авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии кости

На правах рукописи

Вахрушев

Игорь Викторович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

КЛЕТОК ПУЛЬПЫ МОЛОЧНОГО ЗУБА И КОСТНОГО МОЗГА:

ФЕНОТИП И ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ КОСТИ

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии учреждения Российской академии медицинских наук «НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН».

Научный руководитель:

Зав. лаб. клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ ОПП РАМН, член-корреспондент РАМН, Ярыгин Константин Никитич доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Зав. кафедрой гистологии и эмбриологии лечебного ф-та ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, Дубовая Татьяна Клеониковна доктор медицинских наук Ст.н.с. лаб. молекулярной кариологии и основ клеточной терапии ИМБ РАН, Попов Константин Васильевич кандидат биологических наук

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_» февраля 2011 года, в _ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул.

Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан «_» января 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Саврова Ольга Борисовна кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время наиболее распространенными высокотехнологичными хирургическими подходами к восстановлению поврежденных органов являются реконструктивная хирургия и трансплантация органов. С их помощью спасены миллионы жизней, но они имеют принципиальные ограничения. Биомедицинские конструкции, как правило, не могут полностью заменить живую ткань, а главные проблемы трансплантологии – дефицит пригодных для пересадки органов и иммунологическая несовместимость реципиента и донора. Эти ограничения поставили на повестку дня исследования в области тканевой инженерии (ТИ) как более эффективного метода структурного и функционального восстановления органов и тканей.

ТИ – одна из новых и очень перспективных биомедицинских технологий, позволяющих индуцировать и/или ускорять регенерацию поврежденных тканей, а также проводить замещение дефектных органов или их частей. В то же время ТИ – это современная медицинская методология, основанная на использовании естественной способности организма пациента к восстановлению. Согласно определению, ТИ – это процесс создания трехмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма, на основе комбинации клеток и носителей (скэффолдов), а также прочих факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию экстрацеллюлярного матрикса [Tortelli and Cancedda, 2009].

Одним из наиболее востребованных и, следовательно, интенсивно развиваемых направлений ТИ является терапия костных дефектов [d'Aquino et al., 2009]. Дефекты костной ткани, возникающие в результате травм, хирургических вмешательств, а также вследствие различных заболеваний, во многих случаях приводят к функциональной недостаточности опорно-двигательного аппарата, тем самым существенно снижая качество жизни. Практически во всех случаях в зоне поражения формируется значительный косметический дефект. Актуальность проблемы репарации костной ткани связана также с увеличением встречаемости остеодегенеративных заболеваний, особенно в развитых странах.

ТИ любой ткани возможна лишь при наличии по крайней мере двух исходных компонентов клеток-родоначальниц ее паренхиматозных элементов и – биосовместимого материала для создания трехмерного скэффолда, в пределах которого протекают процессы гисто- и морфогенеза. В идеале материал скэффолда должен имитировать свойства межклеточного вещества и составлять часть «микрониши», т.е. непосредственного окружения клеток, создающего адекватные условия для их пролиферации и/или дифференцировки в нужном направлении, а также для осуществления нормальных функций после дифференцировки, в том числе продукции межклеточного вещества.

В качестве клеточного материала для заселения скэффолдов чаще всего используют аутологичные мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга [Costa-Pinto et al., 2009] или жировой ткани [Haimi et al., 2009] и размноженные в культуре. К сожалению, в течение жизни эти клетки, подобно всем другим клеткам человеческого организма, стареют [Bellantuono et al., 2009] и подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что приводит к накоплению соматических мутаций и снижению пролиферативного и остеогенного потенциала [Cancedda et al., 2003]. Эффективный путь решения этой проблемы – применение аутологичных остеогенных клеток пульпы молочного зуба, которые после выделения и экспансии в культуре могут до момента их использования храниться в жидком азоте в криобанке.

Цель исследования.

Целью данного исследования явилась характеристика cравнительная мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека и оценка возможности применения пульпы молочного зуба в качестве источника клеточного материала для тканевой инженерии кости.

Задачи исследования.

1. Получить культуры мезенхимальных клеток (МК) пульпы молочного зуба и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека.

2. Сравнить цитофенотипические профили полученных культур.

3. Сравнить способность исследуемых клеток к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

4. Отработать методику культивирования изучаемых клеток на биодеградируемых скэффолдах.

5. Оценить возможность остеогенной дифференцировки МК пульпы молочного зуба, культивируемых на трехмерных скэффолдах.

Научная новизна.

Впервые осуществлена фенотипическая характеристика первичных культур МК пульпы молочного зуба в сравнении с МСК костного мозга, выявившая различия в их фенотипических профилях.

Впервые показана возможность создания тканеинженерных конструкций на основе мезенхимальных клеток человека и биодеградируемого полилактидного скэффолда, полученного методом селективного лазерного спекания.

Впервые показано, что МК пульпы молочного зуба способны к остеогенной дифференцировке в составе тканеинженерного комплекса с полилактидным скэффолдом, изготовленным методом селективного лазерного спекания.

Практическая значимость.

Полученные результаты обосновывают возможность применения МК пульпы молочного зуба в качестве клеточного материала в тканевой инженерии кости.

Созданные на базе разрабатываемой технологии тканеинженерные комплексы могут найти широкое применение в травматологии, онкологии, стоматологии и многих других областях современной медицины в случаях необходимости восстановления костных дефектов.

Показано, что пульпа молочного зуба является доступным источником большого количества клеток, обладающих остеогенным потенциалом. Закладка МК пульпы молочного зуба в криобанки позволит значительно расширить круг людей, имеющих возможность в течение жизни использовать аутологичные мультипотентные клетки.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на V, VI и VII ежегодных конференциях клетки и перспективы их использования в «Стволовые здравоохранении» британско-российском совещании в (Москва, 2006–2008), сотрудничестве с Европейской Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, конференции стволовые и прогениторные клетки:

2007), «Аутологичные экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), а также V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 6 публикаций в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на _ источник Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Культуры клеток.

МСК костного мозга получали из аспирата костного мозга человека.

Мононуклеарную фракцию клеток выделяли в градиенте плотности фиколла урографина (1,077 г/см3) и культивировали в ростовой среде (DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (все реактивы – Gibco, США)) в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (37ОС, 5% СО2, 80% влажности) до формирования монослоя, меняя среду два раза в неделю.

Молочные зубы детей получали в результате естественного выпадения.

Материал отмывали в растворе Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением культурального антибиотика-антимикотика США). После вскрытия коронки пульпу (Gibco, извлекали, измельчали, а затем инкубировали в 0,1%-ом растворе коллагеназы I типа США). Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в (Gibco, вышеупомянутой ростовой среде и культивировали в стандартных условиях до формирования монослоя, меняя среду два раза в неделю.

Изготовление полилактидных скэффолдов.

Трехмерные синтетические биодеградируемые скэффолды на основе полилактидной кислоты были изготовлены в виде пластин 551 мм методом поверхностного селективного лазерного спекания на установке СЛС-100, разработанной и изготовленной в Институте проблем лазерных и информационных технологий РАН. Источником непрерывного излучения служил (ИПЛИТ) одномодовый волоконный лазер с длиной волны излучения 1,06 мкм и мощностью до 10 Вт (НТО “ИРЭ-Полюс”, РФ). Скорость сканирования составляла 21 см/сек, размер пучка лазерного излучения – 125 мкм.

Для спекания использовались частицы биорезорбируемого полимера D,L полилактида Medisorb 100 DL HIGH IV (Alkermes, США) с молекулярной массой кДа и полидисперсностью 1,4. Средний размер частиц составлял 200 мкм. В порошок полимера добавлялись наночастицы углерода в количестве 0,1 весовых процента.

Удельная геометрическая поверхность частиц поглотителя была 50 м2/г.

Стерилизацию скэффолдов осуществляли путем погружения их в 70%-ный C2H5OH с последующей инкубацией в течение 24 ч в растворе Хэнкса (ПанЭко, РФ) с добавлением культурального антибиотика/антимикотика (Gibco, США).

Заселение скэффолдов клетками.

Клетки переводили в суспензию путем инкубации в смеси 0,25%-ного раствора трипсина с раствором Версена (1:1) (ПанЭко, РФ) в течение 5 мин. при 37С, осаждали центрифугированием, а затем в капле объемом 200 мкл (концентрация клеток – 1 млн./мл) в стерильных условиях наносили на скэффолды, находящиеся в колодцах 24-луночного планшета. Планшет со скэффолдами и нанесенными на них клетками помещали в CO2-икубатор и инкубировали в течение 45 мин. в стандартных условиях для обеспечения эффективной адгезии клеток. Затем в колодца планшета вносили ростовую среду. Иммобилизованные на скэффолде клетки культивировали в стандартных условиях со сменой ростовой среды каждые три дня.

Проточная цитофлуориметрия.

Клетки переводили в суспензию с помощью раствора Версена (ПанЭко, РФ), осаждали центрифугированием, а затем ресуспендировали в 1 мл буферного раствора, состоящего из PBS с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) и 0,1% NaN3 (Sigma, США). Затем клетки трижды отмывали этим раствором путем осаждения центрифугированием, напоследок ресуспендировав осажденные клетки в 0,2 мл того же раствора. В полученную суспензию вносили 15 мкл раствора моноклональных антител, прямо меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) и тандемным красителем фикоэритрин-цианин 5 (PE-Cy5) (Caltag, Великобритания), и инкубировали при +4ОС в течение 60 мин. В качестве отрицательного контроля использовали изотипические антитела, меченные соответствующими флуоресцентными метками (Caltag, Великобритания). После осаждения и отмывки клетки ресуспендировали в 0,25 мл буферного раствора и фиксировали с помощью 4%-ного раствора параформальдегида, добавляемого в количестве 0,25 мл на 4 мин.

при комнатной температуре. Затем объём клеточной суспензии доводили до 1 мл путем добавления буферного раствора и фильтровали для исключения клеточных агрегатов (диаметр пор фильтра 30 мкм).

Исследование выполняли на проточном цитофлуориметре-сортере FACSAria (Becton Dickinson, США). Для управления прибором и первичного анализа данных применялся пакет программ BD FACSDiva Software.

Уровень экспрессии исследуемого маркёра оценивали по гистограмме интенсивности флуоресценции метки, конъюгированной со специфическими антителами. Производили запись регистрируемых событий в количестве 10 тысяч при минимальной скорости подачи клеточной суспензии. Для исключения регистрации шумов, а также объектов с размерами меньше клеточных задавали порог регистрации (threshold) по прямому светорассеиванию, равный 20000.

Дальнейший анализ полученных данных проводили в программе WinMDI 2.8.

Для сравнения интенсивности флуоресценции опытного образца и изотипического контроля применяли наложение результатов исследования образца и контроля в режиме гистограммы.

Остеогенная дифференцировка.

Исследуемые клетки культивировали на покровных стеклах. Дифференцировку культур МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга в костную ткань осуществляли в ростовой среде без сыворотки с добавлением 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ -глицерофосфата кальция, 10-7 М дексаметазона (все реактивы – Sigma, США). Клетки культивировали в течение трех недель, меняя среду два раза в неделю. Остеогенную дифференцировку клеток оценивали на 8-й, 15-й и 22-й день культивирования. Для этого препараты фиксировали 4%-ным параформальдегидом и окрашивали ализариновым красным.

Адипогенная дифференцировка.

МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга культивировали на покровных стеклах. Адипогенную дифференцировку клеток проводили в ростовой среде без сыворотки с добавлением 10% лошадиной сыворотки, 0,5 мМ изобутилметилксантина и 60 µМ индометацина (все реактивы – Sigma, США) в течение семи дней, заменяя среду один раз на 3-й день культивирования. На 8-й день дифференцировки препараты фиксировали параформальдегидом и 4%-ным окрашивали масляным красным.

Исследование активности щелочной фосфатазы.

Цитохимическую реакцию на щелочную фосфатазу проводили путем погружения препаратов клеток на покровных стеклах в реакционную смесь, содержащую 100 мМ NaCl, 100 мМ Tris-HCl (pH 9,5), 5 мМ MgCl2, 1 мг/мл NBT (nitro-blue tetrazolium chloride) и 0,1 мг/мл BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) (все реактивы – Sigma, США). Реакцию останавливали добавлением 10 мМ ЭДТА.

Иммуноцитохимическое окрашивание.

Культуры клеток промывали PBS по стандартной методике (три раза по 2 мин.) и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в течение 4 мин. при комнатной температуре. После фиксации клетки отмывали PBS, проводили пермеабилизацию с помощью PBS, содержащего 1% Triton X-100 (Sigma, США), в течение 10 мин. при комнатной температуре и затем отмывали. Неспецифическое связывание моноклональных антител с материалом блокировали в течение 30 мин.

при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 2% нормальной козьей сыворотки, 0,05% Tween 20, 0,01% мертиолята (Sigma, США). Разведение первичных (специфических) и вторичных (антивидовых) моноклональных антител готовили на этом же буферном растворе. Клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение мин., затем отмывали PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween 20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин., после этого клетки отмывали PBS с добавлением 0, % бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween 20. Ядра клеток окрашивали раствором DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в PBS в концентрации 1 мкг/мл.

Полученные препараты заключали в среду для протектирования флуоресценции (Dako Cytomation, США).

Дополнительно к клеткам, находящимся непосредственно на скэффолде, мы исследовали клетки, пересаженные на покровные стекла после культивирования на скэффолде. Для снятия клеток скэффолд с иммобилизованными клетками погружали на 10 мин. в смесь 0,25%-ного раствора трипсина с раствором Версена (1:1) (ПанЭко, РФ). Клетки переводили в суспензию путем пипетирования, осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали в ростовой среде и культивировали на покровных стеклах в СО2-инкубаторе в стандартных условиях в течение 24 ч. Далее окрашивали препараты по стандартной методике.

В данной работе были использованы первичные моноклональные кроличьи антитела против остеонектина человека (разведение 1:50) (Chemicon, США), а также первичные моноклональные мышиные антитела против остеокальцина человека (разведение 1:10) (R&D Systems, США). В качестве вторичных антител применялись межвидовые антитела против IgG кролика, конъюгированные с родамином США), и антитела против мыши, (разведение 1:300) (Chemicon, IgG конъюгированные с флуоресцентным красителем DyLight 488 (разведение 1:300) (Rockland, США).

Получение и обработка цифровых изображений.

Фотосъёмку полученных флуоресцентных микропрепаратов проводили на флуоресцентном микроскопе ZEISS AxioPlan 2 с установленной на нём цифровой камерой AxioCam HRc при помощи программного пакета AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Для регистрации данных световой микроскопии использовали инвертированный микроскоп AxioVert (Carl Zeiss, Германия) с установленной цифровой камерой D80 (Nikon, Япония). Дальнейшую обработку полученных цифровых микрофотографий проводили в программе Photoshop CS3 (Adobe, США).

Результаты исследования и их обсуждение Нативные культуры клеток.

МСК костного мозга выделяли из аспирата красного костного мозга методом градиентного центрифугирования, МК пульпы молочного зуба путем – ферментативной обработки пульпы. Все клетки полученных культур имели фибробластоподобную морфологию (рис. 1) и представляли собой распластанные клетки преимущественно веретеновидной формы. Клетки культуры МСК костного мозга были сильнее распластаны, чем МК пульпы молочного зуба.

А Б Рис. 1. Нативные культуры клеток А – МСК костного мозга;

Б – МК пульпы молочного зуба. Увеличение 200.

Цитофенотипические профили МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

Полученные культуры клеток были исследованы на экспрессию поверхностных маркерных белков CD29, CD34, CD44, CD45, CD49b, CD54, CD90, CD105, CD106 и HLA-DR (рис. 2, 3).

Экспрессия CD34, CD45 и HLA-DR, характерная для гемопоэтических стволовых клеток, в изучаемых культурах не наблюдалась (рис. 2).

Клетки обеих исследуемых культур продемонстрировали высокий уровень экспрессии CD44, CD105 и CD90, а также менее выраженную экспрессию CD54 и CD106 (рис. 2). CD44 (hyaluronic acid receptor), CD54 (inter-cellular adhesion molecule 1), CD90 (thymocyte differentiation antigen 1), CD105 (endoglin) и CD106 (vascular cell adhesion molecule 1) – поверхностные белки, характерные для мультипотентных клеток мезенхимального ряда. Они играют важную роль в межклеточных взаимодействиях, а также в процессах миграции, хоуминга и дифференцировки клеток.

Маркерные молекулы CD49b и CD29 представляют собой, соответственно, 2- и 1-субъединицы интегрина VLA-2, способного связываться с коллагеном и ламинином. Данный пептидный комплекс обеспечивает взаимодействие клеток с экстрацеллюлярным матриксом. МК пульпы молочного зуба экспрессировали эти маркеры на высоком уровне, а МСК костного мозга продемонстрировали низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b (рис. 3).

СD34 CD44 CD45 CD МСК костного мозга МК пульпы мол.

зуба CD90 CD105 CD106 HLA-DR мол. МСК костного мозга МК пульпы зуба Рис. 2. Экспрессия CD34, CD44, CD45, CD54, CD90, CD105, CD106 и HLA-DR в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии поверхностного маркера;

по оси ординат – количество регистрируемых событий (клеток). Изотипический контроль обозначен черной линией.

Таким образом, в результате проведенного иммуноцитохимического исследования было показано соответствие фенотипа клеток полученных культур мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам [Horwitz et al., 2005].

Выявлено различие в экспрессии CD29 и CD49b, являющихся субъединицами интегрина VLA-2. В отличие от МСК костного мозга МК пульпы молочного зуба обладали высоким уровнем экспрессии этих маркеров, что связано, по-видимому, с различным микроокружением клеток в естественных нишах, а также их различным происхождением.

СD49b CD МК пульпы мол. зуба МСК костного мозга Рис. 3. Экспрессия CD49b и CD29 в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии поверхностного маркера;

по оси ординат – количество регистрируемых событий (клеток). Изотипический контроль обозначен черной линией.

Дальнейшая оценка наличия мультипотентных мезенхимальных клеток в изучаемых культурах включала исследование способности к дифференцироке в различных направлениях, а именно в жировую и костную ткань.

Оценка способности к дифференцировке в адипоциты.

Индукцию адипогенной дифференцировки осуществляли путем внесения в культуральную среду лошадиной сыворотки, изобутилметилксантина и индометацина. Через семь дней культивирования все клетки обеих исследуемых культур накапливали в цитоплазме жировые вакуоли, специфически окрашиваемые масляным красным (рис. 7). Таким образом было показано, что МК пульпы молочного зуба, как и МСК костного мозга, способны к адипогенной дифференцировке.

А Б Рис. 7. Накопление жировых вакуолей в МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе адипогенной дифференцировки.

А – МСК костного мозга;

Б – МК пульпы молочного зуба. Увеличение 630.

Оценка способности к дифференцировке в остеобласты.

Дифференцировку клеток изучаемых культур в остеобласты проводили в ростовой среде без сыворотки с добавлением аскорбиновой кислоты, глицерофосфата кальция и дексаметазона. Накопление клетками солей кальция в процессе дифференцировки в остеобласты выявляли при помощи окрашивания ализариновым красным. К 8-му дню культивирования в среде для остеогенной дифференцировки в культурах обнаруживались области повышенной концентрации клеток, специфически связывающих краситель (рис. 4, а, б). В дальнейшем плотность клеток в данных участках увеличивалась. Находящиеся в них клетки активно накапливали фосфаты кальция, что проявлялось в увеличении интенсивности окраски к 15-м суткам дифференцировки (рис. 4, в, г). К 22-м суткам культивирования в обеих культурах встречалось значительное количество локусов окостенения, характеризующихся наличием в них клеток, обладающих типичной для остеобластов морфологией и высоким содержанием солей кальция в вакуолях (рис. 4, д, е).

Происходило активное вовлечение близлежащих клеток в процесс остеогенной дифференцировки. Результаты данного исследования подтверждают гипотезу о наличие мультипотентных клеток в первичной культуре МК пульпы молочного зуба.

А Б В Г Д Е Рис. 4. Накопление фосфатов кальция в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки.

А, В, Д – МСК костного мозга;

Б, Г, Е – МК пульпы молочного зуба. А, Б – 8-е сутки;

В, Г – 15-е сутки;

Д, Е – 22-е сутки. Окраска ализариновым красным. Увеличение 200.

Способность МК пульпы молочного зуба отвечать на стимуляцию остеогенной дифференцировки накоплением минеральных отложений и образованием локусов окостенения в двумерной культуре указывает на способность клеток к дифференцировке в остеобласты. Однако, комплексная оценка возможности применения МК пульпы молочного зуба в ТИ кости требовала исследования большего количества маркеров дифференцировки клеток в костную ткань. Для решения этой задачи было осуществлено изучение изменения уровня экспрессии остеонектина и активности щелочной фосфатазы при культивировании клеток в остеоиндуктивной среде. При этом производили сравнение МК пульпы молочного зуба с МСК костного мозга по исследуемым параметрам.

А Б В Г Рис. 5. Экспрессия остеонектина МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки.

А, В – МСК костного мозга;

Б, Г – МК пульпы молочного зуба. А, Б – 1-е сутки;

В, Г – 8 е сутки. Окраска ядер DAPI. Увеличение 630.

Изменение уровня экспрессии остеонектина в процессе остеогенной дифференцировки.

Остеонектин – один из основных белков межклеточного вещества костной ткани. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа, обладающий способностью связывать кальций. Взаимодействие остеонектина с коллагеном I типа приводит к созданию комплекса, связывающего кристаллы гидроксиапатита и свободные ионы кальция Ca2+. Образовавшиеся структуры становятся центром отложения минеральных солей, составляющих минеральную компоненту межклеточного вещества костной ткани [Termine et al., 1981]. На начальном этапе остеогенной дифференцировки в культурах клеток пульпы зуба и МСК костного мозга наблюдалась экспрессия данного маркера на фоновом уровне (рис. 5, а, б). К 8-му дню культивирования уровень экспрессии остеонектина возрастал в обеих исследуемых культурах (рис.5, в, г).

Изменение уровня активности щелочной фосфатазы в процессе остеогенной дифференцировки.

Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты. Этот фермент играет важную роль в процессах формирования и роста костей;

высокий уровень его активности приводит к отложению минеральных солей [El-Amin et al., 2006]. Для подтверждения способности МК пульпы молочного зуба к дифференцировке в остеобласты проводили сравнение активности щелочной фосфатазы в культурах МК пульпы и МСК костного мозга при культивировании в среде с индукторами дифференцировки.

На начальном этапе в культуре МСК костного мозга обнаруживались только отдельные клетки, обладавшие невысоким уровнем активности щелочной фосфатазы;

в культуре клеток пульпы зуба активность фермента не выявлялась (рис. 6, а, б). К 8 му дню культивирования в среде для остеогенной дифференцировки уровень активности щелочной фосфатазы критически возрастал во всех клетках изучаемых культур (рис. 6, в, г).

В клеточной биологии экспрессия остеонектина и активность щелочной фосфатазы традиционно используются в качестве основных маркеров остеогенной дифференцировки [Jundt et al., 1987;

George et al., 2006]. Нами было показано, что клетки обеих культур схожим образом отвечают на индукцию дифференцировки увеличением этих параметров. Таким образом, МК пульпы молочного зуба обладают высоким остеогенным потенциалом, практически аналогичным остеогенному потенциалу МСК костного мозга. Следовательно, пульпа молочного зуба может быть использована в качестве источника клеток для ТИ кости наравне с костным мозгом.

А Б В Г Рис. 6. Активность щелочной фосфатазы в культурах МСК костного мозга и МК пульпы зуба в процессе остеогенной дифференцировки А, В – МСК костного мозга;

Б, Г – МК пульпы молочного зуба. А, Б – 1-е сутки;

В, Г – 8 е сутки. Увеличение 630.

Культивирование МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба на полилактидных скэффолдах.

Концепция ТИ кости подразумевает применение остеогенных клеток в комплексе со скэффолдом. Скэффолд иммобилизует клетки на своей поверхности, обеспечивает механическую прочность конструкции, а также имитирует межклеточное вещество костной ткани, в естественных условиях взаимодействующее с остеопрогениторными клетками и обеспечивающее реализацию их функций.

Было осуществлено заселение изготовленных полилактидных скэффолдов клетками костного мозга и пульпы молочного зуба человека. В обоих случаях на 8-й день после заселения на скэффолдах обнаруживалось значительное количество клеток (рис. 8, а, б). Через шесть недель культивирования жизнеспособность клеток сохранялась в обоих случаях;

разница между клетками пульпы зуба и клетками костного мозга визуально не обнаруживалась (рис. 8, в, г). Тем самым была продемонстрирована возможность культивирования клеток на изучаемых скэффолдах.

А Б В Г Рис. 8. МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба, культивируемые на полилактидных скэффолдах.

А, В – МСК костного мозга;

Б, Г – МК пульпы молочного зуба. А, Б – 8-е сутки;

В, Г – 43-е сутки. Окраска ядер DAPI. Увеличение 100.

Изменение уровня экспрессии остеокальцина МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки на полилактидных скэффолдах.

С целью подтверждения полученного вывода о перспективности МК пульпы молочного зуба человека в качестве источника остеопрогениторных клеток для ТИ кости была произведена оценка способности МК пульпы молочного зуба к остеогенной дифференцировке на полилактидных скэффолдах. Клетками заселяли скэффолды, а затем культивировали в среде для остеогенной дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту, -глицерофосфат кальция и дексаметазон. Для оценки дифференцировки клеток в остеобласты исследовали изменение уровня экспрессии остеокальцина путем иммуноцитохимического окрашивания клеток на скэффолдах с применением вторично меченных моноклональных антител.

Для подтверждения результатов мы осуществляли также окрашивание клеток, которые после культивирования на скэффолдах были перенесены на покровные стекла.

К 21-му дню инкубации в остеогенной среде в культуре МК пульпы молочного зуба, заселенных на скэффолды, наблюдалось существенное увеличение экспрессии остеокальцина в отличие от культуры тех же клеток на скэффолдах, инкубированных в ростовой среде (рис. 9, а, б). Исследование клеток, пересаженных на покровные стекла, дало такой же результат (рис. 9, в, г).

Полученные данные указывают на то, что МК пульпы молочного зуба сохраняют свой остеогенный потенциал при культивировании на полилактидных скэффолдах;

также показано отсутствие негативного влияния на процесс дифференцировки клеток со стороны самого скэффолда. Следовательно, изучаемые полилактидные скэффолды могут быть использованы для целей ТИ кости. Стоит отметить, что технология селективного лазерного спекания позволяет эффективно контролировать такие характеристики создаваемых скэффолдов как эффективность клеточной адгезии [El-Amin et al., 2003] и сроки резорбции [Antonov et al., 2004;

Kanczler et al., 2009]. Дополнительно в состав скэффолдов могут быть введены остеоиндуктивные вещества, например наноструктурированный гидроксиапатит.

А Б В Г Рис. 9. Экспрессия остеокальцина МК пульпы молочного зуба, культивированными на полилактидных скэффолдах.

А, В – клетки, культивированные в ростовой среде;

Б, Г – клетки, культивированные в среде для остеогенной дифференцировки. А, Б – иммуноцитохимическое окрашивание клеток на скэффолдах (слева – окраска антителами, справа – окраска ядер DAPI);

В, Г – иммуноцитохимическое окрашивание клеток на покровных стеклах, окраска ядер DAPI.

Увеличение 100 (А, Б);

400 (В, Г).

В результате выполненной работы нами показано, что пульпа молочного зуба является перспективным источником клеточного материала для ТИ кости. Кроме того, МК пульпы молочного зуба с большой степенью вероятности могут применяться для создания технологий регенерации других типов соединительной ткани, таких как хрящ, сухожилия и связки. Известно, что культуры МК, полученные из пульпы молочных зубов, содержат плюрипотентные клетки, способные к нейрогенной, миогенной и гепатогенной дифференцировке [Miura et al., 2003]. По своей природе МК пульпы зуба являются высокогетерогенной популяцией, содержащей, в том числе, клетки, обладающие васкулогенным потенциалом [Iohara et al., 2008], способствующим неоангиогенезу при трансплантациях.

Одной из наиболее широких областей применения ТИ кости является челюстно лицевая хирургия. Широко распространены костные дефекты, возникающие в результате резорбции альвеолярных отростков, экстракции зубов, воспалительных процессов и онкологических заболеваний. Однако, попытки клинического применения аутотрансплантатов из трубчатых костей для замещения этих дефектов оказались недостаточно эффективны [Akintoye et al., 2006], что, вероятно, связано с различным эмбриональным происхождением этих тканей. Данная несовместимость отсутствует при применении МК пульпы молочного зуба [Seo et al., 2008].

В отличие от болезненной для пациента инвазивной процедуры пункции костного мозга забор материала для получения культур МК пульпы молочного зуба чрезвычайно прост и не связан с какими-либо рисками. Один выпавший молочный зуб позволяет получить сотни миллионов МК. Таким образом, МК пульпы молочного зуба могут быть использованы для закладки на хранение в банки аутологичных стволовых клеток. В настоящее время в таких банках хранятся лишь образцы пуповинной крови, в которой содержание плюрипотентных клеток невелико и колеблется в широких пределах от родов к родам. Закладка МК пульпы молочного зуба в криобанки позволит существенно расширить круг детей, чьи аутологичные стволовые клетки могут быть заложены на хранение с целью последующего использования в течение жизни.

ВЫВОДЫ.

Пульпа молочного зуба человека, выпавшего естественным путем, дает 1.

возможность получить в культуре значительное количество мезенхимальных клеток.

Первичные культуры МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга 2.

обладают сходными цитофенотипическими профилями и содержат мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, способные к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro.

МК пульпы молочного зуба экспрессируют CD29 и CD49b на высоком уровне в 3.

отличие от МСК костного мозга, для которых характерен низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b.

Трехмерные биодеградируемые скэффолды на основе полилактида, полученные 4.

методом селективного лазерного спекания, могут быть использованы в комплексе с мезенхимальными клетками при создании тканеинженерных конструкций.

МК пульпы молочного зуба обладают способностью к остеогенной 5.

дифференцировке при культивировании на полилактидных скэффолдах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н.

1.

Сравнение способности к дифференцировке мезенхимальных клеток человека, выделенных из разных источников, в ткани мезодермального происхождения // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, №1, с. 3-10.

Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Петракова Н.В., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н., 2.

Ярыгин В.Н. Сравнительный анализ цитофенотипов клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, №1, с. 38-45.

Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н.

3.

Сравнение in vitro иммунологических свойств культивируемых мезенхимальных клеток человека, изолированных из разных источников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008, №2, с. 188-191.

Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., 4.

Ярыгин К.Н. Мезенхимальные клетки пульпы молочного зуба: цитофенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии костной ткани // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2010, №1, с. 55-60.

Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Лупатов А.Ю., Вахрушев И.В., Каралкин П.А., 5.

Ярыгин К.Н. Сравнительный анализ фенотипов и способности к дифференцировке клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека // Материалы конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 24-25 мая 2006 г., с. 27-29.

Ярыгин В.Н., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Чеглаков И.Б., Холоденко Р.В., 6.

Холоденко И.В., Лупатов А.Ю., Вахрушев И.В., Каралкин П.А., Ярыгин К.Н.

Сравнительная характеристика культивируемых человеческих клеток мезенхимального ряда, выделенных из разных источников. Тезисы докладов и сообщений Всероссийского симпозиума "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006 г. // Цитология, 2006, т. 48, №9, с. 817-818.

7. Vakhrushev I.V., Suzdaltseva Y.G., Burunova V.V., Lupatov A.Y., Karalkin P.A., Yarigin K.N. Comparison of cytophenotypic profiles of mesenchymal cells isolated from various human tissues // Proceedings of British-Russian workshop in association with the European Commission "Stem cells: policy, research, and innovations. European Union - Russian Federation perspectives", Moscow, 15-16 March 2007. P. 7-8.

Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Ярыгин К.Н. Использование постнатальных 8.

мезенхимальных стволовых клеток человека, иммобилизованных на синтетическом трёхмерном биодеградируемом матриксе, для инженерии костной ткани in vitro. Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, ММА им. Сеченова, 19-22 мая 2008г. // Вестник Российской академии медицинских наук, 2008, спец. выпуск, с. 6.

Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Ярыгин К.Н. Сравнительный анализ 9.

цитофенотипов и способности к дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и пульпы зуба человека // Материалы конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 29 мая 2008 г.

10. Суздальцева Ю.Г., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н. Пульпа зуба – источник постнатальных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток // Материалы конференции "Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения", Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 9-11 июня 2008 г.

Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии кости Проведено сравнительное исследование первичных культур мезенхимальных клеток (МК) пульпы молочного зуба человека и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга в отношении свойств, характеризующих потенциал клеток как материала для тканевой инженерии кости. Фенотипический профиль обеих культур соответствовал мультипотентным клеткам мезенхимального ряда.

Было обнаружено различие между исследуемыми типами клеток в экспрессии CD и CD49b: МК пульпы молочного зуба экспрессировали эти маркеры на высоком уровне, а МСК костного мозга продемонстрировали низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b. Клетки пульпы молочного зуба и костного мозга обладали почти одинаковой способностью как к адипогенной, так и к остеогенной дифференцировке, о чем судили по накоплению жировых вакуолей либо фосфатов кальция в соответствующих условиях. В ответ на введение в среду индукторов остеогенной дифференцировки в обеих культурах возрастали уровни экспрессии остеонектина и активности щелочной фосфатазы. Исследуемые клетки были использованы для заселения биодеградируемых полилактидных скэффолдов.

При культивировании МК пульпы молочного зуба на скэффолдах в остеогенной среде возрастал уровень экспрессии клетками остеокальцина. Полученные результаты указывают на то, что МК пульпы молочного зуба могут быть использованы в составе тканеинженерных конструкций для восстановления костных дефектов, являясь при этом легко доступным источником мультипотентных клеток для закладки в криобанки.

Vakhrushev I.V.

Comparative characteristics of mesenchymal cells from deciduous tooth pulp and bone marrow: phenotype and an initial evaluation of the potential for use in bone tissue engineering This study was performed to compare the primary cultures of mesenchymal cells isolated from the pulp of human exfoliated deciduous teeth (often abbreviated SHED, stem cells from human exfoliated deciduous teeth) and human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMMSC) regarding their properties characterizing the potential of cells as a material for bone tissue engineering. The phenotypic profile of both cell cultures was indicative of multipotent cells of a mesenchymal line. A difference between SHED and BMMSC was found concerning the expression of CD29 and CD49b:

SHED expressed high levels of these markers, whereas low-level expression of CD29 and no expression of CD49b were observed on BMMSC. The cultured cells from both sources exhibited nearly the same capacity for adipogenic as well as for osteogenic differentiation, as judged by the accumulation of fat vacuoles or calcium phosphates under appropriate conditions. The addition of osteogenic inducers to any of both cell cultures caused the increase in the levels of osteonectin expression and alkaline phosphatase activity. We used SHED and BMMSC to populate a biodegradable polylactide scaffold. Upon cultivation of the SHED-seeded scaffold in osteogenic differentiation medium, the level of osteocalcin expression in the cells increased. Our data suggest that SHED may be used as a component of tissue engineering constructions for bone defect reparation. In addition to this, these cells are an easily accessible source of multipotent cells for stem cell banking.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.