авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб волго-каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации

На правах рукописи

АКИМОЧКИНА ТАТЬЯНА ИВАНОВНА

«ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СПЕРМИЕВ ЦЕННЫХ ВИДОВ

РЫБ ВОЛГО-КАСПИЙСКОГО БАССЕЙНА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ В

ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КРИОКОНСЕРВАЦИИ»

03.03.04 – клеточная биология, цитология и гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Астрахань – 2010 1

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук Земков Герман Вениаминович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Алтуфьев Юрий Владимирович доктор биологических наук, доцент Каниева Нурия Абдрахимовна

Ведущая организация: Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ РАСХН, г. Москва)

Защита состоится «30 » июня 2010 года в 14-30 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д. 1, Естественный институт АГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан « » мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Ю.В. Нестеров

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Постоянно растущее загрязнение окружающей природной среды, нерациональное использование биоресурсов, разработка новых источников полезных ископаемых, урбанизация и другие компоненты техногенной среды губительно сказываются на живых организмах, лишая их убежища, условий размножения, кормовых ресурсов т.д., что в итоге привело и продолжает негативно сказываться на численности ценных и редких видов животного и растительного царства (Державин А.Н., 1947;

Кожин Н.И., 1953).

Волго-Каспийский бассейн продолжает развиваться в направлении расширения техногенной среды. В настоящее время осуществляется нефтебуровая добыча углеводородов непосредственно в Каспийском море. Имеются опубликованные данные о превышении сульфатных соединений в почве и воде (Орлова О.В. с соавт., 2006). Еще до нефтеразведки, на Каспии насчитывалось несколько ценных видов рыб, занесенных в Красную книгу (Васильченко, 1997;

Кокоза, 1997).

Существующее положение приводит к необходимости принятия срочных мер для сохранения ценных видов растений и животных во всем их генетическом многообразии. Из имеющихся в настоящее время способов сохранения генофонда наиболее перспективным в сложившихся условиях является долговременная криоконсервация генетического материала, с последующей возможностью его реализации для получения полноценных особей, как резерва восстановления численности (Вепринцев Б.Н. с соавт., 1984, 1989;

Карнаухов В.Н., 1994;

Багиров В.А. с соавт., 2004;

Грищенко В.И. с соавт., 2004).

Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видов животных имеет значительную научную, информационную, экономическую и медицинскую ценность.

Генетический материал, сохраняемый в криобанке, может быть использован для обмена им между популяциями, разводимыми в неволе, а также для обогащения резерва наследственной изменчивости свободно живущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения в виду их малой численности. Кроме того, сохранение половых продуктов может найти широкое применение в селекционно-племенной работе, при этом появляется возможность избежать инбредной депрессии, упрощаются получение промышленных гибридов.

В настоящее время удается замораживать и хранить в жидком азоте, при температуре -196° половые клетки, гонады, многие соматические клетки ранних зародышей и ряд органов животных, а также семена, пыльцу и меристему растений. Однако, как показали исследования, эта технология должна разрабатываться специально применительно к каждому виду и объекту. Одна из наиболее разработанных отраслей криобиологии - глубокое замораживание сперматозоидов. Это связано как с биологическими особенностями спермиев, делающими их наиболее подходящим объектом для замораживания, так и с большим практическим значением этих работ. В настоящее время в России существует ряд криобанков репродуктивных клеток животных исследовательского назначения.

Анализ научной информации по проблеме криоконсервации репродуктивных клеток животных показал, что исследования осуществляются в двух направлениях: разрабатывается состав искусственной среды для спермиев, обеспечивающий защиту клеток от механического повреждения при замораживании;

второе направление связано с реактивацией подвижности спермиев после дефростации семенной жидкости.

Несмотря на большой объем научной информации по криоконсервации семенной жидкости животных, в опубликованных работах, как правило, нет данных для сравнения эффективности криопротекторов, различающихся между собой по составу. Одним из важных предметов исследований продолжает оставаться вопрос унификации методов по расчету качественного и количественного состава криозащитной среды Наибольший опыт хранения семенной жидкости получен на примерах различных пород сельскохозяйственных животных, а также по различным диким видам млекопитающих (Курбатов А.Д. с соавт., 1988;

Дьяконов Л.П. с соавт., 2004;

Айбазов В.М. с соавт., 2004;

Максудов Г.Ю., 2004;

Жильцов Н.З. с соавт., 2007). Известно, что криоустойчивость спермиев сельскохозяйственных животных превышает таковую у рыб. Для сельскохозяйственных животных, в отличие от рыб, разработаны разнообразные методы оценки качества половых клеток после хранения их в криосреде (Максудов Г.Ю. с соавт., 1987). Кроме того, отсутствуют публикации, отражающие перечень криоповреждений клеток рыб на различном уровне организации.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить цитологические особенности спермиев некоторых видов рыб Волго-Каспийского бассейна (осетровых, карповых, белорыбицы, окуня) в зависимости от состава криозащитной среды, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучить морфофункциональные особенности спермиев разных видов рыб до и после воздействия низких температур при различном химическом составе искусственных криопротекторных сред.

2. Изучить цитологические особенности сохранения спермиев рыб в зависимости от температуры и других условий замораживания и хранения биоматериала.

3. Определить оплодотворяющую способность и цитоморфологическое состояние дефростированных спермиев рыб после различных сроков хранения в криосреде при использовании стандартных и модифицированных по составу криопротекторов.

4. Разработать морфологические критерии оценки качества половых клеток после размораживания и разработать базу данных морфологических нарушений спермиев рыб в зависимости от состава криопротектора, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

5. Разработать способы повышения подвижности и оплодотворяющей способности спермиев рыб после дефростации семенной жидкости НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ Изучены и обобщены морфофункциональные особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна, ранее фрагментарно описанных в современных информационных источниках.

На основе микроскопического анализа впервые дана характеристика морфофункциональных изменений спермиев тех же видов рыб до и после криоконсервации в зависимости от состава криопротекторных сред, условий замораживания, хранения и размораживания. Выявлены наиболее типичные криоповреждения спермиев рыб на клеточном уровне организации.

Разработана матрица степени морфофункциональных нарушений спермиев рыб в зависимости от различного состава стандартных криопротекторных сред и их модификаций, а также разработаны и апробированы оригинальные составы криопротекторов, удовлетворяющих сохранению основных морфофункциональных показателей спермиев после криоконсервации.

На основании результатов проведенных серийных экспериментальных работ доказаны приемлемость замораживания и хранения семенной жидкости рыб в условиях низкой температуры (минус 22 градуса по Цельсию), что является альтернативой криоконсервации биоматериала в жидком азоте.

На основании проведенных опытов по оценке оплодотворяющей способности дефростированной семенной жидкости зарегистрировано оплодотворение яйцеклеток, что указывает на необходимость дальнейших коррективных изменений в традиционную биотехнику искусственного воспроизводства рыб.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Работа представляет цитологическую, функциональную характеристику половых клеток рыб в норме и на фоне низкотемпературного воздействия. Полученные данные позволяют выявить цитологические особенности строения спермиев в зависимости от ряда условий криоконсервации, а именно от состава криопротекторной среды, способа замораживания, температурных условий хранения и дефростации биоматериала.

Практическая значимость работы заключается в том, что она позволяет расширить существующие представления о механизмах и характере повреждения половых клеток в результате воздействия низких и сверхнизких температур, что рекомендуется использовать в качестве тест-критерия качественного состояния спермиев после хранения их в замороженном виде в условиях криобанка.

Полученные данные являются основой для последующих исследований с целью использования криоконсервированной семенной жидкости в практике искусственного оплодотворения репродуктивных клеток ценных видов рыб, а также позволит снизить затраты на содержание производителей на рыбоводных заводах.

Результаты проведенного комплекса исследований рекомендуется использовать в рыбоводной практике, а также специалистам в области криобиологии и криоконсервации спермиев и других видов клеток и тканей животных и человека.

Полученные данные могут быть внедрены для преподавания соответствующих разделов цитологии, гистологии, физиологии человека и животных, криобиологии. Результаты исследования могут быть использованы для написания монографий, и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Одной из причин морфофункциональных нарушений спермиев при замораживании семенной жидкости является гиперосмотичность плазмы за счет внесения водных растворов различных компонентов криопротекторной среды. Дополнительное введение воды в семенную жидкость перед замораживанием усиливает акустическую эмиссию, что приводит к деструктивным изменениям спермиев.

2. Обоснована способность к частичному оплодотворению яйцеклеток рыб дефростированной семенной жидкостью, что указывает на стабильность ДНК в условиях криоконсервации. На этом основании выдвигается положение о коррекции традиционных способов искусственного оплодотворения рыб.

3. Хранение семенной жидкости рыб при низкой и сверхнизкой температуре не снижает количества живых спермиев, функциональную активность которых возможно увеличить за счет биологически активных веществ различной природы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы доложены и обсуждены на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005);

на студенческой конференции Астраханского государственного университета (Астрахань, 2006);

на IX Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006);

в докладах Московского общества испытателей природы «Биотехнология - охране окружающей среды (Москва, 2006);

на Международной научной студенческой конференции «Научный потенциал студенчества - будущему России» (Ставрополь, 2007);

на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007);

на Международной конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России» (Сочи, 2007);

на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007);

на Международном конгрессе молодых ученых, студентов и аспирантов «Перспектива - 2007» (п. Эльбрус, 2007);

на Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, 2008);

на II Международной научно-практической конференции «Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2009).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы.

Указатель литературы включает в себя 103 отечественных и иностранных источников. Работа содержит 9 таблиц, 33 фотографии, приложение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования являлись самцы русского осетра (Acipenser guldenshtadti), севрюги (Acipenser stellatus), белорыбицы (Stenodus leucichthys leucichthys), пестрый толстолобик (Aristichthys nobilis), белый амур (Ctenopharyngonod idella), а также самки севрюги (Acipenser stellatus). Семенную жидкость и икру отбирали у репродуктивных самцов и самок рыб, резервированных для искусственного воспроизводства на Александровском, Кизанском, Бертюльском и Волжском рыбоводных заводах Астраханской области.

Кроме того, в весенний период для сравнительного анализа отлавливали половозрелых самцов и самок речного окуня (Perca fluviatilis).

Качество нативной и дефростированной спермы определяли по двум показателям: по подвижности спермиев и их морфологической целостности. Подвижность спермиев оценивали по времени поступательного и колебательного движения спермиев по общепринятой методике (Гинзбург А.С. с соавт., 1969). По шкале Персова (Персов Г.М., 1941) оценивали процент подвижных клеток в пределах поля зрения микроскопа.

Для морфологической оценки спермиев приготавливали мазки семенной жидкости, взяв за основу методику, используемую для изготовления и окраски мазков крови (Иванова Н.Т., 1982). Препараты окрашивали азур-эозином по Романовскому. Микроскопировали мазки спермы при увеличении 840 и 8100. Морфологические особенности описывали с указанием структурных нарушений и затем фотографировали с помощью видеоокуляра НВ 35, копируя с монитора компьютера.

При криоконсервации семенной жидкости разных видов рыб были использованы ряд стандартных криопротекторов (Ананьев В.И. с соавт., 1998 а). Низкое качество семенной жидкости, полученное нами при криоконсервации семенной жидкости разных видов рыб с использованием различных вариантов стандартных криопротекторов, привели к необходимости разработки и использования модифицированных нами составов криозащитных сред. С этой целью на водопроводной воде приготавливали растворы веществ по единой шкале концентраций 0,01;

0,05;

0,1;

0,5;

1;

1,5;

2 мл на 0,5 мл спермы. После определения оптимальной концентрации, которую оценивали по подвижности спермиев, все вещества смешивали. Приготовленную смесь (криопротектор) вносили в семенную жидкость в расчете по объему 1: (общепринятое соотношение) и вновь наблюдали за подвижностью спермиев.

Кроме состава криопротекторной среды важным условием успешного криосохранения семенного материала являются такие показатели, как способ замораживания и условия хранения семенного материала. Нами было испытано два способа криоконсервации семенной жидкости русского осетра: ступенчатое замораживание в пробирках Эпендорфа и сверхбыстрое замораживание в гранулах до 80-и градусов с последующим погружением в жидкий азот для длительного хранения.

Также было испытано два уровня температурного режима замораживания и хранения семенной жидкости рыб: при минус 196 в условиях жидкого азота и минус 22 градуса по Цельсию в морозильной камере.

Размораживание криоконсервированной семенной жидкости осуществляли тремя способами: в термостате при температуре 37С, в холодильнике при 8С и в ладонях при комнатной температуре.

В связи с тем, что после дефростации семенной жидкости подвижность спермиев резко снижалась, применяли следующие химические активаторы: растворы эпина 10-6 и 10-4 мг/л, циркона 10-4 мг/ л, Na2CO3 0,7%, NaHCO3 0,7%, селенактива, метилтестостерона, глюкозы 0,7%, MgSO4 0,7%, K2HPO4 0,7%, KCl 0,7%, CaCl2 0,7%, аскорбиновой кислоты 0,7%, -токоферола 0,7%, сыворотка эмбриональная телячья.

Для стимуляции двигательной активности спермиев на предметное стекло рядом с каплей семенной жидкости наносили каплю раствора стимулятора, быстро смешивали ее со спермой и микроскопировали, фиксируя количество активных спермиев в процентах, время подвижности, а также характер движения. Контролем служила семенная жидкость, которую активировали водопроводной водой.

Осеменение икры севрюги дефростированной семенной жидкостью осуществляли полусухим способом. В связи с использованием дефростированных спермиев, подвижность которых была значительно ниже нативных, семенную жидкость севрюги разводили водой в 10 раз.

Оплодотворение осуществляли в течение 20 мин, из расчета 30 мл спермы на 300 икринок. Икру обесклеивали тальком в течение 10 мин.

Развитие икры происходило в инкубационных аппаратах. В качестве контроля служили аппараты с нативной икрой.

Осеменение икры речного окуня осуществляли мокрым способом.

Для этого икру размещали в чашки Петри по 100 штук, далее приливали речную воду, вносили порцию семенной жидкости и перемешивали в течение 5 мин, после этого икру отмывали той же водой. Осеменение проводили при комнатной температуре. Инкубацию икры осуществляли в лабораторных условиях. Во время инкубации три раза в сутки меняли воду на свежую, и ежедневно регистрировали стадии развития эмбрионов под микроскопом. Наблюдения проводили в течение пяти дней после обнаружения явных признаков деструкции зародышей.

Для установления достоверности полученных данных при анализе результатов исследования все материалы были подвергнуты статистической обработке (Лакин Г.Ф., 1973;

Плохинский Н.А., 1980).

Материал обрабатывали на персональном компьютере с помощью программ Microsoft Office Windows 2003 и Microsoft Office Excel 2003.

При этом определяли средние арифметические величины (М), средние ошибки (m) и вероятность различия (р) по критерию Стьюдента (Плохинский Н.А., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ У спермиев осетровых имеются структурные и метаболические особенности, которые при неблагоприятных условиях резко меняют их криоустойчивость, поэтому криобиологам довольно трудно работать с осетровыми. После дефростации при использовании различных по составу стандартных криопротекторов у спермиев русского осетра и севрюги были обнаружены различные нарушения с явными признаками деструкции: изменение формы головок спермиев, их сморщивание или, напротив, набухание, шизоцитоз, а также разрушение хвостовой части (Рис. 1 А). Данные нарушения удалось предотвратить, используя стандартные криопротекторы без включения в их состав углеводов, что приводило к склеиванию морфологически полноценных спермиев друг с другом (Рис. 1 Б), а также путем разработки и использования для защиты клеток от повреждений модифицированных криопротекторов.

А. Б.

Рис. 1. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, замороженная с криопротектором с добавлением (А) и без добавления углеводов (Б). Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об.

х100.

При использовании модифицированных криопротекторов различного состава удавалось сохранить без изменений головки спермиев, в то время как хвостовые части разрушались (Рис. 2). Это, по всей видимости, и явилось одной из причин снижения подвижности дефростированных спермиев.

Рис. 2. Мазок дефростированной семенной жидкости русского осетра с добавлением модифицированного криопротектора.

Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х100.

Оценивая качественное состояние спермиев осетровых по их подвижности после дефростации, нами отмечен факт явной инактивации половых клеток во всех использованных стандартных и модифицированных криопротекторах. Количество подвижных клеток после дефростации составляло 5-15%. Общее время подвижности дефростированных спермиев севрюги сокращалось в два раза, а русского осетра оставалось без изменений. Важно отметить, что некоторые клетки приходили в движение спустя некоторое время. Особо важно отметить характер подвижности, некоторые клетки от поступательного движения переходили в колебательное, другие совершали поступательно колебательное или только колебательное движение. Наконец, скорость движения была также значительно ниже по сравнению с клетками до замораживания.

Нарушения в виде набухания спермиев, деформации головки и потери хвостовой части были обнаружены и у дефростированных спермиев карповых видов рыб при использовании стандартных криопротекторов (Рис. 3 А). В ряде случаев происходило гелеобразование семенной плазмы, в связи с чем, сперматозоиды не удавалось выявить микроскопически (Рис 3 Б).

А. Б.

Рис. 3. Мазок дефростированной семенной жидкости белого амура (А) и пестрого толстолобика (Б) с добавлением стандартных криопротекторов. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об.

х40.

Добавление модифицированных криопротекторов позволило избежать данные нарушения, однако были получены противоречивые результаты при использовании в качестве коагулянта гепарина.

Отсутствие в составе криопротектора гепарина вызывало коагуляцию семенной жидкости толстолобика после дефростации (Рис. 4 А). И наоборот, использование криопротектора без внесения гепарина, позволило избежать коагуляции семенной жидкости амура и сохранить клетки целыми (Рис. 4 Б). В целом, семенная жидкость этих видов рыб была очень густой и спермии не имели поступательного движения, в редких случаях отдельные спермии совершали слабые колебательные движения.

А. Б.

Рис. 4. Мазок дефростированной семенной жидкости белого амура (А) и пестрого толстолобика (Б) с добавлением модифицированного криопротектора. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об.

х40.

В плане обсуждения экспериментальных данных по криоконсервации семенной жидкости белорыбицы в первую очередь важно отметить, что в дефростированной семенной жидкости по скорости и по характеру движения спермии белорыбицы не отличались от осетровых. Также показана зависимость деструктивных признаков клеток белорыбицы от состава криопротекторов. Наиболее выраженные изменения на клеточном уровне заключались в том, что спермии белорыбицы имели округлую форму, с набуханием спермиев и их хвостовой части в одних случаях (А) и явными признаками разрушения спермиев в других (Б).

А. Б.

Рис. 5. Дефростированная семенная жидкость белорыбицы.

Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х100.

Из всех изученных нами видов спермии окуня оказались наиболее устойчивыми при хранении в условиях низких и сверхнизких температур. После дефростации спермии оставались неповрежденными и сохраняли свою активность при использовании разнообразных по составу стандартных и модифицированных криопротекторов (Рис. 6).

После дефростации количество подвижных спермиев окуня снижалось незначительно. По характеру и продолжительности движения клетки окуня также заметно превосходили спермии остальных изученных видов рыб. Возможно, такая криорезистентность спермиев окуня связана с размерами и формой их головной части по сравнению с осетровыми, а именно, чем меньше по размеру клетки, тем меньше они испытывают физическое напряжения во время замораживания. Таким образом, морфологическая целостность, высокая функциональная активность, целостность ядра спермиев окуня указывает на высокую толерантность не только клетки, но и ее генетического материала. Именно ядерно плазматические и ядерно-плазменные процессы клетки лежат в основе качественного состояния гамет и их оплодотворяющей способности (Баглай Е.Б., 1979).

Рис. 6. Дефростированная семенная жидкость речного окуня.

Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40.

Ряд авторов (Scott A.P. et al., 1980) критически оценивали включение некоторых соединений в состав криозащитных сред. По их мнению, соли кальция и магния имеют тенденцию скорее активировать, а не ингибировать подвижность спермы. Применение сахаров, обеспечивающих источник энергии при анаэробном метаболизме спермы млекопитающих, вероятно, не имеет смысла для спермы лососевых, которым присущ аэробный метаболизм. С другой точки зрения, сахара являются важными компонентами сред, так как могут уменьшить агглютинацию спермиев и окисляться, выполняя роль антиоксидантов (Piironen J., 1993), что было подтверждено в наших исследованиях. К настоящему времени требования, которым должны отвечать криозащитные среды, полностью еще не выработаны.

Помимо состава криопротектора, одну из главных ролей в практике криоконсервации играют условия замораживания и хранения биологического материала. Существуют различные технологии замораживания спермиев: замораживание в гранулах, поливиниловых соломинках, хлорвиниловых ампулах, пробирках Эпендорфа и другие.

Выбор контейнера напрямую определяет способ замораживания и размораживания. Чаще всего при работе со спермой рыб применяют многоступенчатые режимы охлаждения, когда скорости его варьируют в разных интервалах температур на разных этапах замораживания. При этом во многих случаях отклонения на десятые доли градуса от оптимального температурного режима консервации чреваты критическими последствиями (Ананьев В.И. с соавт., 1998 b).

При криоконсервации семенной жидкости русского осетра ступенчатым способом в пробирках Эпендорфа в одном случае спермии после дефростации изменили свою форму и частично утратили хвостовую часть, в другом случае были близки к нативной. Что, по всей видимости, было связано с составом используемых криопротекторов: в первом случае использовался стандартный криопротектор, в состав которого входили сахароза и маннит, во втором стандартный криопротектор без внесению углеводов.

Сверхбыстрое замораживание в гранулах с использованием тех же криопротекторов привело к противоположному результату. Спермии, замороженные сверхбыстрым способом в гранулах с использованием стандартного криопротектора с углеводами, морфологически более близки к нативным, в то время как спермии, замороженные с использованием стандартного криопротектора без углеводов, изменили свою форму и частично утратили хвостовую часть.

При замораживании семенной жидкости белорыбицы сверхбыстрым способом в гранулах головная часть спермиев оставалась без изменений, но происходило разрушение хвостовой части. Напротив, при замораживании семенной жидкости белорыбицы ступенчатым способом в пробирках Эпендорфа, сохранялась хвостовая часть спермиев, но головки части клеток деформировались и склеивались друг с другом. В обоих случаях подвижность спермиев с 100% снижается до нуля. Однако спермии с целыми хвостовыми частями, замороженные ступенчатым способом в пробирках Эпендорфа, частично имели слабые колебательные движения.

Таким образом, варьирование способов замораживания не позволило получить однозначного результата, что вероятно связано с различиями в криоустойчивости спермиев рыб.

Обращаясь к источникам научной информации по данной проблеме все опубликованные материалы за редким исключением, посвящаются вопросам замораживания и хранения репродуктивных клеток рыб при сверхнизкой температуре. Однако полученные нами данные показали, что в семенной жидкости русского осетра, замороженной с использованием стандартных криопротекторов и хранившейся при -196С и при -22С цитоморфологически спермии не отличаются друг от друга (Рис. 7 А, Б). Замораживание семенной жидкости осетровых при низкой температуре -22С существенно не снижает процент подвижных спермиев.

А. Б.

Рис. 7. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, замороженная и хранившаяся при -196°C (А) и при -22°C (Б).

Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40.

При резком изменении температурного режима наблюдается деформация спермиев, изменение формы и набухание головной части спермиев, разрушение хвостовой части, а также резкое снижение их числа (Рис. 8).

Рис. 8. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, температурные условия хранения которой были нестабильными.

Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40.

Набухание и предшествующие лизису признаки, по всей вероятности, происходят в результате изменения осмотического давления плазмы и внутриклеточной жидкости. В настоящее время нет общей теории, объясняющей механизмы повреждения клеток и степени денатурации белков в процессе криоконсервации биологического материала. На современном этапе исследований основная цель большинства опубликованных работ посвящается разработке искусственной среды, предназначенной фактически для криозащиты клеток в условиях низкой и сверхнизкой температуры. Основные усилия исследований направлены на предотвращение физического разрушения клеток под влиянием кристаллов льда. Значительно меньше уделяется внимания изучению состояния внеклеточных и внутриклеточных молекул. Опубликованные фактические материалы исследований (Кяйваряйнен А.И., 1980) указывают на возможность ренатурации ряда ферментов в водных растворах после их размораживания.

Не меньшее значение для успеха криоконсервации имеет способ размораживания и последующего манипулирования дефростированной спермой. Скорость оттаивания должна выбираться такой, чтобы свести до минимума рекристаллизацию остаточной внутриклеточной жидкости, образующейся при отогреве клеток (Ананьев В.И. с соавт., 1998 b).

Нами было испытано три способа дефростации семенной жидкости белорыбицы: в термостате при 37С, при комнатной температуре и в холодильнике при 8С. Семенная жидкость, дефростированная в термостате при 37С, была очень густой, при смешивании с водой происходило гелеобразование семенной плазмы. Головки спермиев оставались без изменений, незначительная часть набухала и была деформирована. Хвостовая часть разрушалась полностью и спермии были неподвижны. При дефростации семенной жидкости медленным способом в холодильнике при 8С происходила деструкция спермиев. В большинстве случаев головки спермиев разрушались полностью, немногочисленная часть набухала. Частично сохранялись хвостовые части спермиев. Наиболее оптимальным способом дефростации семенной жидкости оказалось размораживание при комнатной температуре. Семенная жидкость после дефростации при комнатной температуре была нормальной консистенции. Микроскопический анализ показал, что головки спермиев также остались без изменений, незначительная часть набухала. Хвостовые части спермиев также не разрушались и были отчетливо видны (Рис. 9). Однако после дефростации спермии теряли подвижность, что, возможно было вызвано агрегацией спермиев и спутыванием их хвостовых частей.

Рис. 9. Семенная жидкость белорыбицы, дефростированная при комнатной температуре. Окрашивание азур-эозином по Романовскому.

Ув. об. х100.

Решая многие вопросы по проблеме криоконсервации репродуктивных клеток животных и, в частности, спермиев, основным и широко распространенным критерием качества являлась и до сих пор используется их подвижность. Вместе с тем накапливались и результаты морфологических нарушений спермиев в результате замораживания семенной жидкости в жидком азоте, что привело в использовании результатов структурного анализа. В последующих исследованиях появилось несколько работ, в которых авторы привели данные применения оплодотворяющей способности спермиев после дефростации в качестве основного критерия функционального состояния спермиев (Ананьев В.И. с соавт., 1998 b;

Пронина Н.Д., 2004). Связь морфологических нарушений и оплодотворяющей способности спермиев показана многими авторами (Соколовская И. с соавт., 1981;

Blom E., 1973;

Saacke R.G., 1968, 1970, 1972;

Sato H. et al., 1984;

Schoysman R. et al., 1985).

После дефростации семенной жидкости для оплодотворения икры севрюги наибольшее количество подвижных спермиев составляла 10- %, а скорость подвижности клеток по сравнению с нативными была крайне низкой. Несмотря на столь низкие показатели качественной характеристики половых клеток, нами зарегистрирован факт оплодотворения и дальнейшего развития эмбрионов севрюги до выклева предличинок. Количество оплодотворенной икры (оценка на стадии гаструлы) по трем самкам колебалось и составило 11;

13;

22 %. Считая от общего количества оплодотворенной икры, заложенной на инкубацию, выклев предличинок составил лишь в одном случае на уровне около 5%.

От остальных самок выклева предличинок не наблюдали, в связи с тем, что после стадий дробления и гаструляции развитие приостановилось.

Несмотря на столь низкие результаты опытов по оплодотворению икры севрюги дефростированной семенной жидкостью, полученные нами фактические данные согласуются с опубликованными работами упомянутых выше авторов (Ананьев В.И. с соавт., 1998 а, 1998 b;

Савушкина С.И., 1999;

Цветкова Л.И. с соавт., 1999). Для дальнейших исследований полученные данные, прежде всего, доказывают возможность практического использования криоконсервированной жидкости в рыбоводной практике, а также свидетельствуют о функциональной активности генетического материала.

Несмотря на отсутствие видимых нарушений в половых клетках окуня, оплодотворяемость в искусственных условиях практически равна нулю. Аномалии дробления-деления оплодотворенной икры окуня мы относим к несовершенству биотехники искусственного оплодотворения ооцитов. Биотехника искусственного оплодотворения икры речного окуня практически не разработана, поэтому полученные нами фактические материалы следует считать предварительными, но весьма необходимыми для совершенствования приемов и способов не только для оплодотворения in vitro, но и для разработки условий инкубации эмбрионов. Причем, как показали результаты, наиболее высокий отход икры происходит на ранних стадиях развития. Потомство осетровых видов рыб, полученное с использованием криоконсервированной спермы, по рыбоводно-биологическим показателям не отличается от такового, полученного традиционным способом, за исключением нескольких худших показателей на ранних стадиях зародышевого развития (Савушкина С.И., 1999).

Большое значение для достижения максимального оплодотворения икры криоконсервированной спермой имеет инициирование подвижности сперматозоидов после размораживания. Испытание различных активаторов, составленных на основе буферных растворов с разными значениями рН и водных растворов солей, сахаров, фитогормона эпина, АТФ, аминокислот позволило определить оптимальные стимуляторы движения спермиев для каждого вида рыб.

Из всех веществ положительный эффект на дефростированные спермии русского осетра оказали метилтестостерон и раствор эпина 10 - мг/л. Под влиянием метилтестостерона время поступательного движения дефростированных спермиев было значительно выше, чем до криоконсервации. Процент подвижных спермиев с нуля поднялся до 6,33%. Раствор эпина 10-6 активировал около 5% спермиев. Клетки начинали активные колебательные движения спустя 2,12 мин после воздействия стимулятора. При использовании раствора эпина 10-4 слабые колебательные движения были зарегистрированы у единичных клеток.

Полученные данные по воздействию различных стимуляторов на спермии русского осетра представлены в таблице 1.

Таблица Влияние растворов стимуляторов на двигательную активность дефростированных спермиев русского осетра Экспериментальные Процент подвижных спермиев Время подвижности (мин) условия М±m n CV % М±m n CV % Раствор эпина 10-6 мг/л 3.5 ± 1.19 4 2.38 68.01 6.25 ± 4.62 4 9.2 148. Раствор эпина 10-4 мг/л 0 - - - 0 - - Раствор Na2CO3 0,7% 2.66 ± 1.45 4 2.52 93.37 3.67 ± 2.73 4 4.73 128. Сыворотка 3.67 ± 0.67 4 1.15 31.49 5 ± 0.58 4 1 эмбриональная телячья Раствор 0 - - - 0 - - метилтестостерона Раствор селенактива 0 - - - 0 - - Обсуждая полученные результаты по стимуляции подвижности спермиев белорыбицы после их хранения в жидком азоте, существенное значение оказало внесение питательных веществ. Использование сыворотки эмбриональной телячьей для активации подвижности дефростированных спермиев белорыбицы позволило повысить процент подвижных спермиев с нуля до 3,67%. Время подвижности составило пять минут, что близко к показателям нативной семенной жидкости.

Составление питательных сред носит исследовательский характер из-за недостатка фактических данных по механизму криоповреждений (Котляров Г.Ю. с соавт., 2004;

Шишова Н.В. с соавт., 2004).

Сравнительные данные по активности спермиев белорыбицы после воздействия стимуляторов приведены в таблице 2.

Таблица Влияние различных по составу растворов стимуляторов на двигательную активность спермиев белорыбицы после дефростации Экспериментальные Процент подвижных спермиев Время подвижности (мин) условия М±m n CV М±m n CV % % Раствор эпина 10-6 мг/л 3.5 ± 1.19 4 2.38 68.01 6.25 ± 4.62 4 9.2 148. Раствор эпина 10-4 мг/л 0 - - - 0 - - Раствор Na2CO3 0,7% 2.66 ± 1.45 4 2.52 93.37 3.67 ± 2.73 4 4.73 128. Сыворотка 3.67 ± 0.67 4 1.15 31.49 5 ± 0.58 4 1 эмбриональная телячья Раствор 0 - - - 0 - - метилтестостерона Раствор селенактива 0 - - - 0 - - Таким образом, комплексное использование различных способов стимуляции подвижности в целом сводятся к процессам репарации структурных элементов, ренатурации белковых соединений и восполнению питательных веществ, необходимых для обмена веществ в процессе жизнедеятельности клеток.

В доступной нам литературе нет аналогичных сведений по морфологическому описанию спермиев после замораживания клеток, за исключением прорисовок и описания цитохимических методов дифференциации мертвых и живых клеток сельскохозяйственных животных (Максудов Г.Ю. с соавт., 1987). Полученные нами данные по подвижности и морфологическому описанию спермиев после их замораживания служат одним из надежных критериев, с помощью которого возможно проводить целенаправленные исследования на важном участке разработки оптимальных условий криоконсервации генетического материала.

Проведенные исследования имеют большое научное значение в разработке новых направлений и концепций в решении многообразных вопросов по проблеме сохранения редких и исчезающих видов животных и растений.

Анализ полученных данных позволил не только завершить определенный этап исследований в соответствии с поставленными целью и задачами, но и выдвинуть ряд новых задач, которые в настоящее время решаются нами по обсуждаемой теме исследований. Основные из них следующие: исследования физико-химических свойств сократительных белков спермиев и возможности ренатурации после хранения их при низких и сверхнизких температурах;

осуществление всестороннего сравнительного анализа физико-химических показателей плазмы семенной жидкости рыб до и после дефростации;

определение эффективности факторов активизирующих ренатурацию белков и регенерацию клеток под влиянием биологически активных веществ разной природы.

ВЫВОДЫ 1. Анализ морфофункционального состояния спермиев изученных видов рыб после криоконсервации семенной жидкости показал, что применение стандартных криопротекторов приводит к смещению изоосмотичности плазмы, что и является основной причиной утраты подвижности клеток и сопровождается в различной степени мофологическими нарушениями головной и особенно хвостовой части спермиев.

2. Исключение дополнительного введения воды за счет водных растворов криопротекторных веществ в семенную жидкость до замораживания позволяет заметно снизить степень нарушений спермиев.

3. Результаты экспериментальных исследований подтвердили информационные данные о возможности оплодотворения яйцеклеток рыб при использовании дефростированной семенной жидкости после хранения ее при низкой и сверхнизкой температуре в криопротекторах стандартного и модифицированного состава.

4. Низкая оплодотворяемость икры рыб при использовании дефростированной семенной жидкости указывает на необходимость внести изменения в традиционную биотехнику искусственного оплодотворения.

5. Доказана возможность замораживания семенной жидкости рыб при низкой температуре без снижения ее качества при длительном хранении.

6. Для оценки качества дефростированных спермиев рыб необходимо учитывать комплекс показателей, таких как их морфологическая целостность, физиологическая активность и оплодотворяющая способность 7. Подвижность нативных спермиев полностью прекращается без фазового перехода по мере снижения концентрации веществ, обладающих криопротекторными свойствами, что возможно связано с изменением качества плазмы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. На основании полученных результатов по качеству дефростированных спермиев разных видов рыб и их оплодотворяющей способности, в практике искусственного оплодотворения промысловых видов рыб рекомендуем увеличить объем семенной жидкости, время оплодотворения, а также испытать процесс оплодотворения при различных вариантах обесклеивания икры.

2. В процессе искусственного оплодотворения яйцеклеток рыб целесообразно применение активирующих растворов для оттаивания криоконсервированной спермы и осеменения ею икры. Активизирующие растворы, возможно, использовать и при работе с нативной семенной жидкостью, в связи с понижением жизнеспособности спермы и оплодотворяемости икры.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Акимочкина Т.И. Оплодотворяемость икры белорыбицы после криоконсервации репродуктивных клеток в условиях сверхнизкой температуры. / Г.В. Земков, М.А. Егоров, А.М.

Тихомиров, Т.И. Акимочкина // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: материалы Международной научной конференции. 11-12 октября 2005 г. / отв. ред. В.Н. Пилипенко. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2005. - С. 88-89.

2. Акимочкина Т.И. Альтернативные хладоагенты для реализации методов криосохранения репродуктивных клеток ценных видов животных. / Т.И. Акимочкина // Естественные науки. - № 3- (16-17). - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С. 26-29.

3. Акимочкина Т.И. Микроскопический анализ дефектов репродуктивных клеток русского осетра после хранения при сверхнизкой температуре. / Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря:

материалы 9 Международной научной конференции. 10- октября 2006г. / отв. ред. В.Н. Пилипенко. - Астрахань:

Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С.

261-262.

4. Акимочкина Т.И. Разработка методов криосохранения генеративных клеток белорыбицы. / Т.И. Акимочкина // Доклады Московского общества испытателей природы, том 38:

Биотехнология - охране окружающей среды (под ред. проф.

Садчикова А.П., к.б.н. Котелевцева С.В.) - М.: Изд-во «Грификон», 2006. - С. 15.

5. Акимочкина Т.И. Особенности технологии криосохранения репродуктивных и соматических клеток осетровых и белорыбицы. / Т.И. Акимочкина // Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 12-16 марта, 2007 г.). - М.:

ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - С. 252.

6. Акимочкина Т.И. Перспективы изучения морфологии спермиев рыб с целью оценки их качественного состояния после хранения в условиях сверхнизкой температуры. / Т.И.

Акимочкина // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С.

230-231.

7. Акимочкина Т.И. Поиск оптимальных концентраций криопротекторных веществ при замораживании семенной жидкости рыб / Т.И. Акимочкина // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России: материалы Международной конференции, 3- октября 2007 г. / сост.: М.А. Егоров. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007. - С. 112-115.

8. Акимочкина Т.И. Предварительные данные по изучению способов качественной оценки спермиев быка после хранения семенной жидкости при сверхнизкой температуре. / Г.В.

Земков, М.А. Егоров, Г.Ф. Журавлева, Т.И. Акимочкина // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России: материалы Международной конференции, 3-5 октября 2007 г. / сост.: М.А. Егоров. Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007. - С. 105-108.

9. Акимочкина Т.И. Определение сравнительной криоустойчивости спермиев в зависимости от видовой принадлежности рыб. / Т.И. Акимочкина, О.П. Попов, Г.В.

Земков // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных // Материалы международной научно-практической конференции. - Дубровицы: ВНИИЖ, 2007. - С. 127-128.

10. Акимочкина Т.И. Исследование генетического материала криохранилища, цитоморфологический анализ образцов из криоколлекции, содержащейся более полугода. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 16 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04565.

11. Акимочкина Т.И. Исследование генетического материала сельскохозяйственных животных для нужд криохранилища. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 17 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04567.

12. Акимочкина Т.И. Исследование криопротекторных свойств различных химических соединений, используемых для замораживания и хранения клеток биообъектов. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 70 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04162.

13. Акимочкина Т.И. Морфологический анализ генетического материала. Эксперименты по дефростации и отработки режимов заморозки половых клеток осетровых рыб. / М.А.

Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.:

ВНТИЦ, 2007. - 20 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 04563.

14. Акимочкина Т.И. Проведение биотехнологических исследований, сбор качественного генетического материала.

Контроль развития рыбоводной продукции (эмбрионов, личинок, молоди) на каждом из технологических этапов. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 18 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04564.

15. Акимочкина Т.И. Проведение экспериментов по корректировке оптимальных значений компонентов – составных частей криопротекторов. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И.

Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 15 с. - № ГР 01200609511.

- Инв. № 022007 04566.

16. Акимочкина Т.И. Цитологический анализ генетического материала осетровых видов рыб. Характеристика выживаемости полученного потомства. / М.А. Егоров, В.И.

Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. 20 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04562.

17. Акимочкина Т.И. Экспериментальный подбор криопротекторов. Пополнение криохранилища генетическим материалом от качественных производителей белорыбицы. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 16 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04561.

18. Акимочкина Т.И. Цитоморфологические изменения спермиев после хранения их при низкой температуре. / Т.И.

Акимочкина // Международная конференция "Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб". - СПб. -2008. - С. 30.

19. Akimochkina T.I. The Cryoconservation Features of the Target Fish Species’ Generative Cells. / T.I. Akimochkina // Biotechnology:

State of the Art and Prospects for Development. - N.Y.: Nova Science Publishers, 2008. - pp. 1-4.

20. Акимочкина Т.И. Криоконсервация эксплантов гонад рыб и их последующее культивирование как один из способов сохранения генофонда. / Т.И. Акимочкина, Д.А. Шигаев // Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология:

состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.

Менделеева, 2009. - С. 193-194.

21. Акимочкина Т.И. Сравнительные данные количественного содержания углеводородов в природных водах дельты реки Волги и семенной жидкости русского осетра. / Г.В. Земков, Т.И.

Акимочкина, О.Н. Рылина // Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования: материалы II Международной научно-практической конференции (г.

Астрахань, 25-30 августа 2009 г) / сост.: В.Н. Пилипенко, С.Р.

Кособокова. – Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2009. – С. 146-148.

22. Акимочкина Т.И. Цитоморфологические и функциональные изменения спермиев русского осетра (ACIPENSER GULDENSHTADTI B.) после криоконсервации. / Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // Цитология. - 2009. - Т. 51. - № 11. - С.

945-952.

Подписано к печати...05. Заказ №. Тираж 100 экз.

Уч.-изд. л. 1,4. Усл. печ. л. 1, Оттиражировано в Издательстве «»



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.