически активных белков, синтезируемых этими клетками.

Для изучения биологической активности препаратов химерного белка DBD-EGF in vitro была разработана методика культивирования клеток эукариот в объеме питательной среды на поверхности сфер Сефадекса, покрытых гибридным белком. Было показано, что при добавлении к культуре эукариотических клеток суспензии Сефадексов клетки практически не адгезируются на их поверхности. При добавлении к питательной среде с клетками Сефадексов, предварительно проинкубированных с препаратом белка DBD-EGF, клетки адгезируются и ровным слоем покрывают поверхность сфер Сефадексов. Полученный белковый препарат может применяться для создания новых систем для культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды. Использование данной технологии может значительно повысить эффективность культивирования и, как следствие, снизить стоимость биологически активных белков, синтезируемых эукариотическими клетками.

Было проведено исследование активности химерного белка DBD-IFN, иммобилизованного на Сефадексе G-75. Биологическая активность определялась по способности химерного белка защищать эукариотические клетки линии Л-41 от заражения модельным вирусом энцефаломиокардита мышей. Результаты исследования биологической активности химерного белка DBD-IFN- представлены в таблице 10.

Таблица 10.

Активность препаратов интерферона-.

Образец Токсичность Титр в опытах Активность (ед./мл) образца (МЕ/мл) Химерный белок DBD-IFN 640 5 на Сефадексе Отсутствует 1280 10 2560 20 Бетаферон Отсутствует (Schering, Ag) 1280 10 000* Человеческий лейкоцитар- ный интерферон- (Биомед Отсутствует 640 1 000* им. И.И. Мечникова) Ребиф (Industria Farmaceutica Отсутствует Serono S.P.A.) 640 10 000* Авонекс Отсутствует (Biogen B.V.) 1280 10 000* * - заявленная активность коммерческих препаратов.

Была показана активность препаратов рекомбинантного интерферона иммобилизованного на Сефадексе G-75, сопоставимая с референс препаратом и коммерческими препаратами интерферона-, применяемыми в лечебной практике. В качестве референс-препарата использовали препарат интерферона- Бетаферон (104 МЕ/мл) (Schering, AG). В качестве коммерческих препаратов для сравнения активности использовались применяемые в настоящее время лекарственные средства Ребиф (104 МЕ/мл) (Industria farmaceutica serono S.p.A.) и Авонекс (104 МЕ/мл) (Biogen B.V.), и человеческий лейкоцитарный интерферон- (103 МЕ/мл) (ОАО «Биомед» им.

И.И. Мечникова).

Таким образом, на основе созданной в данном исследовании системы векторов для получения конструкций с аффинным доменом, синтезированы гибридные белки, включающие коллаген-связывающий или декстран связывающий домены и биологически активные белковые домены со специфической активностью: EGF, FGF и интерферон-. Наличие аффинного домена обеспечивало одностадийную очистку препаратов белков до 95% чистоты и возможность различных вариантов практического использования препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основе разработанных в настоящем исследовании технологических решений получено значительное количество белковых антигенов и других белков. Помимо белков, описанных в тексте, автором также были получены разнообразные ДНК-связывающие белки и белки нуклеотидного обмена, вирусные и бактериальные белки, белки растений, многокомпонентные белки-векторы для трансформации растений, пептиды, содержащие активные центры ингибиторов циклиновых киназ для применения в онкологии и др.

белки, получение и перспективы практического использования которых детально изложены в соответствующих публикациях. Разработанные технологические решения позволяют в короткие сроки конструировать белки, состоящие из двух или более модулей, а также обеспечивают эффективную очистку, концентрирование и иммобилизацию белков, что делает данные продукты перспективными для применения в сельскохозяйственной биотехнологии и медицине.

ВЫВОДЫ Разработана система научно–обоснованных технологических 1.

решений, имеющих приоритетное значение для современной сельскохозяйственной и медицинской биотехнологии, а также нанобиотехнологии. Основу этой системы составляют: способ направленной контролируемой полимеризации и сборки генно–инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами, а также технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полисахаридных и других матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков. Практическая реализация данных технологических решений привела к созданию эффективных биологически активных препаратов на основе рекомбинантных белков.

Созданы мультидоменные рекомбинантные белки 2.

(нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и эффективную доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки.

На основе микробиологического синтеза создан 3.

высокоэффективный препарат – стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «CAT-Сом», основанный на принципах аутоиммунной коррекции ингибитора роста животных соматостатина.

Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, 4.

кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию).

Показано, что иммобилизация вакцинно-ценных белков на 5.

полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных свойств: полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта и стимулирует развитие более сильного иммунного ответа на вводимые белки.

Разработаны основанные на принципе самосборки подходы для 6.

получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин.

Получены препараты, на основе которых могут быть созданы кандидатные субъединичные генно-инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

Получен двухкомпонентный белок, обладающий способностью к 7.

аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термостабильной –галактозидазы. На основе этого гибридного белка создан проточный реактор, позволяющий проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Данный подход может использоваться в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток.

На основе технологии аффинных доменов получены препараты 8.

ряда важных для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов: EGF, FGF, бета–интерферон, обладающие специфической активностью. Наличие аффинного домена обеспечивает одностадийную очистку белков до 95% чистоты и возможность различных вариантов практического использования препаратов, в том числе, для усовершенствования методов культивирования эукариотических клеток.

БЛАГОДАРНОСТИ Экспериментальные работы проводились на базе ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии и ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России при участии О.В. Сергиенко, М.-В.Л. Ходуна, Т.В. Тихоновой, А.С. Карягиной-Жулиной, М.А. Грачевой, З.М. Галушкиной, Е.М. Рязановой, Н.В.Лавровой, Н.Н. Полетаевой, А.М. Лящука, О.Л.

Ворониной, проф. И.С. Мещеряковой, Е.И. Аксеновой, Н.Е. Шараповой, проф. Ю.В. Ананьиной, А.С. Семихина, А.М. Лящука, А.П. Котновой, Д.Ю.

Логунова, А.И. Тухватулина, М.В. Мезенцевой и других сотрудников.

Работы по оценке функциональности доменов мультидоменных белков-нанотранспортеров выполнялись на базе Института биологии гена РАН под руководством проф. А.С. Соболева совместно с А.А. Розенкранцем, П.В. Гулаком, Д.Г. Гилязовой, Ю.В. Храмцовым и другими сотрудниками лаборатории;

работы с использованием атомно-силовой микроскопии – совместно с сотрудниками НИИ физико-химической биологии им.

А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова Ю.Н. Антоненко и Т.И.

Рокицкой.

В работах по созданию препаратов соматостатина принимали участие сотрудники Института экспериментальной эндокринологии ЭНЦ РАМН Е.Т.

Сазина и С.К. Карпова, в работах по исследованию свойств гибридных белков на основе термостабильной бета-галактозидазы – сотрудники Института молекулярной генетики РАН проф. Г.А.Великодворская, Н.А.Лунина и сотрудник НИИ физико-химической биологии им.

А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова В.Н.Ташлицкий.

Работа по оценке иммуногенности и протективного эффекта препаратов на основе гибридных белков с антигенами возбудителя туберкулеза проводилась на базе лаборатории иммуногенетики Центрального научно-исследовательского института туберкулза РАМН под руководством проф. А.С. Апта с участием сотрудников лаборатории Э.Н. Рубаковой, Т.К.

Кондратьевой.

Автор выражает глубокую признательность всем коллегам, принимавшим участие в работе, обсуждении результатов, оформлении диссертации, а также руководству институтов и лабораторий, предоставивших возможность для проведения исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных рецензируемых журналах:

1. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Скрипкин Е.А., Смирнов В.Д.

Выделение эндонуклеазы рестрикции с HindIII–специфичностью из Bordetella bronchiseptica // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 1986. – № 4. – С. 16–19.

2. Карягина А.С., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С.

Функциональная характеристика плазмид штамма S. sonnei 47 // Молекулярная генетика. – 1986. – № 10. – С. 16–21.

3. Grabko V.I., Lunin V.G., Naroditsky B.S., Khilko S.N., Tickhonenko T.I., Makhov A.M., Karpova O.V. Study of avian adenovirus DNA infectivity in chick embryos // Acta Virol. – 1987. – Vol. 31. – P. 97–102.

4. Карягина А.С., Лунин В. Г., Грубер И.И., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы SsoII в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47 // Молекулярная генетика. – 1987. – № 12. – С. 26–29.

5. Rivkina M.B., Lunin V.G., Mahov A.M., Tikchonenko T.I., Kukain R.A.

Nucleotide sequence of integrated hepatitis B virus DNA and human flanking regions in the genome of the PLC/PRF/5 cell line // Gene. – 1988. – Vol. 64. – P. 285–296.

6. Карпов В.А., Лунин В.Г., Тихоненко Т.И. Фазированный полилинкер для клонирования и экспрессии генов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 1989. – № 9. – С. 28–33.

7. Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Тихоненко Т.И. Полимеризация фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, в клетках Escherichia сoli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 1989.– № 10. – С. 24–29.

8. Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Смирнов В.Д., Тихоненко Т.И. Синтез и экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностных антигенов вируса гепатита В, клетками Escherichia coli // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 1989. – № 9. – С. 39–42.

9. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII–restriction endonuclease and modification methyltransferase // Gene. – 1990. – Vol. 87. – P. 113–118.

10. Akopian T.A., Lunin V.G., Kruglyak V.A., Ruchadze G.G., Bakhutashvili V.I., Naroditsky B.S., Tichonenko T.I. Nucleotide sequence of the cDNA for porcine rotavirus VP7 gene (strain K) // Virus Genes. – 1992. – Vol. 6. – P. 393–396.

11. Karyagina A.S., Lunin V.G., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Y., Nikolskaya I.I.

Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the SsoI restriction endonuclease and methyltransferase // Gene. – 1993. –Vol. 124. – P. 13–19.

12. Карпова С.К., Сазина Е.Т., Бадер Л.Б., Сергиенко О.В., Ходун М.Л., Кривцов В.Ф., Лунин В.Г., Тихоненко Т.И., Панков Ю.А. Генетическая инженерия в бактериальном синтезе соматостатина // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. – 1994. – № 12. – С. 24–29.

13. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis // Gene. – 1995. – Vol. 157 – P. 93–96.

14. Парашина Е.В., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В.Г., Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки // Физиология растений. – 2000. – Т. 47. – С. 471.

15. Demchinskaya A.V., Shilov I.A., Karyagina A.S., Lunin V.G., Sergienko O.V., Voronina O.L., Leiser M., Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J Biochem Biophys Methods. – 2001. – Vol. 50.– Р.

79–89.

16. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК–полимераза из термофильного микроорганизма archaeon Archaeoglobus fulgidus VC16 и е свойства // Биохимия. – 2002. – Т. 67. – C. 366–374.

17. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК–полимераза из archaeon Archaeoglobus fulgidus // Доклады Академии Наук. – 2002. – Т. 382.–С. 707–709.

18. Yakimovich O.Yu., Alekseev Ya.I., Voronina O.L., Kolobova O.B., Anisimova S.S., Lunin V.G. Hot–start polymerase chain reaction using a DNA–ligand // Biotechnology in Russia. – 2002. – № 6. – C. 86–89.

19. Розенкранц А.А., Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Гилязова Д.Г., Шумянцева М.А., Воронина О.Л., Янс Д.Э., Кофнер А.А., Миронов А.Ф., Соболев А.С.

Направленная внутриклеточная доставка локально действующих лекарств:

Специфическая доставка фотосенсибилизаторов в ядра клеток меланомы // Генетика. – 2003. – № 39. – С. 259–268.

20. Zhuravleva Yu.N., Lugovtsev V.Yu., Voronina O.L., Shilov I.A., Vaniusheva O.V., Lunin V.G., Naumova M.A., Mamaeva T.A., Tikhonova N.T. Genetic analysis of wild measles virus strains isolated in the european part of the Russian Federation // Vopr Virusol. – 2003. – Vol. 48. – Р. 29–35.

21. Гудим Е.А., Агапов И.И., Лунин В.Г., Комолов И.С. Клонирование и экспрессия белка NS3 вируса гепатита С // Биотехнология. – 2004. – № 5. – С. 80– 86.

22. Анисимова C.С., Корнеева И.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Аветисов В.А. Создание многокомпонентного химерного белка для повышения эффективности трансформации томатов на основе природного опыления– оплодотворения // Биотехнология. – 2005. – № 3. – С. 35–41.

23. Анисимова С.С., Сергиенко О.В., Ванюшева О.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г. Влияние рекомбинантного белка TTRECA на специфичность, эффективность и точность ТАО ДНК–полимеразы в ПЦР // Биотехнология. – 2005. – № 3. – С. 90–96.

24. Артеменко Е.О., Гилязова Д.Г., Розенкранц А.А., Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Тимофеев К.Н., Грин М.А., Миронов А.Ф., Рубин А.Б., Соболев А.С. Влияние присоединения бактериохлорина p к модульным рекомбинантным транспортерам для направленной внутриклеточной доставки на эффективность его фотодинамического действия // Молекулярная медицина. – 2005. – № 3. – C. 43–47.

25. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный Na+/H+_антипортер ячменя:

идентификация и реакция на солевой стресс // Биохимия. – 2005. – Т. 70. – С. 123– 132.

26. Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Прохоров В.Я., Матвеев С.М., Аляпкина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2005. – № 3. – С. 27–32.

27. Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Зубков А.В., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Буркин М.А., Летаров А.В., Лаврова Н.В., Рязанова Е.М. Моноклональные антитела к человеческой пероксидазе щитовидной железы // Биотехнология. – 2005. – № 1. – С. 51–58.

28. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G, Sergienko O.V., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Sobolev A.S. Recombinant modular transporters on the basis of epidermal growth factor for targeted intracellular delivery of photosensitizers // Proc. SPIE. – 2005. – Vol. 5973. – Р.101–110.

29. Ершова А.С., Лаврова Н.В., Тихонова Т.В., Кузнецова А.Ю., Мостовенко Е.В., Алексеевский А.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Разработка модификации метода SELEX и ее использование для определения нуклеотидных последовательностей, узнаваемых гомеодоменом Antennapedia // Доклады РАСХН.

– 2006. – № 5. – С. 5–9.

30. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66. – Р. 10534–10540.

31. Гудов В.П., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н.

Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно–меченых зондов для ПЦР в реальном времени // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2007. – № 6. – С. 7–11.

32. Насонова Д.С., Раскатов В.А., Лунин В.Г. Оценка переноса генов при выращивание трансгенных растений сои // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – 2007. – № 2. – с. 136–138.

33. Семененко Т.А., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л. Банк сывороток крови как компонент системы биологической безопасности // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – № 4. – С. 73–78.

34. Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Романенко В.В., Карпова Т.И., Аляпкина Ю.С., Омон Е.П., Романова Ю.М., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Яцишина С.Б., Шипулин Г.А. Применение стандартов лабораторной диагностики легионеллеза во время эпидемической вспышки пневмоний в городе Верхняя Пышма Свердловской области // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2007. – Т.9. – С. 361– 35. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г., Филясова Е.И., Шишкин А.М., Сергеенко О.В., Рязанова Е.М., Воронина О.Л., Боженко В.К.

Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов циклиновых киназ // Вопросы онкологии. – 2007. – Т. 53. – С. 448– 452.

36. Воронина О.Л., Лунин В.Г. Молекулярно–генетическое типирование Legionella pneumophila серогруппы 1, выделенных в г. Верхняя Пышма, с использованием международных стандартов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008. – № 2. – С. 20–23.

37. Воронина О.Л., Кунда М.С., Лунин В.Г., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Молекулярно–генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской федерации // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2008. – Т. 10. – С. 154–162.

38. Грачева М.А., Попадьин П.В., Евстифеев В.В., Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Верховская Л.В., Лунин В.Г., Швец В.И. Экспрессия в Escheriсhia coli А– и В–субъединиц рицина в составе химерных белков с целлюлозосвязывающим доменом и их одностадийная аффинная очистка на целлюлозе // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2008. – № 3. – С. 50–56.

39. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лунин В.Г., Грабко В. И., Шарапова Н.Е., Нестеренко В.Г. Влияние сыворотки крови мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы Л, на эффективность клонирования стромальных клеток– предшественников in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.

– 2008. – Т. 146. – С. 663–666.

40. Гришин Д.В., Гудов В.П., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Харченко П.Н.

Получение белковой векторной конструкции, включающей ДНК–связывающий домен SSBTNE и сигнал ядерной локализации VIRD2 // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2008. – № 5. – С. 38–41.

41. Романова Ю.М., Томова А.С., Шингарова Л.Н., Лунин В.Г., Карягина А.С., Лупу И.П., Гинцбург А.Л. Механизм взаимодействия фактора некроза опухолей (ФНО) макроорганизма с клетками Salmonella enterica (ser.

Typhimurium) // Молекул. генетика. – 2008. – Т. 4. – С. 18–22.

42. Rosenkranz A.A, Vaidyanathan G., Pozzi O.R., Lunin V.G., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. Engineered modular recombinant transporters: application of new platform for targeted radiotherapeutic agents to alpha–particle emitting 211 // International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. – 2008. – Vol. 72. – Р. 193–200.

43. Гудов В.П., Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов для твердофазного синтеза зондов для ПЦР в реальном масштабе времени // Вестник МИТХТ им. М.В. Ломоносова. – 2009. – Т. 4. – С. 25–30.

44. Зайцев В.В., Карягина А.С., Лунин В.Г. Костные морфогенетические белки (BMP): общая характеристика, перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н.

Приорова. – 2009. – № 4. – С. 79–84.

45. Лунин В.Г., Шарапова Н.Е., Тихонова Т.В., Полетаева Н.Н., Галушкина З.М., Аксенова Е.И., Грабко В.И., Великодворская Г.А., Лаврова Н.В., Ананьина Ю.В. и др. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного целлюлозосвязывающего домена Anaerocellum thermophilum in vitro // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2009. – № 1. – С. 21–26.

46. Семихин А.С., Лящук А.М., Мезенцева М.В., Трегубова М.И., Сергиенко О.В., Полетаева Н.Н., Народицкий Б.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Гинцбург А.Л.

Получение рекомбинантного интерферона– человека на основе технологии аффинных доменов // Молекул. генетика. – 2009. – № 4. – С. 38–41.

47. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Лаврова Н.В., Аксенова Е.И., Семихин А.С., Карягина А.С., Лунин В.Г. Получение и характеристика коллаген–связывающих доменов из факторов фон Виллебранда (vWF) человека // Молекул. генетика. – 2009. – № 1. – С. 31–35.

48. Владимирский М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е. И., Сергиенко О.В., Ляшук А.М., Неретина Т.В., Карягина А.С., Лунин В.Г., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест–системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона–гамма в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов // Клиническая и лабораторная диагностика. – 2010. – №2. – С. 49–53.

49. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватуллин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергеенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo // Молекулярная биология. – 2010. – Т44. – С. 1036–1044.

50. Velikodvorskaya G.A., Tikhonova T.V., Gurvits I.D., Karyagina A.S., Lavrova N.V., Sergienko O.V., Tashlitskii V.N., Lunina N.A. and Lunin V.G. Chimeric lactase capable of spontaneous and strong immobilization on cellulose and developmrnt of continuous-flow system for lactose hydrolysis at high temperatures. Applied and Environmental Microbiology. – 2010. – V.76. Published online ahead of print on October 2010.

51. Глушков А.Н., Апалько С.В., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Бакулина А.Ю., Лунин В.Г., Костянко М.В. Новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин // Acta Naturae. – 2010. – Т.2. – С. 51–57.

Патенты и авторские свидетельства:

52. Калинин В.Н., Лапаева И.А., Лунин В.Г., Золотова О.М., Тихоненко Т.И.

А.С 1040794 МКИ C12N15/00, C12N9/22. Штамм Bordenella bronchiseptica–4994 – продуцент сайт–специфической эндонуклеазы. – №3385723/28–13, заявлено 11.01.82, опубликовано 05.30.1985 Открытия, изобретения №20. – C. 242.

53. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская–Санович И.И. А.с.1539205 от 1 октября 1989 г МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d33, кодирующая синтез метилазы SsoII и штамм E. coli B834, несущий плазмиду d33 – продуцент метилазы SsoII. (заявка №4394464 от 18 марта 1988 г.). опубл. 01.30.1990. Бюл. № 4. – C.72.

54. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская–Санович И.И. А.с 1532585 от 1 сентября 1989 г. МКИ C12N15/00 Рекомбинантная плазмида d24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы SsoII и штамм E. coli B834, несущий плазмиду d24 – продуцент рестриктазы и метилазы SsoII. (заявка №4394643 от 18 марта 1988 г.). опубл.

30.12.89 Бюл. № 48. – C.161.

55. Лунин В.Г., Сергиенко О.В,. Ходун М.–В. Л., Бадер Л. Б., Карпов В. А., Тихоненко Т. И. Пат. RU 2031121 C1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21.

Способ получения рекомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина–14;

рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин–14;

штамм бактерий Escherichia coli – продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина–14;

полипептид / – № 93031156/13;

заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8. – C.136.

56. Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Ходун М.–В., Бадер Л.Б., Карпов В.А., Тихоненко Т.И. Пат. RU 2031121 C1 РФ, МПК6 C12N15/12, C12N15/70, C12N1/21.

Способ получения реомбинантных плазмидных pC(Sp)n, кодирующих химерный белок с последовательностью соматостатина–14;

рекомбинантная плазмидная ДНК pC(Sp)4, кодирующая часть гена хлорамфениколацетилтрансферазы, тетрамерный спейсер и соматостатин–14;

штамм бактерий Escherichia coli – продуцент химерного белка с последовательностью соматостатина–14;

полипептид / – № 93031156/13;

заявлено 22.06.93, опубл. 20.03.95. Бюл. № 8.

57. Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Ходун М.–В.Л., Бадер Л.Б., Тихоненко Т.И.

Пат. RU 2034457 C1 РФ, МПК6 A01K67/02, A61K39/385, C12N15/16. Способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и препарат для его осуществления / – № 93031157/13;

заявлено 22.06.93, опубл. 10.05.95. Бюл. № 13. – С.108.

58. Народицкий Б.С., Лунин В.Г., Анисимова С.С., Сердобинский Л.А., Лаврова Н.В., Ковалева М.В. Пат. RU 2176669 C1 РФ, МПК7 C12N15/29, C12N15/82. Ген rs–ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения / – № 2000124582/13;

заявлено 28.09.00, опубл. 10.12.01. Бюл. № 34 (II ч.) – С.271.

59. Лунин В.Г., Тимофеева Т.В., Сучков А.В. Пат. RU 2207374 C1 РФ, МПК C12N15/51, C12N15/81, A61K39/29, C12N1/19. Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (HBSAg) вируса гепатита B, ее получение и штамм дрожжей Hansenula polymorpha – продуцент поверхностного антигена (HBSAG) вируса гепатита B / – № 2002112447/14;

заявлено 14.05.02, опубл.

27.06.03. Бюл. №18(IV ч). – С. 860.

60. Lunin V.G., Sergienko O.V., Khodin M.–V.L., Bader L.B., Karpov V.A., Tikhonenko T.I. United States Patent. 6,316,004 МПК A61K38/31, A61K39/385, C12P21/02, C07K14/655. November 13, 2001. Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain–producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals – № 264042;

заявлено 22.06.94. Изобретения стран мира №21/2002, выпуск 008, С. 69.

61. Лунин В.Г., Сергиенко О.В., Воронина О.Л., Рязанова Е.М., Розенкранц А.А., Соболев А.С. Пат. RU 2265055 C2 РФ, МПК7 C12N15/62, C12N15/70, C12N1/21, C07K19/00, A61K41/00, A61K47/42, C12N1/21, C12R1:19.

Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая модульный полипептид для доставки фотосенсибилизатора, и штамм Escherichia coli ВКПМ В–8356 – продуцент модульного полипептида / – № 2004100070/13;

заявлено 05.01.04;

опубл. 27.11.05, Бюл. №33(I ч.). – С. 181.

62. Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Карягина–Жулина А.С., Лаврова Н.В., Лунин В.Г., Лунина Н.А., Рязанова Е.М., Сергиенко О.В., Тихонова Т.В. Пат.

RU №2278160 С2 РФ, МПК C12N9/38 (2006.01), C12N15/56 (2006.01), C12N15/ (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12N11/12 (2006.01), C12P19/00 (2006.01), C12R1/ (2006.01). Рекомбинантный белок LACspCBD, обладающий бета–галактозидазной активностью и способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентами, рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка LACspCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, LACspCBD] – продуцент рекомбинатного белка LACspCBD, способ получения иммобилизованного рекомбинантного белка LACspCBD на целлюлозе и способ ферментативного расщепления лактозы / – № 2004110981/13 ;

заявлено 13.04.04;

опубл. 20.06.06, Бюл. № 17(II ч.) – С.368.

63. Гинцбург А.Л., Карягина–Жулина А.С., Кормилицина М.И., Лаврова Н.В., Лящук А.М., Лунин В.Г., Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Родионова И.В., Сергиенко О.В., Шмаров М.В. Пат. RU №2270249 С1 РФ, МПК C12N15/ (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C07K19/00 (2006.01), C12P21/00 (2006.01).

Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, штамм Escherichia coli M15[pREP4, pTUL4spCBD] – продуцент рекомбинатного белка TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD / – № 2004135849/13;

заявлено 20.02.06;

опубл. 20.02.06, Бюл. № 5(II ч). – С. 399.

64. Аксенова Е.И., Лунин В.Г., Галушкина З.М., Полетаева Н.Н., Грабко В.И., Гинцбург А.Л. Пат. RU №2378371 C1 РФ, МПК C12N1/21 (2006.01), C12N15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида (варианты), штамм Escherichia coli (варианты) – продуцент химерных белков, химерный белок (варианты), способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе, способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях / – № 2008145612/13;

заявлено 19.11.08;

опубл. 10.01.10, Бюл. № 1 (III ч.) – С.713–714.

65. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401302 С2 РФ, МПК C12N 15/00 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD1spGBD, штамм Escherichia coli – продуцент рекомбинантного белка D1–GBD, рекомбинантный белок D1–GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D1–GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D1–GBD / – № 2008146597/13;

заявлено 26.11.08;

опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

66. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401305 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12P21/00 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD4spGBD, штамм Escherichia coli – продуцент рекомбинантного белка D4–GBD, рекомбинантный белок D4–GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D4–GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D4–GBD / – № 2008146598/13;

заявлено 26.11.08;

опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

67. Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Верховская Л.В., Ананьина Ю.В., Гинцбург А.Л. Пат. RU № 2401304 С2 РФ, МПК C12N15/70 (2006.01), C12N1/21 (2006.01), C12P21/00 (2006.01), C12P21/08 (2006.01), G01N33/53 (2006.01) Рекомбинантная плазмида pD5spGBD, штамм Escherichia coli – продуцент рекомбинантного белка D5–GBD, рекомбинантный белок D5–GBD и способ его получения, способ исследования связывания белка D5–GBD с антителами сывороток больных, способ получения специфических антител к белку D5–GBD / – № 2008146599/13;

заявлено 26.11.08;

опубл. 10.10.2010 Бюл. № 28.

Заявка на патент с положительным решением Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам:

1. Котнова А.П., Шарапова Н.Е., Лунин В.Г., Карягина–Жулина А.С., Сергиенко О.В., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Гинцбург А.Л. Рекомбинантный белок Collbd–CBD, рекомбинантная плазмида pOC–Collbd, штамм Escherichia coli – продуцент рекомбинантного белка Collbd–CBD, способ получения рекомбинантного белка Collbd–CBD. Заявка № 2009144489 от 02.12.2009.



Pages:     | 1 ||
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.